Effet du tuina sur l’expression hypothalamique de l’Orexin-A et le comportement du sommeil dans un modèle rat d’insomnie primaire

Résumé

Cette étude étudie si Tuina soulage l’insomnie dans un modèle de rat en régulant l’expression de l’oréxine-A hypothalamique, à l’aide d’analyses comportementales, d’immunohistochimie et de PCR quantitative en temps réel.

Résumé

L’insomnie est un trouble du sommeil courant qui entraîne une altération des fonctions diurnes et un risque accru de comorbidités, impactant significativement la qualité de vie des patients. Les traitements actuels, principalement la thérapie cognitivo-comportementale et la pharmacothérapie, sont limités par des problèmes tels que la dépendance aux médicaments, la tolérance et le rebond de sevrage. Il a été démontré que la thérapie par la Tuina régule les systèmes nerveux, endocrinien et immunitaire, tandis que le système orexin est un régulateur clé du cycle sommeil-veille. Cela a conduit à l’exploration de la question de savoir si Tuina soulage l’insomnie en modulant le système des orexines hypothalamiques. Ce protocole décrit les méthodes d’intervention de Tuina dans un modèle de rat d’insomnie primaire induite par la méthode modifiée de l’environnement aquatique à plusieurs plateformes. Nous avons réparti au hasard 64 rats Wistar en quatre groupes : témoin, modèle, Tuina et antagoniste de l’orexine. Des évaluations comportementales (test en champ ouvert, test du sommeil induit par le pentobarbital) ont été réalisées, et l’expression d’Orexin-A dans l’hypothalamus a été détectée par PCR quantitative en temps réel et immunohistochimie. Le protocole vise à évaluer l’efficacité de Tuina et à étudier son mécanisme potentiel lié au système orexin, fournissant une référence pour l’application et l’étude mécaniste de Tuina dans les troubles du sommeil.

Introduction

L’insomnie, caractérisée par un insatisfaction quant à la durée ou à la qualité du sommeil entraînant des troubles diurnes, est un problème de santé mondial répandu avec un fardeau important pour les individus et les systèmes^{de santé 1,2}. En Chine, la prévalence de l’insomnie est particulièrement élevée, ce qui aggrave encore son impact sur la santé^{publique 3}. Ce trouble est associé à une altération des fonctions cognitives, à un risque accru de maladies cardiovasculaires et à une forte comorbidité avec des troubles psychiatriques tels que la dépression et l’anxiété ^4,5. La prise en charge clinique actuelle repose principalement sur la thérapie cognitivo-comportementale et la pharmacothérapie, notamment les benzodiazépines et les sédatifs-hypnotiques non benzodiazépines. Cependant, leur application à long terme est limitée par la dépendance aux médicaments, la tolérance, les effets résiduels diurnes et les symptômes de sevrage, ce qui souligne la nécessité d’alternatives non pharmacologiques^{efficaces 6}. En pratique clinique, Tuina convient particulièrement aux patients souffrant d’insomnie primaire chronique recherchant des interventions non pharmacologiques, en particulier aux personnes âgées à haut risque de dépendance aux médicaments, ainsi qu’aux femmes enceintes ou^{allaitantes 7}.

En tant que pierre angulaire de la thérapie externe de la médecine traditionnelle chinoise, Tuina a démontré des avantages uniques dans le traitement de l’insomnie⁸. Les preuves méta-analytiques montrent que Tuina surpasse significativement les médicaments ou l’acupuncture seule en taux effectif total (OR = 4,12), qualité du sommeil et états anxio-dépressifs, avec une sécurité élevée⁹. Les protocoles spécifiques de Tuina offrent des avantages distincts : le Tuina traditionnel atteint une efficacité de 89,5 % contre l’insomnie de type « flacs à chaleur », le frottement abdominal réduit les taux de rechute à 14,7 % (contre 38,2 % pour le Tuina ^{conventionnel)10}. La méthode Tuina en trois parties augmente l’efficacité de la thérapie à base de plantes de 80,49 % à 92,68 % tout en améliorant l’architecture du sommeil et les profils de^{neurotransmetteurs 11}. Des études cliniques et des revues systématiques ont confirmé que Tuina peut améliorer significativement la qualité du sommeil, réduire les scores d’anxiété et de dépression, et moduler les niveaux sériques de neurotransmetteurs comme la 5-hydroxytryptamine (5-HT⁾¹². On pense que ses effets thérapeutiques sont médiés par une régulation holistique du réseau neuro-endocrino-immunitaire. Les recherches récentes se sont de plus en plus concentrées sur le système orexine, un système neuropeptidique clé issu de l’hypothalamus latéral et crucial pour favoriser et maintenir l’éveil¹³. Une suractivité anormale des neurones orexines est impliquée dans la physiopathologie de l’insomnie, tandis que l’inhibition de cette voie a montré un potentiel^{thérapeutique 14}. Des preuves préliminaires suggèrent que des manipulations comme le frottement abdominal peuvent influencer les niveaux cérébraux d’Orexin-A chez les rats privés de^{sommeil 12}, mais une étude systématique pour déterminer si Tuina exerce ses effets anti-insomnie, spécifiquement en modulant le système d’orexine, fait défaut.

Ainsi, sur la base d’un modèle de rat d’insomnie primaire, cette étude vise à : (1) Évaluer l’amélioration du comportement de sommeil après une intervention standardisée sur Tuina à l’aide de tests comportementaux ; et (2) Étudier le mécanisme sous-jacent en examinant si l’effet de Tuina est associé à la régulation à la baisse de l’expression d’Orexin-A dans l’hypothalamus, en comparant son efficacité à celle d’un antagoniste du récepteur de l’orexine. Cette recherche vise à fournir des preuves expérimentales sur le mécanisme central de Tuina dans le traitement de l’insomnie.

Protocole

Toutes les procédures expérimentales et évaluations du bien-être animal ont été approuvées par le Comité d’éthique animale de l’Université médicale du Xinjiang (numéro d’approbation éthique : IACUC-20020158). Le protocole suit les directives institutionnelles pour les soins et l’utilisation des animaux. Les réactifs et l’équipement utilisés sont listés dans le tableau des matériaux.

1. Préparation animale

1. Des rats Wistar sans agents pathogènes spécifiques (SPF) de la maison 64 (poids corporel 250 g ± 50 g, répartition égale entre les sexes) dans un système barrière SPF à 18–22 °C avec un cycle clair-obscur de 12 h. Fournissez de la nourriture et de l’eau à volonté de manger.
2. Après une semaine d’alimentation adaptative, divisez aléatoirement les rats en 4 groupes (n = 16 par groupe) : témoins (groupe A), modèle (groupe B), tuina (groupe C) et antagoniste (groupe D).

2. Établissement du modèle primaire de l’insomnie

REMARQUE : À l’exception du groupe A, les rats des groupes B, C et D subissent la procédure de modélisation suivante.

1. Préparez un contenant cylindrique en plastique (diamètre supérieur : 30 cm, hauteur : 40 cm) comme boîte à rats.
2. Fixez une plateforme cylindrique (diamètre : 6 cm, hauteur : 10 cm) au fond du récipient.
3. Ajoutez de l’eau dans le récipient jusqu’à ce que le niveau d’eau soit à 1 cm sous la surface de la plateforme. Maintenez la température de l’eau à 20 °C.
4. Placez un maillage en fer circulaire (diamètre : 25 cm, taille du maillage : 1 cm) horizontalement à l’intérieur du récipient, à 15 cm au-dessus de la plateforme. Fixez le maillage au rebord du récipient à l’aide de fins fils de fer.
5. Placez de l’eau potable et de la nourriture sur le treillis en fer. Remplacez l’eau chaque jour, nettoyez et désinfectez le récipient.
6. Placez un rat par conteneur sur la plateforme pendant 8 jours consécutifs.

3. Évaluation du modèle utilisant le test du sommeil synergique du pentobarbital sodium

1. La solution de sodium pentobarbital est préparée en introduisant directement de l’eau ultrapure. Pèser 1,0 g de poudre, ajouter de l’eau ultrapure stérilisée à 100 mL, dissoudre, puis filtrer à 0,22 μm pour obtenir une solution à 1 % (10 mg/mL).
2. Au jour 9, injectez à tous les rats par voie intrapéritonéale une solution de sodium pentobarbital à la dose seuil minimale qui induit le sommeil (déterminée lors d’expériences préliminaires).
3. Enregistrer la latence du sommeil (temps entre l’injection et la première perte du réflexe de redressement) et la durée du sommeil (temps entre la perte et la récupération du réflexe de redressement). Définissez la perte du réflexe de redressement pendant 1 minute comme le début du sommeil, et sa récupération comme la fin du sommeil.

4. Intervention de Tuina

REMARQUE : Les interventions commencent le lendemain de l’évaluation réussie du modèle et se poursuivent une fois par jour pendant 14 jours consécutifs. Les groupes A et B subissent une contention dans un cadre de fixation pendant 10 minutes par jour. Les opérateurs reçoivent une formation rigoureuse avant l’expérience afin d’assurer la cohérence de la force, de la fréquence et du rythme.

1. Pour le groupe C, fixez le rat en position couchée sur une table d’opération.
2. Fixez doucement les quatre membres du rat avec les cinq doigts de la main gauche, en étendant complètement l’abdomen.
3. Effectuer une Tuina abdominale avec la main droite : utiliser la pulpe de la phalange distale du majeur pour appliquer une force au point Guanyuan (CV4, situé à 25 mm sous l’ombilic). Gardez les quatre doigts restants naturellement étendus.
4. Poussez le majeur en effectuant de petits mouvements circulaires antéro-latéraux depuis l’articulation de l’épaule, en effectuant une friction translationnelle circulaire antihoraire sur l’abdomen.
5. Suivez un chemin circulaire fermé formé par Jiuwei (CV15, 5 mm sous le processus xiphoïde), Guanyuan (CV4) et les points bilatérals Daimai (GB26, point médian entre l’extrémité libre de la^12e côte et la bordure supérieure de la crête iliaque).
6. Maintenez un mouvement circulaire fluide, régulier et continu à 5 à 7 cycles/min.
7. Effectuez une manipulation dans le sens antihoraire pendant 5 minutes, puis une manipulation dans le sens horaire pendant 5 minutes.
8. Assurez-vous que la force reste stable et ferme, en gardant le rat calme et sans difficulté. Appliquez l’intervention une fois par jour pendant 14 jours.

5. Administration antagoniste

1. Pour le groupe D, administrez MK-4305 (10 mg/kg) par gavage intragastrique une fois par jour pendant 14 jours. Dissoudre le MK-4305 dans du sérum physiologique normal pour préparer une solution de 5 mL.

6. Test en champ ouvert

1. Après la période d’intervention, effectuer le test en champ ouvert à l’aide d’une boîte cubique noire (base : 100 cm × 100 cm, hauteur : 40 cm). Divisez le sol en 25 carrés égaux par des lignes grises (16 périphériques, 9 centrales).
2. Placez le rat dans la case centrale et commencez à chronométer.
3. Enregistrer la distance totale parcourue, le nombre d’épisodes d’élevage et le temps passé dans la zone centrale sur plus de 3 minutes grâce à un système d’acquisition d’images.
4. Après chaque test, retirez les excréments et nettoyez le sol et les murs intérieurs avec 75 % d’éthanol.
5. Fonctionnement du système d’acquisition d’images
   1. Installez le système d’acquisition d’images. Montez un appareil photo CCD numérique (résolution : 1280 × 720 pixels ; fréquence d’images : 25 fps) verticalement à 1,5 m au-dessus du champ ouvert. Connectez l’appareil photo à un ordinateur via une interface USB.
   2. Configurez le logiciel de suivi et les paramètres d’analyse. Effectuez le suivi automatisé à l’aide d’un logiciel d’analyse vidéo comportementale. Définissez les paramètres de suivi comme suit :
      1. Définissez le foyer de suivi comme le point central (centre de masse) du rat.
      2. Réglez le taux d’images à 25 fps pour l’acquisition et l’analyse de l’image.
      3. Calibrez la résolution spatiale de sorte que chaque pixel corresponde à 1,5 mm de distance réelle en fonction des dimensions du champ ouvert et de la résolution vidéo.
      4. Fixez le seuil de soustraction de fond à 15 niveaux de gris (plage : 0–255) pour distinguer le rat du fond.
      5. Fixez la durée minimale de l’événement à 0,2 s (5 images) pour minimiser les faux positifs causés par le bruit.
      6. Divisez virtuellement le champ ouvert en 5 × 5 cases d’aire égale (zones 1 à 25). Définissez la zone centrale comme les zones 7, 8, 9, 12, 13, 14, 17, 18 et 19 (les 3 × 3 carrés centraux, représentant 36 % de la superficie totale). Définissez la zone périphérique comme les carrés restants.
   3. Notez les paramètres de sortie suivants : distance totale parcourue (mm), vitesse moyenne (mm/s), temps passé immobile (s), temps passé en déplacement (s), temps passé dans chaque zone (s), distance parcourue dans chaque zone (mm), nombre d’entrées dans chaque zone et nombre d’épisodes de redressement. Vérifiez manuellement les épisodes d’élevage.

7. Perfusion pour l’immunohistochimie

REMARQUE : Utilisez 4 rats de chaque groupe pour l’immunohistochimie.

1. Préparez une solution saline à 0,9 % (préchauffée à 37 °C) et une solution de paraformoldéhyde à 4 % (conservée à 4 °C).
2. Anesthésiez profondément les rats avec de l’uréthane intraperitonéal (solution à 25 %, 0,6 mL/100 g de poids corporel). Confirmez la perte des réflexes pédal, cornéens et de redressement.
3. Fixez le rat allongé sur une planche en mousse. Ouvrez rapidement la cavité thoracique en coupant la peau, le fascia et le sternum.
4. Rétractez doucement le cœur pour exposer l’aorte. Insérez une aiguille par l’apex ventriculaire gauche dans l’aorte jusqu’à ce que la pointe de l’aiguille soit visible dans la lumière aortique. Assurez-vous que l’aiguille, le ventricule gauche et l’aorte sont alignés horizontalement.
5. Pincez l’aorte et l’aiguille ensemble avec une pince hémostatique. Coupez immédiatement l’oreillette droite pour permettre la circulation sanguine.
6. Perfusez avec 150 à 200 mL de solution saline préchauffée à 0,9 % (37 °C). Une perfusion réussie s’indique par un blanchiment du foie, du mésentère et des membres antérieurs, ainsi que par un liquide clair provenant de l’oreillette droite.
7. Passez à 4 % de paraformoldéhyde froid (4 °C) et perfusez 400 mL. Effectuer rapidement une perfusion initiale jusqu’à ce que des fasciculations musculaires et un raidissement des membres surviennent. Ensuite, réduisez le débit à 2 gouttes/s jusqu’à ce que tout le fixateur soit perfusé.
8. Confirmez la fixation réussie lorsque le cerveau paraît pâle et ferme.

8. Dissection cérébrale

1. Après la perfusion, décapitez le rat et retirez soigneusement tout le cerveau du crâne.
2. Incisez le crâne le long de la suture sagittale à l’aide de ciseaux. Retirez les os pariétaux et occipitaux avec des rongeurs osseux.
3. Soulevez doucement le cerveau avec une spatule, sectionnant les nerfs crânien et optique avec des ciseaux fins.
4. Pour l’immunohistochimie : transférer immédiatement tout le cerveau en paraformoldéhyde à 4 % et fixer à 4 °C pendant 24 heures.
5. Pour la PCR quantitative en temps réel : rincez la surface du cerveau avec du sérum physiologique pré-refroidi, séchez avec du papier filtre, congelez dans de l’azote liquide pendant 5 à 10 minutes, puis conservez à –80 °C. Effectuez toutes les étapes sur la glace.

9. Coloration immunohistochimique

1. Insérer le tissu hypothalamique dans la paraffine et découper des coupes coronales à une épaisseur de 4 à 5 μm à l’aide d’un microtome. Montez les sections sur des glissières anti-chute, laissez cuire à 65 °C pendant 1,5 à 2 heures.
2. Des sections de dewax en xylène I et II (10 min chacune). Réhydrater par éthanol gradué : éthanol anhydre I et II (5 min chacun), puis 95 %, 90 %, 80 %, 70 % d’éthanol (5 min chacun), puis eau distillée (5 min).
3. Effectuer la récupération d’antigènes en plaçant des sections dans un tampon bouillant de 0,01 M citrate (pH 6,0) dans un autocuiseur. Chauffez jusqu’à ce que la valve de pression augmente, puis coupez le chauffage. Laissez tremper pendant 10 minutes, puis laissez refroidir naturellement à température ambiante.
4. Inactivez la peroxydase endogène en immergeant des sections dans du H₂O₂ frais à 3 % pendant 10 minutes à température ambiante. Laver 3× avec du PBS (5 min chacun).
5. Cercle le tissu avec un stylo d’immunohistochimie. Appliquer un anticorps polyclonal anti-HCRT/Orexin-A (dilution 1:50, ~50 μL par lame). Incubez toute la nuit à 4 °C dans une boîte humidifiée.
6. Le lendemain, réchauffez à température ambiante pendant 20 minutes. Laver 3× avec du PBS (5 min chacun).
7. Appliquez un anticorps secondaire marqué à la peroxydase de raifort. Incubez 20 minutes à température ambiante. Laver 3× avec du PBS (3 min chacun).
8. Appliquez une solution de travail marquée avec la peroxydase de raifort. Incubez 20 minutes à température ambiante. Laver 3× avec du PBS (5 min chacun).
9. Préparez une solution chromogène DAB (0,85 mL d’eau distillée + 50 μL de chacun des réactifs A, B, C). Appliquez sur des coupes et développez pendant 3 à 10 minutes à température ambiante, en surveillant au microscope. Arrêtez la réaction en plongeant dans l’eau du robinet pendant 3 minutes.
10. Contre-coloration avec de l’hématoxyline pendant 3 minutes. Différenciez de l’alcool à 1 % d’acide chlorhydrique pendant 1 à 2 secondes. Bleu dans l’eau du robinet pendant 5 minutes.
11. Déshydratez avec de l’eau distillée (3 min), 70 %, 80 %, 90 %, 95 % d’éthanol (3 min chacun), et l’éthanol anhydre I et II (5 min chacun). Clear en xylène I et II (5 min chacun).
12. Appliquez du baume neutre et un cache-slip. Sèche toute la nuit à 37 °C.
13. Observez et photographiez des sections à l’aide d’un microscope optique (40×, 100×, 200×, 400×). Compter les cellules Orexin-A positives (précipité granulaire brune dans le cytoplasme) à l’aide d’ImageJ.
14. Calculez le score total (0–12) comme score d’intensité de coloration (0 = négatif, 1 = jaune clair, 2 = brun clair, 3 = brun foncé) multiplié par le score de pourcentage positif de cellule (0 = 0 %, 1 = 1–25 %, 2 = 26–50 %, 3 = 51–75 %, 4 = 76–100 %). Définissez 1–5 comme expression basse, 6–12 comme expression élevée.

10. PCR quantitative en temps réel pour l’ARNm d’Orexine-A

1. Le traitement de l’ARN après le dégel des tissus doit être effectué dans des conditions sans RNase. Les exigences spécifiques en matière de RNase sans RNase sont les suivantes :
   1. Environnement de travail : Utilisez une zone de travail dédiée à l’ARN qui a été essuyée avec un décontaminant RNase et exposée à l’irradiation UV.
   2. Consommables : Utilisez des tubes de centrifugeuse certifiés sans RNase et des pointes de pipette, ou sinon, faites-les tremper dans de l’eau DEPC à 0,1 % suivie d’un autoclav.
   3. Réactifs : Utilisez un tampon de lyse sans RNase et de l’eau traitée au DEPC.
   4. Fonctionnement : Portez des gants sans poudre tout au long de la procédure, changez fréquemment de gants et évitez le contact direct avec l’intérieur des consommables et les échantillons.
   5. Procédure expérimentale
      REMARQUE : Lors des étapes d’extraction et de transcription inverse de l’ARN, tous les consommables et outils entrant en contact avec l’ARN ou les réactifs de transcription inverse doivent être exempts de RNase. À l’étape d’amplification PCR, puisque l’ADNc est une structure double brin et que la RNase ne peut pas dégrader l’ADN double brin, les consommables et outils à ce stade doivent seulement être exempts de DNase et d’autres impuretés pouvant inhiber les réactions PCR ; un traitement supplémentaire sans RNase n’est pas nécessaire. Broyez le tissu hypothalamique congelé sous de l’azote liquide. Pèser 50 à 100 mg de poudre de tissu dans un tube contenant 1 mL de Trizol. Mélangez et laissez reposer à température ambiante pendant 15 minutes.
2. Ajoutez 200 μL de chloroforme, mélangez par inversion, puis laissez reposer à température ambiante pendant 5 minutes. Centrifugez à 12 000 × g pendant 15 minutes à 4 °C.
3. Transférez la phase aqueuse supérieure dans un nouveau tube. Ajoutez un volume égal d’isopropanol, mélangez, puis laissez reposer à –20 °C pendant 35 minutes. Centrifugez à 12 000 × g pendant 15 minutes à 4 °C. Jetez le surnageant.
4. Lavez le précipité avec 75 % d’éthanol, centrifugez à 12 000 × g pendant 15 minutes à 4 °C. Jetez le surnageant et répétez le lavage une fois.
5. Précipitation sèche à l’air à température ambiante. Dissolvez dans de l’eau sans RNase.
6. Mesurer la concentration et la pureté de l’ARN (rapport A260/A280 1,8–2,1). Évaluer l’intégrité par électrophorèse sur gel d’agarose à 1 % (bandes 28S et 18S claires, bande 5S faible ou absente).
7. Préparer la réaction de transcription inversée (20 μL) : 800 ng d’ARN total, 1 μL d’amorçage aléatoire (0,1 μg/μL), 10 μL 2× mélange de réaction TS, 1 μL de mélange enzymatique TransScript RT/RI, 1 μL de détacheur d’ADN, et de l’eau sans RNase jusqu’au volume.
8. Incuber à 25 °C pendant 10 minutes, puis 85 °C pendant 5 secondes pour synthétiser l’ADNc de première brincadence. Diluez l’ADNc 1:1 avec de l’eau sans RNase.
9. Préparer la réaction qPCR (10 μL) : 5 μL EvaGreen 2× qPCR MasterMix, 0,3 μL amorce directe (10 μM), amorce inverse de 0,3 μL (10 μM), 1 μL de gabarit d’ADNc, eau sans RNase à volume. En tripliqué.
   REMARQUE : Amorces : Orexin-A-F : 5'-CGCCAGAAGACGTGTTCCT-3' ; Orexin-A-R : 5'-GCCGCTTTCCCAGAGTGAG-3' (longueur du produit 88 pb) ; β-Actine-F : 5'-CCCATCTATGAGGGTTACGC-3'
   β-Actin-R : 5'-TTTAATGTCACGCACGATTTC-3' (longueur du produit 150 pb).
10. Exécuter le programme qPCR : 95 °C pendant 30 s (avant la dénaturation) ; 40 cycles de 95 °C pendant 5 s (dénaturation) et 60 °C pendant 30 s (recuit/extension).
11. Vérifiez les courbes d’amplification et de fusion. Appliquer 5 μL de produit sur un gel d’agarose à 2 % pour confirmer la spécificité.
12. Calculez l’expression relative de l’ARNm d’Orexine-A en utilisant la méthode 2^⁻ΔΔCt avec β-Actine comme contrôle interne.

11. Analyse statistique

1. Utilisez SPSS 26.0 pour l’analyse des données. Exprimez toutes les données en moyenne ± écart-type. Pour les comparaisons entre deux groupes, utilisez le test t des échantillons indépendants si les données sont normalement distribuées ; sinon, utilisez le test U de Mann-Whitney.
2. Pour des comparaisons entre plusieurs groupes, utilisez l’ANOVA unidirectionnelle avec le test LSD post-hoc pour les variances homogènes ou le test de Tamhane pour les variances hétérogènes. Si les données ne sont pas normalement distribuées, utilisez le test H de Kruskal-Wallis. Considérons P < 0,05 statistiquement significatif.

Résultats

Le tableau 1 montre que, comparé au groupe A, la latence de sommeil dans les groupes B, C et D était significativement prolongée, et la durée du sommeil a été considérablement raccourcie après modélisation, indiquant que le modèle primaire du rat d’insomnie a été établi avec succès. Les résultats des Tables 2 et 3 offrent un soutien préliminaire à l’effet thérapeutique de Tuina dans le traitement de l’insomnie. Le Test Open Field (OFT) est l’un des paradigmes les plus classiques et couramment utilisés en neurosciences comportementales pour évaluer les comportements anxieux chez^{les rongeurs 15}. Des études ont montré que la préférence pour la zone des quatre coins est un indicateur sensible pour mesurer les comportements anxieux, et elle peut être plus discriminatoire que l’indicateur de la zone centrale en cas de niveaux modérés à faibles d’anxiété. Les rats modèles d’insomnie ont présenté des comportements anxieux significatifs et^{des changements 16,17} dans le comportement exploratoire, tandis que l’intervention de Tuina a efficacement soulagé ces comportements anxieux. Les résultats de biologie moléculaire présentés dans les Tables 4 et 5, ainsi que la Figure 1, démontrent également que Tuina régule efficacement à la baisse la surexpression d’Orexin-A dans l’hypothalamus des rats modèles d’insomnie.

Figure 1 : Résultats de coloration immunohistochimique de l’Orexin-A dans l’hypothalamus des rats de chaque groupe (40×, 100×, 200×, 400×). (A) Des neurones positifs à l’Oréxine-A ont été observés dans le tissu hypothalamique du rat, apparaissant sous forme de signaux granulaires brun foncé. Le score d’intensité de coloration était de 3 points, le pourcentage de cellules positives était de 40 % (se situant dans la fourchette de 26 % à 50 %, obtenant 2 points), et le score total était de 6 points, ce qui se situe dans la plage d’expression la plus élevée. (B) Le nombre de neurones positifs à l’Orexin-A dans le tissu hypothalamique du rat a été significativement augmenté par rapport au groupe normal, avec une distribution plus dense de cellules positives. Le score d’intensité de coloration était de 3 points (brun foncé), le pourcentage de cellules positives atteignait 80 % (se situant dans la fourchette 76 % à 100 %, avec un score de 4 points), et le score total était de 12 points, ce qui se situe dans la plage d’expression élevée. (C) Le nombre de neurones positifs à l’Orexin-A dans le tissu hypothalamique du rat a été réduit par rapport au groupe modèle. Le score d’intensité de coloration était de 3 points (brun foncé), le pourcentage de cellules positives était de 75 % (se situant dans la fourchette 51 % à 75 %, avec un score de 3 points), et le score total était de 9 points, ce qui se situe dans la plage d’expression élevée. (D) Le nombre de neurones positifs à l’Orexin-A dans le tissu hypothalamique du rat a également été réduit par rapport au groupe modèle. Le score d’intensité de coloration était de 3 points (brun foncé), le pourcentage de cellules positives était de 60 % (se situant dans la fourchette de 51 % à 75 %, avec un score de 3 points), et le score total était de 9 points, ce qui se situe dans la plage d’expression élevée. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figurine.

Groupe	Latence de sommeil / min	Durée du sommeil / min
A	4.13 ± 1.80	49,75 ± 38,46
B	6,31 ± 2,80*	22.13 ± 11.41*
C	6,33 ± 2,60*	24,93 ± 14,43*
D	6,53 ± 1,90*	24,73 ± 17,59*

Tableau 1 : Comparaison des tests de sommeil induits par le pentobarbital sodium entre groupes après modélisation. * indique P < 0,05 par rapport au groupe témoin.

Groupe	Fréquence d’élevage	Temps d’immobilité	Temps de locomotion	Distance de locomotion (m)	Temps dans la zone centrale (s)	Distance dans la zone centrale (m)	Temps dans la zone d’angle (s)	Distance dans la zone d’angle (m)	Temps dans la zone d’angle (s)	Distance dans la zone latérale (m)
A	1,875 ± 0,835	76.700 ± 34.324	103.350 ± 34.307	18.318 ± 16.314	8,750 ± 7,718	2.937 ± 5.112	103 000 ± 28 582	6,315 ± 3,893	56.600 ± 27.772	6,705 ± 3,666
B	7.125 ± 5.668	31.513 ± 10.964	148.488 ± 10.964	22.399 ± 9.159	16.275 ± 10.703	3,244 ± 2,991	75,088 ± 21,561	6,578 ± 1,972	85,463 ± 23,374	11.724 ± 4.959
Valeur T	-2.592	3.547	-3.545	-0.617	-1.613	-0.146	2.205	-0.171	-2.249	-2.302
Valeur p	0.035	0.007*	0.007*	0.547	0.129	0.886	0.045*	0.867	0.041*	0.037*

Tableau 2 : L’analyse de l’influence de chaque niveau d’indicateur entre le groupe témoin (A) et le groupe modèle (B).* indique P < 0,05 par rapport au groupe témoin.

Groupe	Fréquence d’élevage	Temps d’immobilité	Temps de locomotion	Distance de locomotion (m)	Temps dans la zone centrale (s)	Distance dans la zone centrale (m)	Temps dans la zone d’angle (s)	Distance dans la zone d’angle (m)	Temps dans la zone d’angle (s)	Distance dans la zone latérale (m)
B	5,875 ± 2,295	29.819 ± 12.871	150.219 ± 12.867	19.165 ± 8.054	24.838 ± 13.068	3.178 ± 2.438	69.075 ± 13.992	5,823 ± 1,422	83.019 ± 15.464	9,878 ± 4,393
C	6,357 ± 0,627	35.993 ± 32.237	144.021 ± 32.246	23.291 ± 4.873	14.321 ± 3.774	3.106 ± 2.214	87.057 ± 12.658 △	8.087 ± 1.496 △	68.943 ± 9.240	10.420 ± 1.225
D	6,667 ± 1,633	30,808 ± 15,389	149.200 ± 15.380	18.584 ± 4.969	27.792 ± 12.460	3.085 ± 1.114	74.600 ± 22.248	5,744 ± 1,291▲	74.192 ± 17.011	9,465 ± 3,380

Tableau 3 : Analyse de l’influence de chaque niveau d’indicateur parmi le groupe modèle (B), le groupe de Tuina (C) et le groupe antagoniste (D). ^△P < 0,05 comparé au groupe de modèles (B) ; ^▲P < 0,05 comparé au groupe de Tuina (C).

Groupe	Orexin-A
A	1,011 ± 0,173
B	10,436 ± 2,512△
C	2,392 ± 0,998▲
D	3,227 ± 1,703▲

Tableau 4 : Niveaux d’expression de l’ARNm d’Orexine-A dans le tissu hypothalamique. ^△P < 0,05 comparé au groupe témoin (A) ; ^▲P < 0,05 comparé au groupe de modèles (B).

Groupe	Orexin-A
	Intensité de coloration	Pourcentage de cellules positives	Score en pourcentage	Partition
A	3	40%	2	6
B	3	80%	4	12
C	3	75%	3	9
D	3	60%	3	9

Tableau 5 : Scores de coloration immunohistochimique d’Orexin-A dans l’hypothalamus des rats de chaque groupe. Critères de notation de l’intensité de coloration : 0 = coloration négative (incolore), 1 = jaune clair, 2 = brun clair, 3 = brun foncé. Pourcentage de critères de notation de cellules positives : 0 = 0 %, 1 = 1 % – 25 %, 2 = 26 % – 50 %, 3 = 51 % – 75 %, 4 = 76 % – 100 %. Score total = score d’intensité de tache × score en pourcentage. Les scores totaux de 1 à 5 étaient définis comme faibles expressions, et les scores de 6 à 12 comme élevés expressions.

Discussion

Cette étude visait à évaluer l’efficacité de Tuina dans un modèle de rat à insomnie primaire et à explorer son mécanisme potentiel lié au système de l’orexine hypothalamique. Les résultats actuels démontrent qu’un protocole standardisé de Tuina a significativement amélioré la latence et la durée du sommeil, atténué les comportements anxieux et a efficacement réduit la surexpression d’Orexin-A tant au niveau d’ARNm qu’aux niveaux de protéines dans l’hypothalamus. Notamment, l’effet de Tuina était comparable à celui de l’antagoniste des récepteurs d’orexine MK-4305, suggérant que la modulation du système d’orexine pourrait être un mécanisme clé par lequel Tuina soulage l’insomnie.

Comparé aux interventions pharmacologiques, Tuina, en tant que thérapie externe non invasive, offre des avantages en matière de sécurité, d’effets secondaires minimes et d’adhésion au patient^12,18. Ses bienfaits thérapeutiques contre l’insomnie sont étayés par des preuves cliniques montrant des améliorations de la qualité du sommeil et de l’état psychologique^18,19. Le mécanisme est multifacette, impliquant la régulation de l’axe hypothalamo-hypophyse-surrénalienne, l’homéostasie du système nerveux autonome et des neurotransmetteurs clés comme 5-HT^18,20. Les résultats approfondissent cette compréhension en identifiant le système des orexines comme une cible spécifique. Les neurones de l’oresine sont des moteurs centraux de l’éveil, et leur hyperexcitabilité est liée à l’instabilité du sommeil 21,22,23. La régulation à la baisse de l’orexine-A observée après Tuina semble cohérente avec l’effet du nouveau médicament anti-insomnie, l’antagoniste du double récepteur de l’orexine, mettant en lumière une possible voie convergente entre interventions pharmacologiques et non^{pharmacologiques 24,25}.

Bien que cette étude s’appuie sur nos travaux précédemment publiés concernant le tuina abdominal et le règlement²⁵ de l’orexine-A, le manuscrit actuel représente une extension substantielle et un raffinement méthodologique au-delà du rapport initial. Plus précisément, cette étude étend la taille de l’échantillon à 64 rats pour renforcer la puissance statistique et introduit une batterie complète d’évaluations comportementales, incluant le test en champ ouvert et les tests du sommeil induits par le pentobarbital, afin d’évaluer systématiquement l’architecture du sommeil et les comportements anxieux, qui n’avaient pas été abordés dans l’étude précédente. Contrairement aux travaux précédents, qui se concentraient fortement sur le stress oxydatif et les neurotransmetteurs classiques, cet article privilégie la validation fonctionnelle du système d’orexines par des résultats comportementaux intégrés et des tests moléculaires, servant d’investigation mécanistique autonome qui complète plutôt que de reproduire les résultats précédents.

Le plan expérimental a adhéré à la théorie de la MTC en se concentrant sur l’abdomen et des points d’acupuncture spécifiques comme le Guanyuan (CV 4), qui est considéré comme tonnifiant le Qi primordial et régulant la fonction viscérale, dans un chemin de manipulation en boucle^{fermée 26,27}. Les paramètres (fréquence, durée, cours) ont été standardisés sur la base de travaux préliminaires afin d’assurer la cohérence et la reproductibilité, un aspect crucial pour les études mécanistes sur les animaux¹².

Cependant, ce protocole présente des limites. Premièrement, l’intervention a été administrée à un moment unique après la modélisation. Les études futures devraient étudier différentes durées et fréquences d’intervention afin d’établir une relation optimale de « dose-réponse » pour Tuina. Deuxièmement, cette étude est un plan de recherche observationnel. Bien qu’une corrélation ait été trouvée entre Tuina et une expression réduite d’Orexin-A et une amélioration comportementale, il reste incertain si cette association est un effet direct ou indirect de Tuina ou d’autres facteurs. Les recherches futures pourront utiliser des stratégies expérimentales telles que le knockout génique, l’inhibition chimiogénétique ou le blocage des antagonistes pour vérifier davantage si Tuina améliore le comportement d’insomnie en régulant l’expression d’Orexin-A, élucidant ainsi son mécanisme causal. Enfin, cette étude n’a pas établi d’opération simulée ni de groupe témoin par intervention placebo. Cependant, cette étude a pris cela en compte lors de la conception, et tous les groupes d’animaux ont reçu le même niveau d’opérations de saisie et de fixation, qui, dans une certaine mesure, contrôlaient l’influence des facteurs de stress non spécifiques. De plus, la fréquence, l’intensité et la voie d’action du programme Tuina dans cette étude ont été standardisées sur la base d’expériences préliminaires afin d’assurer la cohérence et la reproductibilité de l’intervention. Les recherches futures devraient se concentrer sur le développement de méthodes de contrôle plus rigoureuses, telles que l’utilisation de simulations sans contact ou de stimulation tactile minimale, afin de clarifier les effets spécifiques des opérations de Tuina.

Les étapes clés cruciales pour le succès de ce protocole incluent : premièrement, un contrôle strict de la température de l’eau et des dimensions des plateformes dans la méthode modifiée de l’environnement aquatique multiple ; deuxièmement, la titration pré-expérimentale de la dose sub-seuil de pentobarbital sodique ; troisièmement, la standardisation des paramètres de manipulation de Tuina (fréquence de 5 à 7 cycles/min, manipulation antihoraire puis horaire pendant 5 minutes chacun) et la formation de l’opérateur ; et quatrièmement, la congélation rapide du tissu hypothalamique dans de l’azote liquide suivie d’une manipulation sans RNase afin d’assurer la stabilité de l’ARNm d’Orexin-A.

Les modifications possibles incluent : premièrement, le développement d’un dispositif mécanique automatisé Tuina pour réduire la variabilité entre opérateurs ; deuxièmement, l’utilisation de la télémétrie EEG/EMG pour remplacer le test du sommeil sodique pentobarbital, permettant une surveillance continue des phases du sommeil ; et troisièmement, la combinaison d’approches chimiogénétiques ou optogénétiques pour vérifier la nécessité des neurones orexines dans la médiation des effets de Tuina.

La reproductibilité de ce protocole repose sur : des trajectoires opérationnelles et des paramètres détaillés, l’utilisation d’un médicament témoin positif, la détection en double dimension aux niveaux des protéines et des ARNm, ainsi que des rapports statistiques rigoureux. Son utilisabilité pratique se reflète dans les aspects suivants : faibles exigences en équipements pour les tests comportementaux sans besoin de systèmes de télémétrie coûteux ; un cycle expérimental total de seulement 8 jours pour la modélisation et 14 jours pour l’intervention Tuina, se terminant en 4 semaines, ce qui s’aligne bien avec les cycles de financement et les calendriers de laboratoire de la plupart des projets de recherche de routine, facilitant la collecte rapide de données et la validation méthodologique. De plus, le protocole de manipulation de Tuina est clairement quantifié en termes de trajectoire opérationnelle (CV15 → CV4 → GB26 bilatéral → retour à CV15), de fréquence (5–7 cycles/min), de séquence directionnelle (dans le sens antihoraire suivi puis horaire) et de durée (10 min par session). Ces spécifications permettent à différents opérateurs de maîtriser la technique après une brève formation, réduisant ainsi le risque de mauvaise reproductibilité causé par des différences individuelles couramment observées dans les études de manipulation manuelle.

Lors de la mise en œuvre de ce protocole, plusieurs problèmes courants peuvent survenir, et des mesures de dépannage appropriées sont recommandées. Premièrement, les rats peuvent tomber de la plateforme lors de la procédure modifiée de l’environnement d’eau multiple. Cela est généralement causé par une surface de plateforme excessivement glissante. La solution consiste à rugueuse légèrement la surface de la plateforme avec du papier de verre fin pour augmenter la friction. De plus, chaque conteneur ne devrait abriter qu’un seul rat afin d’éviter les perturbations mutuelles. Deuxièmement, le test du sommeil sodique pentobarbital peut ne pas montrer de différences significatives entre les groupes. La solution consiste à re-titrér la dose minimale sous-seuil par incréments de 5 mg/kg lors des expériences pilotes en utilisant une cohorte distincte d’animaux (3–4 par groupe). Les injections doivent être effectuées à la même heure chaque jour (de préférence entre 9h00 et 11h00) afin de minimiser les variations circadiennes. Troisièmement, les rats peuvent lutter ou vocaliser lors de la manipulation de Tuina, ce qui indique généralement une force excessive ou une contrainte inadéquate. L’opérateur doit réduire la force appliquée jusqu’à ce que le rat reste calme sans se débattre. Il est recommandé d’avoir une formation préalable avec un mannequin à détection de pression pour standardiser l’application de la force. Le rat doit être positionné sur le dos, les quatre membres délicatement mais solidement fixés, assurant une exposition complète de l’abdomen. Quatrièmement, une grande variabilité du pourcentage de cellules positives à l’Orexin-A au sein d’un même groupe expérimental provient souvent de plans de section incohérents à travers l’hypothalamus, d’un biais subjectif de comptage ou d’une variation de la coloration d’un lot à l’autre. La solution recommandée consiste à standardiser le niveau anatomique en se référant à un atlas cérébral de rat (par exemple, Paxinos & Watson), en collectant des sections coronales du bregma –1,8 mm à –3,3 mm pour une analyse hypothalamique. Deux observateurs indépendants aveuglés par l’allocation de groupes doivent effectuer le comptage des cellules, et la valeur moyenne doit être utilisée. Tous les échantillons pour une mesure de résultat donnée doivent être colorés dans le même lot, et une analyse semi-automatisée des seuils utilisant ImageJ est encouragée afin de réduire la subjectivité des observateurs.

En conclusion, cette étude a établi un protocole d’intervention standardisé pour Tuina et un système d’évaluation multi-niveaux dans un modèle primaire d’insomnie. Il fournit des preuves convaincantes que Tuina améliore les comportements d’insomnie, potentiellement par un mécanisme impliquant la suppression de la surexpression hypothalamique d’Orexin-A. Ce cadre méthodologique offre non seulement un paradigme reproductible pour étudier les mécanismes centraux de Tuina, mais fournit aussi une référence pour des études mécanistes d’autres interventions non pharmacologiques pour les troubles du sommeil.

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
5x All-In-One RT MasterMix	abm	G492	Synthèse de l'ADNc
Acétycholine (Ach)	Nanjing Jiancheng	A105-1	Réactif ELISA
Lamelles de microscope d'adhésion	Jiangsu ShiTai Experimental Equipment Co., Ltd.	N/A	Montage de sections de tissus
Agarose	Sangon Biotech (Shanghai)	A811BA0014	Électrophorèse sur gel
Éthanol anhydre	Tianjin Fuyu Fine Chemical Co., Ltd.	N/A	Déshydratation des tissus
Diluant d'anticorps	Beijing ZSGB-Bio Technology Co., Ltd.	ZLI-9029	Dilution d'anticorps primaire
Panier	Fuzhou Maxim Biotechnologies Co., Ltd.	N/A	Support pour lames
Poudre de citrate	Fuzhou Maxim Biotechnologies Co., Ltd.	MVS-0066	Préparation du tampon de récupération d'antigène
Lamelle de recouvrement	Jiangsu ShiTai Experimental Equipment Co., Ltd.	N/A	Microscopie
Kit de chromogène DAB	Fuzhou Maxim Biotechnologies Co., Ltd.	DAB-1031	Détection chromogène
DEPC	Sangon Biotech (Shanghai)	B417BA0001	Traitement sans RNase
Dopamine (DA)	Wuhan Huamei Bioengineering Co., Ltd.	CSB-E08660r	Réactif ELISA
Cellule d'électrophorèse	Beijing Liuyi Instrument Factory	DYCZ-21	Électrophorèse sur gel
Alimentation pour électrophorèse	Beijing Liuyi Instrument Factory	DYY-6C	Électrophorèse sur gel
EvaGreen Express 2× qPCR MasterMix-Low Rox	abm	G891 / MasterMix-EL	Réactif qPCR
Acide gamma-aminobutyrique (γ-GABA)	AMOKE	AE91068Ra	Réactif ELISA pour neurotransmetteurs
Système d'imagerie de gel	Shanghai Tanon	2500	Documentation sur les gels
H2O2 (30%)	Tianjin Fuyu Fine Chemical Co., Ltd.	N/A	Bloquage des peroxydases endogènes
Solution de coloration à l'hématoxyline	Fuzhou Maxim Biotechnologies Co., Ltd.	CTS-1097	Contre-coloration
Centrifugeuse réfrigérée à haute vitesse	Shanghai Lishen Scientific Equipment Co., Ltd.	Nefuqe 15R	Centrifugation des échantillons
Histamine (HIS)	Nanjing Jiancheng Bioengineering Institute	EH171-1	Réactif ELISA
Four à air chaud	Shanghai Jinghong Experimental Equipment Co., Ltd.	Série DHG	Séchage des échantillons
Chambre d'humidité pour coloration IHC	Fuzhou Maxim Biotechnologies Co., Ltd.	BOX-1001	Chambre d'incubation humide
Kit de coloration immunochimique	Beijing ZSGB-Bio Technology Co., Ltd.	SP9000	Coloration IHC
Incubateur	Shanghai Jinghong Experimental Equipment Co., Ltd.	DNP-9272	Incubation à température contrôlée
Cuisinière à induction	Guangdong Midea Living Electric Manufacturing Co., Ltd.	C21-RK2101	Source de chaleur
Lecteur de microplaques	Bio-Rad, Chine	xMark	Mesure d'absorbance
Microscope	Nikon	E200	Imagerie microscopique
MK-4305	Meilun Bio	MB3773	Réactif expérimental
Balsam neutre	Beijing ZSGB-Bio Technology Co., Ltd.	ZLI-9555	Médium de montage
Norépinéphrine (NA)	Nanjing Jiancheng	H096	Réactif ELISA
Quantificateur d'acides nucléiques et de protéines	Beijing Kaiao	K5500	Quantification des acides nucléiques
Orexine A	Wuhan Huamei Bioengineering Co., Ltd.	CSB-E08860r	Réactif ELISA
Cycleur thermique PCR	Bio-Rad, USA	MyCycler Thermal Cycler	Amplification PCR
Tampon de phosphate (PBS)	Fuzhou Maxim Biotechnologies Co., Ltd.	PBS-0060/0061	Tampon de lavage
Pipette	Eppendorf, Allemagne	Dragon lab	Manipulation de liquides
Autocuiseur	Zhejiang Supor Co., Ltd.	YW20F1	Récupération d'antigène
Kit de quantification des protéines	TransGen Biotech	DQ111-01	Kit d'analyse BCA des protéines
Anticorps polyclonal anti-HCRT (Orexine-A) de lapin	Sangon Biotech (Shanghai)	D163595	Anticorps primaire
Instrument de PCR en temps réel	ABI (Thermo Fisher)	QuantStudio 6 Flex	Analyse qPCR
Réfrigérateur	Hefei Meiling Co., Ltd.	BCD-249LCK	Stockage des échantillons
Sérotonine (5-HT)	Wuhan Huamei Bioengineering Co., Ltd.	CSB-E08364r	Réactif ELISA
Pot de coloration	Générique	N/A	Conteneur de coloration de lames
Stylo de super-immunohistochimie	Fuzhou Maxim Biotechnologies Co., Ltd.	PEN-0002	Stylo à barrière hydrophobe
Trans2K DNA Marker	TransGen Biotech	BM101	Échelle d'ADN
TRIzol Reagent	Ambion	15596026	Extraction d'ARN
Mixeur vortex	Haimen Kylin-Bell Lab Instruments Co., Ltd.	GL-88B	Mixeur de laboratoire
Xylène	Tianjin Fuyu Fine Chemical Co., Ltd.	N/A	Déparaffinage