Cette étude décrit un modèle in vitro. visant à évaluer les effets protecteurs du Sanqi Baiji San contre les lésions des cellules épithéliales gastriques induites par l’éthanol et son implication dans la signalisation liée à PI3K/AKT.
Un abonnement JoVE est requis pour visualiser ce contenu. Connectez-vous ou commencez votre période d'essai gratuite.
Article de recherche
Cette étude décrit un modèle in vitro. visant à évaluer les effets protecteurs du Sanqi Baiji San contre les lésions des cellules épithéliales gastriques induites par l’éthanol et son implication dans la signalisation liée à PI3K/AKT.
Ce travail visait à clarifier le mécanisme protecteur de Sanqi Baiji San (SQBJ) contre les lésions des cellules épithéliales gastriques induite par l’éthanol et à explorer sa pertinence potentielle pour l’ulcère gastrique (GU). La pharmacologie en réseau a été utilisée pour cribler les composants actifs du SQBJ (Traditional Chinese Chinese Systems Pharmacology Database and Analysis Platform [TCMSP], Bioavailability orale [OB] ≥ 20 %, ressemblance de médicaments [DL] ≥ 0,1), cartographier leurs cibles (Universal Protein Resource [UniProt]), collecter des cibles liées aux GU (GeneCards/OMIM/DrugBank), et analyser des cibles qui se chevauchent via l’enrichissement et le docking moléculaire de la Gene Ontology (GO)/Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes (KEGG). Les cellules de la lignée cellulaire épithéliale gastrique (GES-1) lésées à l’éthanol ont été traitées avec le SQBJ ou l’inhibiteur PI3K LY294002. CCK-8 a été utilisé pour déterminer la concentration optimale de SQBJ. Les analyses de pharmacologie en réseau ont identifié 126 cibles communes enrichies dans les cascades liées à PI3K/AKT/MAPK et ont suggéré des interactions potentielles entre les principaux constituants de SQBJ et les protéines liées à PI3K/AKT. Dans les cellules à faible efficacité éthanol, le SQBJ atténuait les lésions cellulaires en réduisant la libération des médiateurs inflammatoires et le stress oxydatif, comme en témoignent la diminution des espèces réactives intracellulaires de l’oxygène et des niveaux de malondiadéhyde. Le SQBJ a rétabli le potentiel de la membrane mitochondriale et la teneur en ATP, et a réduit les changements associés à l’apoptose dans le lymphome B-2, la caspase-3 clivée et les niveaux de protéine X associée à Bcl-2. SQBJ modulait également les marqueurs de signalisation associés à PI3K/AKT et MAPK. Ces effets protecteurs ont été largement affaiblis par LY294002, ce qui suggère que la signalisation liée à PI3K/AKT est impliquée dans la cytoprotection médiée par SQBJ. Ces résultats fournissent une base mécanistique in vitro pour l’application potentielle du SQBJ dans le GU, bien qu’une validation supplémentaire dans des modèles animaux d’ulcère gastrique induit par l’éthanol soit nécessaire.
L’ulcère gastrique (GU) est un trouble gastro-intestinal très répandu dans le monde, caractérisé par une inflammation localisée, une érosion et des ulcères de la muqueuse gastrique. Selon les estimations de l’analyse 2021 Global Burden of Disease (GBD 2021), la maladie des ulcères gastro-inflammatoires (PUD) continue d’imposer un fardeau clinique et économique important à des millions de patients dans le monde. Bien que la prévalence globale du PUD ait diminué avec la dépendance clinique généralisée et étendue aux schémas anti-infectieux et aux inhibiteurs de pompe à protons (IPP) suppresseurs d’acide, cette tendance à la baisse s’est stabilisée, avec un rebond même observé dans certainesrégions 1. Notamment, la consommation d’alcool (éthanol) est un facteur pathogène critique, indépendant de l’infection à Helicobacter pylori (H. pylori.) et de l’utilisation d’anti-inflammatoires non stéroïdiens (AINS). Une consommation excessive d’alcool à long terme endommage la barrière muqueuse gastriqueuse, accélère le développement des ulcères, et augmente même la susceptibilité aux cancers gastriques — faisant ainsi de cette affection une crise sanitaire internationalecritique 2. Dans les pays en développement, l’incidence des lésions de la muqueuse gastrique liée à l’alcool est en hausse en raison de plusieurs facteurs, notamment une consommation croissante d’alcool et des changements de mode de vie, créant un besoin urgent de stratégies de prévention et de traitement efficaces et sûres.
Le mécanisme pathologique sous-jacent à la lésion de la muqueuse gastrique induite par l’éthanol est multifactoriel et multi-couches. Au contact direct avec la muqueuse gastrique, l’éthanol perturbe rapidement la barrière mucus-bicarbonate et déclenche une montée incontrôlée d’espèces réactives intracellulaires de l’oxygène (ROS). Cette explosion oxydative provoque ensuite la peroxydation lipidique (caractérisée par un taux élevé de malondiadéhyde, MDA), appauvrit les antioxydants endogènes de la muqueuse gastrique, notamment la superoxyde dismutase (SOD), ainsi que le glutathion (GSH), et induit finalement un dysfonctionnementmitochondrial 3. Les preuves accumulées indiquent que les ROS intracellulaires induits par l’éthanol proviennent principalement des mitochondries et sont étroitement liés à l’effondrement du potentiel de membrane mitochondriale interne (Δψm) et à l’inhibition de la synthèse de l’adénosine triphosphate (ATP) 4. Parallèlement, le stress oxydatif active davantage les cascades pro-inflammatoires sous la direction du facteur nucléaire-kappa B (NF-κB). Cette activation favorise ensuite la libération massive de médiateurs inflammatoires, principalement le facteur de nécrose tumorale α (TNF-α), l’interleukine-6 (IL-6) et la protéine C-réactive (CRP), formant ainsi un cercle vicieux de « réponse de stress oxydatif inflammatoire »5. Sur cette base, la cascade apoptotique intrinsèque entraînée par les mitochondries est déclenchée, comme en témoigne un rapport perturbé de Bcl-2 à Bax parallèlement au clivage enzymatique séquentiel protéolytique de la protéinase spécifique à l’aspartate cysteinyl (Caspase-3), ce qui conduit finalement à une mort massive des cellules épithéliales de la muqueuse gastrique et à la formationd’ulcères 6. Ainsi, le ciblage simultané des trois liens pathologiques fondamentaux du stress oxydatif, de la réponse inflammatoire et de l’apoptose représente une stratégie clé pour l’intervention efficace des lésions de la muqueuse gastrique alcoolique.
La voie de signalisation phosphoinositide 3-kinase/kinase protéine B (PI3K/AKT) constitue un axe régulateur central régissant la longévité cellulaire, la prolifération et la mort programmée, jouant un rôle vital dans la préservation de l’homéostasie de la muqueuse gastriqueuse. Après activation, la signalisation PI3K/AKT phosphoryle plusieurs substrats en aval, inhibe l’activité du facteur pro-apoptotique Bad, empêchant ainsi l’échappement mitochondrial du cytochrome c, destructeur cellulaire, mainmaintenant l’homéostasie de ΔΨm et favorisant la survie cellulaire7. De plus, il existe un dialogue antagoniste complexe entre la cascade PI3K/AKT et les réseaux de protéines kinases activées par les mitogènes (MAPK) : l’activation à la hausse de PI3K/AKT peut atténuer la transduction du signal inflammatoire et les réactions en cascade apoptotique en inhibant l’activation des kinases de stress, notamment p38, la kinase N-terminale c-Jun (JNK) et les kinases protéiques régulées extracellulaires (ERK)8. De nombreuses études ont indiqué que la réduction de l’activité de la voie PI3K/AKT est étroitement liée à une inflammation exacerbée et à une augmentation de l’apoptose dans les modèles de lésions muqueuses gastriques, tandis que la restauration de l’activité de cette voie peut considérablement atténuer la lésionmuqueuse 9. Cependant, il manque actuellement une vérification expérimentale causale systématique concernant le mécanisme régulateur précis de PI3K/AKT dans les lésions de la muqueuse gastrique induite par l’éthanol, en particulier sa relation synergique avec la voie MAPK.
En matière de pharmacothérapie moderne, les IPP constituent l’option de première ligne pour la prise en charge clinique de la GU, mais leur administration à long terme a soulevé des préoccupations croissantes en matière de sécurité. Des études accumulées ont lié l’utilisation chronique d’IPP à divers effets négatifs, notamment les maladies rénales, les événements cardiovasculaires, les fractures ostéoporotiques, les carences en nutriments (fer, magnésium et vitamine B12), l’infection par Clostridioides difficile, et même un risque accru de cancergastrique 10. De plus, le phénomène d’hypersécrétion d’acide gastrique de rebond après l’arrêt des IPP a été confirmé par des données de pharmacovigilance à grandeéchelle 11. Ces risques pour la sécurité ont poussé les communautés cliniques et de recherche fondamentale à explorer activement des thérapies alternatives avec des mécanismes de protection multi-cibles, des effets secondaires minimes et une adaptation à un usage à long terme. En particulier, les préparations à base de composés naturels issues de la médecine traditionnelle chinoise (MTC) ont attiré une large attention en raison de leur concept thérapeutique holistique d’action « multi-composantes, multi-cibles et multi-voies» 12.
La poudre Sanqi Baiji (SQBJ) est une formule classique de composé TCM composée de Panax notoginseng et de Bletilla striata à un rapport de masse de 1:1. Panax notoginseng est bien connu pour ses effets de promotion de la circulation sanguine et d’arrêt des saignements, ainsi que pour soulager le gonflement douloureux. Ses principaux constituants bioactifs, dont le notoginsenoside R1 ainsi que les ginsénosides (Rg1, Rb1), exercent des effets anti-inflammatoires, antioxydants et réparateurs de la muqueuse significatifs. La bletilla striata se caractérise par ses effets astringents qui arrêtent les saignements, réduisent le gonflement et favorisent la régénération des tissus endommagés. Parallèlement, le polysaccharide de Bletilla striata (BSP), qui sert de principal extrait actif, a documenté son efficacité dans la suppression de la cascade MAPK JNK/p38, diminuant ainsi l’expression de l’interleukine-1β (IL-1β), TNF-α et IL-6, et augmentant la capacité antioxydante de défense de la muqueusegastrique 13. Les preuves littéraires accumulées ont confirmé que la co-administration de Panax notoginseng. saponines (SNP) et de BSP exerce un effet synergiquedans les modèles 14 d’ulcères gastriques alcooliques, et les préparations liées au SQBJ ont montré des effets protecteurs muqueuseux significatifs dans des études précliniques sur le reflux, l’œsophagite et l’ulcèregastro-peptique 15. Cependant, il n’existe actuellement aucune vérification expérimentale in vitro systématique du mécanisme de signalisation sous-jacent à l’effet protecteur de la muqueuse gastrique du SQBJ, en particulier le rôle central de la voie PI3K/AKT et sa relation régulatrice avec MAPK. Par le temps, l’association causale entre les composants chimiques clés et les récepteurs fonctionnels du SQBJ n’a pas encore été pleinement élucidée.
Pour combler ces lacunes, la présente étude a adopté une stratégie de recherche intégrée combinant pharmacologie en réseau et vérification expérimentale in vitro , utilisant la lignée cellulaire GES-1 défiée à l’éthanol comme plateforme expérimentale pour étudier le mécanisme moléculaire potentiel sous-jacent aux effets protecteurs épithéliaux gastriques du SQBJ, en mettant l’accent sur le stress oxydatif, les réponses inflammatoires, les processus apoptotiques et la signalisation liée à PI3K/AKT. et les changements associés au MAPK. Tout d’abord, nous avons utilisé le LY294002 inhibiteur PI3K pour évaluer préliminairement l’implication de la signalisation PI3K/AKT et avons constaté que l’inhibition de cette voie atténuait l’effet protecteur du SQBJ, suggérant que la signalisation liée à PI3K/AKT contribue à la cytoprotection médiée par le SQBJ. Ensuite, nous avons exploré l’association entre les changements liés à PI3K/AKT et la régulation des voies MAPK, fournissant des preuves préliminaires que les changements de signalisation MAPK pourraient être liés à la modulation SQBJ de la réponse fonctionnelle de l’axe PI3K/AKT. Collectivement, ce travail établit un cadre moléculaire inn vitro pour évaluer comment le SQBJ atténue les lésions épithéliales gastriques induites par l’éthanol et fournit des preuves préliminaires pour une exploration approfondie des formules de composés MTC dans les lésions muqueuses gastriques alcooliques. Cependant, des expériences animales restent nécessaires pour confirmer si ces effets protecteurs cellulaires peuvent être transposés in vivo. Efficacité thérapeutique dans les modèles expérimentaux d’ulcération gastrique causée par l’alcool (Figure supplémentaire S1).
Accès restreint. Veuillez vous connecter ou commencer un essai pour afficher ce contenu.
Cette étude n’a pas impliqué de participants humains, d’échantillons de tissus humains, de spécimens cliniques ou d’expériences animales. Des ressources de base de données publiques et anonymisées ont été utilisées pour l’analyse pharmacologique en réseau, et des cellules GES-1 disponibles dans le commerce ont été utilisées pour des expériences in vitro. Par conséquent, une approbation éthique formelle et un consentement éclairé n’étaient pas requis. Des informations détaillées sur les principaux réactifs, anticorps, kits de test, instruments, fabricants, numéros de catalogue et identifiants de ressources de recherche (RRID), le cas échéant, sont résumées dans le tableau des matériaux.
Préparation et contrôle qualité de l’extrait aqueux de SQBJ
Matériaux à base de plantes
Les matières premières sont de Panax notoginseng (Burk.), F. H. Chen (racine et rhizome) et Bletilla striata.(Thunb. ex A. Murray) Rchb. f. (tubercule) ont été obtenus auprès d’un fournisseur commercial de médecine traditionnelle chinoise et ensuite authentifiés par un pharmacien senior de la MTC suite à la Pharmacopée chinoise (édition 2025). Spécimens de référence (N° SQBJ-20240301, n° PN-20240301, n° BS-20240301) ont été déposés dans l’herbier de notre établissement. Les deux herbes ont été broyées et mélangées à un rapport de masse de 1:1 pour préparer la poudre de SQBJ.
Préparation de l’extrait aqueux de SQBJ
La poudre de SQBJ a subi deux extractions successives par reflux avec de l’eau déionisée à un ratio solide/liquide de 1:10 (g/mL) pendant 1 heure par séance. Par la suite, les extraits collectés ont été combinés et passés à travers quatre couches de gaze médicale pour éliminer les résidus. Le filtrat obtenu était concentré sous pression réduite à 60 °C jusqu’à atteindre une densité relative de 1,05–1,10, suivi d’un séchage lyophilisé sous vide pour obtenir la poudre d’extrait aqueux SQBJ, avec un rendement final d’extraction de 18,2 % ± 0,6 %. La poudre d’extrait était scellée et stockée à −20 °C, dissoute dans un milieu DMEM sans sérum, puis passée à travers un filtre membranaire de 0,22 μm pour stérilisation avant les expériences cellulaires.
Contrôle qualité de l’extrait aqueux SQBJ
Pour évaluer la cohérence et la standardisation de l’extrait aqueux SQBJ, nous avons réalisé une détermination quantitative parallèlement au profilage des empreintes digitales par chromatographie liquide haute performance (HPLC). Le tableau des matériaux liste les paramètres techniques complets concernant le système HPLC. Sur la base des profils chimiques des deux plantes constitutives, nous avons ciblé quatre marqueurs représentatifs : notoginsenoside R1, ginsenoside Rg1, ginsenoside Rb1 et militarine. Cependant, cette stratégie de contrôle qualité basée sur les HPLC reflétait principalement plusieurs constituants représentatifs et ne fournissait pas un profil chimique complet de tous les composés actifs dans le SQBJ.
La séparation chromatographique a été réalisée via une colonne C18 à phase inversée (4,6 mm × 250 mm, 5 μm). Le fonctionnement était maintenu à une température de colonne de 30 °C, avec un débit de 1,0 mL/min, un volume d’injection de 10 μL et une longueur d’onde de détection de 203 nm. La composition de la phase mobile était composée d’acétonitrile (A) et de solution aqueuse phosphorique (B) à 0,1 %, utilisant la course d’élution en gradient suivante : 0–15 min, 19 % A ; 15–35 min, 19 %–35 % A ; 35–55 min, 35 % – 55 % A ; et 55–60 min, 55 % à 19 % A. Des informations détaillées sur les instruments et les colonnes sont fournies dans le tableau des matériaux.
Préparation de la substance de référence
Pour réaliser une analyse quantitative, nous avons obtenu des normes commerciales pour la notoginsenoside R1, le ginsénoside Rg1, le ginsénoside Rb1 et le militarine, tous avec une pureté ≥ 98 %. Les produits chimiques de référence individuels ont été précisément mesurés et dissous dans un seul stock de méthanol afin d’obtenir une solution de référence mixte uniforme avec une concentration finale de 50 μg/mL pour chaque composant.
Préparation de l’exemple :
La poudre sèche à extrait aqueux de SQBJ (50 mg) a été mesurée avec précision, suivie d’une dissolution à l’aide de 25 mL de méthanol de qualité analytique. Ce mélange a subi un traitement par bain ultrasonore pendant 30 minutes sous des paramètres d’instrumentation contrôlés (puissance : 250 W ; fréquence : 40 kHz). Après un équilibre à température ambiante de la pièce, le liquide était passé à travers une membrane filtrante organique de 0,22 μm pour obtenir la solution finale d’essai analytique.
Résultats de la détermination du contenu :
La teneur moyenne des composants caractéristiques du cœur dans trois lots consécutifs d’extrait aqueux de SQBJ était la suivante : notoginsenoside R1 3,12 ± 0,11 mg/g, ginsénoside Rg1 8,45 ± 0,23 mg/g, ginsénoside Rb1 5,26 ± 0,18 mg/g, et militarine 2,78 ± 0,09 mg/g, avec la RSD de chaque composant < 5 % entre les lots, confirmant une bonne consistance de l’extrait d’un lot à l’autre.
Déclaration d’éthique et de conformité
Ni les tests sur les animaux ni l’inclusion de spécimens cliniques humains, de biopsies tissulaires et de sujets vivants n’ont été abordés tout au long de cette étude. L’analyse pharmacologique du réseau a été réalisée à l’aide de bases de données publiques, notamment TCMSP, UniProt, GeneCards, OMIM, DrugBank, STRING, Metascape, PubChem et RCSB PDB. Toutes les données récupérées à partir de ces bases de données étaient accessibles au public et anonymisées ; par conséquent, le profilage bioinformatique était totalement exempté de l’exigence d’un consentement informé formel ou d’une surveillance éthique supplémentaire.
Les expériences in vitro présentes ont été menées avec la lignée cellulaire épithéliale de la muqueuse gastrique humaine, GES-1, disponible commercialement. Aucune cellule humaine primaire ni matériel biologique dérivé du patient n’a été utilisé. La lignée cellulaire a été obtenue à partir d’un dépôt cellulaire authentifié et traitée conformément aux directives institutionnelles de biosécurité et de culture cellulaire. Comme cette étude ne concernait que des lignées cellulaires établies et des bases de données publiques, elle était exemptée de l’approbation formelle du comité d’éthique institutionnelle. Toutes les procédures expérimentales ont été réalisées conformément aux exigences institutionnelles pertinentes en matière de sécurité des laboratoires et de conformité à la recherche.
Études de pharmacologie des réseaux
Identification et dépistage des cibles d’ingrédients actifs
Les composantes actives de Panax notoginseng et Bletilla striata., les deux plantes constitutives du SQBJ, ont été extraites de bases de données publiques. Toutes les informations issues de la base de données utilisées dans cette étude étaient accessibles au public et ne contenaient pas d’informations personnelles identificables. En utilisant des noms botaniques comme requêtes, nous avons identifié des phytochimiques candidats à partir de la Base de Données et Plateforme d’Analyse des Systèmes de Pharmacologie de la Médecine Traditionnelle Chinoise (TCMSP). Pour identifier les molécules bioactives éligibles, le protocole de dépistage a appliqué des seuils de biodisponibilité orale (OB) ≥ 20 % et de ressemblance au médicament (DL) ≥ 0,1. Ensuite, nous avons identifié les cibles génétiques potentielles en aval associées à ces composants candidats, en omettant tout constituant sans cibles géniques valides correspondantes. Tous les gènes cibles ont été annotés et standardisés via le Universal Protein Resource (UniProt), limitant la recherche dans la base de données de référence exclusivement à Homo sapiens, générant ainsi la liste finale des gènes cibles pour les composants actifs fonctionnels du SQBJ.
Récupération de cibles liées à la pathologie
Pour compiler les gènes liés à la maladie, nous avons interrogé trois bases de données publiques : GeneCards, Online Mendelian Inheritance in Man (OMIM) et DrugBank, avec « ulcère gastrique » comme terme de recherche. L’ensemble de données multiplateforme a ensuite été fusionné, suivi de l’élimination des entrées redondantes pour établir une liste standardisée des gènes cibles associés aux ulcères gastriques.
Construction de réseaux pour les ingrédients, les cibles et les maladies
Nous avons déterminé le chevauchement des gènes cibles entre les composants actifs du SQBJ et l’ulcère gastrique. Par la suite, un réseau d’interaction multi-couches a été construit à l’aide d’un logiciel de visualisation de réseau. Pour évaluer l’importance des nœuds, l’algorithme intégré d’évaluation topologique a calculé les paramètres topologiques de chaque nœud, y compris la centralité des degrés et des intermédiaires. Sur la base de ces valeurs calculées, nous avons identifié les composantes actives et les principales cibles fonctionnelles de la SQBJ dans le traitement de l’ulcère gastrique.
Cartographie des réseaux d’interaction protéine-protéine (PPI)
Les cibles consensuelles identifiées partagées entre SQBJ et ulcère gastrique ont été croisées avec la base de données STRING. Notre requête spécifiait le modèle d’analyse multi-protéique tout en limitant le fond analytique à Homo sapiens. Les IPP ont été filtrés avec un seuil minimum de confiance en interaction moyen (> 0,4).
Les enregistrements de connectivité fonctionnelle résultants étaient exportés sous forme de fichier TSV, qui a ensuite été intégré dans un logiciel dédié de visualisation réseau pour l’analyse PPI. Sur la base de la topographie de connexion calculée, nous avons évalué les nœuds fonctionnels centraux du réseau en classant la valeur de degré spécifique de chaque nœud.
Annotation fonctionnelle en aval et cartographie des chemins
Pour élucider les rôles biologiques des nœuds d’intersection partagés, nous avons réalisé une analyse d’enrichissement fonctionnel par Gene Ontology (GO) et une analyse d’enrichissement des voies par la Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes (KEGG) en utilisant un outil d’annotation bioinformatique accessible sur le web. La classification fonctionnelle classe les gènes en trois catégories classiques : processus biologique (BP), composant cellulaire (CC) et fonction moléculaire (MF). Des diagrammes à bulles et des graphiques à barres pour les résultats d’enrichissement ont été générés à l’aide d’une plateforme de tracé bioinformatique en ligne pour cartographier les principaux processus biologiques et voies de signalisation associés à l’effet thérapeutique du SQBJ sur l’ulcère gastrique.
Simulation d’amarrage moléculaire computationnelle
Les fichiers de géométrie spatiale des composants actifs principaux de SQBJ ont été téléchargés depuis des bases de données publiques de composés et ensuite enregistrés sous forme de fichiers MOL2 à l’aide d’un logiciel de traitement de fichiers. Nous avons également obtenu les structures cristallines tridimensionnelles des protéines cibles principales en interrogeant la Protein Data Bank. Ces structures macromoléculaires ont été prétraitées en retirant les ligands originaux et les molécules d’eau, et les modèles propres résultants ont été sauvegardés au format PDB. Pour simuler l’énergétique de liaison récepteur-ligand, la vérification d’amarrage impliquant les composants actifs du cœur et les protéines cibles a été réalisée via un logiciel standard de couplage moléculaire computationnel. Les résultats de l’amarrage ont été optimisés et rendus à l’aide d’un logiciel de visualisation moléculaire.
Culture cellulaire
Les cellules épithéliales gastriques d’origine humaine GES-1 ont été cultivées en utilisant un milieu RPMI-1640 intégré à 10 % de sérum bovin fœtal et 1 % de pénicilline-streptomycine à 37 °C dans une atmosphère humidifiée contenant 5 % de CO₂. Nous avons identifié la culture source comme une lignée cellulaire établie, obtenant le stock initial à partir d’un dépôt cellulaire authentifié. À une confluence observée de 80–90 %, les monocouches ont été rincées deux fois avec PBS suivies d’un décollement à l’aide de trypsine-EDTA à 0,25 % pendant 2 minutes à 37 °C. Pour mettre fin à la réaction de clivage enzymatique, nous avons introduit un volume égal de milieu complet. La suspension cellulaire résultante était centrifugée à 1 000 × g pendant 5 minutes, après quoi la pellete était remise en suspension dans un milieu complet frais, puis resemée à la densité appropriée. Les cultures ont été renvoyées dans des conditions d’incubation identiques. Tout au long de la période de propagation, un microscope à contraste de phase inversé a été utilisé pour évaluer la viabilité cellulaire, la morphologie et le statut de croissance, et les cellules en phase de croissance logarithmique ont été régulièrement collectées pour des analyses en aval.
Établissement et traitement du modèle de lésion cellulaire GES-1 induit par l’éthanol
Les cellules GES-1 en phase logarithmique ont été ensemées à 5 × 10 cellulesde 5 puits par puits dans des plaques à 6 puits ou 1 × 10 cellulesde 4 puits dans des plaques à 96 puits et incubées toute la nuit pour adhérer. Une lésion induite par l’éthanol a été établie en exposant les cellules à 500 mmol/L d’éthanol dans du RPMI-1640 non supplémenté pendant 4 heures. Cette condition a été sélectionnée sur la base d’expériences préliminaires de concentration et de réponse temporelle. Dans le test préliminaire, 250 mmol/L d’éthanol pendant 4 heures n’a causé que des lésions légères, la viabilité cellulaire restant autour de 78,6 ± 5,4 %, tandis que 750 mmol/L d’éthanol a réduit la viabilité à 32,8 ± 4,7 %, indiquant une cytotoxicité excessive. L’exposition à 500 mmol/L d’éthanol pendant 4 h a réduit la viabilité cellulaire à 54,7 ± 4,9 %, ce qui a produit des lésions modérées à sévères reproductibles tout en conservant suffisamment de cellules viables pour une intervention ultérieure et des tests mécanistiques. Par conséquent, 500 mmol/L d’éthanol pour 4 heures a été sélectionné pour l’établissement du modèle. Cette affection a été utilisée pour simuler in vitro une lésion épithéliale aiguë induite par l’éthanol et ne reproduit pas entièrement le schéma physiologique d’exposition de la muqueuse gastrique in vivo.
Pour l’intervention pharmacologique, trois concentrations d’extrait aqueux de SQBJ (5, 10 et 50 μg/mL) ont été sélectionnées et administrées immédiatement après l’éthanol par défi. Dans le bras d’inhibition PI3K, les cellules ont été préincubées avec 20 μmol/L LY294002 pendant 30 minutes avant le co-traitement avec l’éthanol et la concentration optimale de SQBJ. Une cohorte témoin positive a reçu 20 μmol/L oméprazole immédiatement après exposition à l’éthanol. L’oméprazole a été utilisé comme agent gastroprotecteur de référence plutôt que comme comparateur dose-équivalent. La concentration a été sélectionnée sur la base d’une évaluation préliminaire de cytotoxicité et sur les plages d’interventions in vitro couramment utilisées, et visait à fournir une référence pharmacologique pour la protection cellulaire. Les cellules témoins étaient maintenues dans un milieu complet sans éthanol ni agents supplémentaires. Toutes les incubations ont été réalisées dans une atmosphère humidifiée contenant 5 % de CO₂ à 37 °C. Chaque groupe expérimental comprenait au moins trois puits répliqués, et l’ensemble du protocole était exécuté indépendamment 3 fois.
Détermination de la concentration optimale de SQBJ via la méthode CCK-8
Les éléments HGE/GES-1 en phase logarithmique ont été placés en vecteurs de 96 puits à une densité de 1 × 104 cellules/puits et incubés toute la nuit dans un milieu RPMI-1640 complet dans des conditions standard (37 °C, 5 % CO₂) pour assurer l’adhérence. Les cultures ont été randomisées en quatre groupes : contrôle par véhicule (moyen complet unique), intervention SQBJ à faible dose (5 μg/mL), intervention SQBJ à dose moyenne (10 μg/mL) et intervention à forte dose (50 μg/mL) ; ces trois concentrations ont été utilisées pour le dépistage thérapeutique et préparées en dissolvant le SQBJ dans le PBS. Toutes les conditions ont été testées dans au moins trois puits parallèles, et le protocole total a été répété en trois lots expérimentaux distincts. Après la période de traitement désignée, chaque puits a reçu 10 μL de réactif CCK-8, suivis d’une période d’incubation de 2 h à 37 °C. La densité optique (OD) à 450 nm a été mesurée à l’aide d’un lecteur de microplaques. Le pourcentage de viabilité cellulaire a été calculé comme (absorbance_treatment / absorbance_control) × 100 %, permettant d’identifier la concentration la plus efficace de SQBJ pour les expériences ultérieures.
qPCR
Les éléments GES-1 en phase logarithmique ont été cultivés dans des plaques à 6 puits (5 × 10cellules de 5 puits/puits) et maintenus toute la nuit à 37 °C dans un incubateur humidifié contenant 5 % de CO₂ pour permettre l’adhérence. Par la suite, les cellules ont été exposées à la concentration optimale prédéterminée de SQBJ et prélevées au départ (0 h) et à 6, 12, 24 et 48 heures après traitement afin de déterminer la réponse dynamique des molécules de signalisation. Sur la base des résultats du cours temporel, l’intervalle de 24 heures a été choisi pour les tests mécanistiques ultérieurs car il montrait la réponse de signalisation la plus forte tout en maintenant une viabilité cellulaire stable. Chaque point temporel était représenté par trois puits triplés, et l’ensemble de l’expérience était répété indépendamment 3 fois.
Nous avons isolé l’ARN total à l’aide d’un réactif d’extraction spécialisé, évaluant la concentration et la qualité du rendement à l’aide d’un spectrophotomètre. Tous les échantillons présentaient un rapport d’absorption A₂₆₀/A₂₈₀ dans la plage de 1,8 et 2,0. Un kit de transcription inversée avec essuie-gDNA a été utilisé pour transcrire à l’inverse l’ADNc à partir de 1 μg d’ARN total. L’analyse PCR en temps réel a été réalisée via un système quantitatif de PCR avec des amorces pour PI3K, AKT, p38, JNK, ERK et le gène de référence GAPDH. Les détails du système PCR, des réactifs et du service de synthèse d’amorce sont détaillés dans le tableau des matériaux. Les amorces étaient conçues pour des régions spécifiques des gènes humains correspondants. Protocole qPCR : activation à chaud à 95 °C pendant 30 s, suivie de 40 cycles de dénaturation à 95 °C pendant 5 s et de recuit/extension à 60 °C pendant 30 s. Le calcul de l’expression de l’ARNm du gène cible reposait sur la méthode quantitative relative de la PCR avec la méthode 2-ΔΔCt .
ELISA
Les surnatants ont été récoltés et éliminés par centrifugation à 1 200 × g pendant 10 minutes à 4 °C pour l’élimination des débris cellulaires. Les niveaux de médiateurs inflammatoires (CRP, IL-6, TNF-α) et d’indices de stress oxydatif (SOD, MDA, GSH) ont été évalués à l’aide de kits ELISA commerciaux en suivant les instructions spécifiques des fabricants. Les profils de concentration de ces cibles ont été vérifiés avec des formulations commerciales selon les instructions des fournisseurs. Chaque groupe expérimental comprenait trois puits de réplication, et la procédure a été exécutée sur trois lots de cultures cellulaires distincts afin de confirmer la reproductibilité des données expérimentales. En résumé, 100 μL de surnatants standards ou clarifiés ont été distribués dans des plaques de réaction pré-enduites et incubés à 37 °C pendant 90 minutes. Après trois cycles de lavage successifs, chaque cavité a reçu 100 μL de l’anticorps spécifique de détection pour une incubation de 60 minutes à 37 °C, suivie de trois autres cycles de lavage. Ensuite, une solution substrat (100 μL) a été introduite, et les échantillons ont été protégés de la lumière pendant 15 minutes avant de bloquer la réaction enzymatique avec 50 μL de solution stop. La densité optique à 450 nm a été détectée via un lecteur de microplaques. Les concentrations ont été interpolées à partir des courbes standard correspondantes. Pour minimiser les biais causés par des différences de nombre de cellules ou des changements de viabilité cellulaire induits par le traitement, les profils MDA, SOD, GSH, CRP, TNF-α et IL-6 ont été calibrés par rapport aux contenus en protéines de chaque échantillon analytique, tel que déterminé par le test BCA, et exprimés en valeurs relatives comparés au groupe témoin.
Détection des ROS intracellulaires dans les cellules GES-1 à l’aide de la sonde fluorescente DCFH-DA
Pour quantifier les niveaux d’espèces réactives d’oxygène intracellulaires (ROS), nous avons utilisé l’indicateur fluorogénique perméable à la membrane DCFH-DA. Les cellules prélevées ont été resuspendues dans du RPMI-1640 non supplémenté contenant 10 μmol/L DCFH-DA et maintenues pendant 20 minutes dans des conditions de culture standard (37 °C, 5 % CO₂) dans l’obscurité. Après trois lavages successifs avec un milieu sans sérum pour une sonde non liée claire, l’intensité de fluorescence a été surveillée par cytométrie en flux avec une excitation de 488 nm et une émission de 525 nm. Les niveaux relatifs de ROS ont été rapportés comme l’intensité moyenne de fluorescence pour chaque groupe de traitement, normalisés au nombre de cellules viables déterminés dans des puits parallèles à l’aide du test CCK-8, et exprimés par rapport au groupe témoin correspondant.
Détermination du potentiel de la membrane mitochondriale (ΔΨm)
Nous avons évalué les modifications du potentiel de membrane mitochondriale (ΔΨm) à l’aide d’un kit commercial de test JC-1. En résumé, les cellules prélevées étaient remises en suspension dans une solution de travail JC-1 fraîchement préparée — un mélange à volume égal de colorant JC-1 et de tampon de coloration fourni par le kit — jusqu’à une concentration finale de 1 × 106 cellules/mL. Après une incubation de 20 minutes à 37 °C dans un environnement humidifié contenant 5 % de CO₂, protégé de la lumière pour éviter le blanchiment, l’échantillon a été prélevé par centrifugation (800 × g., 5 min) et rincé une fois avec 1 mL de tampon de coloration JC-1 refroidi à la glace. La fluorescence a ensuite été acquise par cytométrie en flux.
Les agrégats de JC-1 (indiquant la présence intacte de ΔΨm) ont été surveillés via le canal FL2 en utilisant des longueurs d’onde d’excitation de 488 nm et d’émission de 590 nm, tandis que les monomères de JC-1 (indicateurs de dissipation de ΔΨm) ont été suivis via le canal FL1 en utilisant des réglages d’excitation de 488 nm et d’émission de 525 nm. Le ΔΨm était exprimé comme la proportion du signal de fluorescence rouge-vert ; les valeurs de baisse indiquent une dépolarisation mitochondriale.
Détermination du niveau d’ATP intracellulaire
La fonctionnalité mitochondriale a été évaluée par quantification intracellulaire de l’ATP à l’aide d’un kit de test ATP. Une réaction bioluminescente luciférine–luciférase a été employée pour déterminer la teneur en ATP, qui est directement proportionnelle à l’activité mitochondriale. En résumé, les cellules prélevées ont été resuspendues dans un tampon de lyse ATP glacé et conservées pendant une fenêtre de lyse de 5 minutes sur glace. La centrifugation a ensuite été effectuée à 12 000 × g pendant 5 minutes à 4 °C, après quoi 20 μL du surnageant obtenu a été transféré sur des microplaques blanches opaques à 96 puits. Par la suite, 100 μL de solution de travail de détection d’ATP fraîchement préparée — un mélange de réactif luciférase et de substrat de luciférine préparé selon le protocole fourni — ont été introduits dans chaque cavité. Le signal de luminescence résultant était rapidement capté avec un lecteur de microplaques de luminescence. Pour obtenir des niveaux relatifs d’ATP, les valeurs de luminescence brute ont été normalisées aux concentrations individuelles de protéines surnageantes quantifiées avec un kit commercial de test de protéines BCA, corrigeant ainsi les variations du nombre de cellules.
Détection de l’apoptose cellulaire par double coloration Annexin V/PI
La détection des cellules apoptotiques a été réalisée avec une configuration commerciale de test de mort cellulaire Annexin V-FITC/PI telle que définie par le fabricant. Après lavage, les granulés ont été resuspendus dans un tampon de liaison Annexin V-FITC à une densité cellulaire de 1 × 106 cellules/mL (195 μL par échantillon). Par la suite, chaque tube indépendant a reçu 5 μL d’Annexin V-FITC suivis de 10 μL de solution colorante PI. L’échantillon a été délicatement vortexé et incubé dans l’obscurité à température ambiante pendant 15 minutes. Suite à ce processus, les cellules apoptotiques étaient surveillées à l’aide d’un cytomètre en flux. Les canaux fluorescents respectifs facilitaient la différenciation entre les cellules viables (Annexin V⁻/PI⁻), les cellules apoptotiques précoces (Annexin V⁺/PI⁻) et les cellules apoptotiques/nécrotiques tardives (Annexin V⁺/PI⁺). Le pourcentage de cellules apoptotiques dans chaque groupe a été quantifié en suivant ces paramètres de verrouillage.
Tache occidentale
Les membranes ont été incubées toute la nuit à 4 °C avec des anticorps primaires contre Bcl-2, Bax, Caspase-3 clivée, AKT, p38 MAPK, JNK, ERK1/2 et GAPDH. Les anticorps ont été sélectionnés en fonction des informations de validation pour des échantillons humains et des applications western blot. Des RRID ont été ajoutés pour tous les anticorps dont les dossiers sont disponibles dans le Registre des Anticorps ou le portail RRID. Les niveaux de protéines cibles ont été normalisés en GAPDH. Après les protocoles de lavage standards, les taches ont été exposées à des anticorps secondaires conjugués au HRP pendant 1 heure à température ambiante. Les bandes ont été détectées à l’aide d’une solution de substrat ECL. Les valeurs de gris des bandes Western Blot ont été évaluées à l’aide d’un logiciel d’analyse d’images numériques.
Coloration par immunofluorescence
Les monocouches GES-1 ont été installées sur des bâtons de verre à l’intérieur de plaques à 24 puits avant les traitements indiqués. Après traitement, la fixation a été réalisée en utilisant du paraformaldéhyde à 4 % pendant 15 minutes à température ambiante, suivie d’une perméabilisation membranaire avec du Triton X-100 à 0,3 % en PBS pendant 10 minutes, puis d’un blocage avec de l’albumine sérique bovine à 5 % pendant 30 minutes à 37 °C. Les coverslips ont ensuite été transférés pour une incubation nocturne à 4 °C, avec des anticorps primaires ciblés vers AKT, p38, JNK et ERK. Après trois lavages PBS successifs, les échantillons ont été incubés pendant 1 heure à température ambiante avec un anticorps secondaire anti-lapin conjugué à la fluorescence protégé de la lumière. Un contre-coloration DAPI a été appliqué pendant 5 minutes pour visualiser les noyaux. Les couversets ont ensuite été montés avec un réactif anti-décoloration, et la collecte des données a été utilisée à l’aide d’un microscope laser confocal pour déterminer la distribution subcellulaire des protéines ciblées. Toutes les images d’immunofluorescence ont été capturées sous les mêmes paramètres d’imagerie à l’aide d’une lentille objective de 20×. Des barres d’échelle correspondant à 50 μm ont été ajoutées à toutes les images d’immunofluorescence représentatives.
Analyse statistique
Les valeurs quantitatives sont illustrées par la moyenne ± l’écart-type (DS), provenant d’au moins trois essais expérimentaux indépendants avec chaque échantillon vérifié en triple exemplaire. Les analyses statistiques ont été réalisées à l’aide d’outils spécialisés d’analyse numérique. Pour déterminer des variations distinctes entre plusieurs cohortes, nous avons utilisé l’analyse unidirectionnelle de la variance (ANOVA) en complément du test post hoc de Tukey pour les comparaisons intergroupes. Un seuil à deux queues de P < 0,05 de signification statistique désignée.
Accès restreint. Veuillez vous connecter ou commencer un essai pour afficher ce contenu.
Dissection bioinformatique des mécanismes médiés par le SQBJ dans l’ulcère gastrique
Pour explorer comment le SQBJ pourrait exercer ses actions pharmacologiques sur le GU, nous avons initialement prédit les cibles correspondant à ses constituants bioactifs primaires. Grâce à la programmation R, nous avons extrait et effacé les entrées redondantes parmi ces composants bioactifs, obtenant finalement 411 cibles candidates. Par la suite, des cibles pathologiques liées à G...
Accès restreint. Veuillez vous connecter ou commencer un essai pour afficher ce contenu.
L’objectif principal de cette étude était d’évaluer si le SQBJ, une formule classique de la MTC composée de Panax notoginseng et de Bletilla striata, possède une activité cytoprotectrice contre les lésions épithéliales de la muqueuse gastrique déclenchées par l’éthanol au sein d’un modèle cellulaire GES-1, avec une implication de la signalisation liée à PI3K/AKT et des réductions associées des médiateurs inflammatoires, des indicateurs de stress oxydatif, des dysfonctio...
Accès restreint. Veuillez vous connecter ou commencer un essai pour afficher ce contenu.
Les auteurs n’ont aucun conflit d’intérêts à déclarer.
Cette étude a été financée par le projet général du Plan de développement scientifique et technologique de la médecine traditionnelle chinoise provinciale du Jiangsu (2023), numéro de projet : MS2023118.
Accès restreint. Veuillez vous connecter ou commencer un essai pour afficher ce contenu.
| Nom | Entreprise | Numéro de catalogue | Commentaires |
|---|---|---|---|
| Test d'apoptose | Kit de détection de l'apoptose Annexine V-FITC/PI | Beyotime | C1062L |
| Test d'ATP | Kit d'analyse amélioré d'ATP | Beyotime | S0027 |
| Tampon | PBS | Solarbio | — |
| Réactif de digestion cellulaire | Trypsine-EDTA à 0,25 % | Gibco | 25200072 |
| Ligne cellulaire | cellules épithéliales de la muqueuse gastrique humaine GES-1 | Banque de cellules, Académie chinoise des sciences | SCSP-533 |
| Test de viabilité cellulaire | Réactif CCK-8 | — | — |
| Microscope confocal | Microscope confocal LSM 880 | Zeiss | LSM 880 |
| Milieu de culture | RPMI-1640 | Gibco | — |
| Kit ELISA | Kit ELISA CRP humain | R&D Systems | DCPR00 |
| Kit ELISA | Kit ELISA IL-6 humain | R&D Systems | DTAM00D |
| Kit ELISA | Kit ELISA TNF-α humain | R&D Systems | — |
| Cytomètre à flux | FACSCalibur / FACSCanto II | BD Biosciences | — |
| Matière végétale | Bletilla striata (Thunb. ex A. Murray) Rchb. f. (tubercule) | Marché de médecine traditionnelle chinoise d'Anguo | N° de bon BS-20240301 |
| Matière végétale | Panax notoginseng (Burk.) F. H. Chen (racine et rhizome) | Marché de médecine traditionnelle chinoise d'Anguo | N° de bon PN-20240301 |
| Matière végétale | Poudre Sanqi Baiji San | Préparation interne | N° de bon SQBJ-20240301 |
| Colonne HPLC | Colonne ZORBAX SB-C18 | Agilent Technologies | 4,6 mm × 250 mm, 5 μm |
| Système HPLC | Système HPLC 1260 Infinity II | Agilent Technologies | 1260 Infinity II |
| Anticorps secondaire IF | Anti-IgG de lapin conjugué à Alexa Fluor 594– | Invitrogen | A11012 |
| Microscope inversé | Microscope à contraste de phase inversé CKX41 | Olympus | CKX41 |
| Lecteur de luminiscence | Lecteur de microplaques Infinite 200 PRO | Tecan | Infinite 200 PRO |
| Membrane | Membrane PVDF | Millipore | IPVH00010 |
| Lecteur de microplaques | Lecteur de microplaques iMark | Bio-Rad | iMark |
| Kit de potentiel membranaire mitochondrial | Kit d'analyse JC-1 | Beyotime | C2006 |
| Coloration nucléaire | DAPI | Beyotime | C1002 |
| Plateforme en ligne | Plateforme de traçage bioinformatique en ligne | Plateforme d'analyse bioinformatique en ligne | Plateforme en ligne |
| Plateforme en ligne | Plateforme d'analyse d'enrichissement basée sur le Web | Metascape | Plateforme en ligne |
| Test de stress oxydatif | Kit d'analyse GSH | Beyotime | S0052 |
| Test de stress oxydatif | Kit d'analyse MDA | Beyotime | S0131 |
| Test de stress oxydatif | Kit d'analyse SOD | Beyotime | S0109 |
| Inhibiteur PI3K | LY294002 | MCE | S1105 |
| Médicament de contrôle positif | Oméprazole | MCE | HY-B0053 |
| Anticorps primaire | AKT | Cell Signaling Technology | 4691 |
| Anticorps primaire | Bax | Cell Signaling Technology | 5023 |
| Anticorps primaire | Bcl-2 | Cell Signaling Technology | 15071 |
| Anticorps primaire | Cleaved Caspase-3 Asp175 | Cell Signaling Technology | 9664 |
| Anticorps primaire | ERK1/2 | Cell Signaling Technology | 4695 |
| Anticorps primaire | GAPDH | Abcam | ab8245 |
| Anticorps primaire | JNK / SAPK-JNK | Cell Signaling Technology | 9252 |
| Anticorps primaire | p-AKT Ser473 | Cell Signaling Technology | 4060 |
| Anticorps primaire | p-ERK1/2 Thr202/Tyr204 | Cell Signaling Technology | 4370 |
| Anticorps primaire | p-JNK Thr183/Tyr185 | Cell Signaling Technology | 4668 |
| Anticorps primaire | p-p38 MAPK Thr180/Tyr182 | Cell Signaling Technology | 4511 |
| Anticorps primaire | p-PI3K p85 Tyr458 / p55 Tyr199 | Cell Signaling Technology | 4228 |
| Anticorps primaire | p38 MAPK | Cell Signaling Technology | 8690 |
| Anticorps primaire | PI3K p85 | Cell Signaling Technology | 4257 |
| Primer | AKT avant | — | — |
| Primer | AKT arrière | — | — |
| Primer | ERK avant | — | — |
| Primer | ERK arrière | — | — |
| Primer | GAPDH avant | — | — |
| Primer | GAPDH arrière | — | — |
| Primer | JNK avant | — | — |
| Primer | JNK arrière | — | — |
| Primer | p38 avant | — | — |
| Primer | p38 arrière | — | — |
| Primer | PI3K avant: | — | — |
| Primer | PI3K arrière | — | — |
| Inhibiteur de protéase | PMSF | Beyotime | ST506 |
| Test de protéine | Kit d'analyse de protéine BCA | Beyotime | P0010 |
| Tampon de lyse protéique | Tampon RIPA | Beyotime | P0013B |
| Base de données publique | DrugBank | DrugBank Online | Base de données en ligne |
| Base de données publique | GeneCards | Institut Weizmann des sciences | Base de données en ligne |
| Base de données publique | Hérédité mendélienne en ligne chez l'homme | Université Johns Hopkins | Base de données en ligne |
| Base de données publique | Base de données de composés PubChem | Centre national d'informations sur la biotechnologie | Base de données en ligne |
| Base de données publique | RCSB Protein Data Bank | RCSB PDB | Base de données en ligne |