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Force et durée du signal du TCR dans l'activation et la différenciation des lymphocytes T CD8+ primaires de souris : une approche in vitro standardisée

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DOI :

10.3791/71979

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25 août 2026

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1Guangdong Province Key Laboratory of Immune Regulation and Immunotherapy, School of Laboratory Medicine and Biotechnology, Southern Medical University, 2Institute of Immunology, Third Military Medical University, 3Institute for Immunology and Pathogenesis, College of Basic Medicine, Chongqing Medical University, 4Center for Immune Ageing and Rejuvenation, Department of Rheumatology and Immunology, The First Affiliated Hospital of Chongqing Medical University

* These authors contributed equally

Dans cet article

Résumé

Ce protocole décrit une méthode systématique pour activer des lymphocytes T CD8+ naïfs primaires de souris en utilisant une approche de stimulation graduelle du TCR, permettant une analyse complète de la prolifération, de l'activation et de la production de cytokines des lymphocytes T CD8+ selon différentes intensités du signal du TCR.

Résumé

L'intensité et la durée du signal du récepteur des cellules T (TCR) sont des déterminants critiques de l'activation, de la prolifération et de la différenciation fonctionnelle des cellules T CD8⁺. Toutefois, les modèles in vitro standardisés permettant de comparer systématiquement la manière dont des entrées de signal TCR variables façonnent le destin des cellules T restent limités. Cette étude présente une méthode reproductible pour activer in vitro des cellules T primaires de souris à l’aide d’anticorps anti-CD3 fixés sur plaque et d’anticorps anti-CD28 solubles, en complément d’interleukine-2 (IL-2), et examine comment la modulation de la concentration en anti-CD3 (force du signal) et de la durée de stimulation (durée du signal) influence les résultats d’activation des cellules T. Nous détaillons un protocole d’isolement de cellules T naïves provenant de souris C57BL/6, suivi d’une stimulation selon une gamme de concentrations en anti-CD3 (0,1–10 µg/mL) et de durées (6–48 h). Nous avons réalisé une analyse par cytométrie en flux pour évaluer les signaux précoces induits par le TCR via la protéine ribosomale S6 phosphorylée intracellulaire (p-S6) comme indicateur de l’activité du complexe 1 ciblant mécanistiquement la rapamycine (mTORC1), puis évalué les événements en aval, notamment les marqueurs d’activation membranaires (CD69, CD25, ICOS, PD-1), la prolifération cellulaire par dilution du colorant violet de traçage de la prolifération (CTV) et l’expression des molécules effectrices (Granzyme B, TNF-α) comme indicateurs de la différenciation fonctionnelle. La méthode fournit un guide visuel clair et étape par étape pour réaliser des stimulations reproductibles des cellules T, permettant aux chercheurs d’analyser comment des paramètres spécifiques du signal TCR orientent les décisions concernant le destin des cellules T. Cette approche soutient non seulement les études mécanistiques de l’activation et de la différenciation des cellules T, mais offre également une plateforme pour optimiser le conditionnement des cellules T destinées à l’immunothérapie adoptive et aux tests de priming in vitro. En intégrant une démonstration vidéo à une narration détaillée du protocole, ce protocole améliorera la transparence méthodologique et la reproductibilité dans la recherche en immunologie des cellules T.

Introduction

Les lymphocytes T sont indispensables pour les réponses immunitaires protectrices contre les agents pathogènes et les tumeurs. Les lymphocytes T naïfs sont activement maintenus dans un état de quiescence afin de préserver leur survie et leur persistance à long terme1. Suite à une stimulation par un antigène, les lymphocytes T sortent de la quiescence, subissent une expansion clonale et une différenciation en effecteurs2. La signalisation via le récepteur des lymphocytes T (TCR) constitue le processus fondamental permettant l'initiation et la régulation des réponses immunitaires adaptatives3. Lors de la reconnaissance spécifique des complexes peptide–complexe majeur d'histocompatibilité (pCMH) présentés à la surface des cellules présentatrices d'antigènes (CPA), une cascade d'événements de signalisation est déclenchée, induisant ainsi l'expansion clonale et la différenciation fonctionnelle des lymphocytes T4,5,6.

L'intensité de la stimulation du TCR, déterminée par des facteurs clés tels que l'affinité, l'avidité et la concentration de l'antigène, joue un rôle essentiel dans la régulation de l'ampleur de l'activation des lymphocytes T, l'acquisition de fonctions effectrices et la trajectoire de différenciation vers des sous-populations distinctes de lymphocytes T effecteurs ou mémoires7,8,9. Les modèles in vitro actuels pour l'étude de l'activation des lymphocytes T dépendante du TCR utilisent principalement des anticorps anti-CD3 et anti-CD28 fixés sur des plaques ou liés à des billes, fournissant simultanément une liaison du TCR et des signaux co-stimulateurs10,11. Bien que ces systèmes soient largement utilisés, ils emploient généralement une seule concentration, souvent saturante, d'anticorps anti-CD3, permettant uniquement une comparaison binaire tout-ou-rien de l'activation des lymphocytes T, plutôt que de refléter la gamme dynamique des intensités du signal du TCR obtenue avec un gradient titré de stimuli12,13.

Le protocole décrit ici fournit un système in vitro standardisé et reproductible permettant d'évaluer de manière systématique la manière dont des intensités croissantes du signal du récepteur des cellules T (TCR) modulent l'activation, la prolifération et les phénotypes fonctionnels des lymphocytes T CD8+ primaires murins, à l'aide de gradients titrés d'anticorps anti-CD3 (0,1–10 µg/mL) et d'une concentration constante d'anticorps anti-CD28 (1 µg/mL). Cette approche repose sur la cytométrie en flux multiparamétrique, qui permet de mesurer à la fois les événements précoces de la signalisation—via la protéine ribosomale S6 phosphorylée intracellulaire (p-S6) comme indicateur de l'activité du complexe 1 de la cible mécanistique de la rapamycine (mTORC1)—et les conséquences cellulaires ultérieures, notamment la prolifération suivie par la dilution du CTV, les marqueurs d'activation à la surface cellulaire (CD69, CD25, costimulateur inducible des lymphocytes T [ICOS], protéine 1 de mort cellulaire programmée [PD-1]) et l'expression de molécules effectrices (granzyme B, facteur de nécrose tumorale-alpha [TNF-α]), au cours d'un suivi temporel allant de 6 à 48 heures.

Notre protocole utilise un gradient de concentration d'anticorps anti-CD3 fixés sur plaque afin de moduler précisément l'intensité de la stimulation, imitant ainsi l'avidité différentielle de liaison du TCR observée dans des conditions physiologiques. La méthode permet une forte efficacité de réticulation du TCR et une activation robuste des lymphocytes T primaires au repos. La procédure standardisée d'enduction assure une répartition uniforme des anticorps à la surface de la plaque, conduisant à une stimulation homogène des cellules au sein d'un même lot et à une excellente reproductibilité expérimentale. Ce format offre une approche économique et simple sur le plan opérationnel pour l'activation des lymphocytes T.

Cependant, certaines limites de cette approche doivent être reconnues. La stimulation médiée par des anticorps anti-CD3/CD28 diffère nettement du contexte physiologique in vivo. Bien que les méthodes expérimentales utilisant uniquement des anticorps agonistes anti-CD3 et anti-CD28 pour évaluer l'activation des lymphocytes T puissent fournir des indicateurs efficaces de l'activation, elles ne parviennent pas à reproduire complètement les interactions entre les cellules présentatrices d'antigène et les lymphocytes T, ainsi que le microenvironnement co-stimulateur qui se produit dans des conditions physiologiques14.

Malgré ces limitations, ce protocole offre une plateforme systématique et reproductible qui constitue un outil précieux et accessible pour étudier les réponses des lymphocytes T dépendantes de l'intensité du signal du TCR, et peut compléter des modèles plus complexes spécifiques à l'antigène.

Protocole

Toutes les expériences sur les animaux menées dans cette étude ont été approuvées par le Comité d'éthique pour les soins et l'utilisation des animaux de l'Université militaire médicale du Troisième district.

1. Préparation des réactifs et des plaques

  1. Préparer l'anticorps anti-CD3 fixé sur plaque dans du PBS stérile à 0,1, 0,5, 1, 5 et 10 µg/mL.
  2. Ajouter 50 µL de la solution d'anticorps anti-CD3 de revêtement par puits dans des plaques 96 puits à fond plat.
  3. Fermer les plaques avec un film d'étanchéité et incuber toute la nuit à 4 °C.
  4. Aspirer la solution de revêtement et laver chaque puits deux fois avec 200 µL de PBS stérile avant d'ajouter les cellules.

2. Isolement de cellules T CD8+ naïves à partir de la rate de souris

  1. Sélectionner des souris mâles C57BL/6 âgées de 6 à 8 semaines (achetées auprès de Sibeifu (Beijing) Biotechnology Co., Ltd.) et les euthanasier par inhalation de CO2  suivie d'une dislocation cervicale. Les souris sont élevées dans des conditions spécifiques sans agents pathogènes, avec un cycle lumière/obscurité de 12 heures et un accès libre à la nourriture et à l'eau. Un minimum de 3 souris est utilisé par expérience indépendante.
  2. Inciser soigneusement le péritoine avec des ciseaux chirurgicaux pour exposer la rate, saisir et prélever la rate à l’aide de pinces, puis la placer dans une boîte de collecte contenant du RPMI 1640 prérefroidi supplémenté avec 2 % de sérum de veau fœtal (FBS) (R2). Maintenir la boîte sur glace jusqu’à la dissociation.
    NOTE : Collecter tous les cadavres d’animaux et les déchets de culture cellulaire dans des sacs de biosécurité désignés et les stériliser à l’autoclave à 121 °C pendant 20 min avant élimination.
  3. Retirer la rate de la boîte de collecte et la transférer dans une boîte de 60 mm contenant 3 mL de tampon de lyse 1 × ammonium-chlorure-potassium (ACK).
  4. Préparer une suspension monocellulaire en broyant doucement la rate à travers un tamis cellulaire de 70 µm à l’aide du piston d’une seringue de 3 mL.
  5. Incuber la suspension pendant 1 min à température ambiante (RT), puis ajouter 3 mL de milieu R2 prérefroidi pour neutraliser le tampon de lyse ammonium-chlorure-potassium (ACK).
  6. Transférer la suspension cellulaire dans un tube conique de 15 mL et centrifuger à 500 × g pendant 5 min à 4 °C.
  7. Après centrifugation, aspirer le surnageant et resuspendre le culot dans 10 mL de tampon de marquage pour cytométrie en flux (PBS avec 2 % de FBS).
  8. Filtrer la suspension à travers un tamis cellulaire de 70 µm dans un nouveau tube conique de 15 mL, puis centrifuger à nouveau à 500 × g pendant 5 min à 4 °C.
    NOTE : L’azoture de sodium doit être omis du tampon de marquage pour cytométrie en flux afin de préserver la viabilité cellulaire pour les essais fonctionnels. Tous les échantillons doivent être maintenus à 4 °C et analysés immédiatement.
  9. Aspirer le surnageant et resuspendre le culot cellulaire dans 200 µL de cocktail d’anticorps biotinylés par rate de souris (contenant anti-CD16/32 (blocage Fc), anti-TER-119, anti-CD19, anti-CD4, anti-B220, anti-NK1.1, anti-Ly-6G, anti-CD11b, anti-CD11c, anti-CD49b, anti-CD44 et anti-F4/80).
  10. Incuber sur glace pendant 25 min en retournant doucement le tube toutes les 5 min pour assurer un mélange complet.
  11. Laver les cellules avec un grand volume de tampon de marquage pour cytométrie en flux, centrifuger à 500 × g pendant 5 min et éliminer le surnageant.
  12. Resuspendre le culot dans le même volume de tampon de marquage pour cytométrie en flux utilisé pour le cocktail d’anticorps biotinylés, ajouter des billes magnétiques revêtues de streptavidine à la moitié de ce volume, puis incuber sur glace pendant 15 min en retournant doucement le tube toutes les 5 min pour assurer un mélange complet.
  13. Centrifuger brièvement le tube, le placer sur un support magnétique pendant 2 à 3 min, puis transférer soigneusement le surnageant (cellules T CD8+ naïves enrichies) dans un nouveau tube conique de 15 mL.
  14. Laver les cellules collectées une fois avec du tampon de marquage pour cytométrie en flux, puis centrifuger à nouveau à 500 × g pendant 5 min.
  15. Éliminer le surnageant et resuspendre le culot dans du RPMI 1640 supplémenté avec 10 % de FBS (R10) pour les applications ultérieures.

3. Marquage avec le colorant violet de suivi de la prolifération (CTV) pour le suivi de la prolifération

  1. Préparez immédiatement avant utilisation 2 × une solution de travail fraîche de CTV (10 µM). Mélangez complètement la solution mère de CTV à 5 mM (dans du diméthylsulfoxyde [DMSO]) par vortexage, puis diluez-la davantage avec du PBS stérile pour obtenir une concentration finale de 10 µM.
    ATTENTION : Manipulez la solution mère de CTV (préparée dans du DMSO) avec des gants en nitrile sous hotte chimique, car le DMSO facilite l'absorption cutanée de composés toxiques. Évitez toute inhalation et tout contact cutané.
  2. Resuspendez la moitié des cellules T CD8+ naïves isolées dans du PBS pré-refroidi à une densité de 8 × 107 cellules/mL.
  3. Ajoutez rapidement un volume égal de solution de travail 2 × de CTV (10 µM) à la suspension cellulaire et mélangez soigneusement par pipetage, obtenant ainsi une concentration finale de CTV de 5 µM.
  4. Incubez les cellules à température ambiante à l’abri de la lumière pendant 20 min, en retournant doucement les tubes toutes les 5 min pour assurer un mélange homogène.
  5. Ajoutez 5 volumes de milieu de culture (contenant au moins 10 % de FBS) aux cellules et incubez pendant 5 min sur de la glace pour éliminer tout colorant libre.
  6. Centrifugez les cellules à 500 × g pendant 5 min, puis resuspendez le culot dans du milieu complet R10 fraîchement pré-chauffé, supplémenté en anti-CD28 (concentration finale : 1 µg/mL) et en IL-2 (concentration finale : 10 ng/mL).
  7. Ajoutez 250 µL de suspension cellulaire (contenant 6 × 105 cellules) dans chaque puits des plaques 96-puits pré-enrobées.
  8. Incubez les cellules à 37 °C avec 5 % de CO₂ pendant un maximum de 48 h.

4. Détection du VTC par cytométrie en flux

  1. Recueillir les cellules dans une plaque de 96 puits à fond rond à 6, 36 et 48 h. Centrifuger à 500 × g pendant 5 min et laver deux fois avec le tampon de marquage pour cytométrie en flux.
  2. Pour le marquage des surfaces, incuber les cellules avec 50 µL d'un mélange d'anticorps contenant l'anti-CD8, un colorant vital fixable et l'anti-CD44 pendant 30 min sur de la glace à l'abri de la lumière.
    NOTE : Recueillir tous les surnageants contenant des anticorps conjugués à des fluorophores dans des récipients désignés pour les déchets, supplémentés avec 0,5 % d'hypochlorite de sodium pour la décontamination, et les éliminer conformément aux protocoles institutionnels de gestion des déchets biologiques dangereux.
  3. Laver les cellules deux fois avec le tampon de marquage pour cytométrie en flux et les resuspendre dans 200 µL de ce même tampon pour l'acquisition sur cytomètre en flux.
  4. Acquérir les échantillons sur un cytomètre en flux équipé de trois lasers. Préparer des témoins monocolorés à l'aide de cellules marquées afin de régler les paramètres de compensation.
  5. Appliquer la stratégie de sélection suivante : exclure les débris par la porte en fonction de la diffusion directe (FSC) par rapport à la diffusion latérale (SSC), éliminer les doublests par la porte des cellules uniques, puis sélectionner les lymphocytes T CD8+ viables (négatifs pour le colorant vital fixable) pour l'analyse.
  6. Recueillir au moins 1 × 104 événements de lymphocytes T CD8+ sélectionnés par échantillon. Analyser les données à l'aide du logiciel d'analyse de cytométrie en flux et calculer la proportion de cellules ayant subi une ou plusieurs divisions à l'aide du module d'analyse de la prolifération.

5. Coloration de surface et intracellulaire pour l'activation et la signalisation

  1. Résuspendre une autre moitié de cellules T CD8+ naïves dans du R10 supplémenté avec un anti-CD28 à 1 µg/mL et de l'IL-2 à 10 ng/mL, à une concentration de 2,4 × 106 cellules/mL.
  2. Ajouter 250 µL de suspension cellulaire (6 × 105 cellules) dans chaque puits des plaques 96 puits pré-enrobées.
  3. Incuber les cellules à 37 °C avec 5 % de CO₂ pendant un maximum de 48 h.
  4. Aux temps indiqués (6, 10, 12, 24 et 36 h), récupérer les cellules dans une plaque 96 puits à fond rond.
    NOTE : Le temps de 6 h permet de capter la signalisation précoce du TCR (p-S6) et l'expression de CD69 ; cette dernière est également évaluée aux temps 12, 24 et 36 h afin de suivre sa cinétique complète. L'expression de CD25, PD-1 et ICOS est mesurée aux temps 10, 12, 24 et 36 h ; le temps de 48 h est réservé à l'analyse de la prolifération (section 4) et à la détection des cytokines (section 6).
  5. Centrifuger à 500 × g pendant 1 min et résuspendre le culot cellulaire dans 200 µL de tampon de marquage pour cytométrie en flux.
  6. Centrifuger à 500 × g pendant 1 min, puis aspirer le surnageant. Laver les cellules deux fois avec 200 µL de tampon de marquage pour cytométrie en flux.
  7. Pour le marquage des protéines membranaires, incuber les cellules avec 50 µL d'un mélange d'anticorps contenant des anticorps anti-CD69, anti-CD25, anti-CD8, anti-PD-1, anti-ICOS et un colorant vital fixable pendant 30 min sur glace à l'abri de la lumière.
  8. Laver les cellules trois fois avec le tampon de marquage pour cytométrie en flux afin d'éliminer les anticorps non liés.
  9. Résuspendre le culot cellulaire dans 200 µL de paraformaldéhyde à 1 % et fixer les cellules à température ambiante (TA) à l'abri de la lumière pendant 15 min.
    ATTENTION : Effectuer toutes les étapes impliquant le paraformaldéhyde sous hotte chimique afin d'éviter l'inhalation de vapeurs. Collecter tous les déchets liquides contenant du fixateur dans un récipient séparé, étiqueté pour l'élimination des produits chimiques dangereux.
  10. Centrifuger à 500 × g pendant 1 min, puis laver une fois avec le tampon de marquage pour cytométrie en flux.
  11. Préchauffer à température ambiante le tampon de lyse/fixation 5 × et préparer une solution de travail 1 × avec de l'eau distillée.
  12. Ajouter 200 µL de solution de travail (tampon de lyse/fixation 1 ×) dans chaque puits, puis incuber les cellules à température ambiante à l'abri de la lumière pendant 30 min.
  13. Laver deux fois avec le tampon de perméabilisation/lavage 1 × pour le marquage des épitopes phosphorylés. Résuspendre le culot dans le tampon de perméabilisation/lavage 1 × pour le marquage des épitopes phosphorylés et incuber à température ambiante à l'abri de la lumière pendant 10 min.
  14. Centrifuger à 500 × g pendant 1 min et jeter les surnageants.
  15. Pour le marquage intracellulaire, incuber les cellules avec 50 µL d'un mélange d'anticorps contenant un anticorps anti-p-S6 pendant 60 min à température ambiante à l'abri de la lumière.
  16. Laver les cellules trois fois avec le tampon de perméabilisation/lavage 1 × pour le marquage des épitopes phosphorylés.
  17. Pour le marquage avec l'anticorps secondaire, incuber les cellules avec 50 µL d'un mélange d'anticorps contenant un anticorps secondaire anti-lapin pendant 30 min sur glace à l'abri de la lumière.
  18. Laver les cellules trois fois avec le tampon de perméabilisation/lavage 1 × pour le marquage des épitopes phosphorylés, puis une fois avec le tampon de marquage pour cytométrie en flux.
  19. Résuspendre le culot cellulaire dans 200 µL de tampon de marquage pour cytométrie en flux et acquérir les échantillons sur le même cytomètre en flux.
  20. Appliquer la même stratégie de gating que celle décrite dans la section 4.5 et acquérir au moins 1 × 104 cellules T CD8+ par échantillon.
  21. Analyser l'intensité médiane de fluorescence (IMF) pour chaque marqueur à l'aide d'un logiciel d'analyse de cytométrie en flux.

6. Blocage et détection des cytokines intracellulaires

  1. 5 h avant la récolte, ajouter 100 µL par puits de R10 frais supplémenté avec de la PMA (50 ng/mL), de l'ionomycine (1 µg/mL), des inhibiteurs du transport protéique (monensine) (1:1000) et des inhibiteurs du transport protéique (à base de brefeldine A) (1:1000). Mélanger délicatement et replacer les plaques dans l'incubateur à 37 °C afin d'inhiber la sécrétion de cytokines et permettre l'accumulation intracellulaire.
  2. Au point temporel souhaité, recueillir les cellules dans une plaque de 96 puits à fond rond.
  3. Centrifuger à 500 × g pendant 1 min et resuspendre le culot cellulaire dans 200 µL de tampon de marquage pour cytométrie en flux.
  4. Centrifuger à 500 × g pendant 1 min et aspirer le surnageant. Laver deux fois avec 200 µL de tampon de marquage pour cytométrie en flux.
  5. Pour le marquage des marqueurs de surface, incuber les cellules avec 50 µL d'un cocktail d'anticorps contenant de l'anti-CD44, de l'anti-CD8 et un colorant vital fixable pendant 30 min sur de la glace, à l'abri de la lumière.
  6. Laver trois fois avec le tampon de marquage pour cytométrie en flux afin d'éliminer les anticorps non liés.
  7. Perméabiliser les cellules en ajoutant 200 µL de solution de fixation et de perméabilisation et incuber pendant 30 min sur de la glace, à l'abri de la lumière.
    ATTENTION : Effectuer toutes les étapes impliquant la solution de fixation/perméabilisation (contenant du paraformaldéhyde) sous une hotte aspirante afin d'éviter l'inhalation de vapeurs. Recueillir tous les déchets liquides contenant du fixateur dans un récipient séparé marqué pour l'élimination des produits chimiques dangereux.
  8. Centrifuger à 500 × g pendant 1 min et jeter le surnageant dans les déchets chimiques dangereux.
  9. Laver les cellules trois fois avec 1 × tampon de perméabilisation/lavage.
  10. Pour le marquage intracellulaire des cytokines, incuber avec 50 µL d'un cocktail d'anticorps contenant de l'anti-TNF-α et de l'anti-Granzyme B pendant 30 min sur de la glace, à l'abri de la lumière.
  11. Laver les cellules trois fois avec 1 × tampon de perméabilisation/lavage pour éliminer les anticorps non liés, puis effectuer un dernier lavage avec le tampon de marquage pour cytométrie en flux.
  12. Resuspendre le culot cellulaire dans 200 µL de tampon de marquage pour cytométrie en flux et acquérir les échantillons sur le même cytomètre en flux.
  13. Appliquer la même stratégie de fenêtrage que celle décrite à la section 4.5 et recueillir au moins 1 × 104 cellules T CD8+ par échantillon. Analyser le pourcentage de positivité et l'intensité moyenne de fluorescence (MFI) pour chaque marqueur à l'aide d'un logiciel d'analyse en cytométrie en flux.

Résultats

Afin d'étudier les effets de différentes intensités de stimulation par l'anti-CD3 sur l'activation des lymphocytes T, nous avons isolé des splénocytes murins et purifié les lymphocytes T CD8+ pour une culture in vitro, puis réalisé des tests d'activation des lymphocytes T et une analyse par cytométrie en flux. Pour l'analyse des données, les lymphocytes ont d'abord été sélectionnés à l'aide d'une combinaison de FSC-A et de SSC-A, suivie de la sélection des événements simples via FSC-H et FSC-W, puis de SSC-H avec SSC-W. Les lymphocytes T CD8+ vivants ont ensuite été sélectionnés en utilisant le marqueur CD8 combiné à un colorant de viabilité fixable pour les analyses ultérieures (Figure 1A).

Afin de valider que le système de stimulation par anticorps fixé sur plaque active efficacement les lymphocytes T in vitro, nous avons examiné la phosphorylation de la protéine ribosomale S6 (p-S6), un indicateur bien établi de l'activité de mTORC1 et un point de convergence des voies PI3K-mTOR et MEK-ERK MAPK en aval de la signalisation du TCR15,16. Conformément à ces résultats, nous avons observé une augmentation dépendante de la dose des niveaux de p-S6 à 6 h après la stimulation, avec des concentrations croissantes d'anticorps anti-CD3 (0,1–10 µg/mL) (Figure 1B), confirmant ainsi que le système anti-CD3 fixé sur plaque active l'axe TCR-mTORC1-S6 de manière dépendante de l'intensité du signal. Cet événement précoce de phosphorylation est compatible avec l'engagement de voies métaboliques dépendantes de mTORC1, qui soutiennent ultérieurement la prolifération des lymphocytes T et leur différenciation en effecteurs.

La prolifération cellulaire a été évaluée par cytométrie en flux de dilution du CTV après une stimulation du TCR par des concentrations croissantes d'anticorps anti-CD3 (0,1–10 µg/mL) à trois moments après la stimulation : 6, 36 et 48 h. Au stade précoce de 6 h, seule une dilution proliférative minimale a été observée dans toutes les conditions de stimulation. À 36 h, le groupe stimulé à faible dose (0,1 µg/mL) n'avait toujours pas induit d'expansion clonale notable, tandis que les groupes à dose intermédiaire et élevée présentaient des pics bien définis de dilution du CTV (5 et 10 µg/mL), indiquant le début de la progression du cycle cellulaire. À 48 h, les phénotypes prolifératifs différentiels selon les concentrations de stimulation étaient les plus marqués. Une stimulation faible du TCR (0,1 µg/mL) a produit seulement 1,25 % de cellules proliférant et un unique pic de CTV non dilué, indiquant une activation suboptimale. Une stimulation intermédiaire (1–5 µg/mL) a induit trois pics de division bien résolus, avec des fractions prolifératives augmentant de 70,8 % à 84,0 %. Une stimulation forte (10 µg/mL) a atteint la fraction proliférative la plus élevée (89,5 %), affichant le nombre maximal de générations de division et démontrant la détection d'une saturation de la prolifération (Figure 2).

Nous avons ensuite examiné l'expression des marqueurs précoces d'activation CD69 et CD25. Notamment, la présente étude a révélé une surexpression rapide et dépendante de la dose de CD69, basée sur l'intensité médiane de fluorescence (IMF). Sous stimulation intermédiaire et forte (5 et 10 µg/mL), CD69 augmentait rapidement à 24 h, suivie d'une diminution progressive entre 24 et 36 h. Toutefois, sous stimulation faible (0,1, 0,5 et 1 µg/mL), CD69 augmentait progressivement durant toute la période de stimulation. Le profil cinétique d'expression de CD69 décrit ci-dessus est conforme à son rôle de marqueur précoce d'activation des lymphocytes T (Figure 3A)17. Fait intéressant, nous avons observé que l'expression de CD25 augmentait progressivement de manière dépendante de la dose et du temps (Figure 3B). Conformément aux recherches antérieures, la surexpression de CD25 était plus lente que celle de CD69, particulièrement lors d'une stimulation optimale18,19.

Afin d'étudier davantage l'effet régulateur de l'intensité de la stimulation du TCR sur l'expression des récepteurs inhibiteurs et des molécules co-stimulatrices dans les lymphocytes T CD8+, nous avons analysé les niveaux d'expression de PD-1 et d'ICOS. L'expression inductible de PD-1 dépend d'une stimulation intense du TCR. Dans le groupe de stimulation faible intensité (0,5–1 µg/mL), PD-1 était exprimé à un faible niveau tout au long de la période de stimulation. En revanche, dans le groupe de stimulation d'intensité moyenne à élevée (5–10 µg/mL), l'expression de PD-1 augmentait progressivement à partir de 10 h et atteignait un maximum à 36 h (Figure 4A). L'expression d'ICOS augmentait également en fonction de l'intensité de la stimulation et atteignait son niveau maximal à 5–10 µg/mL à 36 h (Figure 4B). Ces résultats suggèrent qu'une stimulation intense du TCR peut augmenter significativement les niveaux d'expression de PD-1 et d'ICOS.

Enfin, nous avons examiné la capacité fonctionnelle des lymphocytes T stimulés après une re-stimulation par la PMA et l'ionomycine à 24 h et 48 h post-stimulation. À 24 h, nous avons quantifié la production de TNF-α et de la granzyme B et observé que les fréquences des cellules TNF-α+, Granzyme B+ et TNF-α+Granzyme B+ augmentaient progressivement de manière dépendante de la dose d'anticorps anti-CD3 (Figure 5A, B). De façon cohérente, l'intensité moyenne de fluorescence (MFI) du TNF-α et de la granzyme B montrait également une augmentation dépendante de la concentration et atteignait un maximum lors d'une stimulation intense (10 µg/mL) (Figure 5C), reflétant une différenciation précoce en effecteurs dépendante de la dose, induite par une intensité croissante du signal du récepteur des cellules T (TCR). À 48 h, toutefois, ce profil s'inversait nettement. Des concentrations plus élevées d'anti-CD3 réduisaient significativement les pourcentages de cellules TNF-α+Granzyme B+ et diminuaient l'expression des molécules effectrices au niveau de chaque cellule.

Toutes les données présentées sont représentatives de 3 expériences indépendantes. Les analyses statistiques ont été réalisées à l'aide d'une ANOVA à un ou deux facteurs suivie du test post-hoc de Tukey ; les données sont exprimées comme moyenne ± SEM. La viabilité cellulaire a régulièrement dépassé 90 %, et un minimum de 1 × 104 événements de cellules T CD8+ vivantes a été acquis par échantillon.

Données de cytométrie en flux : diagrammes de sélection des populations cellulaires, histogrammes de quantification des protéines et graphique en barres.
Figure 1: Activation in vitro et analyse par cytométrie en flux des lymphocytes T CD8+. (A) Des lymphocytes T CD8+ purifiés à partir de splénocytes de souris ont été stimulés in vitro avec différentes concentrations d'anticorps anti-CD3 (0,1–10 µg/mL) combinées à une concentration fixe d'anticorps anti-CD28 (1 µg/mL) pendant 6 à 48 heures, suivis d'une analyse par cytométrie en flux de l'activation cellulaire. Les débris cellulaires ont été exclus par sélection selon la diffusion directe (FSC) et la diffusion latérale (SSC), les doublets ont été exclus par sélection des cellules simples (singlets), et les lymphocytes T CD8+ négatifs pour le colorant de viabilité fixable ont été sélectionnés pour les analyses ultérieures. (B) Phosphorylation de la protéine ribosomale S6 (p-S6) dans les lymphocytes T CD8+ 6 heures après stimulation avec les concentrations indiquées d'anti-CD3 (0,1–10 µg/mL) en présence d'une concentration constante d'anti-CD28 (1 µg/mL). Histogramme représentatif (à gauche) et résumé de l'intensité moyenne de fluorescence (MFI, à droite). Les graphiques de cytométrie en flux sont représentatifs de 3 expériences indépendantes. Les données montrent la moyenne ± erreur standard de la moyenne (SEM). Analyse statistique : ANOVA à un facteur avec mesures répétées et test post-hoc de Tukey. *P < 0,05, **P < 0,01, ***P < 0,001, ****P < 0,0001 ; ns, non significatif. Veuillez cliquer ici pour visualiser une version agrandie de cette figure.

Essai de prolifération cellulaire, graphique en histogramme, montrant la relation entre le CTV et le pourcentage de prolifération au fil du temps.
Figure 2 : Analyse de la prolifération basée sur le colorant violet de traçage de la prolifération (CTV) de cellules T CD8+ primaires de souris soumises à une stimulation TCR progressive. Des cellules T CD8+ marquées au CTV ont été stimulées in vitro avec un anticorps anti-CD3 à des concentrations croissantes comprises entre 0,1 et 10 µg/mL pendant 6 à 48 heures. La prolifération cellulaire a été évaluée en fonction de la dilution et de l'atténuation de la fluorescence du CTV dans les cellules T CD8+ par analyse en cytométrie en flux. Les histogrammes montrent la distribution de la fluorescence du CTV pour chaque groupe de concentration, le pourcentage de cellules ayant subi une ou plusieurs divisions étant indiqué. Les dot plots de cytométrie en flux sont représentatifs de 3 expériences indépendantes. Veuillez cliquer ici pour visualiser une version agrandie de cette figure.

Analyse par cytométrie en flux, expression de CD69 et CD25, histogramme et courbe, activation des cellules immunitaires.
Figure 3 : Kinétique d'expression des marqueurs précoces d'activation CD69 et CD25 sur les lymphocytes T CD8+ après stimulation par anti-CD3. Des lymphocytes T CD8+ naïfs ont été stimulés par des anticorps anti-CD3 fixés sur plaque aux concentrations indiquées (0,1–10 µg/mL) en présence d'une concentration constante d'anticorps anti-CD28 (1 µg/mL). L'expression de CD69 a été mesurée aux temps 6, 12, 24 et 36 h ; celle de CD25 aux temps 10, 12, 24 et 36 h, puis analysée par cytométrie en flux. Les panneaux de gauche montrent des histogrammes représentatifs aux temps indiqués ; les panneaux de droite illustrent l'évolution dynamique de l'intensité moyenne de fluorescence (MFI) au fil du temps. (A) CD69. (B) CD25. Les graphiques de cytométrie en flux sont représentatifs de 3 expériences indépendantes. Les données montrent la moyenne ± erreur standard de la moyenne (SEM). Analyse statistique : ANOVA à deux facteurs avec mesures répétées, suivie du test post-hoc de Tukey. *P < 0,05, **P < 0,01, ***P < 0,001, ****P < 0,0001 ; ns, non significatif. Veuillez cliquer ici pour consulter une version agrandie de cette figure.

Analyse par cytométrie en flux, expression de PD-1 et ICOS, histogrammes et graphiques, réponse cellulaire au fil du temps.
Figure 4: Cinétique d'expression du récepteur inhibiteur PD-1 et de la molécule co-stimulatrice ICOS sur les lymphocytes T CD8+ après stimulation par anti-CD3. Des lymphocytes T CD8+ naïfs ont été stimulés par une anti-CD3 fixée sur plaque aux concentrations indiquées (0,1–10 µg/mL) en présence d'une anti-CD28 constante (1 µg/mL). Les cellules ont été récoltées aux temps 10, 12, 24 et 36 h et analysées par cytométrie en flux. Les panneaux de gauche montrent des histogrammes représentatifs aux temps indiqués ; les panneaux de droite illustrent les variations dynamiques de l'intensité moyenne de fluorescence (MFI) au fil du temps. (A) PD-1. (B) ICOS. Les graphiques de cytométrie en flux sont représentatifs de 3 expériences indépendantes. Les données montrent la moyenne ± erreur standard de la moyenne (SEM). Analyse statistique : ANOVA à deux facteurs avec mesures répétées et test post-hoc de Tukey. *P < 0,05, **P < 0,01, ***P < 0,001, ****P < 0,0001 ; ns, non significatif. Veuillez cliquer ici pour consulter une version agrandie de cette figure.

Résultats de l'analyse par cytométrie en flux, expression de TNF-α et de la granzyme B, graphiques en barres et nuages de points, étude immunologique.
Figure 5 : La production intracellulaire de cytokines par les lymphocytes T CD8+ dépend de la force du TCR. Des lymphocytes T CD8+ naïfs ont été stimulés avec des concentrations croissantes d'anticorps anti-CD3 (0,1–10 µg/mL) en présence d'une concentration constante d'anticorps anti-CD28 (1 µg/mL). À 24 h et 48 h après la stimulation, les cellules ont été récoltées après une incubation de 5 h avec des inhibiteurs du transport protéique (monensine et brefeldine A) en présence de PMA et d'ionomycine, afin de bloquer la sécrétion des cytokines et permettre leur accumulation intracellulaire. (A) Les diagrammes en contour montrent les fréquences de cellules positives pour la TNF-α et la granzyme B à chaque concentration et point temporel indiqués. Les cellules non stimulées ont servi de contrôle négatif. (B) Proportions de cellules TNF-α+, granzyme B+, et TNF-α+ granzyme B+. (C) L'intensité moyenne de fluorescence (MFI) de la TNF-α et de la granzyme B. Les graphiques de cytométrie en flux sont représentatifs de 3 expériences indépendantes. Les données montrent la moyenne ± erreur standard de la moyenne (SEM). Analyse statistique : ANOVA à deux facteurs avec mesures répétées, suivie du test post-hoc de Tukey. *P < 0,05, **P < 0,01, ***P < 0,001, ****P < 0,0001 ; ns, non significatif. Veuillez cliquer ici pour consulter une version agrandie de cette figure.

Discussion

Ce protocole fournit une méthode systématique et reproductible pour étudier les réponses des lymphocytes T dépendantes de l'intensité du signal du TCR. La stratégie de revêtement progressif par anti-CD3 permet un contrôle précis de l'intensité de la stimulation, permettant aux chercheurs d'analyser la relation quantitative entre l'activation du TCR et les effets fonctionnels en aval. Les étapes clés comprennent la purification des lymphocytes T CD8⁺ naïfs, le contrôle précis du gradient de concentration de revêtement par anti-CD3 et la normalisation stricte du nombre de cellules par puits. Afin d'assurer la comparabilité des données entre les expériences, nous recommandons également d'utiliser des paramètres d'instrument constants, des matrices de compensation et des stratégies de sélection (gating), ainsi que les mêmes lots d'anticorps et de colorants viables fixables, lorsque cela est possible. La fiabilité de ces étapes critiques détermine directement si les résultats expérimentaux peuvent refléter avec précision les effets de variations de l'intensité de stimulation du TCR sur la dynamique phénotypique des lymphocytes T.

Dans ce protocole, nous avons utilisé une stimulation par anticorps fixé sur plaque, dans laquelle des anticorps anti-CD3 sont directement déposés à la surface de la plaque de culture afin de réticuler le complexe TCR-CD3. Cette approche offre un bon rapport coût-efficacité, une distribution uniforme des anticorps, une variabilité inter-puits minimale et une excellente reproductibilité. Notamment, le titrage des concentrations d'anticorps de revêtement permet une modulation précise et graduée de l'intensité de la stimulation, une caractéristique qui distingue ce système de la stimulation par billes conjuguées, où la densité de ligand est généralement fixée à un niveau saturant, limitant ainsi la modulation fine du signal14. Toutefois, la stimulation par anticorps fixé induit une réticulation du TCR supraphysiologique et prolongée, fondamentalement différente de l'interaction transitoire dépendante de l'affinité provoquée par les complexes peptide-MHC sur les cellules présentatrices d'antigène. Bien que plus proche de la physiologie, la stimulation basée sur les pMHC est techniquement exigeante, nécessite une expertise spécialisée pour la production de multimères et entraîne des coûts nettement plus élevés. Pour l'isolement cellulaire, nous avons utilisé une sélection immunomagnétique négative, qui est simple, rapide et économique. Bien qu'elle offre une pureté inférieure par rapport à la cytométrie en flux (FACS), elle évite les contraintes mécaniques et le marquage fluorescent qui pourraient compromettre l'état physiologique des cellules triées20,21.

Les principaux problèmes susceptibles de survenir lors de l'exécution du protocole comprennent une faible pureté du tri, une prolifération faible, une cytotoxicité induite par le CTV, une mauvaise viabilité post-culture et une coloration irrégulière. En cas de faible pureté, assurez-vous d'un mélange suffisant des cellules avec le cocktail d'anticorps biotinylés et les billes revêtues de streptavidine, prolongez la durée de séparation magnétique si nécessaire, et optimisez le rapport billes-anticorps pour chaque nouveau lot de réactif. Si une prolifération minimale est observée même à la concentration maximale d'anti-CD3, vérifiez la viabilité et la pureté (notamment la contamination par les cellules CD44hi) des cellules naïves isolées, confirmez la procédure d'enrobage par l'anti-CD3 (scellez les plaques avec un film de scellage durant l'incubation nocturne à 4 °C et assurez une couverture uniforme par l'anticorps), et validez la concentration d'IL-2, car cette cytokine est essentielle pour soutenir l'expansion des lymphocytes T. En cas de cytotoxicité induite par le CTV, réduisez la concentration de coloration tout en maintenant une résolution claire des pics de division, et assurez-vous que l'étape de blocage soit effectuée strictement sur glace pendant les 5 minutes complètes afin d'éliminer tout colorant libre résiduel22,23. En cas de mauvaise viabilité après la culture, contrôlez la densité cellulaire, assurez un volume suffisant de milieu, et maintenez une technique stérile. Si une coloration irrégulière ou une variabilité élevée en cytométrie en flux est observée, préparez les mélanges d'anticorps sous forme de mélanges maîtres, protégez tous les échantillons colorés de la lumière, et utilisez les mêmes lots d'anticorps et les mêmes lots de colorant de viabilité fixable pour tous les réplicats.

Néanmoins, ce protocole présente certaines limites. En tant que système in vitro, il ne peut pas recréer le microenvironnement tissulaire complexe, les interactions cellulaires ou le milieu de cytokines des organes lymphoïdes secondaires. La fenêtre de culture est limitée à 48 h, ce qui restreint l'analyse aux événements précoces d'activation et empêche l'évaluation de la différenciation tardive, de l'épuisement ou de la formation de la mémoire. De plus, le protocole repose fortement sur des lectures par cytométrie en flux, qui exigent une standardisation rigoureuse des paramètres des instruments, des matrices de compensation et des stratégies de gating entre expériences indépendantes. En outre, les résultats obtenus avec ce système basé sur l'anti-CD3/CD28 proviennent exclusivement de lymphocytes T CD8+ et ne peuvent pas être directement généralisés aux lymphocytes T CD4+, dont les seuils d'activation, les besoins en co-stimulation et les trajectoires de différenciation en aval sont connus pour être différents12,24,25. En outre, l'état basal d'activation des lymphocytes T peut varier entre différentes colonies de souris en raison des différences de microbiote commensal, ce qui constitue une source potentielle de variabilité inter-laboratoires à prendre en compte lors de l'interprétation des résultats entre études.

Le système de stimulation graduée décrit ici permet aux chercheurs d'ajuster la force du signal du TCR à des objectifs expérimentaux spécifiques en fonction des profils de réponse distincts observés pour différents marqueurs de lecture. Ces données montrent que le choix de la concentration en anti-CD3 et du moment de prélèvement doit être guidé par la question biologique posée. Pour les marqueurs précoces d'activation immédiate, la surexpression de CD69 est détectable dès 6 à 12 heures pour toutes les concentrations, mais présente une cinétique différente : les fortes concentrations (5 à 10 µg/mL) induisent un pic rapide suivi d’un déclin, tandis que les faibles concentrations (0,5 à 1 µg/mL) entraînent une augmentation progressive et durable. Pour les tests de prolifération, les concentrations inférieures à 1 µg/mL sont sous-optimales et peuvent servir de contrôles négatifs internes, alors que les concentrations de 5 à 10 µg/mL induisent de manière fiable une expansion clonale robuste, détectable par dilution du CTV à 48 heures. L'expression du récepteur co-inhibiteur PD-1 et de la molécule co-stimulatrice ICOS nécessite une stimulation intense (5 à 10 µg/mL) et atteint un maximum à 36 heures, indiquant que les études portant sur ces molécules doivent éviter des conditions plus précoces ou à dose plus faible. Pour les marqueurs de fonction effectrice (TNF-α et Granzyme B), la relation entre l'intensité de la stimulation et la production de cytokines dépend du temps et suit un profil biphasique caractéristique. À 24 heures, la production de molécules effectrices augmente avec la concentration en anti-CD3, les doses plus élevées entraînant une production plus importante de cytokines. Cependant, à 48 heures, bien que les niveaux absolus de cellules productrices de cytokines soient nettement plus élevés dans toutes les conditions par rapport à 24 heures, la relation dose-réponse s'inverse : les concentrations de stimulation plus faibles (0,5 à 1 µg/mL) donnent lieu à des fréquences relativement plus élevées de cellules TNF-α⁺ Granzyme B⁺ que les fortes doses (5 à 10 µg/mL). Cette inversion suggère que, malgré son rôle dans la différenciation initiale des effecteurs, une signalisation TCR forte et prolongée pourrait limiter la capacité de production de cytokines par cellule, reflétant potentiellement le début d’un état d’épuisement ou d’hyporéactivité induit par l’activation.

Collectivement, ces observations empiriques positionnent notre protocole comme un cadre de référence permettant aux utilisateurs de pré-sélectionner des conditions de stimulation selon des points terminaux spécifiques en aval, améliorant ainsi l'efficacité de la conception expérimentale et l'interprétabilité des données. Au-delà des études mécanistiques fondamentales, ce système peut également guider l'optimisation des protocoles d'expansion des lymphocytes T pour l'immunothérapie adoptive, où une régulation précise de l'intensité du signal du TCR pourrait orienter la différenciation vers des phénotypes effecteurs ou mémoires favorables26,27,28.

Déclarations de divulgation

Les auteurs n'ont rien à divulguer.

Remerciements

Cette étude a été soutenue par la Fondation nationale des sciences naturelles de Chine (n° T2394504, LY) et le Fonds de démarrage de recherche du scientifique en chef Lilin Ye (n° R2045, LY).

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
Tube conique de 15 mLLabgicCD-002-15ATube conique stérile de centrifugation de 15 mL
Paraformaldéhyde à 4 %BeyotimeP0099Fixateur aqueux à 4 % pour la préservation des cellules avant coloration
Boîte de 60 mmLabgic12211Boîte de culture cellulaire de 60 mm
Filtre cellulaire en maille de 70 µmLabgicBS-70-CSFiltre en nylon de 70 µm pour préparer des suspensions monocellulaires
Plaque à fond rond de 96 puitsBeyotimeFPT016Plaque de 96 puits à fond rond pour culture cellulaire et coloration
Solution tampon de lyse ACKBeyotimeC3702Solution tampon de lyse des globules rouges à base de chlorure d'ammonium
Anti-CD25 sourisBiolegend101910Anticorps anti-CD25 souris conjugué à l'APC, clone 3C7, pour cytométrie en flux
Anti-CD28 sourisBio X CellBE0015-1Anticorps purifié anti-CD28 souris, clone 37.51, pour la costimulation des lymphocytes T
Anti-CD3 sourisBio X CellBP0001-1Anticorps purifié anti-CD3ε souris, clone 145-2C11, pour l'activation des lymphocytes T
Anti-CD69 sourisBD Biosciences553237Anticorps anti-CD69 souris conjugué au PE, pour la coloration du marqueur d'activation
Anti-CD8 sourisInvitrogen17-0081-82Anticorps anti-CD8a souris conjugué à l'APC, clone 53-6.7, pour cytométrie en flux
Anti-GZMB sourisBiolegend372212Anticorps anti-granzyme B humain/souris conjugué au PerCP/Cyanine5.5, clone QA16A02, pour cytométrie en flux intracellulaire
Anti-ICOS sourisBD Biosciences565886Anticorps anti-ICOS (CD278) souris conjugué au BV421, pour cytométrie en flux
Anti-PD-1 sourisBiolegend135220Anticorps anti-PD-1 (CD279) souris conjugué au BV605, clone 29F.1A12, pour cytométrie en flux
Anti-TNF-α sourisInvitrogen46-7321-82Anticorps anti-TNF-α souris conjugué au PerCP-eFluor 710, clone MP6-XT22, pour cytométrie en flux intracellulaire
Anti-CD44 souris/humainBiolegend103030Anticorps anti-CD44 souris/humain conjugué au PE/Cyanine7, clone IM7, pour cytométrie en flux
Anti-CD11b souris biotineBiolegend101204Anticorps anti-CD11b souris conjugué à la biotine, pour l'épuisement de lignée
Anti-CD11c souris biotineBiolegend117304Anticorps anti-CD11c souris conjugué à la biotine, pour l'épuisement de lignée
Anti-CD16/32 souris biotineBiolegend156604Anticorps anti-CD16/32 souris conjugué à la biotine, pour l'épuisement de lignée
Anti-CD19 souris biotineBiolegend115504Anticorps anti-CD19 souris conjugué à la biotine, pour l'épuisement de lignée
Anti-CD4 souris biotineBiolegend100508Anticorps anti-CD4 souris conjugué à la biotine, pour l'épuisement de lignée
Anti-CD44 souris biotineBiolegend103004Anticorps anti-CD44 souris conjugué à la biotine, pour l'épuisement de lignée
Anti-CD45R souris biotineBiolegend103204Anticorps anti-CD45R/B220 souris conjugué à la biotine, pour l'épuisement de lignée
Anti-CD49b souris biotineInvitrogen13-5971-85Anticorps anti-CD49b souris conjugué à la biotine, pour l'épuisement de lignée
Anti-F4/80 souris biotineBiolegend123106Anticorps anti-F4/80 souris conjugué à la biotine, pour l'épuisement de lignée
Anti-Ly6G souris biotineBiolegend127604Anticorps anti-Ly6G souris conjugué à la biotine, pour l'épuisement de lignée
Anti-NK1.1 souris biotineBiolegend108704Anticorps anti-NK1.1 souris conjugué à la biotine, pour l'épuisement de lignée
Anti-TER119 souris biotineBiolegend116204Anticorps anti-TER-119 souris conjugué à la biotine, pour l'épuisement de lignée
Souris C57BL/6Sibeifu (Beijing) Biotechnology Co., Ltd.N/ASouris mâles âgées de 6–8 semaines utilisées pour les expériences
Incubateur au dioxyde de carbone (CO2)Thermo Fisher3120Incubateur humidifié au CO2 pour la culture cellulaire de mammifères
Colorant CellTrace VioletInvitrogenC34557Colorant fluorescent violet pour le suivi de la prolifération cellulaire
DMSOSigmaD2650Diméthylsulfoxyde ; solvant pour la préparation de solutions mères de réactifs
Anticorps secondaire anti-IgG de lapin (H+L) de âne hautement adsorbé, Alexa Fluor™ 488InvitrogenA-21206Anticorps secondaire de âne anti-IgG de lapin (H+L) conjugué à l'Alexa Fluor 488
D-PBSVivaCell BiosciencesC3590-0500Solution saline tamponnée au phosphate de Dulbecco’s pour le lavage et la préparation des réactifs
Sérum de veau fœtal (FBS)GibcoC11995500BTComplément sérique pour le milieu de culture cellulaire de mammifères
Colorant de viabilité fixableInvitrogen65-0865-14Colorant de viabilité fixable pour exclure les cellules mortes lors de la cytométrie en flux
Solution de fixation et de perméabilisationBD Biosciences51-2090KZRéactif de fixation et de perméabilisation pour coloration intracellulaire
Plaque de 96 puits à fond platLabgic11510Plaque de 96 puits à fond plat pour culture cellulaire et tests de stimulation
Cytomètre en fluxBD BiosciencesLSRFortessa-3 laserCytomètre en flux à trois lasers pour l'acquisition de fluorescence multicolore
Golgi PlugBD Biosciences51-2301KZInhibiteur du transport des protéines à base de brefeldine A pour la coloration intracellulaire des cytokines
Golgi StopBD Biosciences51-2092KZInhibiteur du transport des protéines à base de monensine pour la coloration intracellulaire des cytokines
Sel de calcium d'ionomycineSigmaI3909-1MLIonophore calcique utilisé avec le PMA pour la stimulation cellulaire
Solution tampon Perm/WashBD Biosciences51-20911KZSolution tampon de perméabilisation et de lavage pour coloration intracellulaire
Solution Phosflow Lyse/FixBD Biosciences558049Solution tampon 5× pour lyser simultanément les globules rouges et fixer les leucocytes
Solution Phosflow Perm/Wash IBD Biosciences557885Solution tampon de perméabilisation à base de méthanol pour coloration intracellulaire des phosphoprotéines
Anticorps monoclonal de lapin contre la protéine ribosomique S6 phosphorylée (Ser235/236) (D57.2.2E)Cell Signaling4858SAnticorps monoclonal de lapin contre la protéine ribosomique S6 phosphorylée (Ser235/236), clone D57.2.2E
PMASigmaP1585-1MGPhorbol 12-myristate 13-acétate ; activateur utilisé pour la stimulation cellulaire ex vivo
Interleukine-2 recombinante de sourisGibco200-02-50UGInterleukine-2 recombinante de souris pour la culture et l'expansion des lymphocytes T
RPMI 1640Life-LabAC01L064Milieu Roswell Park Memorial Institute 1640 pour la culture cellulaire de mammifères
Billes magnétiques streptavidineBEAVER22307Billes magnétiques revêtues de streptavidine pour l'épuisement cellulaire basé sur les anticorps biotinés
Solution de coloration pour cytométrie en fluxNon spécifiéNon spécifiéSolution de coloration pour cytométrie en flux ; fournisseur ou formule de préparation non fournis
Parafilm M film de laboratoireAmcorPM996Film souple auto-adhésif de laboratoire pour sceller les plaques, tubes et récipients de culture
Solution tampon Lyse/FixBD Biosciences558049Solution tampon 5× pour lyser simultanément les globules rouges et fixer les leucocytes
FlowJoBD Biosciencesv10.8.1Logiciel, version 10.8.1, pour l'analyse des données de cytométrie en flux

Références

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