La présente étude a été réalisée conformément à la Déclaration d'Helsinki. Une approbation a été accordée par le Comité d'éthique de l'Université médicale de Mongolie-Intérieure le 21 octobre 2021. Le consentement éclairé écrit a été obtenu de tous les participants inclus dans l'étude.
Prélèvement des échantillons cliniques
Des tissus de CCR appariés et des tissus non cancéreux adjacents ont été prélevés chez 45 patients ayant subi une résection radicale entre décembre 2017 et février 2020. Aucun des patients n'avait reçu de radiothérapie ou de chimiothérapie préopératoire, et les patients présentant d'autres tumeurs malignes ont été exclus. Le tissu non cancéreux adjacent a été prélevé à au moins 5 cm de la marge tumorale. Les échantillons ont été congelés rapidement après leur ablation chirurgicale et stockés dans de l'azote liquide jusqu'à l'extraction de l'ARN. La cohorte comprenait 27 patients de sexe masculin et 18 de sexe féminin ; 13 patients avaient moins de 60 ans, et 32 avaient 60 ans ou plus. Les variables clinico-pathologiques comprenaient le diamètre tumoral, le stade TNM, le degré de différenciation, la présence d'un thrombus tumoral vasculaire, la métastase ganglionnaire et le taux préopératoire de CEA.
Acquisition et prétraitement de données publiques
Des données d'ARNm-séquençage, de miARN-séquençage et des données cliniques en accès libre pour TCGA-COAD et TCGA-READ ont été obtenues à partir du portail Genomic Data Commons. Les échantillons de tumeurs primitives et de tissus solides normaux ont été identifiés selon le type d'échantillon GDC. Les échantillons de tumeurs métastatiques et récidivantes ont été exclus de l'analyse différentielle d'expression tumeur-normale. Pour les fichiers TCGA de miARN-séquençage, l'entrée au niveau de la base de données détectée pour cette analyse était hsa-mir-192 ; les valeurs d'expression ont été analysées sous la forme log2(RPM + 1), où RPM indique les lectures par million de lectures d'ARNmi cartographiées. Des analyses appariées et non appariées tumeur-normale ont été réalisées lorsque des échantillons appariés étaient disponibles. Les jeux de données GEO GSE89076 et GSE156355 ont été utilisés pour le criblage des gènes cibles candidats. Les gènes différentiellement exprimés provenant de GEO ont été sélectionnés en utilisant une valeur p ajustée < 0,05 et une variation absolue du log2 ≥ 2. Les noms des jeux de données ont été vérifiés pour assurer leur cohérence tout au long du manuscrit.
Analyses diagnostiques, clinicopathologiques et de survie
Une analyse de la courbe ROC (receiver operating characteristic) a été utilisée pour évaluer la séparation exploratoire entre tumeurs et tissus normaux dans les cohortes TCGA-COAD, TCGA-READ et la cohorte combinée COADREAD. Étant donné le faible nombre d'échantillons normaux, des analyses de sensibilité supplémentaires ont été réalisées, incluant un rééchantillonnage équilibré tumeur-tissu normal sur 5 000 itérations et une analyse laissant de côté un échantillon normal à la fois. Pour les analyses d'association clinicopathologiques, les échantillons de tumeurs primitives ont été divisés en groupes à forte et faible expression selon le niveau médian d'expression de miR-192 dans TCGA. Les analyses ont été répétées pour la cohorte COADREAD combinée, ainsi que séparément pour COAD et READ lorsque la taille de l'échantillon le permettait. La survie globale a été évaluée à l'aide d'une analyse de Kaplan-Meier avec le test du log-rank et d'une régression de Cox univariée. Les analyses diagnostiques, clinicopathologiques et de survie ont été présentées séparément afin d'éviter de surestimer les conclusions pronostiques.
Analyses des gènes cibles candidats et des gènes centraux
Les gènes cibles candidats ont été identifiés en intégrant la prédiction de miRWalk avec les gènes différentiellement exprimés provenant des jeux de données GSE89076 et GSE156355. L'intersection entre ces trois sources a été conservée pour des analyses exploratoires ultérieures. Un réseau d'interactions protéine-protéine a été construit à l'aide de STRING, et les gènes centraux ont été sélectionnés selon le degré des nœuds et la connectivité des modules, en utilisant les analyses cytoHubba et MCODE basées sur Cytoscape. Les gènes centraux retenus (KIF20A, TPX2, CDCA5, CCNB1, CDK1, PLP1, NRXN1, GRIK3 et KIF5C) ont été évalués plus en détail à l'aide des données d'ARN-séquençage du projet TCGA. Les différences d'expression tumeur-normale, les corrélations de Spearman avec l'expression de miR-192 dans TCGA, ainsi que les associations avec la survie globale ont été résumées dans des analyses exploratoires supplémentaires. Ces gènes ont été considérés uniquement comme des cibles candidates ; aucune liaison directe, effet de sauvetage ou régulation au niveau protéique en aval n'a été déduite des données bioinformatiques.
Analyse d'enrichissement GO et KEGG
Des analyses d'enrichissement de l'ontologie génique (GO) et de l'Encyclopédie de Kyoto des gènes et des génomes (KEGG) ont été réalisées pour l'ensemble des gènes candidats et les modules significatifs du réseau. Les termes GO ont été regroupés en catégories de processus biologique, composant cellulaire et fonction moléculaire. Les résultats d'enrichissement avec une valeur p < 0,05 ont été considérés comme statistiquement notables et ont été interprétés comme des signaux de voies générant des hypothèses, plutôt que comme des mécanismes validés expérimentalement.
Extraction d'ARN et analyse par qRT-PCR
L'ARN total a été extrait à partir de 45 échantillons appariés de tissus de CCR et de tissus non cancéreux adjacents à l'aide du réactif TRIzol, conformément au protocole du fabricant. La pureté et la concentration de l'ARN ont été évaluées par spectrophotométrie, et les échantillons présentant des valeurs A260/A280 comprises entre 1,8 et 2,1 ont été utilisés pour la transcription inverse. La qRT-PCR a été réalisée à l'aide d'un système de transcription inverse pour les miARN et de réactifs de qPCR pour miARN basés sur le SYBR Green fournis par TransGen Biotech. La transcription inverse et l'amplification par qPCR ont été effectuées conformément aux instructions du fabricant des réactifs. Chaque réaction de qRT-PCR a été effectuée en triple répétition technique. L'ARN RNU6B a été utilisé comme référence interne. Les amorces pour miR-192-5p étaient 5'-GGGGCTGACCTATGAATTGA-3' (sens) et 5'-CAGTGCAGGGTCCGAGGT-3' (antisens). Les amorces pour RNU6B étaient 5'-ATTGGAACGATACAGAGAAGATT-3' (sens) et 5'-GGAACGCTTCACGAATTTG-3' (antisens). Une analyse de la courbe de fusion a été utilisée pour évaluer la spécificité de l'amplification lorsque la plateforme de qPCR le permettait. L'expression relative a été calculée selon la méthode 2-ΔΔCt. Les résultats obtenus à partir des tumeurs appariées et des tissus adjacents ont été analysés comme des mesures cliniques appariées.
Culture cellulaire et transfection
La lignée cellulaire humaine de CCR HT29 a été obtenue à partir du stock cellulaire du laboratoire des auteurs et avait été authentifiée et confirmée comme étant libre de contamination par les mycoplasmes. Les cellules HT29 ont été cultivées dans un milieu McCoy's 5A supplémenté avec 10 % de sérum bovin fœtal, 100 U/mL de pénicilline et 100 µg/mL de streptomycine à 37 oC dans une atmosphère à 5 % de CO2. Les cellules ont été repiquées lorsqu'elles atteignaient environ 80 % de confluence. Les mimétiques de miR-192-5p et l'oligonucléotide contrôle négatif con238 ont été achetés chez Sangon Biotech (Shanghai, Chine) et utilisés pour une transfection transitoire. Les cellules HT29 ont été semées dans des plaques de 6 puits et transfectées lorsque la densité cellulaire a atteint environ 20–30 %, en utilisant une concentration finale d'oligonucléotide de 50 nM et un protocole de transfection à base de lipides réalisé conformément aux instructions du fabricant du réactif. Le rapport exact entre le réactif et l'oligonucléotide ainsi que la quantité de réactif ont suivi le protocole recommandé par le fabricant, tel qu'indiqué dans les registres de laboratoire des auteurs. Les cellules ont été incubées avec les complexes de transfection dans des conditions de culture standard, et les analyses d'imagerie post-transfection ainsi que les tests de cicatrisation des blessures ont été réalisés après la transfection, conformément au planning expérimental. Seules les données obtenues avec les cellules HT29 ont été incluses dans la présente étude.
Dosage de cicatrisation des plaies
Des cellules HT29 transfectées ont été semées dans des plaques de 6 puits et cultivées jusqu'à la formation d'une monocouche confluente. Une estafilade linéaire a été réalisée à l'aide d'une pipette stérile de 200 µL, et les cellules détachées ont été éliminées par lavage au PBS. Le milieu a ensuite été remplacé par un milieu sans sérum afin de réduire les effets liés à la prolifération pendant l'évaluation de la migration. Des images de la lésion ont été prises à 0 h, 24 h et 48 h. Le test de cicatrisation de la plaie a été réalisé en trois réplicats biologiques indépendants, et plusieurs champs microscopiques ont été mesurés pour chaque groupe et chaque point temporel. La largeur de la plaie a été quantifiée à partir des images microscopiques à l'aide d'un logiciel d'analyse d'images ; la version exacte du logiciel utilisée pour les mesures initiales n'était pas disponible dans les documents sources. Le taux de cicatrisation a été calculé selon la formule suivante : [(largeur de la plaie à 0 h - largeur de la plaie au point temporel indiqué) / largeur de la plaie à 0 h] × 100 %. Étant donné que les données manuscrites disponibles ne comprennent pas d'expérience contrôle spécifique de la prolifération, les résultats du test de cicatrisation ont été interprétés comme liés à la migration, sans toutefois exclure complètement les effets de la prolifération.
Analyse de corrélation des signatures immunitaires
L'association entre l'expression de miR-192 dans TCGA et les signatures liées à l'immunité a été réévaluée à l'aide de données d'ARN-séquençage provenant de tumeurs primitives. Un total de 425 échantillons tumoraux dotés de données appariées de séquençage d'ARN et de miARN a été inclus dans l'analyse de corrélation des scores de signature. L'expression de miR-192 présentait des corrélations négatives statistiquement significatives mais faibles avec plusieurs signatures immunitaires après correction du taux de fausses découvertes (FDR), notamment les cellules Tfh (rho = -0,205, FDR = 0,00049), les cellules dendritiques activées (rho = -0,186, FDR = 0,00098), les cellules Treg (rho = -0,185, FDR = 0,00098), les cellules dendritiques plasmacytoïdes (rho = -0,169, FDR = 0,0027) et les macrophages (rho = -0,149, FDR = 0,0092). Des corrélations positives ont été observées principalement pour les signatures des éosinophiles (rho = 0,139, FDR = 0,0155) et des cellules Th17 (rho = 0,121, FDR = 0,0296). Ces résultats indiquent des associations immunitaires hétérogènes et généralement faibles, plutôt qu'un patron uniforme d'infiltration immunitaire positive.
Analyse statistique
Les analyses statistiques ont été réalisées à l'aide des logiciels GraphPad Prism 9.0, SPSS 25.0 et R 3.6.3. Les variables continues ont été résumées par la moyenne ± l'écart-type ou la médiane avec l'intervalle interquartile, selon le cas. Les comparaisons appariées de tissus ont été analysées à l'aide de tests appariés lorsque les échantillons de tumeur et de tissu adjacent étaient appariés. Des tests non paramétriques ont été utilisés lorsque les hypothèses de normalité n'étaient pas satisfaites. Des courbes ROC, un rééchantillonnage équilibré et une analyse laissant de côté un témoin à la fois ont été utilisés pour une discrimination diagnostique exploratoire ; des tests du Chi-deux ont été utilisés pour les associations clinico-pathologiques catégorielles ; les modèles de log-rank et de Cox ont été utilisés pour les analyses de survie ; et une corrélation de Spearman a été utilisée pour les analyses immunitaires et des gènes centraux. Une valeur de p bilatérale < 0,05 a été considérée comme statistiquement significative, avec une correction du taux de fausses découvertes indiquée pour les corrélations des signatures immunitaires.