Mesure des effets des composés pharmacologiques sur la morphologie mitochondriale dans les modèles de vieillissement de la souris

Résumé

Ce protocole décrit des méthodes de mesure des effets de médicaments administrés via des minipompes osmotiques implantables sur la morphologie mitochondriale chez des modèles murins vieillissants. Une imagerie confocale super-résolution tridimensionnelle (3D) du foie de souris est réalisée, et un pipeline pour la segmentation, la classification et l’analyse quantitative non biaisée des structures mitochondriales est développé.

Résumé

L’accumulation de dommages moléculaires liés au vieillissement peut contribuer à des modifications de la morphologie mitochondriale et des dysfonctionnements métaboliques, en particulier dans les tissus à forte dépense énergétique. Les composés pharmacologiques qui améliorent les dysfonctionnements métaboliques et restaurent des morphologies mitochondriales « jeunes » et saines peuvent ainsi représenter des modalités efficaces pour prolonger la durée de vie (c’est-à-dire la partie de sa vie libre du fardeau des maladies chroniques liées au vieillissement) chez les mammifères. Ici, des méthodes pour réaliser des implantations de pompes osmotiques sous-cutanées chez des souris âgées afin d’assurer une délivrance stable de composés pharmacologiques hydrophobes sont décrites. Ensuite, les tissus sont fixés, cryosectionnés, colorés et imagés à l’aide de microscopie à lumière confocale à super-résolution. Enfin, un pipeline automatisé pour la segmentation tridimensionnelle, la classification et la mesure quantitative des structures mitochondriales est présenté. Ainsi, ces méthodes peuvent être utiles pour évaluer quantitativement les changements de la structure tridimensionnelle mitochondriale dans différents tissus tout au long de la vie de la souris. De plus, ces techniques peuvent aider à identifier la reproduction de médicaments à petites molécules qui atténuent les dysfonctionnements métaboliques liés au vieillissement.

Introduction

Les mitochondries sont des organites doublement liés à une membrane, organisés spatiotemporalement pour répondre aux besoins métaboliques actuels de leur cellule et tissu hôte¹. Les invaginations dans la membrane interne, appelées cristes, se forment et s’organisent via une coordination dynamique entre les phospholipides de membrane interne non bicouches tels que la cardiolipine et la phosphatidylylolamine, des rangées de dimères d’ATP synthase aux extrémités des cristes, des oligomères liant la cardiolipine de l’atrophie optique GTPase de type dynamin (OPA1) au sommet des cristes, ainsi que les complexes du site de contact mitochondrial et du système d’organisation de Cristae (MICOS) aux jonctions¹. Ces structures de membranes internes sous-compartimentent les mitochondries en unités fonctionnelles^{individuelles 2} et fournissent une surface accrue sur laquelle les complexes respiratoires producteurs de potentiel transmembranaire mitochondrial^{peuvent s’assembler 1}. En tant qu’organites dynamiques avec des fonctions cellulaires secondaires liées à la signalisation^{apoptotique 3, à} l’homéostasie des espèces réactives d’oxygène³, et à la biosynthèse^{lipidique 4}, les structures morphologiques mitochondriales sont très sensibles aux changements environnementaux tels que la diminution de la disponibilité^{d’oxygène 5} et l’augmentation de la libération de Ca²⁺ par le réticulum endoplasmique ^6,7.

L’accumulation de dommages moléculaires contribue aux changements de la structure et de la fonction mitochondriales au cours de^{l’âge 8}. Des études pionnières de cryo-tomographie électronique (cryo-ET) menées par le groupe de Kühlbrandt sur plusieurs organismes modèles ont démontré une corrélation claire entre la densité des cristes et la capacité respiratoire, ainsi qu’une diminution dépendante de l’âge de la densité des cristes et une perte associée de dimers d’ATP^{synthase 9,10}. De plus, des modifications du volume mitochondrial peuvent résulter d’une fission et d’une dynamique de fusion mitochondriales^{altérées 11}, d’une accumulation lipidique^{accrue 12} et d’un gonflement^{accru 13}. Dans le muscle squelettique, VO₂ max, qui est un fort prédicteur de l’espérance de vie^14,15, peut être prédit avec précision en fonction du degré de fragmentation mitochondriale intermyofibrillaire et de la densité des^{cristes 16}.

Sans surprise, les modifications structurelles et fonctionnelles liées au vieillissement dans les mitochondries peuvent contribuer à la pathogenèse de plusieurs maladies^chroniques 17,18,19,20. Une fragmentation mitochondriale accrue et des altérations de la biogenèse et de la morphologie mitochondriales sont associées à la fois à la maladie d’Alzheimer et à la maladie de Parkinson²⁰. Ces changements entraînent des perturbations des complexes de phosphorylation oxydatif, altèrent la génération de la force motrice des protons et conduisent à une production excessive d’espèces réactives d’oxygène 20,21,22. Dans les dysfonctionnements cardiaques liés au vieillissement et l’insuffisance cardiaque, une fragmentation mitochondriale accrue, un gonflement, une vacuolisation et une perte de densité des cristes contribuent à une diminution de la production^{d’ATP 23,24}. Ces altérations structurelles peuvent être en partie liées à une manipulation altérée du Ca²+ mitochondrial et à une activité accrue du pore de transition de perméabilité^{mitochondriale} 6,7,13,25. En tant que régulateur présumé de la mitophagie, une ouverture excessive du pore de transition de perméabilité au cours du vieillissement peut plutôt être destructrice et conduire à une mort cellulaire^{incontrôlée 13}. Enfin, il est connu que des déficits liés au vieillissement dans le métabolisme lipidique mitochondrial et la mitophagie peuvent également contribuer au développement de la stéatose hépatique^{non alcoolique 26}. En particulier, la stéatose hépatique a été accompagnée d’un stress oxydatif accru et d’une formation accrue de structures mitochondriales semblables à des^{beignets 3,27}.

Par conséquent, il existe un intérêt considérable pour le développement de traitements ciblant les déclins de la fonction mitochondriale liés au vieillissement afin d’améliorer la qualité de vie des personnes souffrant de certaines maladies chroniques. Forzinity (elamiprétide), un peptide interactif lipidique qui atténue le potentiel de surface de la membrane^{interne 28} et augmente la génération^29,30 d’ATP mitochondriale, est récemment devenue le premier médicament ciblant les mitochondries approuvé par la FDA pour le traitement du syndrome de Barth. Le syndrome de Barth est un trouble lié à l’X dans lequel des défauts dans le remodelage cardiolipine contribuent à la cardiomyopathie, à la faiblesse des muscles squelettiques et à la mortalité^{prématurée 31}. Bien que le traitement à court terme n’ait pas produit de changements détectables dans l’âge biologique musculaire chez des souris^{âgées 32}, le traitement par élamiprétide a montré des améliorations répétées des paramètres fonctionnels du vieillissement, tels que la fraction d’éjection cardiaque et la tension longitudinale^{globale 32,33}, la fatigue musculaire et la génération de force 33,34,35, et la fragilité³². L’urolithine A, une ellagitannine d’origine intestinale qui induit la mitophagie³⁶, a également montré des améliorations cliniques de l’endurance et de la force musculaires^{aérobies 37,38}, en plus d’effets positifs sur le dysfonctionnement cardiaque chez des souris âgées et des modèles rats d’insuffisance cardiaque^{induite 39}. La metformine, un médicament antidiabétique qui a été démontré pour interagir avec le complexe I⁴⁰, a également été suggérée comme un mimétique partiel de la restriction^{calorique 41,42}. Cependant, bien que le traitement par metformine ait été associé à une réduction du risque de cancer et à un déclin cognitif retardé dans les données épidémiologiques^{précédentes 43,44}, ses effets sur la durée de santé et la durée de vie chez les patients non diabétiques restent une question^{ouverte 45}. Enfin, le traitement avec le riboside de nicotinamide, un précurseur de NAD+, peut augmenter la biogenèse mitochondriale et la réponse protéique dépliée mitochondriale pour améliorer la génération^d’énergie 46,47,48,49, mais son traitement à long terme chez des souris UM-HET3 n’a eu aucun effet significatif sur la médiane de la souris ni sur la durée de vie du 90e percentile^de la souris.

Ici, des méthodes sont décrites pour préparer des tissus de souris âgées traitées avec des composés pharmacologiques pour l’imagerie confocale à super-résolution de la morphologie mitochondriale. L’implantation réussie de minipompes osmotiques pour une administration prolongée de médicaments chez la souris est démontrée, et le foie est analysé pour les effets du traitement sur la structure de la membrane externe. Enfin, une chaîne d’analyse pour la mesure quantitative non biaisée et reproductible du volume, de la surface et de la sphéricité mitochondriale, ainsi que pour la classification des mitochondries en différentes structures, est présentée. Ainsi, ces méthodes sont applicables à la fois pour étudier les changements de morphologie mitochondriale tout au long de la vie des mammifères et pour identifier les composés pharmacologiques susceptibles d’atténuer les déclins métaboliques liés au vieillissement.

Protocole

Toutes les procédures impliquant des animaux de recherche ont été réalisées conformément aux directives institutionnelles pour l’utilisation des animaux de laboratoire et ont été approuvées par les comités institutionnels de soins et d’utilisation des animaux de l’hôpital Brigham and Women’s et de la Harvard Medical School sous le protocole n° 2016N000368. Les chercheurs souhaitant appliquer ce protocole dans d’autres pays devraient consulter leurs organismes institutionnels et réglementaires locaux afin de garantir le respect des réglementations applicables sur le bien-être animal.

1. Implantation de la pompe osmotique sous-cutanée

REMARQUE : Les interventions chirurgicales doivent être réalisées uniquement par du personnel expérimenté et formé, et il faut prendre un soin considérable pour minimiser le stress et/ou la souffrance des animaux. Effectuer des procédures impliquant des animaux de recherche uniquement telles que définies dans les protocoles approuvés pour les animaux. Toute recherche concernant l’utilisation d’animaux doit strictement respecter les 3R – Remplacement, Réduction et Raffinement. Ce protocole détaille l’implantation de la pompe osmotique sous-cutanée, qui est classée comme une intervention chirurgicale mineure. Des implantations de pompe osmotique intrapéritonéale peuvent également être réalisées, mais il s’agit d’une procédure plus complexe classée comme une intervention chirurgicale majeure. Il est donc recommandé de réaliser la procédure sous-cutanée sauf s’il existe une solide justification scientifique en faveur de l’implantation intrapéritonéale.

1. Remplissage des pompes osmotiques
   REMARQUE : La préparation des solutions médicamenteuses et le remplissage des pompes osmotiques doivent être réalisés dans un cabinet de biosécurité selon une technique stérile. Les modèles de pompes doivent être choisis en fonction du volume de réservoir souhaité et de la durée de traitement délivrée. Pour cette étude, le modèle 2004 a été utilisé (~200 μL de volume de réservoir, traitement délivré pendant 4 semaines).
   1. Préparez la solution médicamenteuse dans un solvant compatible avec les pompes osmotiques. Référez-vous à https://alzet.com/formulating-the-solution/. Utilisez le débit (μL/h) indiqué sur le lot des pompes osmotiques ordonnées pour déterminer la concentration de médicament nécessaire à la dose quotidienne ciblée.
      REMARQUE : Une solution de 50 % de DMSO v/v et 50 % de PEG₃₀₀ v/v solubilise de manière stable les composés hydrophobes et est compatible avec les pompes osmotiques. Tous les composés et solvants doivent être de qualité pharmaceutique lorsque cela est possible.
   2. Filtrez, stérilizez la solution médicamenteuse à l’aide d’un filtre à seringue de 0,22 μm et conservez-la à température ambiante.
   3. Placez un modérateur de débit dans une pompe et poussez-la jusqu’à ce qu’elle rentre dans un tube microfuge. Ne poussez pas le modérateur de flux complètement vers le bas.
   4. Faites une balance analytique sur un tube microfuge vide, puis enregistrez le poids de la pompe osmotique.
   5. Fixez le tube de remplissage à une seringue de 1 mL et aspirez au moins 1,5 fois le volume du réservoir de la pompe. Enlevez les bulles d’air en tirant le piston vers le bas, en faisant un mouvement de la seringue, puis en la poussant vers le haut jusqu’à ce que du liquide se forme en haut du tube de remplissage.
   6. Retirez le modérateur de débit tout en tenant la pompe droite.
   7. Insérez le tube de remplissage par l’ouverture en haut de la pompe jusqu’à ce qu’il ne puisse plus aller plus loin.
   8. Poussez lentement la ventouse vers le bas tout en tenant la pompe debout. Continuez à remplir jusqu’à ce que la solution apparaisse à la prise. Ensuite, retirez le tube de remplissage et essuyez l’excès de solution avec une lingette délicate.
   9. Insérez le modérateur de débit jusqu’à ce que le bouchon soit à ras avec le dessus de la pompe.
   10. Remettez la pompe remplie dans un tube microfuge et pesez. Déterminez le poids de la solution et vérifiez que le volume de remplissage est au moins 90 % du volume du réservoir (différence de poids en milligrammes ≈ volume en microlitres).
   11. Remplissez un tube conique de 15 mL avec 5 mL de solution saline stérile 1× phosphate tamponnée (PBS) et ajoutez la pompe pré-remplie. Scellez avec un film de paraffine et amorcez la ou les pompes en incubant à 37 °C pendant le temps requis par le modèle des pompes osmotiques. Pour le modèle 2004, il s’agit de 40 h.
2. Préparation du méloxicam
   REMARQUE : Cela doit être réalisé dans un cabinet de biosécurité en utilisant une technique stérile. Le méloxicam, un anti-inflammatoire non stéroïdien (AINS), n’est pas une substance contrôlée mais peut nécessiter une licence de substance contrôlée pour être acquis.
   1. À l’aide d’une aiguille de 27 g et d’une seringue Luer-lok de 3 mL, diluez la bouille de méloxicam de 5 mg/mL à 1 mg/mL en utilisant du PBS stérile dans un flacon en verre stérile de 5 mL. Préparez le jour même et conservez à température ambiante.
3. Préparation du site de chirurgie
   REMARQUE : Il n’est pas nécessaire d’implanter une pompe osmotique à l’intérieur d’un cabinet de biosécurité, ni de maintenir la stérilité lors des interventions chirurgicales. Cependant, le site de la chirurgie doit toujours respecter des normes strictes de propreté et une pratique aseptique. Le site de l’opération doit être propre, sans encombrement et avec peu de passage. Idéalement, il existe à la fois un site de préparation (c’est-à-dire pour le rasage et le frottage) et un site chirurgical (c’est-à-dire pour l’implantation de la pompe).
   1. Désinfectez complètement la zone chirurgicale avec 70 % d’éthanol et séchez avec des essuie-tout.
   2. Allumez le stérilisateur à billes en verre et réglez-le à 250 °C. Laissez chauffer pendant 15 à 30 minutes.
   3. Allumez le vaporisateur et réglez la bouillotte à 65 %. Réglez le poids corporel de l’animal et fixez le pourcentage d’isoflurane à 3,2 %.
   4. Collez une des sondes de température à la surface de la bouillotte. Laissez chauffer la bouillotte à 35–37 °C.
   5. Retirez la seringue vaporisatrice. Enfoncez complètement la languette verte et remplissez d’isoflurane en la connectant à une bouteille d’isoflurane et en tirant vers l’arrière sur la ventouse.
   6. Refixez la seringue au vaporisateur et amorzez la seringue.
   7. Placez une seconde bouillotte sous une cage propre pour la récupération. Placez la cage à moitié sur place, à moitié en détachant du coussin chauffant.
4. Implantation de la pompe
   REMARQUE : Tous les instruments chirurgicaux doivent être nettoyés et autoclavés à l’avance. Pour la stérilisation des outils chirurgicaux entre animaux, un stérilisateur à billes de verre peut être utilisé. Cela ne peut être utilisé que pour des lots allant jusqu’à 5 animaux. Veillez à inclure une bande indicatrice d’autoclave pour vérifier que les paramètres de stérilisation ont été respectés. L’équipement de protection individuelle (EPI) approprié comprend une blouse propre, un masque chirurgical, des gants chirurgicaux stériles et une protection capillaire. Les animaux qui subissent une intervention chirurgicale ne devraient pas être sous la vue des autres animaux.
   1. Attrapez la souris par la base de la queue et placez-la dans la chambre d’anesthésie. Déclipsez les tubes et activez l’écoulement d’isoflurane (3,2 %) vers la chambre. Placez deux feuilles de drapé stérilisées sur le coussin chauffant.
   2. Attendez que la souris se tourne sur le côté et surveillez sa respiration. Lorsque la respiration a ralenti et se relâche, arrêtez l’écoulement d’isoflurane vers la chambre. Fixez les tubes à la chambre et déclipsez les tubes du nez à utiliser. Commencez le flux d’isoflurane (2 %) vers le nez.
   3. Récupérez la souris de la chambre et mettez son nez dans le nez du coussin chauffant. Ajoutez une pommade ophtalmique sur les deux yeux.
   4. Pèse la souris sur une balance puis revenez à la pointe du nez. Déterminez le volume de 1 mg/mL de méloxicam à administrer. Pour une dose de 5 mg/kg, multipliez le poids de la souris en grammes par 5 pour obtenir les microlitres de méloxicam à administrer.
   5. Vaporisez le bouchon du flacon contenant 1 mg/mL de méloxicam avec 70 % d’éthanol, puis essuyez avec une lingette délicate. Ensuite, à l’aide d’une seringue d’insuline de 0,3 mL, prélève le volume correct de méloxicam. Retirez toutes les bulles d’air de la seringue.
   6. Saisir la moule ou attacher la souris d’une main, la tête inclinée vers le bas. Insérez l’aiguille à un angle de 30°–45° dans le quadrant inférieur droit de l’abdomen, avec le biseau orienté vers le haut. Aspirez pour confirmer le bon placement de l’aiguille.
   7. Si aucun aspirat n’est observé, appuyez doucement sur le piston et injectez le méloxicam par voie intrapéritonéale.
   8. Remettez la souris dans le nez et la bouillotte. Raser complètement 150 % de la zone entourant le site d’implantation (milieu à haut du dos) avec une tondeuse chirurgicale. Une fois terminé, aspirez doucement ou brossez les poils de l’animal et jetez la première feuille de drape.
      REMARQUE : Un rasage soigné est nécessaire pour réaliser une chirurgie aseptique. Au minimum, toute incision doit être totalement exempte de poils d’animaux.
   9. Placez la souris de façon à ce que sa tête fasse face au chirurgien. Effectuez un frottage alterné avec de l’iode povidone et 70 % d’éthanol, à l’aide d’applicateurs à pointe de coton, pour un total de 3 applications. Veillez à commencer au milieu de l’incision prévue et à spiraler vers l’extérieur avec les applicateurs à extrémité coton.
   10. Drapez l’animal avec des rideaux chirurgicaux fenestrats stériles et utilisez une technique aseptique appropriée pour porter des gants chirurgicaux.
   11. Avant de faire toute incision, assurez-vous de bien vérifier les réflexes pédaliers en pinçant fermement les deux pieds avec des pinces tissulaires. Ne continuez pas avant plusieurs pressions, il n’y a aucun mouvement. Cela confirme un plan d’anesthésie chirurgicale.
   12. Tendez la peau du milieu de l’omoplate avec des pinces tissulaires et réalisez une incision de 1 cm perpendiculaire à la colonne vertébrale avec de petits ciseaux chirurgicaux iris. Pour obtenir une coupe droite, coupez avec les ciseaux chirurgicaux Iris à un angle de 90° par rapport à la souris.
   13. Utilisez de petites pinces hémostatiques à l’intérieur de l’incision pour étaler le tissu sous-cutané et créer une poche pour la pompe. Assurez-vous que la poche de la pompe est éloignée de l’avant de l’animal et placée légèrement sur le côté. Utilisez les pinces hémostatiques pour desserrer la peau de tous les côtés de l’incision.
   14. Ouvrez l’incision avec la pince tissulaire et insérez la pompe à l’aide de la pince hémostatique. Insérez la pompe avec le modérateur de débit en premier.
       ATTENTION : La pompe doit être insérée de manière à être suffisamment éloignée de l’incision, c’est-à-dire que la peau entourant l’incision ne soit pas sous tension. Si ce n’est pas bien positionné, cela peut entraîner une déhiscence de la plaie. La pompe peut également changer de position pendant la récupération de l’animal.
   15. Avec la pince tissulaire, tendez doucement la peau et tirez les deux côtés de l’incision l’un contre l’autre. En commençant par une extrémité de l’incision, utilisez l’application de pinces pour placer des clips de 7 mm sur toute l’incision (2 à 4 clips peuvent être nécessaires).
   16. Pour les espaces trop petits dans l’incision pour être logés par un autre clip, appliquez une petite quantité d’adhésif tissulaire à l’aide de l’applicateur stérile. Pincez avec les pinces tissulaires.
   17. Tirez doucement et étirez la peau autour de l’incision pour vérifier que la plaie est fermée. Ensuite, coupez le flux d’isoflurane vers le nez et coupez les tubes concernés. Placez les souris dans la cage de récupération sur la bouillotte.
   18. Surveillez complètement la souris jusqu’à ce qu’elle se réveille et soit déambulante. Surveillez fréquemment les animaux pour détecter tout signe de détresse ou de douleur, et gardez-les isolés des autres souris jusqu’à ce qu’ils se rétablissent.
   19. Après 24 heures, réadministrez 5 mg/kg de méloxicam par injection intrapéritonéale. (Optionnel) Pour faciliter la récupération animale, fournissez des compléments d’électro-gel et/ou placez la nourriture sur le sol de la cage.
   20. Après 10 à 14 jours, anesthésiez à nouveau les animaux avec de l’isoflurane, appliquez une pommade ophtalmique et retirez les pinces avec un dissolvant.
       REMARQUE : Les pinces doivent être retirées avant ce délai pour éviter la repousse des poils sur les pinces de la plaie. De plus, toutes les pompes osmotiques ont une durée définie. Assurez-vous soit d’explanter les pompes, soit d’euthanasier les animaux avant la fin de leur période. Pour des périodes de traitement plus longues, plusieurs implantations de pompes peuvent être effectuées consécutivement sur le même animal.

2. Fixation, incrustation et coupe des tissus

1. Fixation des tissus
   REMARQUE : Toutes les procédures animales doivent être réalisées par du personnel expérimenté afin de minimiser le stress et la souffrance des animaux. La chambre d’euthanasie doit être nettoyée et physiquement évacuée entre chaque animal afin d’éliminer tout résiduel de dioxyde de carbone. Pour minimiser le stress, les animaux doivent être euthanasiés dans leurs cages domestiques autant que possible. Enfin, les animaux ne doivent pas être euthanasiés en proximité spatiale ou en vue d’autres souris. Des outils chirurgicaux propres sont nécessaires pour les procédures non de survie, mais ils n’ont pas besoin d’être stériles (c’est-à-dire autoclaves).
   1. Placez la souris dans la chambre d’induction et ouvrez le régulateur jusqu’à ce que le débitmètre atteigne le débit prévu (~40 % à 70 % du volume de la chambre par minute).
   2. Observez la souris pendant toute la procédure, en veillant à ne pas détecter de signes de détresse comme un saut. Surveillez l’arrêt de l’activité respiratoire et maintenez le flux de CO₂ pendant au moins 2 minutes après l’arrêt de l’activité respiratoire. Assurez-vous que le temps total d’exposition au_CO2 soit d’au moins 5 minutes.
   3. Récupérez la souris et effectuez une méthode d’euthanasie secondaire telle que la luxation cervicale.
   4. Épinglez les membres de l’animal sur un morceau de mousse de polystyrène recouvert de papier aluminium à l’aide d’aiguilles 23-G. Humidifier la fourrure en vaporisant avec 70 % d’éthanol.
   5. Fais une petite incision près de la base de l’abdomen et coupe la peau jusqu’au cou. Suivez cette même incision pour ouvrir la cavité corporelle et découpez soigneusement la cage thoracique.
   6. Faites des incisions en forme de U à partir de la base de l’abdomen et fixez la peau à l’aide d’aiguilles 23-G.
   7. Disséquez l’organe concerné et placez-le dans un tube conique de 15 mL pré-rempli de 5 mL de paraformoldéhyde (PFA) à 4 %. Fixez pour 24 heures à 4 °C sur une rôtisseur.
      ATTENTION : La solution PFA est dangereuse. Évitez le contact avec la peau. Un équipement de protection approprié lors de la manipulation comprend une blouse de laboratoire, des gants en nitrile et des lunettes de sécurité.
      REMARQUE : Si le sang doit être perfusé à partir des tissus, et/ou si une fixation par perfusion est souhaitée, effectuer la perfusion cardiaque comme décrit^{précédemment 51}. En fixation par immersion, comme réalisée ici, il peut falloir du temps pour que le fixateur diffuse à travers le tissu, en particulier dans les morceaux plus volumineux. Cela peut modifier la morphologie mitochondriale ; de plus, la fixation sur le PFA peut aussi entraîner une réduction des^{tissus à 52}.
   8. Après 24 heures, retirez la solution de paraformoldéhyde et rincez les mouchoirs dans 10 mL de 1× PBS. Effectuez un total de 3 fois pendant 10 minutes chacune à température ambiante sur un rôtisseur.
   9. Retirez le PBS et immergez les tissus dans 10 mL de saccharose à 30 % pendant 48 heures à 4 °C sur un rôtisseur. L’infiltration de saccharose est complète lorsque le(s) tissu(s) s’enfonce.
      REMARQUE : Pour vérifier que le solvant a été livré à l’animal, mesurez la quantité restante dans la pompe.
2. Implantation des tissus
   REMARQUE : Veillez à bien suivre la localisation et l’orientation des tissus dans les moules.
   1. Remplissez un récipient en mousse de polystyrène avec de la glace sèche et placez une plaque de métal à plat dessus.
   2. Placez les moules sur la feuille de métal et remplissez 2/3 à 3/4 jusqu’au sommet avec un composé à température de coupe optimale (OCT) (substrat d’incrustation de tissu). Faites remonter les bulles d’air soit à la surface, soit aux coins avec une pince fine. Pour accélérer la congélation, placez des granulés de glace sèche directement sur les moules.
   3. Placez un substrat d’incrustation de tissu dans un bateau-peseur et mélangez les tissus dedans. Essayez d’éviter de transporter la solution de saccharose.
   4. Une fois que le milieu d’incrustation de tissu a complètement gelé au fond du moule (il doit être totalement opaque), immergez le tissu à l’intérieur du moule de façon à ce qu’il ne touche aucun côté du moule ni la surface. Place à l’emplacement et à l’orientation souhaités.
   5. Attendez que le substrat d’incrustation de tissu gèle complètement avant de transférer les moules dans un congélateur à -80 °C.
      REMARQUE : (Point de pause) Les tissus intégrés peuvent être stockés pendant au moins 3 mois.
3. Coupe des tissus
   REMARQUE : Pour réduire la variation d’épaisseur de section d’un lot à l’autre, tous les tissus à analyser ensemble doivent être sectionnés en une seule séance.
   1. Récupérez les mouchoirs incrustés du congélateur à -80 °C et placez-les dans un récipient en mousse de polystyrène rempli de glace sèche.
   2. Pré-refroidissez la température de la chambre du cryostat et le support de l’échantillon à -24 °C et -25 °C, respectivement.
   3. Placez une lame de microtome neuve dans le porte-lame, puis insérez la plaque anti-roulis. Pour faciliter le nettoyage, tapez la chambre du cryostat avec des essuie-tout.
   4. Retirez le mandrin de l’échantillon de la chambre du cryostat et réchauffez-le à température ambiante.
   5. Utilisez une lame de rasoir pour découper soigneusement chaque coin du moule de tissu. Écartez-le doucement pour enlever le bloc de tissu qui incruste le substrat.
   6. Appuyez fermement sur le bloc de tissu dans le mandrin de l’échantillon en le tournant d’avant en arrière. Une fois bien collé, placez le porte-échantillon dans la chambre du cryostat pendant quelques minutes pour le congeler.
      REMARQUE : Veillez à placer le bloc de tissu sur le mandrin dans la bonne orientation afin que le tissu soit sectionné dans l’orientation souhaitée.
   7. Une fois que le bloc de tissu est complètement congelé au mandrin à échantillon, placez le mandrin dans le porte-mandrin et serrez-le en place. Déplacez la lame du cryostat juste devant le bloc tissulaire sans le toucher.
   8. Réglez le réglage de la coupe à 50 μm et commencez à couper le bloc jusqu’à ce qu’une coupe transversale complète du tissu soit exposée.
   9. Désélectionnez le réglage de la coupe et réglez l’épaisseur de la section à 20 μm. Coupez quelques tranches à cette épaisseur avant d’abaisser la plaque anti-roulis. Coupez lentement et en douceur ~80 % à 90 % de la section avant de vous arrêter.
   10. Soulevez la plaque antiroulis. Récupérez une lame en verre chargé et appuyez le côté chargé sur la section de tissu à l’emplacement souhaité.
       REMARQUE : Si la section de tissu se roule après avoir soulevé la plaque antiroulis, utilisez les pinceaux fins pour la dérouler.
   11. Retirez le mandrin du porte-mandrin. Retirez le mandrin du cryostat et réchauffez-le à température ambiante. Retirez le bloc de tissu du mandrin et remettez-le dans le moule.
   12. Enveloppez dans du papier aluminium pour éviter que le bloc de tissu ne tombe du moule, puis remettez-le dans le congélateur à -80 °C.
   13. Placez les sections de tissu montées à -20 °C.
       REMARQUE : (Point de pause) Les sections de tissu peuvent être stockées en toute sécurité à -20 °C indéfiniment.

3. Coloration par immunofluorescence

1. Récupérez les cryosections et laissez-les sécher pendant 10 minutes à 37 °C dans un incubateur.
2. Lavez les lames pour éliminer l’excès de substrat tissuaire.
   1. Préparez 1 L de 1× PBS contenant 0,1 % v/v de Triton X-100 (PBS-T)
   2. Remplissez 3 bocaux de teinture avec du PBS-T.
   3. Placez les glissières dans le support de glissières. Immergez des glissants dans un bocal de teinture pendant 10 minutes. Répétez cela un total de 3 fois.
3. Bloquez le tissu pour la coloration.
   1. Tapotez doucement chaque lamiera sur une lingette délicate pour la faire sécher. Posez les glissières suspendues dans une boîte à glissières avec le mouchoir vers le haut.
   2. Préparez une solution bloqueante de 20 mL composée de 1× PBS, 0,3 % en v/v de Triton X-100, et 5 % en va/v d’albumine sérique bovine (BSA).
   3. Pipeter 1 mL de solution de blocage sur chaque lame, en veillant à ce que les tissus soient bien couverts.
   4. Incubez à température ambiante pendant 1 heure.
4. Incubez les tissus avec l’anticorps primaire.
   1. Tapotez doucement chaque lamiera sur une lingette délicate pour la faire sécher. Utilisez un autre essuyage délicat pour évacuer doucement le liquide restant entre les parties de tissu.
   2. Préparez une dilution 1:200 de l’anticorps de lapin α-souris Tom20 dans une solution bloqueante (200 μL par lame)
   3. Au fond de la boîte à diapositives, placez des essuie-tout et humidifiez-les complètement à l’eau.
   4. Posez les glissières suspendues dans la boîte à glissières avec le mouchoir vers le haut. Pipeter 200 μL d’anticorps primaire dilué sur chaque lame, assurant que les tissus sont entièrement couverts.
   5. Découpez des morceaux de film de paraffine d’environ la taille des couvercles à utiliser. Découpez 1 morceau de film de paraffine pour chaque diapositive.
   6. Placez chaque morceau de film de paraffine sur chaque lame pour répartir la dilution des anticorps sur les sections tissulaires. Fermez la boîte à lames et étouffez à 4 °C toute la nuit.
5. Lavez les lames après incubation avec l’anticorps primaire.
   1. Remplissez 3 bocaux de teinture avec du PBS-T. Récupérez les lames et retirez des morceaux de film de paraffine.
   2. Placez les glissières dans le support de glissières. Immergez des glissants dans un bocal de teinture pendant 10 minutes. Répétez cela un total de 3 fois.
6. Incubez les lames dans l’anticorps secondaire.
   REMARQUE : Pour confirmer le marquage spécifique des mitochondries, préparez au moins une lame de chaque groupe colorée uniquement avec l’anticorps secondaire.
   1. Tapotez doucement chaque lamiera sur une lingette délicate pour la faire sécher. Utilisez un autre essuyage délicat pour évacuer doucement le liquide restant entre les parties de tissu.
   2. Préparez une dilution à 1:200 de l’anticorps Alexa Fluor 568 α-lapin de chèvre et 5 μg/mL 4′,6-diamidino-2-phénylindole (DAPI) en solution bloqueante (200 μL par lame).
   3. Posez les glissières suspendues dans la boîte à glissières avec le mouchoir vers le haut. Pipeter 200 μL d’anticorps secondaire dilué sur chaque lame, assurant ainsi que les tissus sont entièrement couverts.
   4. Découpez des morceaux de film de paraffine d’environ la taille des couvercles à utiliser. Découpez 1 morceau de film de paraffine pour chaque diapositive.
   5. Placez un morceau de parafilm sur chaque lame pour répartir la dilution des anticorps sur les sections tissulaires. Fermez la boîte à lames et faites couver à température ambiante pendant 4 heures, ou à 4 °C pendant la nuit.
7. Lavez les couvertures de la chambre.
   REMARQUE : Utilisez des pinces en plastique pour ramasser et manipuler les gaines de couverture
   1. Placez les couvertures une à une dans un bécher rempli d’eau chaude du robinet et d’une lessive pour verrerie, comme Contrad 70. Couvrez avec un morceau de film de paraffine.
   2. Sonice pendant 30 minutes dans un sonicateur de bain.
   3. Rincez plusieurs fois à l’eau chaude du robinet. Puis rincez plusieurs fois dans de l’eau double distillée. Sonicez pendant 15 minutes dans le dernier rinçage à l’eau double distillée.
   4. Placez les couvertures dans 70 % d’éthanol et stockez-les. Lorsque vous êtes prêt à monter les couverneaux, retirez-les de l’éthanol à 70 % et laissez-les sécher à l’air libre dans une hotte à fumée.
8. Lavez les lames après incubation avec l’anticorps secondaire.
   1. Remplissez 3 bocaux de teinture avec du PBS-T. Récupérez les lames et retirez des morceaux de film de paraffine.
   2. Placez les glissières dans le support de glissières. Immergez des glissants dans un bocal de teinture pendant 10 minutes. Répétez cela un total de 3 fois.
   3. Tapotez doucement chaque lamiera sur une lingette délicate pour la faire sécher. Utilisez un autre essuyage délicat pour évacuer doucement le liquide restant entre les parties de tissu.
9. Montez les couvertures de la chambre.
   1. Ajoutez 2 à 3 gouttes réparties uniformément de montant antidéfade sur une glissière.
   2. Pour éviter les bulles d’air, prenez un couvercle #1.5 nettoyé et maintenez-le à un angle de 45° par rapport à la glissière le long de l’axe long. Inclinez doucement et lentement la toboggane sur la glissade. Répétez pour toutes les diapositives.
   3. Laissez les lames durcir pendant 18 à 60 heures à température ambiante tout en étant protégées de la lumière.
   4. Conserver les lames à 4 °C protégées de la lumière.
      REMARQUE : (Point de pause) Les lames peuvent être imagées soit immédiatement après la période de durcition, soit jusqu’à 1 mois lorsqu’elles sont stockées à 4 °C. Il n’est pas nécessaire de sceller les bords. Veillez à utiliser des couvercles #1,5 ou #1,5H, car d’autres épaisseurs introduiront une aberration sphérique et peuvent réduire la qualité d’image. N’utilisez pas de supports de montage avec DAPI, car DAPI a de larges spectres d’excitation et d’émission. Le temps de durcissement dépend de l’épaisseur de l’échantillon ; ici, 48 h.

4. Imagerie super-résolution

REMARQUE : Ce protocole utilise un confocal LSM 980 à balayage ponctuel ZEISS Airyscan2 construit autour d’un ZEISS Axio Observer Z1 et équipé de deux tubes photomultiplicateurs multi-alcalins (PMT) et d’un détecteur spectral GaASP à 32 canaux, d’un boîtier environnemental et d’un objectif de contraste d’interférence différentielle d’huile (DIC) III Plan Apo 63×/1.4.

1. Organiser l’acquisition.
   1. Ajoutez une seule piste Airyscan SR et sélectionnez le fluorophore approprié.
   2. Sélectionnez la plaque de 10" et les filtres passe-bande d’émission appropriés.
      REMARQUE : La plaque de 10" est spécifique à ce microscope, car elle est également équipée de détecteurs infrarouges (IR).
   3. Sélectionnez le(s) laser(s) approprié(s). Réglez les critères d’échantillonnage de Nyquist à 2 en cliquant sur SR (la taille des pixels doit être ajustée à 0,05 μm).
   4. Cliquez sur « live » et alignez le détecteur Airyscan (sélectionnez la fonction d’alignement en direct). Cliquez sur arrêter une fois que l’intensité est localisée au centre de l’icône du détecteur et une fois que le détecteur est vert.
      REMARQUE : Si tout est configuré correctement, un message sur le côté gauche du logiciel indiquant « Airyscan les paramètres sont optimisés avec succès » devrait apparaître.
   5. Relance en direct et ajuste l’intensité du laser pour qu’il y ait un signal correct mais pas de pixels saturés (clique sur l’indicateur de distance). Cliquez sur arrêter une fois optimisé.
      1. (Optionnel) Pour augmenter le signal sans ajuster la puissance du laser, augmentez le gain.
2. Effectuer l’acquisition de données.
   1. Cliquez sur z-stack et vérifiez que la taille du pas est réglée à 0,1 μm (ajustez si ce n’est pas le cas).
   2. Cliquez sur live et définissez les bornes inférieure et supérieure de la pile z.
   3. Cliquez sur démarrer l’expérience.
   4. Une fois la pile z collectée, allez dans l’onglet Airyscan sous l’image et cliquez sur traiter 3D. Maintenez cohérents les paramètres du filtre de Weiner de débruit utilisés ici entre les différentes répliques et groupes de traitement.
   5. Sauvegardez la pile z-stack Airyscan traitée.
      REMARQUE : Si deux pistes Airyscan SR sont utilisées, assurez-vous que le microscope change de piste à chaque image.

5. Création d’un pipeline automatisé pour quantifier la morphologie mitochondriale

REMARQUE : Ce protocole décrit le développement d’un pipeline automatisé d’analyse d’images pour la quantification 3D de la morphologie mitochondriale à l’aide du logiciel ZEISS arivis Pro 4.1.2.

1. Convertir les fichiers .czi traités par Airyscan en format .sis à l’aide de l’outil de conversion arivis.
   REMARQUE : Si l’image complète est grande et que le temps de traitement est trop long lors de l’optimisation des paramètres, recadrez une petite sous-région représentative de l’image pour l’utiliser comme référence de travail afin d’optimiser les réglages. Cette image recadrée doit inclure à la fois des mitochondries bien isolées et des régions à densité plus élevée, afin de représenter avec précision le champ d’image complet. Une fois la segmentation satisfaisante obtenue sur l’image recadrée, le pipeline optimisé peut alors être appliqué à l’ensemble complet de l’image. Cette approche fera gagner du temps de manière significative et facilitera l’ajustement de tous les paramètres sans compromettre la qualité du pipeline.
2. Mettez en place et optimisez le pipeline.
   1. Ouvrez une image représentative (par exemple, issue du groupe de contrôle) dans le logiciel.
   2. Sélectionnez le canal d’immunofluorescence Tom20 comme entrée pour analyse.
   3. Appliquez une étape de débruixement avant la segmentation. Ici, l’algorithme d’amélioration des particules a été utilisé, avec un diamètre de 5,42 et une intensité de 0,5.
      REMARQUE : Le filtre d’amélioration des particules est un algorithme de réduction du bruit préservant la structure, conçu pour amplifier des objets compacts, grossièrement sphériques ou allongés tout en supprimant le bruit de fond. Elle agit en augmentant l’intensité locale à une échelle spatiale (diamètre) spécifiée, ce qui la rend particulièrement adaptée aux mitochondries, qui apparaissent sous forme de particules ou de tubules isolés et lumineux sur un fond sombre. Si la valeur du paramètre de diamètre est fixée trop petite, cela augmentera le bruit, tandis qu’une valeur trop grande brouillera les objets adjacents entre eux. Le paramètre de force contrôle le degré d’amélioration, où des valeurs élevées augmentent l’amplification du signal mais peuvent introduire des artefacts si elles sont réglées trop haut. Commencez par les valeurs par défaut et ajustez tout en inspectant visuellement la sortie sur une région représentative d’intérêt. Plusieurs méthodes de débruit sont disponibles dans arivis Pro. Le lissage gaussienne est une option simple et rapide qui réduit uniformément le bruit de haute fréquence mais peut flouter les détails structurels fins. Le filtrage en médiane est meilleur pour préserver les bords tranchants tout en éliminant le bruit de sel et de poivre. L’amélioration des particules (utilisée ici) est préférée lorsque l’objectif est de détecter des objets fluorescents discrets, car elle amplifie sélectivement le signal provenant de structures correspondant à la plage de taille spécifiée. Pour les images avec un faible rapport signal/bruit ou une hétérogénéité de fond significative, un passage de réduction du bruit plus fort peut être justifié. Il est recommandé de tester deux ou trois méthodes sur la même image représentative et de comparer la qualité de segmentation en aval.
   4. Segmentez les mitochondries individuelles à l’aide de l’algorithme Blob Finder, qui détecte les objets dans l’espace 3D.
   5. Ajustez les paramètres de segmentation, y compris la taille de l’objet et le seuil de sensibilité, et inspectez visuellement le chevauchement entre les objets détectés et l’image dénuée de bruit afin d’assurer une segmentation précise. Ici, les paramètres suivants ont été utilisés : un diamètre de 0,244 μm, un seuil de probabilité de 25 %, et une sensibilité de répartition de 22,22 %, avec la normalisation réglée au premier point de départ.
      REMARQUE : Les paramètres de segmentation dépendent de la résolution de l’image et de la taille des voxels. Dans cette étude, les dimensions de l’image étaient de 1354 × 1354 pixels, avec une taille de pixel XY de 0,049 μm et une taille de voxel de 0,049 × 0,049 × 0,100^{μm 3}.
3. Effectuez l’extraction des caractéristiques et le contrôle qualité.
   1. Extraire les paramètres morphologiques de chaque objet détecté, y compris le volume (μm³), la surface (μm²) et la sphéricité (surface d’une sphère ayant le même volume/surface que les mitochondries).
   2. Exportez les objets segmentés sous forme de fichiers TIFF pour validation visuelle.
   3. Ouvrez les fichiers exportés en FIJI ou arivis et superposez-les avec l’image originale pour une inspection visuelle de la précision de segmentation.
   4. Exportez les mesures quantitatives sous forme de fichiers de tableaux individuels pour chaque échantillon.
4. Appliquer le pipeline.
   1. Sauvegardez le pipeline optimisé. Un exemple de pipeline se trouve dans le Fichier Supplémentaire 1.
   2. Appliquer le pipeline à des images supplémentaires provenant de tous les groupes expérimentaux de l’étude.
   3. Affiner itérattivement les paramètres de segmentation si nécessaire afin d’assurer une performance cohérente entre tous les groupes expérimentaux.
   4. Une fois finalisé, appliquer le pipeline en mode batch à toutes les images de l’étude.
5. Effectuer une analyse de données
   1. Importez les données exportées dans RStudio (version 4.3.2) pour une analyse statistique.
   2. Si ce n’est pas installé, installez les paquets : readxl, dplyr, tidyr, purrr, ggplot2, ggpubr, patchwork, scales, randomForest, caret, umap, factoextra, RColorBrewer, mclust, outliers, et tidyverse.
   3. Téléchargez le script (Fichier Supplémentaire 2) pour fusionner tous les ensembles de données, filtrer les données (voir ci-dessous), tracer les valeurs de volume, de surface et de sphéricité, et analyser les mitochondries segmentées pour obtenir les proportions de sous-types par échantillon.
   4. (Optionnel) Filtrez les mitochondries segmentées en fonction du volume pour exclure les artefacts de segmentation et le bruit.
      1. Pour déterminer les filtres appropriés, inspectez visuellement les distributions de volume.
         REMARQUE : Tous les échantillons ont montré un pic marqué à de très faibles volumes (en dessous de 0,0003^{μm 3}), cohérent avec un bruit de segmentation plutôt qu’avec de véritables mitochondries.
      2. Pour identifier la borne inférieure, évaluez la rétention des particules à travers les seuils candidats (0,0009, 0,003, 0,005, 0,007 et 0,01^{μm 3}). La baisse la plus marquée du nombre de particules s’est produite sous 0,003^{μm 3}, ce qui indique que la plupart des particules de bruit se situent dans cette plage. L’inspection visuelle a confirmé que 0,003^{μm 3} correspondait au bord droit du pic de bruit.
      3. Pour la borne supérieure, les distributions se sont naturellement effilées bien en dessous de 10^{μm 3} ; fixer cette limite pour exclure les grands objets artefactuels tels que les réseaux mitochondriaux sur-segmentés. Le filtrage final a conservé des particules de volumes compris entre 0,003 et 10^{μm 3}.
         REMARQUE : Ce script calcule les valeurs médianes par échantillon sur toutes les mitochondries détectées et utilise ces valeurs comme unité d’analyse. Cette approche explique la non-indépendance des mitochondries individuelles au sein d’un même échantillon biologique.

Résultats

Le protocole décrit ci-dessus a été réalisé (Figure 1) sur des souris mâles UM-HET3 de 20 mois. Les souris ont reçu soit un véhicule (Contrôle), soit un cocktail de reprogrammation chimique (Traité) à l’aide de minipompes osmotiques^{modèle 2004 53}. Les foies ont ensuite été sectionnés et imagés sur un microscope confocal Airyscan2 avant de traiter les piles z à l’aide du pipeline d’analyse.

Les images de fluorescence 3D ont été traitées et analysées à l’aide du logiciel ZEISS arivis Pro 4.1.2. Avant la segmentation des mitochondries, l’algorithme d’amélioration des particules était appliqué pour réduire le bruit des images et éliminer le fond de fond, la lumière floue, l’autofluorescence et/ou la fluorescence provenant d’une liaison non spécifique. L’amélioration des particules amplifie sélectivement le signal à partir d’un diamètre donné. Après la réduction du bruit, les mitochondries individuelles ont été segmentées en 3D à l’aide de l’algorithme Blob Finder, qui détecte les objets en fonction des maxima d’intensité locales dans une plage de taille définie. Enfin, la segmentation d’objets réduit chaque tranche 2D à une image binaire.

Pour illustrer le flux de travail de segmentation, la Figure 2 présente des tranches optiques représentatives à chaque étape du pipeline de traitement pour les échantillons de contrôle et traités. L’image brute de fluorescence montre le signal Tom20 non traité, qui contient un mélange de fluorescence mitochondriale spécifique et de fond indésirable, de lumière floue et d’autofluorescence. Après application du débruit par amplification particulaire, le signal de fond a été considérablement réduit, et la fluorescence restante est confinée à des structures discrètes et bien définies (Figure 2). Cela permet une représentation plus propre des frontières mitochondriales, facilitant une segmentation précise.

La sortie de la segmentation du Blob Finder est affichée en vert. Pour confirmer que les z-stacks sont précisément segmentées, les tranches 2D dénoiseisées avec les images binaires segmentées associées ont été superposées (Figure 2). Si le processus de segmentation est suffisamment optimisé, une co-localisation forte et cohérente de la fluorescence mitochondriale avec les objets binaires doit être observée. Si le processus de segmentation est sur-segmenté (c’est-à-dire diviser des mitochondries individuelles en plusieurs objets) ou sous-segmenter (c’est-à-dire combiner plusieurs mitochondries en une seule), ajustez les paramètres de segmentation. L’inspection visuelle des inserts confirme une segmentation de haute qualité : les objets détectés co-localisent précisément avec le signal de fluorescence Tom20 dénouffé, sans preuve de sur-segmentation, de surdimensionnement des objets, de fusion inappropriée de mitochondries spatialement adjacentes en objets uniques, ou de génération d’objets spuries dans des régions sans signal Tom20. Ce niveau de fidélité de segmentation a été systématiquement atteint à la fois sur les échantillons Contrôle et Traité, démontrant que les paramètres de pipeline optimisés dans le logiciel ZEISS arivis sont robustes et généralisables au sein des groupes expérimentaux. Ensemble, ces résultats valident l’approche de segmentation et soutiennent la fiabilité des mesures morphologiques qui en sont déduites.

Les objets segmentés peuvent être mesurés pour des paramètres mitochondriaux tels que le volume, la sphéricité et la surface (Figure 3). Pour tenir compte du grand nombre de mitochondries détectées par échantillon biologique et de l’indépendance des organites individuels au sein d’une cellule, des valeurs médianes par échantillon ont été calculées et utilisées comme unité de comparaison statistique. Les différences entre groupes ont été évaluées à l’aide du test de Wilcoxon. Les échantillons traités présentaient un volume et une surface mitochondriales significativement plus élevés que les témoins, indiquant que la reprogrammation chimique induit un remodelage substantiel de la morphologie mitochondriale.

Enfin, les mitochondries segmentées peuvent être classées en différents sous-types^54,55 (Figure 4). La méthode du^{coude 56} a été utilisée pour déterminer le nombre optimal de clusters pour le regroupement k-means ^57,58 (Figure 4A). Ensuite, en utilisant k = 4 groupes, des sous-échantillons aléatoires de mitochondries pour les groupes Témoins et Traités ont été tracés via une réduction de dimensionnalité par approximation uniforme de variété et projection (UMAP) (Figure 4B), colorié à la fois par sous-type mitochondrial (à gauche) et par groupe de traitement (à droite). Enfin, les proportions de chaque sous-type mitochondrial (Figure 4C) pour les groupes témoins et traité ont été tracées. Dans le groupe traité, il y avait moins de mitochondries fragmentées mais pas de changement significatif dans la proportion de mitochondries en réseau ou allongées.

Figure 1 : Aperçu du protocole. Les souris sont traitées avec des médicaments ou un véhicule pendant jusqu’à 6 semaines grâce à l’implantation d’une minipompe osmotique sous-cutanée (1). Après traitement, les tissus de la souris sont fixés, infiltrés dans le saccharose, intégrés dans un composé OCT et cryocésés (2). Les coupes tissulaires sont ensuite colorées avec des anticorps contre le Tom20 et des anticorps secondaires marqués avec Alexa Fluor 568 (3). Les z-stacks à super-résolution sont collectés sur un microscope confocal à balayage ponctuel Airyscan2 (4), et les z-stacks traités déno-bruit sont segmentés en arivis pour quantifier la morphologie mitochondriale (5). Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figurine.

Figure 2 : Pipeline automatisé pour la segmentation mitochondriale et l’analyse morphologique.
Des tranches optiques uniques représentatives provenant d’échantillons de contrôle (panneaux supérieurs) et traités (panneaux inférieurs). Le signal d’immunofluorescence Tom20 est affiché en gris (à gauche). La même image après le débruit est affichée en gris, suivie de la sortie de segmentation mettant en évidence en vert les objets mitochondriaux détectés. L’image fusionnée montre le chevauchement entre le signal détamisé et les objets segmentés. Les inserts montrent des vues à grossissement plus élevé des régions indiquées, illustrant les effets du débruit et la précision de la segmentation. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figurine.

Figure 3 : Morphologie mitochondriale chez les groupes témoins et traité. Les diagrammes de boîte montrent la médiane ± la plage interquartile des valeurs médianes par échantillon (n = 10 par groupe). Chaque point représente un échantillon biologique, résumé par la médiane de toutes les mitochondries détectées dans cet échantillon. Le volume et la surface sont affichés à l’échelle_logarth-10. Les groupes ont été comparés à l’aide des tests de somme des rangs de Wilcoxon. Niveaux de signification : ns p ≥ 0,05, **p < 0,01, ***p < 0,001. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figurine.

Figure 4 : Classification morphométrique non supervisée des sous-types mitochondriaux. (A) Graphique coude montrant la somme totale des carrés à l’intérieur du groupe (WSS) en fonction du nombre de grappes (k), calculée sur un sous-échantillon aléatoire de 10 000 mitochondries. Le point d’inflexion à k = 4 a été sélectionné comme nombre optimal de clusters pour l’analyse en aval. (B) (à gauche) Réduction de dimensionnalité UMAP des caractéristiques morphométriques mitochondriales (n = 20 000 mitochondries échantillonnées au hasard), colorée par sous-type assigné. Quatre sous-types morphologiquement distincts ont été identifiés : fragmentés (petits, très sphériques), allongés (longs, faibles sphéricités), en réseau (grands, irréguliers) et intermédiaires. (À droite) Projection UMAP coloriée par groupe expérimental (Contrôle vs. Traité) montrant la répartition de chaque groupe dans l’espace morphologique. (C) Proportions par échantillon de chaque sous-type mitochondrial dans chaque groupe expérimental. Chaque point de données représente un échantillon biologique (n = 10 par groupe). Les boîtes graphiques montrent la plage interquartile et la médiane, avec des moustaches s’étendant jusqu’à 1,5 fois la plage interquartile. Les proportions de sous-types ont été comparées entre groupes à l’aide du test de la somme des rangs de Wilcoxon, et les valeurs p ont été corrigées pour les comparaisons multiples à l’aide de la méthode de Benjamini-Hochberg. ns p ≥ 0,05, ****p < 0,0001. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figurine.

Fichier supplémentaire 1 : Exemple de pipeline arivis. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.

Fichier supplémentaire 2 : script R pour quantifier la morphologie mitochondriale et les populations de sous-types.Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.

Discussion

Les deux étapes les plus cruciales pour réussir ce protocole sont (i) la fermeture de l’incision lors de l’implantation de la pompe osmotique, et (ii) la segmentation précise. Pour le premier cas, prenez un soin particulier de créer une poche sous-cutanée suffisamment grande pour la pompe, mais pas trop grande pour que la pompe puisse glisser le long du flanc de l’animal. Lorsque l’incision est fermée, la pompe doit être placée suffisamment éloignée pour ne pas induire de tension sur la peau environnante, ce qui pourrait entraîner une déhiscence. Veillez à tirer sur la peau entourant l’incision fermée dans toutes les directions afin de vérifier que la plaie est suffisamment fermée avant d’entamer la récupération animale. Les clips de plaie sont avantageux car ils sont rapides à appliquer et à retirer. Cependant, si des problèmes surviennent dus à une incapacité à fermer correctement les incisions, des points de suture interrompus peuvent être utilisés à la place. Pour ce dernier, une segmentation précise nécessite de comparer constamment les résultats de la segmentation avec les images dénoiseisées jusqu’à ce qu’il y ait suffisamment de similarité d’image. Les Z-stacks d’animaux témoins et traités doivent être prélevés en utilisant les mêmes paramètres de collecte et de préférence lors de la même séance d’imagerie. De même, toutes les étapes de traitement doivent être appliquées à toutes les images en utilisant exactement les mêmes paramètres. Le paramètre de segmentation du diamètre définit la taille attendue des objets à détecter. Un bon point de départ est la largeur mitochondriale moyenne mesurée à partir de quelques objets inspectés manuellement à l’aide d’une tranche optique. Le seuil de probabilité contrôle la confiance minimale de détection requise pour qu’un objet soit accepté. Des valeurs plus basses augmentent la sensibilité et détectent plus d’objets, mais certains de ces objets peuvent être faux. Inversement, des valeurs plus élevées améliorent la spécificité mais peuvent entraîner la perte d’objets à signal plus faible. Une plage de départ recommandée est de 25 % à 30 %. Enfin, la sensibilité fractionnée régit la manière dont les objets touchants ou qui se chevauchent sont séparés en objets individuels. Une faible sensibilité à la division laissera les mitochondries regroupées comme des objets fusionnés uniques. En revanche, une forte sensibilité à la scission peut entraîner une sur-division des mitochondries allongées ou ramifiées en fragments. Des valeurs comprises entre 15 % et 30 % sont raisonnables pour les études morphologiques mitochondriales typiques. Si la segmentation précise reste difficile, la segmentation peut être réalisée à l’aide de l’analyseur de^{mitochondries 59} dans FIJI⁶⁰. Un pipeline semi-automatisé pour la quantification des morphologies mitochondriales dans les cellules et les tissus utilisant le logiciel Huygens Professional et un script Python personnalisé a également été récemment^{décrit 61}.

Une limitation est la limite de résolution du microscope confocal Airyscan2, qui est de ~150 nm en XY et ~350 nm dans le plan Z. Cela empêche l’imagerie haute résolution des cristes mitochondriales, car les distances entre les cristes individuelles sont de ~40 à 120^nm 62,63,64. En revanche, la déplétion d’émission stimulée (STED) peut atteindre des limites de résolution de ~20–50 nm latéralement et distinguer clairement les cristes mitochondriales^{individuelles} 62,63,64. Plusieurs colorants STED ont récemment été développés permettant une coloration et une imagerie efficaces de la membrane interne mitochondriale, tant dans les cellules vivantes que^fixes 63,64,65. Étant donné que l’analyse des morphologies des cristes peut fournir des éclairages sur la santé bioénergétique mitochondriale¹⁰, de telles données sont donc souhaitées. Cependant, la morphologie mitochondriale diffère fortement entre les tissus des mammifères et la culture cellulaire (discutée en profondeur ci-dessous), et il n’existe actuellement aucune méthodologie pour colorer la membrane interne des tissus pour l’imagerie STED et l’analyse des structures des cristes.

La quantification de la morphologie mitochondriale dans un tissu intact présente des défis uniques par rapport aux systèmes de culture cellulaire. Dans les cellules cultivées, les mitochondries sont généralement réparties dans tout le cytoplasme dans des réseaux bien séparés avec un chevauchement minimal entre les cellules. Dans les coupes tissulaires ou les préparations à montage complet, cependant, les cellules sont densément regroupées et leurs limites ne sont pas bien définies. Si une analyse au niveau cellulaire est nécessaire, un marqueur fluorescent supplémentaire ciblant la membrane plasmique ou un marqueur spécifique au type cellulaire doit être intégré, ainsi qu’une étape de segmentation correspondante dans le pipeline d’analyse d’images pour définir les limites cellulaires individuelles avant la quantification de la morphologie mitochondriale. Une deuxième différence importante est que, dans les cellules cultivées, les mitochondries forment souvent des réseaux réticulaires continus et interconnectés, faciles à visualiser et à interpréter. Dans les tissus, ce schéma est rarement observé. Par exemple, les mitochondries issues de sections hépatiques présentent un motif de ponctuel, de bâtonnet et de faisceau qui occupe l’ensemble du^{cytosol 66}. Cependant, les hépatocytes en culture présentent des morphologies tubulaires avec des formations nettes^{en réseau 66}. De même, en comparant les mitochondries issues de tissus lisses à celles des cellules musculaires lisses en culture, on observe des différences distinctes dans leurs morphologies et leurs schémas^{de réseau 67}. L’architecture tridimensionnelle, combinée aux différences spécifiques au type cellulaire dans la distribution mitochondriale, fait apparaître les mitochondries de ces tissus comme des points discrets densément compacts ou de courts fragments plutôt que comme des réseaux allongés. Par conséquent, une interprétation prudente des données est justifiée lors de la comparaison des caractéristiques morphologiques entre les tissus et la culture cellulaire, car les différences entre les deux peuvent être en partie attribuables au contexte d’imagerie plutôt qu’à une véritable variation biologique.

Un point fort de ce protocole est la capacité à mesurer quantitativement les structures mitochondriales des tissus à l’aide de la microscopie optique. Bien qu’il existe d’autres méthodes pour quantifier la morphologie mitochondriale à partir d’images de microscopie optique à super-résolution, beaucoup d’entre elles ne conviennent qu’aux cellules en culture. De plus, contrairement à d’autres méthodes d’analyse, le pipeline présenté ici est entièrement automatisé, quantifie à la fois les dimensions mitochondriales et les proportions de sous-types, et nécessite peu d’expérience en codage pour être exécuté avec succès. La microscopie électronique à balayage/transmission (SEM/TEM) et la cryo-ET ont déjà été utilisées pour imager les structures mitochondriales dans des tissus en 2D et^{3D 10, 68, 69}. Cependant, pour le premier, des inquiétudes subsistent quant à la préservation des structures indigènes après fixation d’échantillons, déshydratation et incorporation^70,71. De plus, la mesure manuelle des paramètres mitochondriaux dans FIJI⁶⁰ est parfois la méthode d’analyse privilégiée pour les images^{TEM 72}, ce qui nécessite un travail important et peut entraîner un biais d’échantillon. Cependant, des méthodes d’apprentissage profond pour la quantification automatisée des morphologies mitochondriales à partir d’images TEM ont été récemment^{décrites 73,74}. Un avantage de l’approche présentée est qu’une fois le pipeline d’analyse établi, il peut traiter en lots des images avec peu ou pas d’intervention utilisateur. Pour ce dernier, la congélation à haute pression peut préserver les structures tissulaires dans des conditions proches^{de la nativité 75}. Cependant, la congélation des échantillons cryo-ET, le sectionnement, le fraisage, la collecte et le traitement des données nécessitent tous une formation approfondie et des équipements très avancés. En revanche, la microscopie confocale à super-résolution est relativement plus accessible et nécessite moins de formation et de ressources pour être réalisée avec succès.

Les implantations de pompes osmotiques peuvent être réalisées en toute sécurité chez des souris âgées afin d’évaluer les effets de différents composés pharmacologiques sur les déclins physiologiques liés au vieillissement. De plus, les méthodes décrites ici sont généralisables à de nombreux organes différents. Il est bien caractérisé que les déclins métaboliques liés au vieillissement contribuent à la maladie et proviennent d’un dysfonctionnement mitochondrial, l’un des signes familiers du^{vieillissement à 76} ans. De plus, il est compris que les structures mitochondriales informent la capacité bioénergétique mitochondriale et son état^{métabolique 77,78}. Ainsi, l’évaluation quantitative des composés pour leurs effets sur la structure mitochondriale lors du vieillissement de la chiot, en utilisant les méthodes décrites ici, peut aider à identifier des traitements susceptibles de prolonger la durée de la santé humaine.

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Microscope confocal à balayage de points Airyscan2	ZEISS	LSM 980 avec Airyscan2	Microscope confocal ZEISS LSM 980 à balayage de points construit autour d'un ZEISS Axio Observer Z1 et équipé de deux PMT multi-alcalis et d'un détecteur spectral GaASP à 32 canaux, d'une enceinte environnementale et d'une objectif Plan Apo 63×/1.4 Oil DIC III. Le microscope utilisé dans cette étude est également équipé de deux détecteurs NIR externes, ainsi que des lignes laser suivantes : 405, 458, 488, 514, 561, 594, 639 et 730 nm.
Feuille d'aluminium	Essendant	BWK712
Balance analytique	Mettler Toledo	MR204
Plaque de verre anti-rouleau	Gel Company	LGI70
Logiciel Arivis Pro	ZEISS	Version 4.1.2
Sonicateur de bain	Branson Ultrasonics	71020-MT
Albumine de sérum bovin	Research Products International	A30075
Tubes de centrifugeuse, 15 mL	CELLTREAT	229411
Lamelles de microscope chargées	Globe Scientific	1358W
Pince pour décapsuler	Alzet	0009976
CO2	Airgas	CD 50
Contrad 70	Decon Labs	1003
Applicateurs à bout en coton	Puritan Medical	25-8061WC
Cryostat	Leica Biosystems	CM3050 S
Lames de cryostate	Sakura Finetek USA Inc	4689
DAPI	Sigma-Aldrich	D9542	Préparez à 5 mg/mL dans du ddH2O, répartissez en aliquotes et conservez à -20 °C à l'abri de la lumière
Dimethyl sulfoxide	Sigma-Aldrich	D2650
Système de coloration de lame EasyDip	Electron Microscopy Services	71388-01
Electro-Gel	Bio-Serv	EGS-1
Moules d'enrobage, 22 mm ´ 22 mm ´ 20 mm	Polysciences	18646A-1
Ethanol, 200 proof	Decon Labs	V1001
Feuilles de draps stériles fenestrés	Dukal	20001
Pince fine	Fine Science Tools	11445-12
Stérilisateur à billes de verre	VWR	75999-324
Goat anti-rabbit Alexa Fluor 568	Invitrogen	A-11036
Tapis chauffant	CVS	215313
Pince hémostatique	World Precision Instruments	501705
Huile d'immersion Immersol 518 F	ZEISS	433802-9010-000
Chambre d'induction	World Precision Instruments	EZ178
Seringues d'insuline, 0,3 mL	BD	328431
Ciseaux chirurgicaux Iris	Sklar Surgical Instruments	47-1135
Isoflurane	Patterson Veterinary	07-890-8115
Kimwipes	Kimberly-Clark	34120
Seringues Luer-Lok de 1 mL	BD	309628
Seringues Luer-Lok de 3 mL	BD	309657
Seringues Luer-Lok de 50 mL	BD	309653
Meloxivet (méloxicam)	Patterson Veterinary	07-894-8524
Tubes de microcentrifugation, 1,5 mL	CELLTREAT	229443
Boîte de lames de microscope	Heathrow Scientific	15994E
Verre de couverture de lame de microscope, #1,5, 22 mm ´ 50 mm	Electron Microscopy Services	72204-04
Incubateur non-CO2	Benchmark Scientific	H2200-H
Feuilles de draps stériles non fenestrés	Dukal	20-002
Composant OCT	Sakura Finetek USA Inc	4583
Pommade ophtalmique	Patterson Veterinary	07-888-2572
Minipompes osmotiques	Alzet	2004
Parafilm	Bemis	PM999
Paraformaldéhyde, 4% p/v	Santa-Cruz Biotechnology	sc-281692
PBS, 1´	Thermo Scientific	10010023
PEG300	Sigma-Aldrich	90878
Filtres de seringue PES, 0,22 µm	CELLTREAT	229747
Bâtonnets de povidone iodée 10% USP	Medline	MDS093901ZZ
ProLong Glass Antifade	Invitrogen	P36980
Anticorps anti-Tom20 de lapin	Novus Biologicals	NBP2-67501
Lames de rasoir, 0,22 mm	VWR	55411-050
Rotateur/rotisserie	Labnet	H5500
RStudio	The R Project for Statistical Computing	version 4.3.2
Balance	Fisher Scientific	S72422
Système d'anesthésie à faible débit SomnoSuite	Kent Scientific	SS-01
Bandes indicatrices de stérilisation à la vapeur	Crosstex	SIS-250
Fioles en verre stériles, 5 mL	Thermo Scientific	ST5
Aiguilles stériles, 0,5", 23 G	BD	305145
Aiguilles stériles, 0,5", 27 G	BD	305109
Sacs de stérilisation	Cardinal Health	92510