Nous présentons ici un protocole de dissection permettant de préserver la glande pinéale, souvent perdue lors du retrait du cerveau de la cavité crânienne. Ce protocole garantit la conservation de la glande pinéale dans les préparations de cerveau de souris embryonnaires et postnatales précoces pour des applications ultérieures, notamment l'immunohistochimie, l'hybridation in situ et la transcriptomique spatiale.
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Article de méthode
Préservation de la glande pinéale dans les préparations de cerveau de souris périnatales
Dans cet article
Résumé
Résumé
La glande pinéale, une structure neuroendocrine qui sécrète la mélatonine, se forme à partir d'une anlase située à la ligne médiane dorsale du prosencéphale embryonnaire. Chez la souris, au jour embryonnaire (E) 14,5, un diverticule pinéal apparaît en saillie à partir du toit du diencéphale, entre les vésicules télocéphaliques appariées. Ce diverticule est en contact étroit avec les tissus cartilagineux, méningés et vasculaires sus-jacents. Il est facilement perdu lors de l'ouverture de la voûte crânienne pour l'extraction du cerveau aux stades embryonnaires tardifs ou postnataux précoces. Malgré son rôle neuroendocrinien important, le développement précoce de la glande pinéale et les mécanismes de signalisation qui régulent ce processus restent mal compris, en partie en raison de la difficulté à préserver cette structure intacte durant les stades embryonnaires du développement cérébral de la souris.
Cet article présente une procédure de dissection innovante qui préserve la glande pinéale tout en maintenant son intégrité structurelle et son attachement au toit du diencéphale lors de l'isolement du cerveau, des stades embryonnaires jusqu'au jour postnatal (P) 7. La procédure est démontrée à l'aide d'un cerveau de souris E18,5 et convient donc aux applications en aval nécessitant la préservation de l'architecture tissulaire, notamment l'hybridation in situ, l'immunohistochimie et la transcriptomique spatiale. Le protocole peut également être utilisé pour isoler la glande pinéale en développement, améliorant ainsi la représentation spécifique de la pinéale dans les analyses transcriptomiques et protéomiques, ce qui est autrement difficile en raison de sa petite taille.
Introduction
La glande pinéale est une petite structure neuroendocrine située à la ligne médiane dorsale du cerveau des vertébrés et joue un rôle central dans la régulation de la physiologie circadienne par la sécrétion rythmique de mélatonine1,2. Au cours de l'embryogenèse des mammifères, la glande pinéale se développe à partir de la ligne médiane dorsale du prosencéphale en formation. Chez la souris, le développement pinéal commence lorsque une région spécialisée de l'épithélium neuroépithélial dorsal du diencéphale forme l'anlage pinéal ou le sillon pinéal, qui s'évagine ensuite pour former le diverticule pinéal au jour embryonnaire (E) 14,53,4,5. Ce diverticule est attaché au toit du diencéphale et se situe entre les vésicules télocéphaliques appariées. Au fur et à mesure du développement, ce diverticule s'associe étroitement aux structures sus-jacentes situées à la ligne médiane dorsale du cerveau, en particulier au sinus sagittal supérieur (SSS) et au sinus transverse (TS), des voies veineuses qui courent le long de la surface dorsale du prosencéphale6. La glande pinéale en développement se trouve juste en dessous de l'intersection du SSS et du TS, et son attache délicate au diencéphale dorsal est particulièrement vulnérable lorsque les structures vasculo-méningées sus-jacentes sont retirées pour extraire le cerveau de la voûte crânienne7. Cela rend la glande pinéale particulièrement sujette aux lésions, car elle peut être arrachée lors de l'ouverture de la voûte crânienne pour l'extraction du cerveau. En conséquence, la glande pinéale est fréquemment perdue lors de dissections courantes, ce qui limite l'analyse de sa structure et de sa composition moléculaire dans des préparations intactes.
Ici, nous décrivons un protocole étape par étape pour disséquer le cerveau de la souris tout en préservant la glande pinéale et son insertion sur le toit du diencéphale. La méthode s'applique aux stades embryonnaires à partir de E16,5 jusqu'aux premiers stades postnataux (P7), et convient aux études du développement de la glande pinéale utilisant l'hybridation in situ, l'immunohistochimie et la transcriptomique spatiale. À titre de démonstration d'applications ultérieures, l'hybridation in situ et l'immunohistochimie du marqueur enrichi dans la glande pinéale, CRX, sont présentées.
L'innovation principale de cette méthode réside dans le fait que les contraintes exercées sur les structures médianes sont minimisées en supprimant soigneusement les attaches physiques qui, autrement, arracheraient la glande pinéale lors du retrait du cerveau de la cavité crânienne. Cette approche constitue une amélioration par rapport à la procédure standard.
Cette méthode de dissection est limitée aux stades allant jusqu'à P7, car l'ossification progressive de la voûte crânienne au cours du développement postnatal précoce augmente la rigidité du crâne et renforce son association avec les structures méningées et vasculaires. Bien que plusieurs études aient décrit des protocoles de dissection de la glande pinéale chez les rongeurs adultes8, très peu se sont concentrées sur la préservation de la glande pinéale au stade embryonnaire et au cours des premiers stades postnataux, époque à laquelle la glande est particulièrement fragile et sensible aux dommages pendant l'isolement du cerveau.
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Protocole
Toutes les procédures sont approuvées et réalisées conformément au comité d'éthique institutionnel pour l'expérimentation animale du Tata Institute of Fundamental Research.
1. Préparation du matériel
- Préparer tous les instruments nécessaires à la microdissection (voir le tableau des matériaux) avant de commencer la procédure. Stériliser tous les instruments à l’aide d’éthanol à 70 %. Pour la collecte d’échantillons destinés à des applications ultérieures telles que la transcriptomique spatiale ou l’hybridation in situ, essuyer les instruments avec une solution de décontamination anti-RNase.
- Nettoyer le plateau du microscope de dissection avec une solution de décontamination anti-RNase et garder à portée de main, près du poste de dissection, une bouteille de PBS 1× glacé.
- Préparer les instruments et le matériel plastique suivants avant cette procédure :
- Pour la préparation de l’animal, prévoir : 2 paires de pinces contondantes, 1 paire de ciseaux chirurgicaux, 2 boîtes de Pétri (10 cm) et plusieurs boîtes de Pétri (6 cm ; selon les besoins, une par tête).
- Pour l’isolement du cerveau, prévoir : 1 paire de pinces n°5, 1 paire de pinces n°55, 1 paire de ciseaux de microdissection, ainsi que des tubes ou boîtes de collecte adaptés à l’application ultérieure.
- REMARQUE : Si l’application ultérieure implique une hybridation in situ ou une transcriptomique spatiale, nettoyer les instruments de dissection avec une solution de décontamination anti-RNase avant utilisation.
2. Préparation des animaux
- Suivre les étapes (2.1.1–2.1.6) pour les animaux E14,5–P0
- Endormir la femelle gestante conformément aux directives du comité d'éthique institutionnel pour l'utilisation des animaux. Dans l'exemple présenté, la femelle a été euthanasiée par dislocation cervicale.
- Réaliser une incision médiane dans la cavité abdominale de la femelle gestante afin d'exposer l'utérus. À l'aide de pinces effilées, extraire délicatement les cornes utérines et les placer dans une boîte de Pétri stérile de 10 cm contenant du PBS 1× refroidi sur glace.
- Isoler soigneusement chaque fœtus en le séparant du sac amniotique et du placenta environnants.
- Transférer les fœtus dans une nouvelle boîte de Pétri de 10 cm contenant du PBS 1× refroidi sur glace, et maintenir sur glace jusqu'à ce que chacun soit utilisé pour l'isolement du cerveau. Transférer un fœtus à la fois dans une boîte de Pétri de 6 cm contenant du PBS refroidi sur glace.
- Pour les stades postnataux jusqu'à P7, euthanasier le petit conformément aux directives du comité d'éthique institutionnel pour l'utilisation des animaux. Ensuite, poursuivre à partir de l'étape 2.1.6.
- À l'aide d'une paire de ciseaux chirurgicaux, séparer la tête du corps de manière à inclure le cerveau postérieur dans la tête afin de protéger le prosencéphale contre tout dommage involontaire.
- Laver la tête avec du PBS froid pour éliminer le sang. Transférer dans une boîte de Pétri propre de 6 cm contenant du PBS 1× refroidi sur glace. Garder la tête immergée dans le PBS afin de permettre l'élimination du sang et des débris au cours des étapes ultérieures de dissection.
3. Procédure de dissection pour isoler le cerveau en conservant la glande pinéale intacte
REMARQUE : Toutes les étapes ci-dessous doivent être effectuées à l’aide d’un microscope stéréoscopique. Régler le grossissement à au moins 2× (ou selon les besoins) afin de visualiser clairement le cerveau et les structures environnantes tout au long de la dissection. L’ensemble du processus de dissection doit être réalisé dans du PBS glacé afin de minimiser la dégradation de l’ARN et des protéines. Pour les étapes 3.1 à 3.10, utiliser la main non dominante pour maintenir fermement la tête et la stabiliser tout au long de la procédure, conformément aux instructions de l’étape 3.1. Les étapes 3.2 à 3.9 doivent être effectuées en stabilisant la tête avec la main non dominante, tandis que la main dominante exécute les gestes fins, en commençant par une pince n°5, puis en passant à la pince n°55 ou aux ciseaux de microdissection selon les indications de chaque étape.
- Utilisez une pince #5 dans la main non dominante. Insérez les deux pointes dans les orbites oculaires à l’aide d’un mouvement ferme vers le bas. Maintenez une pression vers le bas afin d’immobiliser le cerveau au fond de la boîte de Pétri jusqu’à la fin de l’étape 3.9.
REMARQUE : Le cerveau se situe au-dessus des orbites oculaires et n’est pas affecté par l’insertion de la pince dans celles-ci. Le maintien d’une pression constante vers le bas stabilise le cerveau tout au long de la dissection. - À l’aide de la main dominante, pincez et retirez la peau recouvrant la tête avec une pince #5.
REMARQUE : À ce stade, le chondrocrâne lisse apparaît recouvrant le cerveau. - Retirez la portion du chondrocrâne qui recouvre le mésencéphale et le métencéphale comme suit :
- Utilisez la pince #5 pour effectuer deux incisions pénétrantes dans le chondrocrâne de chaque côté du mésencéphale, juste à l’endroit où il rejoint le télencéphale.
- Faites glisser une pointe de la pince #5 tangentiellement sous le chondrocrâne le long de la ligne tangentielle imaginaire séparant le télencéphale du mésencéphale. Saisissez fermement et déchirez le chondrocrâne.
- Continuez à retirer le chondrocrâne de manière à exposer le mésencéphale et le métencéphale.
- Changez pour la pince #55. Insérez une pointe juste sous le bord postérieur du chondrocrâne recouvrant le télencéphale. Séparez délicatement le chondrocrâne en détachant tous les liens avec les tissus vasculaires et méningés.
- À l’aide d’une paire de ciseaux de microdissection, incisez le long de la ligne médiane dorsale du télencéphale en direction du bulbe olfactif. À l’aide de la pince #55 fermée, retirez délicatement tous les attachements restants du chondrocrâne au cerveau. Séparez les deux moitiés du chondrocrâne recouvrant les hémisphères télencéphaliques à l’aide de la pince #5.
REMARQUE : À ce stade, le SSS apparaît comme une veine rouge foncé le long de la marge supérieure du chondrocrâne dans le cerveau, et le TS est visible perpendiculairement au SSS. - La glande pinéale se trouve juste sous le SSS. Effectuez une incision à l’extrémité rostrale du SSS à l’aide d’une paire de ciseaux de microdissection.
- À l’aide de la pince #55, retirez complètement la portion dorsale du chondrocrâne de chaque côté afin d’exposer davantage la glande pinéale, le SSS et le TS.
- Effectuez deux incisions dans le TS de chaque côté de la glande pinéale à l’aide d’une paire de ciseaux de microdissection. À l’aide de la pince #55, détachez les attaches latérales du TS.
- À l’aide de la pince #5 fermée, décollez délicatement la portion rostrale du cerveau de la voûte crânienne ventrale. Faites glisser la pince fermée sous la face ventrale du cerveau afin de le détacher complètement.
- Conservez le cerveau avec la glande pinéale intacte, selon les besoins pour les applications ultérieures.
4. Étapes critiques du protocole
REMARQUE : La réussite de ce protocole de dissection dépend d'une manipulation minutieuse des attaches vasculaires entourant la glande pinéale. Les points suivants sont essentiels pour maintenir la glande pinéale intacte tout au long de la procédure de dissection :
- Stabiliser la tête en insérant les branches d'une pince n°5 dans les deux orbites et maintenir une pression ferme vers le bas pendant toutes les étapes 3.1 à 3.9. Cela assure un soutien stable tout en évitant une pression directe sur le cerveau.
- Lors du retrait du chondrocrâne (étape 3.3), éviter toute traction ou décollement excessive, car cela pourrait entraîner un détachement de la glande pinéale du diencéphale dorsal.
- Lors de l'élimination des attaches méningées et vasculaires (étape 3.4) et de l'ouverture du chondrocrâne télocéphalique dorsal (étape 3.5), utiliser uniquement les pointes de la pince n°55. Une pénétration profonde de la pince pourrait endommager la glande pinéale, située immédiatement sous le toit télocéphalique caudal.
- Effectuer complètement la section du sinus sagittal supérieur (étape 3.6) et la section bilatérale du sinus transverse (étape 3.8) avant d'extraire le cerveau. Ces incisions relâchent la tension au sein du réseau veineux dorsal et empêchent le cisaillement de la glande pinéale lors du retrait du cerveau.
- À l'étape 3.9, déloger délicatement le cerveau à l'aide d'une pince fermée sans perturber la ligne médiane dorsale. Le cerveau doit se détacher librement de la voûte crânienne une fois toutes les attaches méningées et vasculaires relâchées.
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Résultats
Ce protocole de dissection permet l'isolement reproductible de cerveaux de souris embryonnaires et postnataux précoces, de E16,5 à P7, avec la glande pinéale conservée dans sa position anatomique d'origine (Figure 1).
Le retrait progressif du chondrocrâne, combiné à un évidement soigneux des attaches méningées et vasculaires, évite les contraintes de cisaillement involontaires sur la glande pinéale. De plus, la section contrôlée du sinus sagittal supérieur (SSS) à...
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Discussion
Des méthodes normalisées de dissection de la glande pinéale ont été mises au point pour le cerveau fœtal et infantile humain, aidant ainsi les médecins légistes à comprendre les causes du syndrome de mort subite du nourrisson11. Des protocoles antérieurs ont démontré l'ablation de la glande pinéale accompagnée des vaisseaux sanguins superficiels, des méninges et du plexus choroïde12 ; toutefois, aucune méthode permettant de conserver de façon fiable une glande pinéale intac...
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Déclarations de divulgation
Tous les auteurs déclarent qu’ils n’ont aucun intérêt concurrent.
Remerciements
Nous remercions le Dr. Shital Suryavanshi et le personnel de l'élevage animalier du Tata Institute of Fundamental Research pour leur excellent soutien. Nous remercions le Dr. Sundar Naganathan de nous avoir aimablement autorisés à utiliser le microscope stéréo macro zoom Olympus MVX10 de son laboratoire pour enregistrer la vidéo de la procédure. Ce travail a été financé par une subvention du Department of Atomic Energy (DAE), Gouvernement de l'Inde, numéro d'identification du projet RTI4003 et RTI4015 (ST) ; subvention ICMR-DHR SUG, GAP00303, subvention ANRF PMECRG GAP00313 (AP).
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Matériaux
| Nom | Entreprise | Numéro de catalogue | Commentaires |
|---|---|---|---|
| Microscope en champ clair | Olympus | IX73 | Tout microscope en champ clair équipé d'une caméra couleur convient. |
| Microscope confocal | Olympus | FV3000 | Tout microscope confocal ou microscope à épifluorescence convient, selon la résolution requise |
| Anticorps anti-CRX | Invitrogen | PA5-32182 | Protocole d'immunomarquage décrit dans Parichha et al.9. |
| Sonde CRX | Personnalisée | Personnalisée | Protocole d'hybridation in situ de Parichha et al.10. |
| Pinces fines # 5 | F.S.T | 11251-23 | Peuvent être remplacées par des outils similaires provenant de n'importe quelle entreprise. |
| Pinces fines # 55 | F.S.T | 11255-20 | Peuvent être remplacées par des outils similaires provenant de n'importe quelle entreprise. |
| PBS, pH 7,4 | Gibco | 10010023 | Peut être remplacé par des produits similaires provenant de n'importe quelle entreprise. |
| Boîte de Pétri | Corning | CLS351029 | Peut être remplacée par des produits similaires provenant de n'importe quelle entreprise. |
| RNaseZap | Invitrogen | AM9782 | La solution de décontamination RNaseZap est une solution de décontamination de surface qui détruit les RNases au contact |
| Ciseaux à ressort (ciseaux de microdissection) | F.S.T | 15020-15 | Peuvent être remplacés par des outils similaires provenant de n'importe quelle entreprise. |
| Microscope stéréo-zoom | Nikon | SMZ745 | Tout microscope de dissection convient |
Références
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Réimpressions et autorisations
