Dispositif portatif pour le prétraitement de la salive afin d’améliorer la détection du cortisol

Résumé

Ce protocole décrit une méthode rapide de prétraitement de la salive pour améliorer la détection du cortisol. Un dispositif de filtration portatif est utilisé pour éliminer les mucines et autres substances gênantes tout en préservant l’analyte cible. La salive prétraitée présente un flux capillaire amélioré, permettant ainsi une performance de test plus constante et reproductible.

Résumé

La détection du cortisol salivaire offre une alternative non invasive à l’analyse sanguine. Cependant, sa mise en œuvre pratique reste limitée par la viscosité intrinsèque de la salive et la présence de composants interférents. En particulier, les mucines et les protéines salivaires entravent le flux capillaire et compromettent la fiabilité des tests de flux latéral (LFA) ultérieurs, nécessitant ainsi des stratégies de prétraitement efficaces et accessibles. Ici, nous présentons un dispositif portatif de prétraitement de la salive, appelé SaliFilter, pour la détection du cortisol au point de soins. L’appareil utilise un mécanisme de filtration qui élimine sélectivement les composants interférents de poids moléculaire élevé tout en permettant le passage de petites molécules, y compris le cortisol. Actionné par une pression manuelle simple, il permet un traitement rapide des échantillons (~2 min) sans nécessiter d’équipement externe, ce qui le rend adapté aux environnements décentralisés. Les performances de l’appareil ont été évaluées à l’aide de mesures de turbidité, de quantification des protéines et de SDS-PAGE, qui ont confirmé l’élimination efficace de la mucine et des protéines salivaires. Les échantillons traités ont présenté un flux capillaire amélioré, ce qui a permis un fonctionnement stable et fiable du LFA. L’analyse quantitative a démontré une meilleure reproductibilité du signal, et la détection du cortisol a atteint une limite de détection de 1,47 ng mL⁻¹ au-dessus des plages de concentration cliniquement pertinentes. Ce protocole établit une stratégie efficace de prétraitement de la salive qui améliore la sensibilité analytique et la fiabilité sans compromettre l’intégrité de l’analyte. L’approche proposée offre une solution pratique et portable pour le diagnostic à base de salive, avec une application potentielle pour les tests au point de prise en charge et l’auto-surveillance.

Introduction

Le cortisol, une hormone glucocorticoïde sécrétée par le cortex surrénal, est un biomarqueur clé pour évaluer le stress^{physiologique 1,2}. Elle peut être mesurée dans plusieurs fluides biologiques, notamment le sérum, le plasma, l’urine, le liquide interstitiel et la salive, le sang et la salive étant les plus couramment utilisés en pratique^{clinique 3}. Bien que les mesures sanguines fournissent des informations quantitatives fiables, elles nécessitent une ponction venaise invasive et un personnel formé, ce qui limite leur adéquation à un suivi fréquent ou longitudinal ^4,5,6. En revanche, la mesure du cortisol salivaire offre une alternative non invasive et pratique, permettant des applications de prise en charge et d’auto-surveillance ^7,8. Notamment, les niveaux de cortisol salivaire sont fortement corrélés aux concentrations sanguines, ce qui soutient la salive comme un échantillon substitutif^{fiable 9}. Cependant, la viscosité intrinsèque de la salive et la présence de composants interférents entravent significativement la performance analytique, nécessitant un prétraitement efficace avant l’analyse 10,11,12.

Diverses stratégies de prétraitement ont été explorées pour relever ces défis. La centrifugation est largement utilisée pour éliminer de gros composants tels que les mucines, les protéines et les débris cellulaires. Cependant, elle nécessite un équipement de laboratoire volumineux et de multiples étapes de traitement, ce qui limite son applicabilité dans des contextes^{décentralisés 13,14}. La dilution avec des solutions tampon peut réduire la viscosité et améliorer le débit^{de l’échantillon 15}. Néanmoins, cela réduit simultanément la concentration de l’analyte, compromettant ainsi la sensibilité analytique. En conséquence, les approches existantes restent insuffisantes pour les applications au point de soins, où un traitement rapide et sans équipement ainsi que la préservation des analytes cibles sont essentiels.

Pour surmonter ces limites, nous avons développé SaliFilter, un appareil portatif pour le prétraitement de la salive adapté à la détection du cortisol au point de soins. L’appareil utilise un mécanisme de filtration qui élimine sélectivement les substances interférantes de poids moléculaire élevé tout en permettant le passage de petites molécules, dont le^{cortisol 16}. Actionné manuellement, l’appareil permet un traitement rapide et convivial sans nécessiter d’instruments externes. En éliminant les composants interférents, cette approche améliore le flux capillaire dans les tests à flux latéral, renforçant ainsi la fiabilité analytique. Ce protocole décrit la fabrication de l’appareil et son application pour un prétraitement rapide de la salive avant la détection du cortisol à l’aide de tests à flux latéral.

Protocole

Une salive humaine en pool dé-identifiée obtenue commercialement a été utilisée dans cette étude. Aucun participant humain n’a été recruté, et aucune approbation éthique institutionnelle n’était requise.

1. Préparation d’échantillons de salive

1. Demandez aux participants de s’abstenir de manger ou de boire pendant au moins 30 minutes avant la collecte de l’échantillon.
2. Préparez l’échantillon de salive selon les instructions du fournisseur.
   REMARQUE : Cette étude a utilisé la salive humaine regroupée disponible dans le commerce pour une validation au niveau protocolaire.
3. Mélangez doucement l’échantillon de salive avant l’utilisation pour assurer l’homogénéité.
4. Conservez les échantillons de salive à 4 °C et utilisez-les dans la période de conservation recommandée par le fournisseur.

2. Préparation de la membrane recouverte de RBCM (Figure 1A)

1. Isoler les globules globulaires globulaires du sang total selon un protocole¹⁶ précédemment signalé.
   1. Utilisez l’anticoagulation du sang humain humain obtenu commercialement avec K2EDTA comme source de globule globulaire rouge.
   2. Centrifugez le sang entier à 800 × g pendant 5 minutes et collectez la fraction de globules rouges après avoir retiré le plasma et la couche buffy.
   3. Rincez la granule isolée de globules rouges trois fois avec une solution sériculaire 1× phosphate tamponnée (PBS) bien froide en mélangeant doucement manuellement.
   4. Reposez la granule de globules rouges lavés dans un PBS de 0,25× glacé pendant 30 minutes pour induire l’hémolyse.
   5. Séparez l’hémoglobine libre en centrifugant la suspension lysée à 20 000 × g pendant 30 minutes et en collectant le globule de globule globulaire globulaire (RBCM).
   6. Lavez la granule RBCM collectée trois fois supplémentaires avec 0,25× PBS et conservez la granule RBCM rose pâle à −80 °C jusqu’à une nouvelle utilisation.
2. Préparez une membrane en polyéthérsulfone (PES) d’une taille de pores de 30 nm et d’un diamètre de 13 mm.
3. Déposez 100 μL de solution de RBCM à 2 % (p/v) sur un côté de la membrane PES. Étalez doucement ou distribuez la solution goutte dans la goutte jusqu’à ce que toute la surface de la membrane soit complètement humide.
4. Incubez la membrane à 50 °C pendant 30 minutes pour assurer un revêtement et un séchage uniformes.
5. Conservez la membrane recouverte à température ambiante et utilisez-la dans les 15 jours suivant la^{préparation 17}.
   REMARQUE : La caractérisation détaillée de la membrane PES recouverte de RBCM a été décrite dans notre étude^{précédente 16}.

3. Fabrication du dispositif SaliFilter (Figure 1B)

1. Placez la membrane recouverte de RBCM dans le support filtre désigné.
2. Assemblez l’appareil en connectant solidement les composants d’entrée et de sortie.
3. Fixez une seringue de 1 mL à l’entrée de l’appareil.
   ATTENTION : Assurez-vous que tous les composants sont bien scellés pour éviter toute fuite pendant le fonctionnement.

4. Prétraitement de la salive

1. Chargez 500 μL de salive dans la seringue reliée à l’appareil SaliFilter.
2. Appliquez une pression manuelle douce pour faire passer l’échantillon de salive à travers la membrane (~ 2 min).
3. Récupérez la salive prétraitée dans la sortie.
4. Utilisez immédiatement l’échantillon prétraité ou conservez-le à 4 °C jusqu’à une analyse plus approfondie.

5. Analyse SDS-PAGE des protéines salivaires

1. Mélangez 15 μL de l’échantillon avec 5 μL de tampon de Laemmli.
2. Chargez le mélange dans des puits séparés d’un gel SDS-PAGE à 8 %.
3. Effectuez l’électrophorèse à 150 V pendant 40 minutes.
4. Teindre le gel avec du bleu Coomassie pendant 2 heures.
5. Retirez le gel dans de l’eau distillée toute la nuit.
6. Capturez des images du gel à l’aide d’un smartphone ou d’un système d’imagerie.

6. Détection du cortisol par test de flux latéral (LFA)

1. Appliquez 150 μL de salive prétraitée sur le coussinet échantillon de la bande LFA.
2. Laissez l’échantillon migrer le long de la bande pendant 10 minutes.
3. Capturez des images des résultats des tests à l’aide d’un smartphone ou d’un système d’imagerie.
4. Ouvrez l’image LFA dans ImageJ et utilisez Image > Couleur > Split Channels pour séparer les canaux RGB.
5. Utilisez l’image du canal vert pour l’analyse de l’intensité des lignes de test.
6. Sélectionnez une région d’intérêt (ROI) rectangulaire de 100 × 10 pixels couvrant la ligne de test et appliquez la même taille ROI à toutes les images en bande.
7. Mesurez la valeur moyenne d’intensité du ROI de la ligne de test. Sélectionnez une région membranaire vierge adjacente avec la même taille de ROI et mesurez l’intensité de fond.
8. Calculer l’intensité normalisée de la ligne d’essai comme suit : intensité normalisée = intensité de la ligne d’essai − intensité de fond.

7. Analyse statistique

1. Présentez les données quantitatives comme moyenne ± écart-type (DS), sauf indication contraire. Définissez les barres d’erreur comme SD.
   REMARQUE : Dans cette étude, toutes les valeurs de N rapportées représentent des réplications techniques réalisées à l’aide d’aliquotes de salive humaine regroupée commercialement obtenue.
2. Effectuer une analyse de régression linéaire en utilisant les valeurs d’intensité normalisées de la ligne d’essai obtenues à partir de concentrations de cortisol de 0 à 8 ng ^mL−1 et calculer le coefficient de détermination (R²) à partir de la courbe ajustée.
3. Calculez la limite de détection (LOD) à l’aide de l’équation suivante : LOD = 3,3 × SE / |pente|, où SE est l’erreur standard de l’intercept y et |pente| est la valeur absolue de la pente obtenue à partir de l’équation de régression linéaire. Utilisez la valeur absolue de la pente car le LFA compétitif produit une pente négative.
   REMARQUE : Dans cette étude, aucun test statistique inférentiel n’a été réalisé et aucun critère de signification n’a été appliqué.

Résultats

Un prétraitement efficace de la salive nécessite de retirer les composants interférents, y compris les mucines et les protéines, qui compromettent la performance analytique en aval. La capacité de filtration de SaliFilter a d’abord été évaluée en comparant les variations de turbidité avec celles obtenues à l’aide de kits de collecte de salive commerciaux (Figure 2A). La salive non traitée présentait une forte turbidité, tandis que les échantillons traités au...

Discussion

Les diagnostics à base de salive offrent une alternative non invasive à l’analyse sanguine. Cependant, leur adoption plus large a été limitée par la viscosité intrinsèque de la salive et la présence de composants interférents tels que les mucines et les protéines. Ces facteurs perturbent le flux capillaire et compromettent la performance de plateformes analytiques simples, y compris les LFA, nécessitant ainsi un prétraitement efficace de l’échantillon.

Dans ce...

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Saliva artificielle	Solarbio, Chine	A7990
Réactif de colorant d'analyse des protéines Bio-Rad	Bio-Rad, États-Unis	5000006	Pour l'analyse Bradford
Bleu de Coomassie	Abcam, Royaume-Uni	ab119211	Pour la visualisation des bandes de protéines
Kit ELISA pour le cortisol	Abcam, Royaume-Uni	ab154996
LFA pour le cortisol	Interne
Planche chauffante	Daihan Scientific, République de Corée)
Hydrocortisone (cortisol)	Sigma-Aldrich, États-Unis	PHR1014
Tampon d'échantillon Laemmli	GenDEPOT, États-Unis	L1200-001	Pour la dénaturation des protéines avant la SDS-PAGE
Porte-membrane	GVS Filter Technology	1220950	Porte-membrane de 13 mm de diamètre
Mini-PROTEAN® Tetra Cell pour gels de 0,75 mm	Bio-Rad, États-Unis	1658000	Pour l'électrophorèse sur gel
Mucine	Sigma-Aldrich, États-Unis	M2378
Spectrophotomètre NanoDrop 2000	Thermo Fisher Scientific, États-Unis		Pour l'analyse des protéines
Membranes PES	STERLITECH, États-Unis	PES00313100	Membrane PES de 0,03 micron, 13 mm
Tampon phosphate (PBS)	DUKSAN, République de Corée	LB004
Saliva humaine poolée	Innovative Research Inc., États-Unis	IRHUSL5ML
RBCM	Interne
Tampon de gel de résolution pour PAGE	Bio-Rad, États-Unis	1610798	Pour la préparation du gel de résolution
Salivette Cortisol	SARSTEDT, Allemagne	51.1534.500	Kit de collecte de salive
Tampon de gel de concentration pour PAGE	Bio-Rad, États-Unis	1610799	Pour la préparation du gel de concentration
Super•SAL™	Oasis Diagnostics, États-Unis	SSAL-601	Kit de collecte de salive
Seringue	koreavaccine, République de Corée)		Volume de 1 mL
TEMED	Bio-Rad, États-Unis	1610800	Pour la polymérisation de l'acrylamide