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Article de méthode

La métaphase de l’ADN-FISH se propage pour distinguer l’ADN extrachromosomique des régions colorant de manière homogène dans les lignées cellulaires cancéreuses humaines

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DOI :

10.3791/71970

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4 août 2026

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1Department of Molecular and Human Genetics, Baylor College of Medicine

Dans cet article

Résumé

Nous rapportons un protocole de propagation de métaphase DNA-FISH qui détecte visuellement le nombre de copies en locus et la localisation dans le génome. Cette approche permet la résolution unicellulaire des états d’amplification, en particulier dans les lignées cellulaires cancéreuses contenant de l’ADN extrachromosomique et des régions colorant homogènement.

Résumé

Le séquençage du génome entier identifie les amplifications focales de l’ADN avec une résolution par paires de bases, mais ne peut pas déterminer si les séquences amplifiées résident sur l’ADN extrachromosomique (ECDNA, également appelé double minutes) ou au sein de régions chromosomatiques de coloration homogène (HSR). Les dispersions métaphasiques d’hybridation in situ par fluorescence de l’ADN (ADN-FISH) restent la référence pour distinguer ces états d’amplification à résolution unicellulaire. Ici, nous présentons un protocole détaillé pour la propagation de la métaphase de l’ADN-FISH en utilisant des lignées cellulaires cancéreuses humaines, englobant la culture cellulaire, l’arrêt de métaphase, le traitement hypotonique, la fixation, la propagation des chromosomes, l’hybridation par sonde fluorescente et l’imagerie par fluorescence. Le protocole intègre des étapes intermédiaires de contrôle qualité pour vérifier la réussite de la dispersion chromosomique et optimiser la qualité de la propagation de la métaphase, rendant le flux de travail accessible aux laboratoires sans expertise spécialisée en cytogénétique. Les résultats démontrent une visualisation claire des états d’amplification d’ECDNA et HSR à l’aide de sondes spécifiques au locus et illustrent des artefacts techniques courants pouvant influencer l’interprétation. Ce protocole offre une approche robuste et reproductible pour étudier l’organisation structurelle de l’amplification des oncogènes dans les cellules cancéreuses.

Introduction

Le génome humain est organisé non seulement par sa séquence, mais aussi par sa structure, et des changements dans la séquence ou la structure peuvent entraîner un cancer 1,2,3,4. L’amplification des oncogènes est présente dans environ 40 % de toutes les tumeurs, où elle contribue à l’initiation, à la croissance, à la métastase et à la résistance des médicaments5. Dans certains cas, des oncogènes amplifiés sont transportés sur des ADN extrachromosomiques (ECNa, également appelés doubles minutes), qui sont des éléments circulaires, auto-réplicatifs et doubles brins, situés en dehors des chromosomeslinéaires 6,7,8,9. Les eADN sont des centaines de kilobases à mégabases de taille10, 11. En raison de leur absence de centromères, ils se séparent de façon asymétrique pendant la mitose, conduisant à jusqu’à 100+ copies dans un seulnoyau 12,13,14,15,16,17,18. Cette ségrégation inégale génère une variabilité du nombre de copies entre les cellules filles, ce qui entraîne une évolution rapide des tumeurs et un mauvais résultat chezles patients 17,19.

Les eADN existent en relation dynamique avec des régions colorant homogènement (HSR) (Figure 1A)8,18. Les HSR sont des amplifications focales intrachromosomiques qui peuvent survenir par la réintégration d’ECDNA en un seul locus dans legénome 8,10,18,20,21,22,23,24,25,26,27,28,29,30,31. Ces deux états, les ECNa et les HSR, peuvent s’interconvertir, révélant que l’amplification oncogène est structurellementplastique 24,25,32,33. Cette interconversion a une pertinence thérapeutique car les ECDNA peuvent passer à l’état HSR en présence de médicaments 32,33,34,35,36,37,38. Les cellules qui subissent cette transition vers l’état HSR deviennent alors résistantes au médicament sous pressionthérapeutique 33. Les HSR semblent également plus fréquentes chez les tumeurs malignes que chez les tumeursbénignes 39. Malgré leur pertinence clinique, aucune stratégie approuvée par la FDA ne vise l’état HSR, en partie parce que les méthodes pour distinguer ces structures d’amplification restent sous-utilisées.

Bien que les états d’ECDNA et HSR aient des conséquences cliniques distinctes, les approches actuelles de séquençage ne peuvent pas les distinguer de manière fiable. Le séquençage du génome entier (WGS) identifie désormais les régions amplifiées avec une résolution par pairede bases de 40. Le WGS a été précieux pour définir la composition de séquences des ECNa et HSR, mais au détriment de la résolution spatiale. Contrairement aux approches cytogénétiques traditionnelles, le WGS seul ne peut pas déterminer si une séquence amplifiée réside sur des ECDNA ou est intégrée dans un chromosome sous forme de HSR 41,42,43. En conséquence, les méthodes qui préservent le contexte spatial de l’amplification restent essentielles pour comprendre la biologie de ces états distincts.

Depuis 40 ans, les propagations métaphasées par hybridation in situ par fluorescence de l’ADN (ADN-FISH) servent de référence pour identifier et distinguer les états d’amplification ECDNAet HSR 42,44,45,46. En fait, les ECDNA et les HSR ont d’abord été identifiés et caractérisés par des analyses cytogénétiques basées sur la métaphase 7,47. Avant l’utilisation généralisée des sondes fluorescentes, l’hybridation in situ était réalisée à l’aide de sondes d’ADN radiomarquées, qui ont également été utilisées pour visualiser les ECDNA et les HSR48,49. À mesure que WGS gagnait en popularité, les propagations de métaphase ADN-FISH sont devenues moins fréquentes. De nombreux aspects du flux de travail sont dispersés dans la littérature cytogénétique, et les protocoles optimisés sont généralement conservés au sein de groupes de recherche individuels ou de laboratoires de cytogénétique qui considèrent la méthode comme propriétaire50,51. Ici, nous décrivons un protocole de propagation métaphasée DNA-FISH pour résoudre visuellement l’état d’amplification au niveau de la cellule unique.

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Protocole

Toutes les procédures de culture de cellules humaines ont été réalisées conformément aux directives institutionnelles.

1. Arrêter les cellules en métaphase à l’aide de colcémide (N-méthyl-N-déacétyl-colchicine)

  1. Commencez par environ 2,0 × 106–2,0 × 107 cellules cancéreuses ou autres cellules cultivées. Trop peu de cellules produiront moins de propagations métaphasiques, tandis que trop de cellules peuvent entraîner une fixation insuffisante.
  2. Déterminer le temps d’incubation approprié du Colcemid pour le système expérimental. Le temps d’incubation influence le nombre de dispersions métaphasiques obtenues et la longueur des chromosomes, et les conditions optimales varient selon les types cellulaires.
    REMARQUE : Des temps d’incubation plus courts entraînent moins de cellules arrêtées en métaphase au moment de la collecte. Des temps d’incubation plus longs produisent plus de chromosomes condensés avec des bras plus courts, rendant l’analyse plus difficile. Pour les lignées cellulaires cancéreuses avec un temps de doublement approximatif de 24 heures, des périodes d’incubation allant de 45 minutes à toute la nuit produisent des propagations métaphasiques appropriées. Optimisez le temps d’incubation pour les cellules avec des temps de doublement plus lents. Une incubation de 2 h suffit généralement à produire un nombre suffisant d’étalements de métaphase avec des longueurs chromosomales adaptées à l’analyse.
  3. Calculez la quantité de Colcémide nécessaire pour atteindre une concentration finale de 10 μL/mL dans le milieu de culture cellulaire approprié.
    REMARQUE : Maintenir les cellules en croissance logarithmique en les faisant passer ou en les semant au moins 24 heures avant l’arrêt de métaphase. Traiter les cellules avec du Colcémide lorsque les cultures atteignent une confluence de 70 % à 90 %.
  4. Diluez la solution de stock de Colcemid 1:1 avec de l’eau ultrapure stérile. Ajoutez le volume approprié à la culture et incubez pendant 45 minutes jusqu’à toute la nuit dans un incubateur de culture cellulaire.

2. Prélèvement des cellules

  1. Préparez un fixateur Carnoy’s frais (méthanol 3:1 : acide acétique). Gardez le fixateur sur la glace pendant tout le processus de fixation.
  2. Préparez une solution fraîche de 0,075 M KCl et réchauffez-la dans un bain-marie à 37 °C.
  3. Collectez les cellules en granule et notez le nombre de cellules. Utilisez cette valeur pour calculer le volume final de resuspension.
    REMARQUE : Détacher les cellules adhérentes par trypsinisation. Transférez les cellules de suspension directement dans des tubes centrifugeuses de 15 mL. Éliminer les matériaux contenant Colcemid et les milieux contenant Colcemid conformément aux directives institutionnelles concernant les déchets dangereux.
  4. Lavez les cellules avec du PBS.
  5. Resuspendez doucement les cellules dans 10 mL de 0,075 M KCl tiède et mélangez par inversion douce. Ce traitement hypotonique gonfle les cellules, leur permettant de se rompre et de disperser les chromosomes pendant la préparation des lames.
  6. Incubez les cellules dans un bain-marie à 37 °C pendant 30 minutes.
  7. Ajoutez lentement 2 mL de fixateur Carnoy’s bien froid tout en mélangeant doucement la suspension par inversion.
  8. Laissez les cellules reposer pendant 5 minutes.
  9. Centrifugez à 500 × g pendant 5 minutes à température ambiante (RT).
  10. Aspirez soigneusement le surnageant ou retirez-le à l’aide d’une pipette.
  11. Ajoutez lentement 10 mL de fixateur Carnoy’s glacé par incréments de 0,5 mL tout en mélangeant doucement après chaque addition.
  12. Laissez les cellules reposer 10 minutes en temps de réanimation.
  13. Centrifugeuse à 650 × g pendant 5 minutes en temps de réflexe.
  14. Répétez deux fois les étapes 2.10–2.13
  15. Lors du lavage final, laissez les cellules suspendues dans le fixateur de Carnoy.
    PAUSE : Stockez la suspension à cellules fixes à −20 °C ou passez immédiatement à la Section 3.
    REMARQUE : Pour les échantillons contenant moins d’environ 3 × 106 cellules, effectuer la fixation dans des tubes microcentrifuges de 1,5 mL au lieu de tubes coniques plus grands. Réduire les volumes de 0,075 M KCl et le fixateur de Carnoy par 10 tout en maintenant tous les temps d’incubation, les températures et les conditions de centrifugation.

3. Descente sur table

  1. Récupérez l’échantillon à −20 °C et décongelez-le en RT.
  2. Centrifugeuse à 800 × g pendant 7 minutes en temps de traitement à la centrifugeuse.
  3. Étiquetez les lames en verre et posez-les sur la glace.
  4. En utilisant le nombre de cellules obtenu avant la fixation, calculez le volume du fixateur de Carnoy nécessaire pour resuspendre le pellet à une concentration finale d’environ 5 × 106 cellules/mL. Après centrifugation, retirez soigneusement le surnageant avec une pipette, laissant le volume calculé du fixateur au-dessus du pellet.
  5. Resuspendez les cellules fixes du fixateur de Carnoy à l’aide d’une pipette P1000.
  6. Transférez environ 300 μL de la suspension à cellules fixes dans un tube microcentrifuge de 1,5 mL.
  7. Resuspendez soigneusement l’échantillon à l’aide d’une pipette P200 en pipettant plusieurs fois vers le haut et vers le bas.
  8. Aspirez 60 μL des cellules en suspension à l’aide d’une pipette P200.
  9. Tenez la pointe de la pipette à environ 1 m au-dessus de la culasse en verre sur la glace et visez le centre de la glissière.
  10. Distribuez lentement une goutte de suspension à cellules sur la glissière.
    REMARQUE : Marquez l’emplacement de la chute sur le bord de la lame avec un marqueur résistant à l’éthanol pour faciliter l’identification lors des étapes suivantes.
  11. Laissez sécher les cellules sur glace pendant 10 minutes.
  12. Placez les lames sur un incubateur à 80 °C pendant 10 minutes.
  13. Retirez les coulisses avec des pinces et laissez-les refroidir au toucher.
  14. Examinez les lames à l’aide d’un microscope à contraste de phase avec un objectif de 10× ou 20×. Confirmer la présence de multiples propagations de métaphase bien dispersées sans chevauchement excessif.

4. Prétraitement de la glissière

  1. Préparez des bocaux Coplin pour les étapes de lavage
    1. Préparez chaque réactif frais : 70 % d’acide acétique (40 mL), PBS (40 mL), PBS (45 mL), 70 % d’éthanol (40 mL), 85 % d’éthanol (40 mL) et 100 % d’éthanol (40 mL).
  2. Placez les lames en verre dans de l’acide acétique à 70 % pendant 2 minutes.
  3. Placez les lames en verre dans 40 mL de PBS pendant 30 secondes.
  4. Placez les lames en verre dans 45 mL de PBS pendant 5 minutes.
  5. Déshydratez les lames du verre séquentiellement à 70 %, 85 % et 100 % d’éthanol pendant 1 minute chacun.
  6. Faites sécher les lames à l’air au RT pendant 10 minutes.

5. Préparez la sonde

REMARQUE : Ce protocole utilise des sondes ADN-FISH spécifiques au locus commercialement disponibles qui s’hybrident vers une région génomique d’intérêt.

  1. Sélectionnez une sonde ciblant le locus amplifié à examiner. Dégelez la sonde et le tampon d’hybridation selon les instructions du fabricant. Laissez la sonde atteindre le RT avant utilisation.
  2. Préparez un mélange de sonde contenant 1 μL de sonde et 4 μL de tampon d’hybridation pour chaque lame en verre.
    REMARQUE : La concentration optimale de la sonde peut dépendre du fabricant et de la sonde. La concentration spécifiée ici a été optimisée selon les sondes utilisées dans cette étude. Cependant, il faut optimiser la concentration de la sonde pour chaque nouveau locus.
  3. Appliquez 5 μL du mélange sonde/tampon d’hybridation au centre de chaque emplacement de goutte sur la lame en verre.
    REMARQUE : Les sondes sont sensibles à la lumière. Minimisez l’exposition à la lumière tout au long de la procédure restante en rangeant les lames dans un tiroir sombre entre les étapes et pendant le traitement des autres lames.
  4. Placez soigneusement une enveloppe de couverture sur l’échantillon.
  5. Scellez les bords de la housse avec du ciment en caoutchouc.
  6. Placez les lames en verre dans une chambre humide.
  7. Hybridez la sonde selon le protocole du fabricant. Laisser l’hybridation se poursuivre pendant la nuit (12–18 h).

6. Lavages post-hybridation, contre-coloration, montage et imagerie

  1. Préparez des bocaux Coplin pour les étapes de lavage
    1. Préparez chaque réactif frais : 2× SSC (40 mL), 0,4× SSC (40 mL), 70 % d’éthanol (40 mL), 85 % d’éthanol (40 mL), 100 % d’éthanol (40 mL) et PBS (45 mL).
    2. Préparez et stockez le SSC sous forme de solution d’origine à 20× (3 M NaCl, 0,3 M citrate de sodium, pH 7,0). Pour préparer 1 L, dissoudre 175,3 g de NaCl et 88,2 g de citrate de sodium dans 1 L d’eau ultrapure. Diluez la crosse pour préparer des solutions de fonctionnement de 2× SSC et 0,4× SSC selon les besoins.
  2. Chauffez la solution de 0,4× SSC à 72 °C dans un bain-marie.
  3. Retirez les lames en verre de la chambre humide et retirez soigneusement le ciment en caoutchouc.
  4. Placez les lames en verre dans 2× SSC pendant 2 minutes à RT. Retirez soigneusement les couverdisses.
  5. Placez les lames en verre préchauffées à 0,4× SSC à 72 °C pendant 2 minutes.
  6. Placez les lames en verre dans 2× SSC pendant 1 minute en RT.
  7. Déshydratez les lames du verre séquentiellement à 70 %, 85 % et 100 % d’éthanol pendant 1 minute chacun.
  8. Faites sécher les lames à l’air libre à RT pendant 10 minutes dans le noir.
  9. Diluez 1 mg/mL de DAPI 1:1000 dans PBS à un volume final de 1 mL.
    REMARQUE : Cette aliquote peut être conservée à 4 °C pendant jusqu’à 1 semaine.
  10. Pipeter 10 μL de DAPI dilué sur chaque lame de verre à l’emplacement de la goutte indiquée.
  11. Placez soigneusement une gaine de couverture sur l’échantillon pour garantir que la solution DAPI se répartit uniformément.
  12. Faites couver les lames dans le noir pendant 5 à 10 minutes.
  13. Placez les lames en verre dans des PBS pendant 30 secondes.
  14. Enlève les couverdises.
  15. Placez les lames en verre dans le PBS pendant 2 minutes.
  16. Déshydratez le verre en les trempant brièvement dans 70 %, 85 % et 100 % d’éthanol pendant environ 10 secondes chacun.
  17. Faites sécher les lames à l’air libre à RT pendant 10 minutes dans le noir.
  18. Ajoutez 15 μL de médium de montage à chaque lame en verre, puis placez une gaine de couverture par-dessus.
  19. Laissez le support s’étaler uniformément, puis évacuez doucement l’excès.
  20. Scellez les bords de la toile de couverture avec du vernis à ongles.
  21. Laissez sécher le vernis à ongles pendant 15 minutes en temps de réanimation dans le noir.
    PAUSE : Stockez les lames à 4 °C pour un stockage à long terme.
  22. Imagine les diapositives.
    REMARQUE : Les images ont été prises à l’aide d’un microscope à fluorescence inversée avec un objectif d’immersion à l’huile de 60×.
  23. Collectez plusieurs piles z pour chaque canal de fluorescence afin de capter le signal sur toute la profondeur de la propagation de la métaphase.
  24. Déconvoluer les piles d’images à l’aide d’un algorithme d’estimation du maximum de vraisemblance afin d’améliorer la clarté du signal et de réduire la fluorescence floue.
  25. Traiter et analyser les images finales dans ImageJ, puis sélectionner le plan focal optimal pour chaque propagation de métaphase avant l’analyse en aval.

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Résultats

Ce protocole (Figure 1B) permet de produire des chromosomes métaphasés propres, bien dispersés et intacts, adaptés à l’analyse cytogénétique, avec des chromosomes et des signaux DNA-FISH clairement visibles par microscopie à fluorescence. L’utilisation d’un microscope à champ clair/contraste de phase à faible grossissement (10× ou 20×) est une étape importante de contrôle qualité pour vérifier que les noyaux ont éclaté et que les chromosomes se sont dispersé...

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Discussion

Malgré leurs avantages bien établis, les propagations de métaphase ADN-FISH sont sous-utilisées à l’ère du WGS. L’organisation physique de l’ADN amplifié est fonctionnellement significative, car elle peut influencer le comportement biologique en aval et la réponse thérapeutique 61,62,63,64. Les oncogènes amplifiés focalement peuvent exister sur l’ECDNA ou au se...

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Déclarations de divulgation

Les auteurs ne déclarent aucun intérêt concurrent.

Remerciements

Ce travail a été soutenu par le NIH R00HG011467 et le CPRIT RR23004 à G.S.E. L’imagerie pour ce projet a été soutenue par l’Integrated Microscopy Core du Baylor College of Medicine, avec un financement des NIH (P30 DK056338, P30 CA125123, S10OD030414). Les auteurs remercient le Dr Pawel Stankiewicz pour ses conseils dès le début. Les auteurs remercient également le Dr Paul Mischel (Université Stanford) pour avoir fourni les lignées cellulaires GBM39ec et GBM39hsr.

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
15-mL conical centrifugeany sourceNACentrifugation. 
15-mL conical tubesany sourceNACell collection.
200 proof ethanolany sourceNAWash steps. 
Acetic Acid, glacial, 99.7%Millipore Sigma695092Carnoys fixative and slide wash steps.
Antifade Mounting MediumFisherScientificNC9265087Montage des lames après préparation complète des lames
Biological safety cabinet with vaccum outletany sourceNAStockage chimique.
Colcemid (N-methyl-N-deacetyl-colchicine)Millipore Sigma10295892001Lie le tubulin, arrête les cellules en métaphase.
Coplin jarsany sourceNAWash steps. 
DAPI (4′,6-diamidino-2-phenylindole)Milipore SigmaD8417-1MGColorant ADN fluorescent.
EGFR/CON7 FISH probe Empire GenomicsEGFR-CHR07Sonde fluorescente spécifique du locus. 
Elmer's rubber cementany sourceNAMaintien de la lame de couverture en place pendant l'hybridation des sondes pendant la nuit.
Ethanol resistant permanent markerany sourceNAMarquage des lames.
Fluorescent microscopeany sourceNAImagerie des lames. 
Glass Cover Slip, 22 x 22mmThermoFisher50-143-780Hybridation des sondes sur la lame.
Glass Slide, precleanedVWR48311-703Pour déposer les étalements métaphasiques et effectuer le DNA-FISH.
Humidified CO2 Incubatorany sourceNAIncubation de cellules vivantes.
Hybridization BufferEmpire GenomicsHyb-BufferTampon utilisé avec la sonde. 
Ice bucketany sourceNAGarder le fixateur de Carnoy froid. 
KCl (2M)ThermoFisherAM9640GGonfler les cellules avant la fixation. 
Methanol, 99.9%, HPLC gradeMillipore Sigma1060351000Pour le fixateur de Carnoy. 
Microcentrifugeany sourceNACentrifugation. 
Microcentrifuge tubesany sourceNAPour les cellules pendant la fixation et pour la préparation des sondes. 
MYC / SE 8 ProbeLeicaKI-10106Sonde fluorescente spécifique du locus. 
PBS, pH 7.4Gibco10010-023Wash steps. 
Phase contrast microscopeany sourceNAImagerie des étalements métaphasiques immédiatement après le dépôt
Pipette tipsany sourceNAPipetage.
Sodium chlorideMillipore SigmaS9888Pour le tampon SSC.
Sodium citrateMillipore Sigma567446Pour le tampon SSC.
Sterile ultrapure waterany sourceNAWash steps. 
ThermoBrite programmable slide incubatorany sourceNAIncubation des lames.
Tongsany sourceNAPour les étapes de lavage des lames. 
Water bathany sourceNAPour l'incubation en KCl. 

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