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La modification par N6-méthyladénosine de Rab27A favorise l’ostéoporose en influençant la différenciation des ostéoclastes dans le modèle murin ovariectomisé

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DOI :

10.3791/71964

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11 août 2026

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1Department of Orthopedics, Affiliated Hospital of Southwest Medical University, 2Department of Orthopedics, The People's Hospital of Pengzhou, 3Department of Clinical Skills Center, Affiliated Hospital of Southwest Medical University, 4Southwest Medical University, 5Stem Cell Immunity and Regeneration Key Laboratory of Luzhou, Affiliated Hospital of Southwest Medical University

* These authors contributed equally

Dans cet article

Résumé

YTHDC1 favorise l’exportation cytoplasmique de Rab27A modifié par m6A, tandis que IGF2BP2 stabilise Rab27A dans le cytoplasme, renforçant ainsi la différenciation des ostéoclastes et contribuant à l’ostéoporose.

Résumé

Le développement de nouvelles thérapies pour l’ostéoporose a suscité une attention croissante. Rab27A est surélevé lors de la différenciation des ostéoclastes, et la modification de la N6-méthyladénosine (m6A) est devenue un régulateur épigénétique important dans les maladies orthopédiques. Des analyses bioinformatiques ont prédit que Rab27A contient plusieurs sites de modification de m6A et interagit avec plusieurs protéines associées à m6A. Des expériences de knockdown ont été menées pour évaluer le rôle de Rab27A dans la différenciation des ostéoclastes et l’ostéoporose à l’aide d’un modèle murin ovariectomisé (OVX). La déplétion de Rab27A a atténué l’ostéoporose et augmenté le pourcentage de formation osseuse de 14,73 % à 28,13 % (P < 0,05) chez les souris OVX. Le Western blot et la PCR quantitative ont démontré que le knockdown de Rab27A réduisait l’expression des marqueurs ostéoclastes TRAP, NFATc1 et c-FOS, supprimant ainsi la différenciation des ostéoclastes des macrophages dérivés de la moelle osseuse (BMM) induits par le facteur stimulant de colonie macrophage (M-CSF) et l’activateur récepteur du ligand du facteur nucléaire-κB (RANKL). La coloration TRAP a également montré que la déplétion de Rab27A réduisait significativement l’activité TRAP de 24,1 % à 12,9 % (P < 0,01) après l’induction de M-CSF et RANKL. Les tests d’immunoprécipitation à ARN ont confirmé les interactions entre Rab27A et les protéines lectrices m6A YTHDC1 et IGF2BP2. Le fractionnement nucléaire et cytoplasmique a démontré que YTHDC1 facilite l’exportation cytoplasmique de Rab27A modifié par m6A. De plus, les analyses q-PCR et western blot ont montré que la réduction de YTHDC1 ou de IGF2BP2 réduisait l’expression de Rab27A et diminuait celle de TRAP, NFATc1 et c-FOS, supprimant ainsi la différenciation des ostéoclastes induite par M-CSF et RANKL. Collectivement, ces résultats indiquent que l’exportation cytoplasmique médiée par YTHDC1 et la stabilisation médiée par IGF2BP2 de Rab27A modifié par m6A favorisent la différenciation des ostéoclastes et contribuent à la perte osseuse dans le modèle murin OVX.

Introduction

L’ostéoporose (OP) est un trouble squelettique courant caractérisé par une détérioration de la microarchitecture osseuse et une réduction de la densité minérale osseuse, entraînant un risque accru de fractures dans lemonde entier 1,2,3. Les fractures ostéoporotiques surviennent le plus fréquemment à l’avant-bras, à l’humérus, à la hanche et à la colonne vertébrale, et sont particulièrement fréquentes chez les personnes âgées. Ces fractures nuisent considérablement à la qualité de vie et imposent d’importants fardeaux physiques, psychologiques et socioéconomiques aux patients, à leurs familles et aux systèmesde santé 3. Par conséquent, la prévention, la prise en charge et le traitement de l’ostéoporose restent des priorités majeures en tant que clinique et santé publique.

Diverses stratégies thérapeutiques ont été développées pour l’ostéoporose et peuvent généralement être classées en deux catégories : agents formateurs osseux et thérapies anti-résorptives 4,5. Les médicaments anti-résorptifs traditionnels incluent les bisphosphonates, le raloxifène et le ranélate de strontium, tandis que les agents plus récents incluent le dénosumab, l’odanacatib et le saracatinib. Les thérapies formatrices osseuses incluent l’hormone parathyroïdienne (PTH 1–84), tandis que plusieurs autres candidats, tels que MK-5442, AMG 785 et BHQ 880, sont en cours de développementclinique 5. Bien que ces traitements puissent être efficaces, beaucoup sont associés à des effets indésirables importants, à une efficacité limitée à long terme ou à des restrictions sur une utilisationprolongée 4,6,7,8,9. Par exemple, l’administration à long terme d’aminobisphosphonates et de dénosumab peut altuer le remodelage osseuxnormal 5. Par conséquent, identifier des cibles thérapeutiques plus sûres et plus efficaces reste un objectif important dans la recherche sur l’ostéoporose.

Les protéines Rab sont des régulateurs clés du trafic intracellulaire des vésicules et de la signalisation cellulaire, et participent à divers processus biologiques, notamment l’infection virale, l’autophagie et l’organisation ducytosquelette 10. Ces dernières années, une attention croissante a été portée sur le rôle des protéines de la famille Rab dans le métabolisme osseux et l’ostéoporose. Il a été rapporté que Rab44 régule la différenciation des ostéoclastes en modulant la signalisation intracellulaire Ca2⁺ et le facteur nucléaire activateur des lymphocytes T 1 activés (NFATc1) dans l’activateur récepteur des macrophages 11 traités au ligand facteur nucléaire κB (RANKL). Les ostéoclastes sont des cellules multinucléées dérivées des précurseurs de la lignée macrophage et jouent des rôles essentiels dans la résorption osseuse et l’homéostasiesquelettique 12,13,14,15,16,17,18,19. Par conséquent, comprendre les mécanismes moléculaires régissant la différenciation des ostéoclastes est essentiel pour développer de nouvelles approches thérapeutiques pour l’ostéoporose.

Rab27A est un membre important de la famille des GTPases Rab et s’exprime largement dans les cellules sécrétoires et immunitaires. Il joue un rôle clé dans le transport des vésicules, l’exocytose et la signalisation intracellulaire 20,21,22,23,24,25,26,27. Des études antérieures ont démontré que Rab27A régule la dégranulation des éosinophiles lors de l’inflammation des voies respiratoires et contrôle la mobilisation vésiculaire associée à l’activité de la NADPH oxydase dans les macrophagesactivés 20.23. Notamment, les preuves accumulées indiquent que l’expression de Rab27A est significativement surélevée lors de la différenciation des ostéoclastes. Shimada-Sugawara et al. ont rapporté que l’expression de Rab27A augmente lors de la différenciation des macrophages dérivés de la moelle osseuse (BMM) en ostéoclastes, suggérant un rôle potentiel dans l’ostéoclastogenèse28. Collectivement, ces résultats suggèrent que Rab27A peut influencer la formation et la fonction des ostéoclastes en régulant le trafic vésiculaire et les voies de signalisation intracellulaire28,29.

La N6-méthyladénosine (m6A) est la modification interne d’ARN la plus abondante dans les ARN messagers eucaryotes et les ARN non codants, et sert de régulateur critique du métabolisme de l’ARN et de l’expression génique. En tant que première modification d’ARNm identifiée chez les mammifères, le m6A a été impliqué dans de nombreux processus biologiques, notamment la stabilité, le splicing, le transport et la traduction de l’ARN. Wang et al. ont démontré que les modifications m6A, couramment présentes dans des motifs de séquence conservés, sont reconnues par les protéines contenant le domaine YTH et contribuent à la régulation de la stabilité et du métabolisme del’ARNm 30. De plus, la modification m6A a été impliquée dans diverses fonctions biologiques, notamment la stabilité du génome, la régulation transcriptionnelle, l’organisation de la chromatine, la progression du cancer et les réponsesimmunitaires 31. Des études récentes ont également mis en lumière des rôles importants de la signalisation m6A dans les maladies osseuses etl’ostéoporose 32.

Parmi les protéines lectrices m6A, YTHDC1 agit comme un lecteur nucléaire qui régule le traitement de l’ARN et l’exportation nucléaire, tandis que la protéine liante à l’ARNm 2 (IGF2BP2), un facteur de croissance insulino-type 2 stabilise les transcriptes modifiés par m6A dans le cytoplasme. Chen et al. ont démontré que YTHDC1 favorise l’exportation nucléaire de circNSUN2 modifié par m6A, qui interagit ensuite avec IGF2BP2 pour stabiliser l’ARNm de HMGA2 etfavoriser la métastase 33 du cancer colorectal. Ces résultats suggèrent que la régulation coordonnée par YTHDC1 et IGF2BP2 pourrait représenter un mécanisme général contrôlant le destin des transcripts modifiés par m6A.

La présente étude a étudié les sites de modification de m6A prédits dans l’ARNm Rab27A et a examiné ses interactions avec YTHDC1 et IGF2BP2. Il a été constaté que YTHDC1 facilitait l’exportation nucléaire de transcrits de Rab27A modifiés par m6A, tandis que IGF2BP2 interagissait avec Rab27A dans le cytoplasme et améliorait sa stabilité. Grâce à ce mécanisme régulateur, Rab27A a favorisé la différenciation des ostéoclastes et a contribué à la progression de l’ostéoporose. Collectivement, les résultats identifient une voie régulatrice dépendante de m6A auparavant non reconnue, impliquant YTHDC1, IGF2BP2 et Rab27A dans la différenciation des ostéoclastes. Ces résultats apportent de nouvelles perspectives sur la pathogenèse moléculaire de l’ostéoporose et pourraient faciliter le développement de nouvelles stratégies thérapeutiques ciblant la régulation médiée par m6A de Rab27A.

Protocole

Toutes les procédures animales ont été approuvées par le Comité de Protection et d’Utilisation des Animaux de l’Hôpital affilié de la Southwest Medical University (Approbation n° 2024-Éthique-042). Toutes les expériences ont été menées conformément aux directives ARRIVE, à la loi britannique sur les Animaux (Procédures scientifiques) de 1986 et aux directives associées, à la directive européenne 2010/63/UE, ainsi qu’au Guide des National Institutes of Health pour le soin et l’utilisation des animaux de laboratoire (publication n° 8023 des NIH, révisée en 1978). Les souris ont été assignées au hasard à des groupes expérimentaux, et la séquence d’allocation a été dissimulée au chercheur. Toutes les acquisitions et analyses de données, y compris l’évaluation histologique, l’analyse d’images par tomodensitométrie (micro-CT) et les analyses statistiques, ont été réalisées par des chercheurs aveuglés à l’allocation des groupes. Aucun animal ni échantillon n’a été exclu des analyses. Tous les réactifs, équipements, logiciels et autres ressources utilisés dans ce protocole sont listés dans le Tableau des matériaux.

1. Construction du modèle d’ovariectomie (OVX)

Vingt-quatre femelles sauvages de type C57BL/6 âgées de 8 semaines ont été utilisées pour établir un modèle d’ostéoporose. Après une période d’acclimatation d’une semaine, les souris ont été assignées aléatoirement soit au groupe Sham, soit au groupe OVX. Le modèle OVX a été établi par ovatrice-ovariectomie bilatérale comme décritprécédemment 34,35. Les souris opérées par simulacre subissaient une exposition chirurgicale des ovaires sans retraite.

Pour la délivrance du gène intra-fémoral, des vecteurs lentiviraux exprimant sh-Rab27A ou sh-NC ont été injectés 7 jours après la chirurgie OVX, comme précédemmentrapporté 36,37. En résumé, des particules lentivirales concentrées (1 ×10 6 unités de transduction/mL) ont été injectées dans le fémur par la voie rotulienne à l’aide d’une aiguille de calibre 22 sous anesthésie. Chaque souris a reçu 20 μL de suspension lentivirale. L’incision a ensuite été suturée et les animaux ont été surveillés tout au long de la convalescence.

Toutes les expériences animales ont été réalisées dans des conditions spécifiques sans agents pathogènes. Des échantillons fémoraux ont été prélevés 8 semaines après l’opération. Au moins six souris par groupe ont été utilisées pour des analyses histologiques et l’extraction d’ARN ou de protéines.

2. Imagerie micro-CT in vivo

Une micro-tomodensitométrie (micro-CT) a été réalisée pour évaluer la morphologie osseuse trabéculaire. Le tibia droit de chaque souris a été scanné in vivo avant la chirurgie OVX à 14 semaines. Des examens de suivi étaient effectués chaque semaine jusqu’à 22 semaines. Au moins six souris par groupe ont été incluses dans l’analyse micro-CT.

Les souris ont été anesthésiées avec un pentobarbital sodique intraperitonéal (50 mg/kg de poids corporel). Une anesthésie adéquate a été confirmée par l’absence du réflexe de pincement de l’orteil et par une surveillance continue de la fréquence respiratoire, et elle a été maintenue tout au long de la procédure d’imagerie. Toutes les procédures d’euthanasie ont été menées conformément au protocole animalier approuvé, aux directives institutionnelles sur le bien-être animal et aux réglementations nationales pour l’euthanasie des animaux de laboratoire.

À 24 semaines, les souris ont été euthanasiées par luxation cervicale après anesthésie profonde, et les deux tibias ont été prélevées pour un scanner ex vivo selon le même protocole d’imagerie. Les paramètres de balayage comprenaient une taille voxel de 10,4 μm, une tension de 55 kV, un courant de 145 μA, un champ de vision de 32 mm, 1500/750 échantillons par projection, et un temps d’intégration de 100 ms.

Les images étaient traitées à l’aide d’un algorithme de correction par durcissement de faisceau polynomial de troisième ordre, calibré selon un fantôme de 1200 mg HA/cm3 . La fraction volumique osseuse (BV/TV), l’épaisseur trabéculaire (Tb.Th) et le nombre trabéculaire (Tb.N) ont été quantifiés dans la métaphyse distale du fémur située à 1,0 mm proximal de la plaque de croissance.

3. Transfection plasmidique

Des plasmides sh-Rab27A et sh-NC ont été générés et utilisés pour la production de lentivirus. Les plasmides d’emballage lentiviral et les constructions d’arnômes de shRNA ont été co-transfectés dans HEK293T cellules selon les instructions du fabricant. Les titres viraux ont été déterminés avant administration intra-fémorale comme décritprécédemment 36. Trois répliques biologiques indépendantes ont été réalisées.

4. Coloration à l’hématoxyline et à l’éosine (HE)

Les échantillons fémoraux ont été fixés dans du paraformoldéhyde à 4 % pendant 24 heures, décalcifiés en EDTA à 10 % pendant 4 semaines, cryoprotégés dans 30 % de saccharose/PBS, intégrés dans la paraffine et sectionnés à une épaisseur de 5 μm. Les coupes tissulaires ont été colorées à l’hématoxyline et à l’éosine et examinées au microscope optique. Au moins six souris par groupe ont été analysées.

5. Coloration par phosphatase acide résistante au tartrate (TRAP)

La coloration par TRAP des sections fémorales a été réalisée conformément aux instructions dufabricant 38. L’activité TRAP dans les macrophages dérivés de la moelle osseuse (BMM) a été évaluée à l’aide d’un test de coloration TRAP. Les ostéoclastes matures ont été définis comme des cellules multinucléées TRAP-positives contenant au moins trois noyaux. Trois réplications biologiques indépendantes ont été réalisées, chacune avec trois répliques techniques.

6. q-PCR

L’ARN total a été isolé à l’aide d’un réactif TRIzol selon les instructions du fabricant. L’ADN complémentaire a été synthétisé à l’aide de transcriptase inverse et soumis à une PCR quantitative en temps réel à l’aide de la chimie verte SYBR. Trois réplications biologiques indépendantes ont été réalisées, chacune avec trois répliques techniques.

Les séquences d’amorces étaient les suivantes :

RAB27A : F, TTCCTGCTTCTGTTCGACCT ; R, GGCAGCACTGGTTTCAAAT

TRAP : F, TGTTGACAGCGGTCCATCATTA ; R, CCTCCTTCTTAACCCGAAGC

NFATc1 : F, GGTGCTGTCTCTCCATAACT ; R, GCGGAAAGGTGGTATCTCAA

C-FOS : AILIER, TACTACCATTCCCCAGCCGA ; R, GCTGTCACCGTGGGGATAAA

YTHDC1 : F, GAAGTGGAAGCTCTGCATCAG ; R, TTGATCTTTTCGGACAGCACG

IGF2BP2 : F, GACTACCCCGACCAGAACTG ; R, GAGGCGGGATGTTCCGAATC

β-actine : F, GGGAAATCGTGCGTGACATTAAG ; R, TGTGTTGGCGTACAGGTCTTTG

7. Plaque western

Les cellules ou tissus ont été lysés à l’aide d’un tampon RIPA complété par des inhibiteurs de protéase. Les concentrations en protéines ont été déterminées à l’aide d’un test de Bradford. Des quantités égales de protéines (20 μg) ont été séparées par SDS-PAGE et transférées dans des membranes de polyvinylidène fluorure (PVDF) ou de nitrocellulose. Les membranes ont été bloquées avec 5 % de lait écrémé pendant 1 h à température ambiante et incubées toute la nuit à 4 °C avec des anticorps primaires contre TRAP, NFATc1, c-FOS, Rab27A, YTHDC1, IGF2BP2 ou β-actine. Après lavage, les membranes ont été incubées avec les anticorps secondaires appropriés pendant 1 h à température ambiante. Les bandes protéiques ont été visualisées à l’aide de procédures de détection standard. Trois répliques biologiques indépendantes ont été réalisées.

8. Culture cellulaire

Les macrophages dérivés de la moelle osseuse (BMM) ont été isolés comme décritprécédemment 39. Les cellules de moelle osseuse prélevées sur des fémurs de souris ont été cultivées pendant la nuit dans un milieu essentiel α minimum complété avec 10 % de sérum fœtal bovin, 30 ng/mL de facteur stimulant la colonie macrophage (M-CSF) et 1 % de pénicilline/streptomycine à 37 °C dans une atmosphère humidifiée contenant 5 % de CO₂. Des cellules non adhérentes ont été collectées et cultivées dans un système stromal sans cellules contenant 30 ng/mL DE M-CSF. Après 3 jours, les cellules adhérentes ont été prélevées sous forme de BMM et ensuite cultivées en présence de 30 ng/mL de m-csf et d’activateur du récepteur à 50 ng/mL du ligand du facteur nucléaire-κB (RANKL) pendant 72 heures afin d’induire la différenciation des ostéoclastes.

9. Interférence ARN (ARNi)

De petits ARN interférents (siRNA) ont été synthétisés et transfectés à l’aide d’un réactif de transfection à base de lipides selon les instructions du fabricant. Les cellules ont été ensemencées à une densité de 2 ×10 4 cellules par puits dans des plaques à six puits avant la transfection. Trois répliques biologiques indépendantes ont été réalisées.

Les séquences de cibles étaient les suivantes :

si-Rab27A : GGACUUAAUCAUCTAAGAGAAUGGAA

si-YTHDC1 : GCAAGGAGUGUUAUCUUAATT

si-IGF2BP2 : CCGUUAACCAACAAGCCAATT

10. Immunofluorescence

Les cellules ont été fixées avec 4 % de paraformoldéhyde pendant 20 minutes et perméabilisées avec 0,1 % de Triton X-100 pendant 10 minutes. Après un blocage avec 5 % d’albumine sérique bovine pendant 30 minutes, les cellules ont été incubées avec des anticorps primaires pendant la nuit à 4 °C.

Après lavage, des anticorps secondaires conjugués au fluorophore ont été appliqués pendant 30 minutes à température ambiante. Les noyaux ont été contre-colorés avec DAPI, et des images ont été acquises à l’aide de la microscopie confocale. Trois répliques biologiques indépendantes ont été réalisées.

11. Séparation nucléaire et cytoplasmique

Les fractions nucléaires et cytoplasmiques ont été isolées selon les instructions du fabricant. Les cellules ont été lysées sur glace pendant 10 minutes puis centrifugées à 500 × g pendant 3 minutes à 4 °C. Le surnageant contenant les composants cytoplasmiques a été collecté, tandis que le noyau contenant la pelote a été lavé et traité séparément.

12. Immunoprécipitation des protéines de liaison à l’ARN (RIP)

Les tests d’immunoprécipitation à ARN (RIP) ont été réalisés selon les instructions du fabricant. Pendant un instant, les cellules ont été lysées sur la glace pendant 30 minutes. Après centrifugation, les surnatants ont été incubés toute la nuit avec des anticorps et des perles d’agarose protéique A/G. Après le lavage, les protéines immunoprécipitées ont été analysées par western blotting, et l’ARN co-immunoprécipité a été analysé par PCR quantitative en temps réel. Trois répliques biologiques indépendantes ont été réalisées.

13. Essai de stabilité de l’ARNm Rab27A

L’ARN total a été extrait aux moments indiqués après IGF2BP2 knockdown. Une transcription inversée et une PCR quantitative en temps réel ont ensuite été réalisées. Les niveaux d’ARNm de Rab27A ont été normalisés au groupe si-NC correspondant à 0 h. Trois répliques biologiques indépendantes ont été réalisées.

14. Analyse statistique

Toutes les expériences ont été réalisées indépendamment en utilisant au moins trois réplications biologiques. Pour la q-PCR, l’interférence ARN, la coloration TRAP, le western blotting et d’autres tests cellulaires, chaque réplication biologique comprenait trois réplications techniques sauf indication contraire. Les données sont présentées sous forme de la moyenne ± de l’écart-type (DE).

Les analyses statistiques ont été réalisées à l’aide de GraphPad Prism version 9.0 et du logiciel SPSS. Des comparaisons entre deux groupes ont été réalisées à l’aide d’un test t de Student à deux queues. Les comparaisons entre plusieurs groupes ont été analysées à l’aide d’une analyse bidirectionnelle de la variance (ANOVA), suivie du test de comparaison multiple post-hoc de Tukey pour ajuster les comparaisons multiples. Une valeur P < 0,05 était considérée comme statistiquement significative.

Résultats

La réduction de Rab27A a réduit l’ostéoporose in vivo.

Pour étudier le rôle de Rab27A dans l’ostéoporose, un knockdown de Rab27A a été réalisé dans un modèle murin ovariectomisé (OVX) établi à l’aide de méthodes précédemmentrapportées 34,40. Le plan global de l’étude est résumé à la Figure 1. L’analyse par tomodensitométrie micro a montré que la densité minérale osseuse, la fraction de volume osseuse (BV/TV), l’épaisseur du trabéculaire (Tb.Th) et le nombre de trabéculaires (Tb.N) étaient significativement réduits chez les souris OVX comparées aux témoins de Sham (Figure 2A). Ces résultats ont confirmé la mise en place réussie du modèle de l’ostéoporose. Le knockdown de Rab27A a significativement restauré tous les paramètres structurels osseux mesurés, indiquant une atténuation de la perte osseuse induite par OVX et de la détérioration microarchitecturale (Figure 2A).

L’examen histologique a également confirmé ces résultats. La coloration de l’hématoxyline et de l’éosine a révélé une perte osseuse trabéculaire marquée et une perturbation de l’architecture trabéculaire chez les souris OVX par rapport au groupe de Sham (Figure 2B). En revanche, la déplétion de Rab27A a atténué la détérioration trabéculaire et partiellement restauré la morphologie osseuse (Figure 2B). Puisque Rab27A est impliqué dans la différenciation desostéoclastes 28, l’activité des ostéoclastes a été évaluée par coloration par phosphatase acide résistante au tartrate (TRAP). L’activité des TRAP était nettement élevée chez les souris OVX par rapport aux témoins Sham et significativement réduite après le knockdown de Rab27A (Figure 2C).

L’expression des marqueurs associés à l’ostéoclaste a ensuite été examinée. L’analyse Western blot a montré que les niveaux de protéines Rab27A, TRAP, NFATc1 et c-FOS étaient significativement augmentés chez les souris OVX et réduits après la déplétion de Rab27A (Figure 2D). Des résultats cohérents ont été obtenus au niveau transcriptionnel, la PCR quantitative en temps réel (q-PCR) montrant des schémas d’expression similaires pour l’expression d’ARNm Rab27A, TRAP, NFATc1 et c-FOS (Figure 2E).

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Figure 1 : Aperçu schématique du plan expérimental et du mécanisme de régulation proposé sous-jacent à la régulation médiée par YTHDC1 et IGF2BP2 de Rab27A modifié par m6A lors de la différenciation des ostéoclastes et de la progression de l’ostéoporose. Un modèle murin ovariectomisé (OVX) et un activateur des récepteurs induit par le ligand nucléaire κB (RANKL) et le facteur stimulant de colonie de macrophages (M-CSF) ont été utilisés pour étudier le rôle de Rab27A dans l’ostéostogenèse. Des tests de démontage de Rab27A, de fractionnement nucléaire et cytoplasmique, ainsi que d’immunoprécipitation à ARN ont été réalisés pour évaluer les marqueurs de différenciation des ostéoclastes (TRAP, NFATc1 et c-FOS), l’expression de Rab27A et la localisation subcellulaire. YTHDC1 a facilité l’exportation cytoplasmique de Rab27A modifié par m6A, tandis que IGF2BP2 stabilisait Rab27A dans le cytoplasme. Ensemble, ces mécanismes régulateurs coordonnés favorisaient la différenciation des ostéoclastes et contribuaient à la perte osseuse dans le modèle OVX. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figurine.

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Figure 2 : Le déplacement de Rab27A a réduit l’ostéoporose in vivo. (A) Analyse morphométrique des os trabéculaires. La densité minérale osseuse, la fraction de volume osseuse (BV/TV), l’épaisseur du trabéculaire (Tb.Th) et le nombre de trabéculaires (Tb.N) ont été quantifiés. **P < 0,01, ***P < 0,001. (B) Évaluation histologique de l’os trabéculaire fémoral après l’épuisement de Rab27A. Une coloration par hématoxyline et éosine (HE) a été réalisée pour évaluer les modifications structurelles du fémur distal. Les groupes OVX et OVX + sh-NC servaient de témoins. Barre d’échelle = 50 μm. ***P < 0,001. (C) Coloration par TRAP des sections fémorales. L’activité TRAP a été évaluée pour évaluer l’activité ostéoclaste. Les groupes OVX et OVX + sh-NC servaient de témoins. Barre d’échelle = 50 μm. ***P < 0,001. (D–E) Expression de Rab27A, TRAP, NFATc1 et c-FOS après l’épuisement de Rab27A. L’expression des protéines était déterminée par western blotting (D), et l’expression de l’ARNm par q-PCR (E). β-actine servait de contrôle de chargement. **P < 0,01, ***P < 0,001. Le groupe Sham a subi une exposition chirurgicale des ovaires sans ovaire, tandis que le groupe OVX a subi une ovatrice-ovaire bilatérale. sh-NC, contrôle négatif à l’ARN en épingle courte. Six souris ont été incluses dans chaque groupe expérimental. Les données sont présentées en moyenne ± SD. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Knockdown de Rab27A a supprimé la différenciation des ostéoclastes des BMM induite par le M-CSF et le RANKL

Pour évaluer davantage le rôle de Rab27A lors de l’ostéostogenèse, les macrophages dérivés de la moelle osseuse (BMM) ont été stimulés avec le facteur stimulant de colonie de macrophages (M-CSF) et un activateur récepteur du ligand facteur nucléaire-κB (RANKL) pour induire la différenciation desostéoclastes 28.

Des analyses quantitatives en temps réel et des analyses western blot ont montré que la stimulation du M-CSF et du RANKL augmentait significativement l’expression de l’ARNm et des protéines de Rab27A, tandis que la transfection avec si-Rab27A réduisait effectivement l’expression de Rab27A (Figures 3A, B). La coloration TRAP a montré une augmentation marquée de l’activité ostéoclaste après le traitement au M-CSF et au RANKL. Le knockdown de Rab27A a significativement réduit l’activité TRAP par rapport au groupe induit (Figure 3C).

L’expression des marqueurs de différenciation des ostéoclastes a ensuite été examinée. L’analyse quantitative en temps réel par PCR a montré que les niveaux d’ARNm de TRAP, NFATc1 et c-FOS ont été significativement augmentés après l’induction de l’ostéoclaste et ont été réduits par l’épuisement de Rab27A (Figure 3D). Des résultats similaires ont été observés au niveau des protéines par western blotting (Figure 3E).

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Figure 3 : Knockdown de la différenciation ostéoclaste supprimée par Rab27A des macrophages dérivés de la moelle osseuse (BMM) induite par le M-CSF et le RANKL. (A–B) Expression de Rab27A après induction de l’ostéoclaste. Les niveaux d’ARNm (A) et de protéines (B) de Rab27A ont été déterminés respectivement par q-PCR et Western blotting. β-actine servait de contrôle de chargement. P < 0,001. (C) Coloration TRAP des ostéoclastes dérivés du BMM. L’augmentation de l’activité TRAP induite par le M-CSF et le RANKL a été supprimée après la chute de Rab27A. Barre d’échelle = 50 μm. ***P < 0,001. (D–E) Expression des marqueurs de différenciation des ostéoclastes après l’épuisement de Rab27A. Les niveaux d’ARNm de TRAP, NFATc1 et c-FOS ont été déterminés par q-PCR (D), et les niveaux de protéines par western blotting (E). β-actine servait de contrôle de chargement. **P < 0,01, ***P < 0,001. Contrôle des cellules non traitées ; si-NC, siRNA témoins négatif. Trois répliques biologiques indépendantes ont été réalisées. Les données sont présentées en moyenne ± SD. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

L’exportation cytoplasmique de Rab27A modifié en m6A a été facilitée par YTHDC1

Pour étudier l’implication potentielle de la modification de m6A dans la régulation de Rab27A, des analyses bioinformatiques ont été réalisées. Plusieurs sites de modification m6A prédits ont été identifiés dans la transcription Rab27A (Figure 4A). De plus, l’analyse de prédiction des interactions a suggéré des associations potentielles entre Rab27A et les protéines lectrices m6A YTHDC1 et IGF2BP2 (Figure 4B).

Pour valider l’interaction entre YTHDC1 et l’ARNm Rab27A, des tests d’immunoprécipitation ARN (RIP) ont été réalisés. L’ARNm de Rab27A était significativement enrichi dans les complexes immunoprécipités avec l’anticorps anti-YTHDC1 comparé au groupe témoin immunoglobuline G (IgG) (Figure 4C).

Parce que YTHDC1 fonctionne comme un lecteur m6A nucléaire impliqué dans l’exportationd’ARN 41, des tests de fractionnement nucléaire et cytoplasmique ont été réalisés. Le knockdown de YTHDC1 a considérablement augmenté la rétention nucléaire de l’ARNm Rab27A tout en réduisant son abondance cytoplasmique (Figure 4D).

L’effet de YTHDC1 sur l’expression de Rab27A a été davantage évalué. L’analyse quantitative en temps réel par PCR a démontré que la déplétion de YTHDC1 réduisait l’expression de l’ARNm de Rab27A (Figure 4E). De manière cohérente, l’analyse Western blot a montré une diminution de l’expression de la protéine Rab27A après le knockdown de YTHDC1 (Figure 4F).

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Figure 4 : L’exportation cytoplasmique de Rab27A modifiée par m6A a été facilitée par YTHDC1. (A) Sites de modification m6A prédits dans Rab27A identifiés à l’aide de l’outil de prédiction SRAMP. (B) Des interactions prédites entre Rab27A et les protéines lectrices m6A YTHDC1 et IGF2BP2 identifiées à l’aide de StarBase. (C) Essai d’immunoprécipitation à ARN (RIP) démontrant l’interaction entre YTHDC1 et l’ARNm Rab27A. **P < 0,01. IgG servait de contrôle négatif. L’enrichissement Rab27A a été normalisé en pourcentage d’entrée. La bande immunoblot YTHDC1 reflète l’efficacité de l’immunoprécipitation. (D) Analyse de fractionnement nucléaire et cytoplasmique montrant une rétention nucléaire accrue de Rab27A après le knockdown de YTHDC1. **P < 0,01, ***P < 0,001. (E–F) Expression de YTHDC1 et Rab27A après la chute de YTHDC1. L’expression de l’ARNm a été déterminée par q-PCR (E), et l’expression des protéines par western blotting (F). β-actine servait de contrôle de chargement. **P < 0,01. si-NC, siRNA témoins négatif. Trois répliques biologiques indépendantes ont été réalisées. Les données sont présentées en moyenne ± SD. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Stabilisation de Rab27A par interaction avec IGF2BP2

L’interaction entre IGF2BP2 et Rab27A a été étudiée à l’aide de tests RIP. L’ARNm de Rab27A était significativement enrichi dans les complexes immunoprécipités avec un anticorps anti-IGF2BP2 comparé au témoin IgG, indiquant une association entre IGF2BP2 et l’ARNm Rab27A (Figure 5A).

L’analyse par immunofluorescence a démontré la co-localisation de IGF2BP2 et Rab27A principalement au sein du cytoplasme (Figure 5B). Pour déterminer l’effet fonctionnel de IGF2BP2 sur l’expression de Rab27A, IGF2BP2 a été réduit au silence à l’aide de siRNA. L’analyse quantitative en temps réel par PCR a révélé une réduction significative des niveaux d’ARNm Rab27A après IGF2BP2 déplétion (Figure 5C). Conformément à ces résultats, l’analyse Western blot a montré une diminution de l’expression de la protéine Rab27A après IGF2BP2 knockdown (Figure 5D).

L’effet de IGF2BP2 sur la stabilité de l’ARNm Rab27A a ensuite été évalué. IGF2BP2 épuisement a considérablement raccourci la demi-vie de l’ARNm Rab27A et réduit la stabilité des transcrits (Figure 5E).

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Figure 5 : Stabilisation de Rab27A par interaction avec IGF2BP2. (A) Un test d’immunoprécipitation à ARN démontrant l’association entre IGF2BP2 et l’ARNm Rab27A. IgG servait de contrôle négatif. L’enrichissement Rab27A a été normalisé en pourcentage d’entrée. P < 0,001. (B) Analyse d’immunofluorescence démontrant la co-localisation de Rab27A et IGF2BP2 dans le cytoplasme. Les noyaux étaient contre-colorés par DAPI. Barres d’échelle = 20 μm. (C–D) Régulation à la baisse de Rab27A après IGF2BP2 épuisement. Les niveaux d’ARNm de Rab27A ont été déterminés par q-PCR (C), et les niveaux de protéines par western blotting (D). β-actine servait de contrôle de chargement. **P < 0,01, ***P < 0,001. (E) Stabilité de l’ARNm Rab27A après IGF2BP2 knockdown. Les niveaux d’ARNm de Rab27A ont été normalisés vers le groupe si-NC correspondant à 0 h. **P < 0,01. si-NC, siRNA témoins négatif. Trois répliques biologiques indépendantes ont été réalisées. Les données sont présentées en moyenne ± SD. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Le silence de YTHDC1 ou IGF2BP2 la différenciation ostéoclaste des BMM induite par le M-CSF et le RANKL

Pour approfondir la relation fonctionnelle entre YTHDC1, IGF2BP2 et Rab27A lors de la différenciation des ostéoclastes, des expériences de knockdown ont été réalisées dans les BMM.

La stimulation du M-CSF et du RANKL a significativement augmenté l’expression de l’ARNm de Rab27A, YTHDC1 et IGF2BP2 (Figure 6A). De même, l’expression protéique de ces molécules a également été élevée après induction d’ostéoclastes (Figure 6B). Le silence de YTHDC1 ou de IGF2BP2 réduisait significativement l’expression de Rab27A, tandis que le knockdown d’un régulateur n’affectait pas substantiellement l’expression de l’autre.

La coloration TRAP a démontré que la déplétion de YTHDC1 ou IGF2BP2 a significativement supprimé l’activité ostéoclaste induite par M-CSF et RANKL (Figure 6C). De plus, une analyse quantitative en temps réel par PCR a révélé une expression réduite de TRAP, NFATc1 et c-FOS après YTHDC1 ou IGF2BP2 knockdown (Figure 6D). L’analyse Western blot a confirmé des réductions correspondantes au niveau des protéines (Figure 6E).

Collectivement, ces résultats indiquent que YTHDC1 et IGF2BP2 favorisent la différenciation des ostéoclastes par la régulation de l’expression de Rab27A.

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Figure 6 : Silence de YTHDC1 ou IGF2BP2 différenciation ostéoclaste supprimée des BMM induite par M-CSF et RANKL. (A–B) Expression de Rab27A après YTHDC1 ou IGF2BP2 knockdown. Les niveaux d’ARNm (A) et de protéines (B) de Rab27A ont été déterminés respectivement par q-PCR et Western blotting. β-actine servait de contrôle de chargement. P < 0,001. (C) La coloration TRAP démontrant la suppression de l’activité ostéoclaste après YTHDC1 ou IGF2BP2 épuisement. Barre d’échelle = 50 μm. **P < 0,01, ***P < 0,001. (D–E) Expression des marqueurs de différenciation des ostéoclastes après YTHDC1 ou IGF2BP2 épuisement. Les niveaux d’ARNm de TRAP, NFATc1 et c-FOS ont été déterminés par q-PCR (D), et les niveaux de protéines par western blotting (E). β-actine servait de contrôle de chargement. *P < 0,05, **P < 0,01, ***P < 0,001. Contrôle des cellules non traitées ; si-NC, siRNA témoins négatif. Trois répliques biologiques indépendantes ont été réalisées. Les données sont présentées en moyenne ± SD. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

DISPONIBILITÉ DES DONNÉES :

Les ensembles de données utilisés et/ou analysés lors de l’étude en cours (y compris les données western blot, les ensembles d’images d’imagerie, les analyses quantitatives et les fichiers sources) ont été fournis dans le Fichier Supplémentaire 1.

Fichier supplémentaire 1 : Les ensembles de données et données brutes de cette étude. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.

Discussion

La différenciation des ostéoclastes joue un rôle essentiel dans le remodelage osseux, la résorption osseuse, la réparation des fractures et l’homéostasiesquelettique 12˒15˒17˒18˒42˒43. Une activité ostéoclastique excessive est un facteur majeur de l’ostéoporose, faisant de l’identification des voies régulatrices contrôlant la différenciation des ostéoclastes un objectif de recherche important. Plusieurs thérapies anti-résorptives ciblant la fonction ostéoclaste ont démontré une efficacité clinique 6,44,45. Par exemple, le dénosumab a été associé à une incidence réduite des fractures et à un profil de sécuritéfavorable 6, tandis que l’inhibiteur de la cathepsine K ONO-5334 a montré des effets bénéfiques sur la densité minérale osseuse et la solidité osseuse chez les primates non humains ovairelectisés44. La présente étude a identifié un mécanisme régulateur dépendant de m6A jusque-là non reconnu, impliquant YTHDC1, Rab27A et IGF2BP2 favorisant la différenciation des ostéoclastes et la progression de l’ostéoporose. Ces résultats apportent de nouvelles perspectives sur la régulation moléculaire de l’ostéoclastogenèse et suggèrent des cibles thérapeutiques potentielles pour l’ostéoporose.

Rab27A a déjà été impliqué dans la différenciation des ostéoclastes et la résorption osseuse par régulation du trafic vésiculaire et de la signalisation intracellulaire, et peut également influencer les cascades de signalisation induites par RANKL via le recyclage endosomal des récepteursclés 28,29. Conformément à ces rapports, l’expression de Rab27A a été nettement augmentée lors de la différenciation des ostéoclastes, tandis que la déplétion de Rab27A a supprimé la différenciation des ostéoclastes in vitro et a atténué la perte osseuse associée à l’ostéoporose in vivo. Ces résultats soutiennent un rôle crucial de Rab27A en biologie des ostéoclastes et étendent davantage les observations précédentes en démontrant que l’activité de Rab27A est régulée par des mécanismes dépendants de m6A. Collectivement, les résultats suggèrent que Rab27A modifié par m6A peut réguler ces processus au niveau post-transcriptionnel et par conséquent influencer l’activité de résorption osseuse.

Les preuves accumulées indiquent que la modification de m6A contribue au développement et à la progression des maladiesosseuses 32. Des analyses bioinformatiques ont identifié plusieurs sites de modification présumés de m6A dans l’ARNm de Rab27A (Figure 4A), et des études fonctionnelles ont démontré que YTHDC1 et IGF2BP2 régulent l’expression de Rab27A et la différenciation des ostéoclastes (Figures 4–6). Ces résultats suggèrent que la modification de m6A est un mécanisme de régulation important en amont contrôlant la fonction de Rab27A lors de l’ostéostopogène. Comme plusieurs sites m6A prédits ont été identifiés dans Rab27A, de futures études devraient déterminer si des sites individuels ou des combinaisons de sites sont nécessaires pour la régulation de Rab27A. La construction de mutants Rab27A déficients en m6A et les expériences de sauvetage subséquentes fourniraient une preuve directe de l’importance fonctionnelle de la modification de m6A dans cette voie.

Sur le plan mécanistique, la présente étude a démontré que YTHDC1 interagit avec l’ARNm de Rab27A et facilite son exportation nucléaire. Après une translocation cytoplasmique, IGF2BP2 s’associe directement à l’ARNm Rab27A et améliore la stabilité des transcripts. Par conséquent, la déplétion de YTHDC1 ou de IGF2BP2 a réduit l’expression de Rab27A et supprimé la différenciation des ostéoclastes. Ces résultats soutiennent un modèle dans lequel YTHDC1 et IGF2BP2 coopérent pour maintenir l’expression de Rab27A en coordonnant le transport et la stabilité de l’ARNm. Ce mécanisme régulateur élargit la compréhension actuelle de la régulation médiée par m6A de la différenciation des ostéoclastes et identifie plusieurs composantes de cette voie comme cibles thérapeutiques potentielles.

Plusieurs limites doivent être reconnues. Premièrement, bien que Rab27A ait montré qu’il ait été efficace pour réguler la différenciation des ostéoclastes, ses effets potentiels sur la fonction des ostéoblastes n’ont pas été étudiés. Parce que l’homéostasie osseuse dépend de l’équilibre entre la résorption osseuse médiée par l’ostéoclaste et la formation osseuse médiée par les ostéoblastes, les études futures devraient évaluer si Rab27A influence également la différenciation ou l’activité des ostéoblastes. Deuxièmement, la présente étude s’est principalement appuyée sur des approches de perte de fonction. La surexpression complémentaire de Rab27A, YTHDC1 et IGF2BP2, ainsi que des expériences de sauvetage utilisant des mutants Rab27A déficients en m6A, renforcerait encore davantage le modèle réglementaire proposé. Troisièmement, bien que plusieurs sites m6A supposés au sein de l’ARNm Rab27A aient été prédits à l’aide d’approches bioinformatiques, les sites spécifiques responsables de la régulation de la fonction de Rab27A restent inconnus et nécessitent une validation expérimentale. Enfin, des études supplémentaires sont nécessaires pour déterminer si d’autres protéines lectrices m6A, protéines liant l’ARN ou voies de signalisation participent à la régulation de Rab27A lors de la différenciation des ostéoclastes.

La régulation immunitaire est devenue un élément important de la pathogenèse de l’ostéoporose46,47. Rab27A a établi des fonctions dans la sécrétion des cellules immunitaires, la libération de granules cytotoxiques, la dégranulation des neutrophiles et la régulation du microenvironnementtissulaire 48,49,50,51,52,53,54,55. Une investigation plus approfondie de la relation entre Rab27A, la régulation immunitaire et l’homéostasie osseuse pourrait fournir des éclairages supplémentaires sur la pathogenèse de l’ostéoporose.

Les futures enquêtes devraient prioriser plusieurs domaines clés. Premièrement, une mutagenèse systématique des sites m6A prédits dans Rab27A est nécessaire pour identifier les sites de liaison fonctionnels impliqués dans la régulation médiée par YTHDC1 et IGF2BP2. Deuxièmement, la surexpression de Rab27A, YTHDC1 et IGF2BP2, ainsi que des expériences de sauvetage utilisant des mutants déficients en M6A, seront essentielles pour établir la contribution directe de l’axe régulateur YTHDC1/Rab27A/IGF2BP2. Troisièmement, la validation de cette voie dans d’autres modèles d’ostéoporose et l’évaluation de la fonction de Rab27A dans les ostéoblastes seront importantes pour étayer davantage les résultats présents.

En conclusion, la présente étude a identifié un nouvel axe régulateur YTHDC1/Rab27A/IGF2BP2 qui favorise la différenciation des ostéoclastes et la progression de l’ostéoporose. YTHDC1 a facilité l’exportation nucléaire de l’ARNm de Rab27A modifié par m6A, tandis que IGF2BP2 amélioré la stabilité de l’ARNm de Rab27A dans le cytoplasme. Ces événements régulateurs coordonnés ont augmenté l’expression de Rab27A et favorisé l’ostéostogenèse. Collectivement, ces résultats élargissent la compréhension actuelle de la régulation médiée par m6A dans l’ostéoporose et fournissent une base pour développer des stratégies thérapeutiques ciblant la voie YTHDC1/Rab27A/IGF2BP2.

Déclarations de divulgation

Les auteurs ne déclarent aucun intérêt financier concurrent ni conflit d’intérêts.

Remerciements

Ce travail a été financé par le projet de coopération stratégique scientifique et technologique entre l’Hôpital populaire de Pengzhou et la Southwest Medical University (Subvention n° 2023PZXNYD01) à Lian Tang.

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
4% ParaformaldehydeThermo Fisher ScientificA5818101Tissue and cell fixation
Alexa Fluor 488 secondary antibodyThermo Fisher ScientificA-11001Fluorescent secondary antibody for immunofluorescence; RRID: AB_2534069
Alexa Fluor 546 secondary antibodyThermo Fisher ScientificA-11035Fluorescent secondary antibody for immunofluorescence; RRID: AB_2534093
Bovine serum albumin (BSA)MerckA2153Blocking reagent
Bradford Protein AssayMerckB6916Protein quantification
C57BL/6JSlac miceShanghai SLAC Laboratory Animal Co., Ltd.—Female, 8 weeks old; RRID: MGI:2159769
c-FOS antibodyAbcamab222699Primary antibody for western blotting; RRID: AB_2891049
Confocal laser scanning microscope (SP8)Leica MicrosystemsSP8Immunofluorescence image acquisition; RRID: SCR_018169
DAPIThermo Fisher ScientificD3571Nuclear counterstain for immunofluorescence; RRID: AB_2307445
EDTAMerckV900081-500GTissue decalcification reagent
EosinSolarbioG1100Histological cytoplasmic stain
Fetal bovine serum (FBS)Thermo Fisher ScientificA5669701Cell culture supplement
GraphPad PrismGraphPad SoftwareVersion 9.0Statistical analysis software; RRID: SCR_002798
HematoxylinCell Signaling Technology#14166Histological nuclear stain
IBM SPSS StatisticsIBMWindows versionStatistical analysis software; RRID: SCR_016479
IGF2BP2 antibodyProteintech11601-1-APPrimary antibody for western blotting and immunofluorescence; RRID: AB_2122672
Inverted light microscope (DMi8)Leica MicrosystemsDMi8Histological image acquisition; RRID: SCR_026672
Lentiviral titer quantification kitTakara Bio631235Lentiviral titer determination
Lipofectamine 3000Thermo Fisher ScientificL3000015Plasmid transfection reagent
Lipofectamine RNAiMAXThermo Fisher Scientific13778150siRNA transfection reagent
M-CSFMedChemExpressHY-P7085Osteoclast differentiation factor
Micro-computed tomography systemScanco MedicalVivaCT80Bone morphometric analysis
M-MLV Reverse TranscriptasePromegaM1701cDNA synthesis
NFATc1 antibodySanta Cruz Biotechnologysc-7294Primary antibody for western blotting; RRID: AB_2152503
PARIS KitThermo Fisher ScientificAM1556Nuclear and cytoplasmic fractionation
Penicillin/StreptomycinThermo Fisher Scientific15140122Antibiotic supplement for cell culture
Power SYBR Green Master MixThermo Fisher Scientific4367659Quantitative real-time PCR
Protease inhibitor cocktailThermo Fisher Scientific78429Prevention of protein degradation
Protein A/G agarose beadsMerckIP05Immunoprecipitation
PVDF membraneThermo Fisher Scientific88520Protein transfer membrane for western blotting
Rab27A antibodyAbcamab55667Primary antibody for western blotting and immunofluorescence; RRID: AB_945112
RANKLMedChemExpressHY-P7425Osteoclast differentiation factor
Real-time PCR systemApplied BiosystemsABI7900HTQuantitative real-time PCR instrument
RIPA bufferThermo Fisher Scientific78501Protein extraction buffer
RNA Immunoprecipitation (RIP) KitMilliporeRIP-12RXNRNA immunoprecipitation assay
SDS-PAGE reagentsThermo Fisher ScientificBT041210BOXProtein electrophoresis
shRNA plasmidsRiboBio—Gene silencing by RNA interference
Small interfering RNAs (siRNAs)GenePharma—Gene silencing by RNA interference
SRAMPOnline resource—Prediction of m6A modification sites; RRID: SCR_024500
StarBase (ENCORI)Online resource—RNA interaction prediction database; RRID: SCR_016303
TRAP antibodyAbcamab2391Primary antibody for western blotting; RRID: AB_303034
TRAP staining kitMerck387ADetection of osteoclast activity
Triton X-100Thermo Fisher Scientific85111Cell permeabilization reagent
TRIzol ReagentThermo Fisher Scientific15596026CNTotal RNA isolation
YTHDC1 antibodyAbcamab122340Primary antibody for western blotting; RRID: AB_11128253
α-MEMFUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation139-15651Cell culture medium
β-Actin antibodyMerckA5441Loading control for western blotting; RRID: AB_476744

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Mots-clés

Macrophages de la moelle osseusemarquage TRAPWestern blotYTHDC1IGF2BP2

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