Expression de la protéine lectrice m6A YTHDC2 dans le cancer du poumon non à petites cellules au sein d'une cohorte clinique chinoise

Résumé

Cette étude évalue l'expression de YTHDC2 dans le cancer du poumon non à petites cellules à l'aide de bioinformatique et de qRT-PCR. Alors que les analyses de bases de données suggèrent une régulation à la baisse et une pertinence pronostique, la validation clinique ne montre aucune différence significative. Les résultats mettent en évidence des incohérences, indiquant une précision diagnostique limitée et la nécessité d'une validation supplémentaire avant toute application clinique.

Résumé

Le cancer du poumon non à petites cellules (CPNPC) demeure l'une des principales causes de mortalité liée au cancer dans le monde, avec peu de biomarqueurs disponibles pour un diagnostic précoce et un pronostic fiable. La modification de l'ARN par la N6-méthyladénosine (m6A) et ses protéines lectrices, telles que YTHDC2, jouent un rôle essentiel dans la régulation génique et la tumorigenèse. Cette étude vise à évaluer le profil d'expression de YTHDC2 dans les tissus de CPNPC à l'aide de l'analyse bioinformatique et de la PCR quantitative en temps réel (qRT-PCR), à examiner la relation entre YTHDC2 et les caractéristiques clinicopathologiques, et à explorer sa pertinence clinique et biologique potentielle pour les recherches futures. Les données d'expression génique et de survie provenant de bases de données ont été analysées afin d'évaluer la précision pronostique. L'expression de YTHDC2 a été quantifiée dans des tissus de CPNPC d'une cohorte clinique chinoise, et les caractéristiques clinicopathologiques ont été analysées. Les analyses de bases de données publiques ont montré que YTHDC2 était sous-exprimé dans les tissus de CPNPC (p < 0,05) et était associé à la survie des patients, bien que sa performance pronostique soit médiocre (AUC ≈ 0,5). L'analyse par qRT-PCR de 19 paires de tissus tumoraux et de tissus normaux adjacents n'a révélé aucune différence statistiquement significative (p = 0,537) de l'expression de YTHDC2 entre les tissus cancéreux et les tissus adjacents. Dans leur ensemble, les analyses de bases de données publiques suggèrent que YTHDC2 pourrait être sous-exprimé et présenter une certaine pertinence pronostique dans le CPNPC, mais la validation clinique indépendante dans notre cohorte n'a pas confirmé une expression différentielle significative. Ces résultats mettent en évidence une hétérogénéité importante entre les jeux de données à grande échelle et les cohortes du monde réel, indiquant que YTHDC2 est peu susceptible de constituer un biomarqueur diagnostique ou pronostique fiable pris isolément, et qu'il pourrait nécessiter une intégration avec d'autres marqueurs moléculaires pour être applicable en clinique.

Introduction

Le cancer du poumon non à petites cellules (CPNPC), qui englobe le carcinome épidermoïde et l'adénocarcinome, est le cancer du poumon le plus fréquemment diagnostiqué et une des principales causes de mortalité par cancer dans le monde¹. Les statistiques mondiales sur le cancer indiquent que ce dernier figure parmi les principales causes de décès par cancer². Les progrès récents en matière de diagnostic, de chirurgie, de radiothérapie et de thérapie ciblée moléculaire n'ont pas amélioré de manière significative le pronostic du CPNPC, car le diagnostic initial est souvent posé à un stade avancé, la maladie étant généralement asymptomatique aux stades précoces³. Cela souligne la nécessité de nouveaux biomarqueurs permettant d'identifier, de prédire le pronostic et d'évaluer l'efficacité du traitement chez les patients atteints de CPNPC.

L'm6A est la première modification de l'ARN identifiée et la plus abondante chez les eucaryotes, et elle est impliquée dans la stabilité de l'ARN, la traduction et la transcription⁴. Les modifications m6A sont dynamiques et réversibles, facilitées par des méthyltransférases (écrivains), des déméthylases (effaceurs) et des protéines de liaison spécifiques (lecteurs)⁵. Parmi celles-ci, YTHDC2, une protéine lecteur m6A majeure, module la stabilité de l'ARN et le taux de traduction⁶. Des études récentes indiquent que YTHDC2 est impliquée dans la régulation de plusieurs types de cancer, soit en supprimant la croissance cellulaire et l'invasion, soit en induisant la mort cellulaire⁷. Des recherches ont également mis en évidence la pertinence clinique d'autres protéines lecteurs m6A, notamment YTHDF1, YTHDF2 et YTHDC1, dans la progression du cancer du poumon, la régulation immunitaire et le pronostic, soulignant l'importance d'une évaluation systématique des différents lecteurs m6A dans des cohortes de patients indépendantes^8,9,10. Dans le CBNPC, les niveaux de YTHDC2 sont significativement faibles, ce qui est associé à des stades tumoraux élevés, à des métastases ganglionnaires et à un mauvais pronostic pour les patients, suggérant qu'elle pourrait constituer un facteur anti-tumoral¹¹. Des expériences in vitro et in vivo révèlent également qu'une forte expression de YTHDC2 inhibe la prolifération cellulaire et la métastase dans le cancer du poumon⁷.

Dans cette étude, la régulation de YTHDC2 dans le CBNPC a été investiguée par des analyses computationnelles intégrées et une validation expérimentale par qRT-PCR. La relation entre l'expression de YTHDC2 et les caractéristiques clinicopathologiques ainsi que le pronostic des patients a également été étudiée. Malgré un nombre croissant de données provenant de bases de données publiques suggérant une dysrégulation de YTHDC2 dans le CBNPC, les études publiées ont rapporté des résultats contradictoires concernant l'ampleur et la signification clinique de cette dysrégulation, et une validation indépendante dans des cohortes cliniques réelles bien caractérisées, en particulier chez les populations asiatiques, reste limitée. De plus, la plupart des études antérieures se sont principalement appuyées sur des jeux de données transcriptomiques publics ou des modèles expérimentaux, peu intégrant les découvertes en bioinformatique avec une validation clinique indépendante. En combinant des analyses transcriptomiques publiques à grande échelle avec une validation indépendante par qRT-PCR dans une cohorte clinique chinoise, cette étude visait à évaluer la reproductibilité des résultats antérieurs et à combler l'écart translationnel entre les analyses de bases de données publiques et les échantillons cliniques réels. Ainsi, cette étude avait pour objectif d'évaluer systématiquement l'expression de YTHDC2 à l'aide d'approches intégrées de bioinformatique et de validation clinique, et d'en évaluer la pertinence biologique et clinique potentielle dans le CBNPC. On a émis l'hypothèse que l'expression de YTHDC2 est dysrégulée dans le CBNPC, et que l'intégration d'analyses de bioinformatique avec une validation clinique indépendante permettrait une évaluation plus fiable de sa signification diagnostique et pronostique que chacune de ces approches prise isolément.

Protocole

L'étude a été approuvée par le comité d'éthique de l'Université médicale de Hainan (numéro d'approbation HMC1984.24) et était conforme à la Déclaration d'Helsinki (telle que révisée en 2013).

Sujets de l'étude

Une étude menée auprès de 50 patients atteints d'un cancer du poumon diagnostiqués entre 2017 et 2024 au Sanya Central Hospital dans la province de Hainan a été réalisée selon les recommandations cliniques de l'Association médicale chinoise pour le diagnostic et le traitement du cancer du poumon (édition 2024). Le stade selon la CSCO (2024) a été aligné sur la 8e édition du système AJCC afin d'assurer la comparabilité entre les études, comme cela a été validé dans des cohortes chinoises.¹², avec deux revues indépendantes par des oncologues afin d'assurer la cohérence. Le processus de sélection des patients, la disponibilité des tissus, l'évaluation de la qualité de l'ARN et l'inclusion finale des échantillons pour l'analyse par RT-qPCR sont résumés dans Figure 1.

Données de l'étude

Cette étude a utilisé la bio-informatique pour analyser les niveaux d'expression de YTHDC2 dans le CBNPC et leur relation avec les caractéristiques clinicopathologiques, offrant des aperçus sur les mécanismes potentiels. Les analyses bio-informatiques ont été réalisées exclusivement à l'aide de données publiques de séquençage ARN provenant de The Cancer Genome Atlas (TCGA), incluant des échantillons de carcinome adénocarcinomateux du poumon (LUAD), de carcinome épidermoïde du poumon (LUSC) et de tissus pulmonaires normaux correspondants téléchargés via le GDC Data Portal (https://portal.gdc.cancer.gov/). Le jeu de données téléchargé comprenait les données d'expression issues du séquençage ARN ainsi que les variables cliniques disponibles (identifiant du patient, identifiant de l'échantillon, âge, sexe, stade pathologique, statut de survie et durée de survie globale) pour les cas éligibles de TCGA-LUAD et TCGA-LUSC. Les échantillons manquant de données d'expression génique ou d'informations sur la survie ont été exclus des analyses de survie et de ROC ultérieures. Le jeu de données utilisé dans cette étude est fourni en tant que fichier supplémentaire 1. Aucun prélèvement clinique collecté à l'hôpital central de Sanya n'a été utilisé pour les analyses bio-informatiques. Les procédures détaillées des analyses GEPIA, Kaplan–Meier Plotter et survivalROC sont fournies dans la section Analyse bio-informatique ci-dessous. L'ensemble du flux de travail bio-informatique, incluant l'acquisition des données, le prétraitement, l'analyse de l'expression génique, l'analyse de survie et l'analyse ROC, est résumé dans Figure 2.

Critères d'inclusion et d'exclusion

Les critères d'inclusion et d'exclusion des patients sont présentés dans le Tableau 1. Une analyse de puissance réalisée à l'aide d'un logiciel d'analyse statistique a déterminé qu'au moins 26 cas par groupe permettraient d'atteindre une puissance de 80 % pour détecter une taille d'effet modérée (d = 0,8, α = 0,05, bilatéral). Bien que l'inscription initiale visait 50 paires dans le groupe cancer du poumon, l'analyse finale par qRT-PCR a inclus 30 échantillons tumoraux et 19 échantillons de tissus adjacents normaux, après exclusion pour qualité insuffisante du tissu ou de l'ARN. Cette réduction de la taille de l'échantillon reflète les contraintes cliniques du monde réel et souligne l'importance de l'intégrité de l'ARN et de la disponibilité des tissus dans les études translationnelles. Pour des comparaisons avec n = 19, la taille d'effet minimale détectable est d = 1,0 (puissance 80 %, α = 0,05). Ainsi, l'expérience disposait d'une puissance suffisante pour détecter des différences importantes, mais pas faibles à modérées, dans l'expression de YTHDC2.

Échantillons de tissus et PCR quantitative en temps réel (qRT-PCR)

Les diagnostics pathologiques ont été établis de manière doublement aveugle par deux pathologistes différents. La pureté tumorale a été estimée par les pathologistes (>70 % de cellules malignes) et confirmée à l’aide du logiciel ESTIMATE (TCGA). Les tissus normaux adjacents ont été macrodissectés afin de minimiser la contamination par le stroma. Les types histologiques de cancer du poumon comprenaient l’adénocarcinome pulmonaire et le carcinome épidermoïde, avec 26 cas d’adénocarcinome pulmonaire et 4 cas de carcinome épidermoïde. Le stade clinique des 50 patients atteints de cancer du poumon a été déterminé selon les critères de stadification décrits dans les « Recommandations cliniques de l’Association médicale chinoise pour le cancer du poumon (édition 2024) ». Les échantillons de carcinome non à petites cellules (NSCLC) confirmés histologiquement (n = 50) représentaient des distributions cliniques typiques (voir Tableau 2). Parmi les 50 patients initialement inclus, 30 échantillons de tissu tumoral et 19 échantillons appariés de tissu normal adjacent ont satisfait aux critères de qualité de l’ARN. Étant donné que l’analyse statistique appariée exige des échantillons appariés provenant du même patient, la comparaison de l’expression entre tumeur et tissu normal adjacent a été effectuée à l’aide des 19 paires appariées disponibles. Ces spécimens cliniques ont été utilisés exclusivement pour la validation expérimentale par qRT-PCR et ont été analysés indépendamment des jeux de données publiques TCGA utilisés pour l’analyse bioinformatique. Ces échantillons sélectionnés ont été traités immédiatement après confirmation pathologique et manipulés dans des conditions sans RNase avant l’extraction de l’ARN. Ce sous-groupe correspond aux cas où une quantité adéquate de tissu et un ARN total de haute qualité (nombre d’intégrité de l’ARN, RIN >7,0) ont pu être obtenus. La concentration et la pureté totales de l’ARN ont été mesurées avant la transcription inverse, et seuls les échantillons présentant une qualité d’ARN adéquate (RIN >7,0) ont été inclus dans les analyses en aval. Des quantités équivalentes d’ARN total ont été transcrits en sens inverse en ADN complémentaire (ADNc) selon le protocole du fabricant avant la PCR quantitative. Ce processus a permis de garantir la validité des données d’expression génique analysées. Les expériences de qRT-PCR ont été réalisées sur un thermocycleur PCR en temps réel, en utilisant un test de PCR quantitative basé sur des sondes. Toutes les réactions ont été effectuées en triple, accompagnées de témoins sans matrice afin d’assurer la reproductibilité analytique. L’amplification par PCR a été réalisée selon les conditions cyclantes suivantes : une étape initiale d’activation enzymatique/dénaturation à 95 °C pendant 10 min, suivie de 40 cycles de dénaturation à 95 °C pendant 15 s et d’hybridation/extension à 60 °C pendant 60 s. Les signaux de fluorescence ont été acquis à la fin de chaque cycle d’amplification. Tous les réactifs et consommables ont été obtenus auprès de fournisseurs commerciaux (voir Tableau des matériaux). Les séquences d’amorces et de sondes utilisées en qRT-PCR sont indiquées dans le Tableau 3.

Analyse bioinformatique

Analyse de l'expression du gène YTHDC2 à l'aide de la base de données GEPIA

La base de données GEPIA a été utilisée pour analyser l'expression de YTHDC2 dans le CBNP. Le serveur web GEPIA (http://gepia.cancer-pku.cn/) a été consulté via un navigateur web. Le module Expression DIY a été sélectionné, le symbole du gène "YTHDC2" a été saisi, les jeux de données LUAD et LUSC ont été choisis, les paramètres de normalisation par défaut ont été conservés, et des boîtes à moustaches d'expression différentielle ont été générées directement à l'aide de l'interface GEPIA. La signification statistique a été définie comme p < 0,05.

Base de données Kaplan-Meier pour l'analyse de survie des patients atteints de cancer du poumon

L'étude a analysée la relation entre l'expression de YTHDC2 et le pronostic chez des patients atteints de cancer du poumon à l'aide de la base de données Kaplan-Meier Plotter. Le jeu de données sur le cancer du poumon a été sélectionné, le symbole du gène "YTHDC2" a été saisi, l'option de seuil optimal automatiquement sélectionnée a été appliquée, et les courbes de Kaplan-Meier pour la survie globale et la survie après progression ont été générées en utilisant les paramètres d'analyse par défaut. Les patients ont été automatiquement répartis en groupes à expression élevée et faible à l'aide du seuil optimal déterminé par la plateforme Kaplan-Meier Plotter, et les rapports de risques avec leurs intervalles de confiance à 95 % correspondants ont été calculés selon les paramètres par défaut de la plateforme.

Exécution de packages R dans le logiciel R pour la création de courbes ROC

Les données d'expression issues du séquençage de l'ARN et les métadonnées cliniques correspondantes pour les cas éligibles de TCGA-LUAD et TCGA-LUSC ont été téléchargées à partir du portail de données GDC. Les jeux de données téléchargés ont été fusionnés par identifiant patient et importés dans R pour des analyses ultérieures. Le package survivalROC a été utilisé pour générer des courbes ROC dépendantes du temps aux points de prédiction de 1, 3 et 5 ans, et les valeurs correspondantes de la surface sous la courbe (AUC) ont été calculées afin d'évaluer la performance pronostique de l'expression de YTHDC2. Seuls les patients atteints de TCGA-LUAD ou TCGA-LUSC disposant d'informations sur l'expression en ARN-séquençage et la survie ont été inclus dans l'analyse ROC de survie. La cohorte clinique locale n'a pas été utilisée pour la prédiction de la survie car des données de suivi à long terme n'étaient pas disponibles.

Expression tissulaire de YTHDC2 par qRT-PCR

Pour analyser les niveaux d'expression génique, une PCR quantitative en temps réel (qRT-PCR) a été réalisée. Des volumes équivalents d'ADNc ont été ajoutés à chaque réaction selon les conditions recommandées par le fabricant. L'amplification a été effectuée à l'aide d'un test de PCR quantitative basé sur une sonde, et les données de fluorescence ont été collectées automatiquement à la fin de chaque cycle d'amplification. Brièvement, le processus d'extraction de l'ARN comprenait plusieurs étapes, notamment la préparation de l'échantillon, la déparaffinisation, l'élimination du liquide résiduel, la digestion par la protéinase K, une incubation, une centrifugation, un traitement à la DNase, l'ajout de DNase I et une précipitation à l'éthanol. L'échantillon a ensuite été lié à une colonne de purification d'ARN à base de silice et centrifugé à 8 000 × g pendant 30 s. La colonne a ensuite été lavée avec le tampon de lavage 1, le tampon de lavage 2 et le tampon de lavage 2 dilué avec de l'éthanol, puis séchée à 13 000 × g pendant 2 min. L'ARN a ensuite été élué en ajoutant 70 µL d'eau sans RNase au centre de la membrane de la colonne, suivie d'une centrifugation à 13 000 × g pendant 1 min. Chaque paire d'amorces a produit un unique produit d'amplification, confirmé par analyse de la courbe de fusion avant le calcul de l'expression génique relative. L'efficacité des amorces (90–110 %) a été validée à l'aide de courbes standards avant l'analyse des échantillons. Les analyses de courbe de fusion ont confirmé la présence d'amplicons uniques et l'absence de dimères d'amorces. L'expression relative de YTHDC2 a été calculée selon la méthode 2^-ΔCt, dans laquelle les valeurs de Ct ont été normalisées par rapport au gène de référence endogène GAPDH. Étant donné que les valeurs d'expression étaient présentées sous forme de niveaux d'expression normalisés plutôt que sous forme de variations d'expression par rapport à un échantillon témoin, les résultats sont rapportés comme des valeurs 2^−ΔCt. Le gène GAPDH a été choisi comme gène de référence car son expression présentait une variabilité minimale (CV < 5 %) par rapport aux alternatives testées (ACTB, CV = 12 % ; ARNr 18S, CV = 18 %), ce qui est conforme aux critères de sélection des gènes de référence dans les études sur la m6A.

Analyse statistique

Des analyses statistiques ont été réalisées à l'aide de logiciels statistiques, y compris la création de graphiques et de diagrammes. Pour analyser les données quantitatives et catégorielles relatives à l'expression du gène YTHDC2 chez des patients atteints de CBNPC, le logiciel R a été utilisé pour les analyses bioinformatiques et la génération de courbes ROC. Les courbes ROC et les AUC ont été utilisées pour évaluer la performance diagnostique de l'expression de YTHDC2 dans la prédiction de la survie. Pour les analyses fondées sur des régressions, les estimations d'effet (rapports de cotes) accompagnées des intervalles de confiance à 95 % correspondants ont été indiquées le cas échéant. Le test de Wilcoxon pour échantillons appariés a été utilisé afin de comparer l'expression de YTHDC2 entre des échantillons appariés de tissu tumoral et de tissu normal adjacent, tandis qu'une analyse de corrélation de Pearson a été employée pour évaluer l'association entre l'expression de YTHDC2 et les caractéristiques clinicopathologiques. Les coefficients de corrélation (r) ainsi que les valeurs-p correspondantes ont été rapportés. Étant donné que les données de qRT-PCR comprenaient des échantillons appariés de tissu tumoral et de tissu normal adjacent provenant des mêmes patients, et que les données d'expression génique n'étaient pas distribuées normalement, le test de Wilcoxon pour échantillons appariés a été utilisé pour comparer les niveaux d'expression de YTHDC2 entre les tissus appariés. Ce test ne suppose pas la normalité des données et est couramment utilisé pour des données biologiques asymétriques. Tous les tests statistiques étaient bilatéraux, et une valeur de p <0,05 a été considérée comme statistiquement significative. La normalité des variables continues a été vérifiée avant l'analyse. Les variables continues sont présentées sous forme de moyenne ± écart-type ou de médiane (intervalle interquartile), selon le cas.

Résultats

Expression du gène YTHDC2 dans les tumeurs selon la base de données TCGA

Figure 3 illustre l'association entre le CBNPC et YTHDC2 en examinant les niveaux d'expression de YTHDC2 dans différents cancers à l'aide de l'outil GDC dans la base de données TCGA.

Expression du gène YTHDC2 dans le CBNP dans la base de données GEPIA

483 échantillons de tissus de carcinome adénoïde pulmonaire, 347 échantillons de tissus pulmonaires normaux, 486 échantillons de tissus de carcinome épidermoïde du poumon et 338 échantillons de tissus pulmonaires normaux ont été obtenus à partir d'un dépistage supplémentaire des niveaux d'expression de YTHDC2 dans le carcinome adénoïde pulmonaire (LUAD) et le carcinome épidermoïde du poumon (LUSC) dans la base de données GEPIA. Grâce à des analyses statistiques, on a constaté que les tissus de carcinome adénoïde pulmonaire et de carcinome épidermoïde du poumon présentaient tous deux des niveaux d'expression de YTHDC2 nettement plus faibles que les tissus pulmonaires normaux (p < 0,05), comme illustré dans la Figure 4.

Analyse GEPIA de l'expression de YTHDC2 selon les stades pathologiques

La base de données GEPIA (Gene Expression Profiling Interactive Analysis) a été utilisée pour générer un graphique par stade afin d'évaluer l'expression différentielle de YTHDC2 au cours des stades du CBNP. Comme illustré dans la Figure 5, aucune différence statistiquement significative de l'expression de YTHDC2 n'a été observée entre les stades pathologiques du CBNP (p = 0.644).

Analyse de Kaplan-Meier de YTHDC2 et de la survie dans le cancer du poumon

La base de données Kaplan-Meier Plotter a été utilisée pour réaliser une analyse de survie de Kaplan-Meier du gène YTHDC2. Selon les résultats, les patients présentant une forte expression de YTHDC2 avaient une survie globale (OS) significativement plus élevée que ceux ayant une faible expression (p < 0,05). Comme indiqué dans Figure 6A (OS), les patients atteints d'un cancer du poumon qui exprimaient des niveaux plus élevés de YTHDC2 avaient un meilleur pronostic, et cette différence était statistiquement significative (p < 0,05). Selon Figure 6B (PPS), le groupe à forte expression de YTHDC2 avait un meilleur pronostic que le groupe à faible expression dans le jeu de données de survie après progression (Post-Progression Survival, PPS) ; la différence était statistiquement significative (p < 0,05).

Modèle de prédiction du taux de survie YTHDC2

L'analyse ROC dépendante du temps, basée sur les données d'expression RNA-séq et de survie de TCGA, a révélé une capacité prédictive limitée de l'expression de YTHDC2 seule pour la survie dans le carcinome non à petites cellules (NSCLC), avec des valeurs d'AUC de 0,50 (IC à 95 % : 0,38-0,62), 0,51 (IC à 95 % : 0,39-0,63), 0,52 (IC à 95 % : 0,40-0,64) et 0,52 (IC à 95 % : 0,39–0,65) respectivement après 1, 3, 5 et 8 ans (Figure 7). Tous les intervalles de confiance des AUC incluaient 0,5, indiquant une performance équivalente au hasard. Ces résultats montrent que l'expression de YTHDC2 seule ne possède pas de pouvoir discriminant suffisant pour la prédiction de la survie et ne devrait pas être considérée comme un biomarqueur pronostique autonome. Une intégration avec des variables clinicopathologiques ou des signatures multi-géniques pourrait améliorer la performance prédictive.

Expression de YTHDC2 dans les tissus cancéreux par rapport aux tissus normaux par qRT-PCR

L'expression du gène YTHDC2 a été étudiée dans des tissus malins et dans des tissus normaux adjacents provenant de patients atteints de CBNPC à l'aide de la qRT-PCR. L'expression normalisée de YTHDC2 (2^−ΔCt) était de 3,24 ± 2,34 dans les tissus malins et de 3,60 ± 1,70 dans les tissus normaux adjacents. Aucune différence significative de l'expression de YTHDC2 n'a été observée entre les 19 paires de tissus tumoraux de CBNPC et les tissus normaux adjacents appariés correspondants (p = 0,537), comme illustré dans la Figure 8. Bien qu'une analyse bioinformatique de grands ensembles de données ait suggéré une régulation négative significative de YTHDC2 dans le CBNPC, la qRT-PCR réalisée sur notre cohorte n'a montré aucune différence significative, mettant en évidence d'éventuelles divergences dues à la taille de la cohorte, à l'hétérogénéité des échantillons et à la variabilité technique. De plus, la faible AUC (0,5) indique que YTHDC2 seul manque de précision diagnostique ou pronostique.

Expression de YTHDC2 et caractéristiques clinico-pathologiques dans le CBNPC

Cette étude comprenait 50 individus atteints de CBNPC. Il y avait 32 patients de sexe masculin (64,00 %) et 18 patients de sexe féminin (36,00 %), avec un âge moyen de 63,10 ± 9,85 ans. Leurs âges variaient de 37 à 86 ans. Parmi les patients, 25 avaient déjà fumé, et 25 n'avaient jamais fumé. Neuf cas de carcinome épidermoïde (18,00 %) et quarante et un cas d'adénocarcinome pulmonaire (82,0 %) figuraient parmi les types histopathologiques. Vingt-deux patients étaient aux stades III–IV (44,00 %) et 28 aux stades I–II (56,00 %) selon le stade clinique CSCO. Vingt-quatre patients n'avaient pas de métastases ganglionnaires, tandis que vingt-six individus (54,00 %) en présentaient. Neuf patients avaient des cancers peu différenciés (18,00 %), tandis que 41 patients présentaient des tumeurs bien à modérément différenciées (82,00 %).

L'association entre les caractéristiques pathologiques cliniques et les niveaux d'expression de YTHDC2 dans les tissus de CBNP a été examinée. Des différences dans l'expression de YTHDC2 ont été observées entre les sous-types pathologiques et selon le statut de métastase ganglionnaire (p < 0,05). Toutefois, comme seules quatre échantillons de carcinome épidermoïde étaient disponibles, la comparaison entre sous-types pathologiques doit être interprétée avec prudence et considérée comme exploratoire. Comme illustré dans les Figures 9A,B, l'expression de YTHDC2 était significativement plus élevée dans le carcinome épidermoïde que dans l'adénocarcinome pulmonaire, et significativement plus élevée dans les tissus de CBNP présentant une métastase ganglionnaire que dans ceux sans métastase ganglionnaire (5,70 ± 2,53 contre 3,83 ± 0,91, p = 0,027). Cependant, comme seuls quatre échantillons de carcinome épidermoïde ont été inclus, la comparaison entre sous-types pathologiques doit être interprétée avec précaution et considérée comme exploratoire en attendant une validation sur des cohortes plus importantes. Un niveau d'expression plus élevé de YTHDC2 chez les patients présentant une métastase ganglionnaire pourrait indiquer une association potentielle entre YTHDC2 et le statut métastatique ganglionnaire ; toutefois, cette observation doit être interprétée avec prudence en raison de la taille limitée de l'échantillon et nécessite une validation dans de plus grandes cohortes indépendantes. En revanche, l'âge, les antécédents de tabagisme, le stade clinique CSCO et la différenciation histologique n'ont pas d'effet significatif sur l'expression de YTHDC2 (p > 0,05). Des informations supplémentaires sont fournies dans le Tableau 4, le Tableau 5 et la Figure 9.

Régression logistique binaire de la métastase ganglionnaire dans le CBNPC

Conformément à l'analyse de corrélation, l'expression de YTHDC2 était significativement associée à la métastase ganglionnaire (p < 0,05). En utilisant la métastase ganglionnaire comme variable dépendante et l'âge, le sexe, les antécédents de tabagisme, le stade tumoral, le type histologique, le niveau d'expression de YTHDC2 et le degré de différenciation comme variables indépendantes, une analyse de régression logistique binaire a été réalisée chez des patients atteints de CBNPC. Les résultats ont montré que l'expression de YTHDC2 chez les patients atteints de CBNPC était significativement associée à la métastase ganglionnaire (p = 0,027, OR = 2,286, IC à 95 % : 1,101–4,748).

Dans les données cliniques générales, le stade tumoral des patients atteints de CBNPC était statistiquement corrélé de manière significative à la métastase ganglionnaire (p = 0,007, OR = 27, IC à 95 % : 2,504-291,186). Toutefois, l'âge, le sexe, les antécédents de tabagisme, le type histologique et le degré de différenciation n'étaient pas significativement corrélés à la métastase ganglionnaire dans le CBNPC (p > 0,05), comme indiqué dans le Tableau 6.

Disponibilité des données : Les ensembles de données soutenant les résultats de cette étude sont disponibles dans le dépôt Zenodo (DOI : 10.5281/zenodo.21409961). Le dépôt inclut les métadonnées cliniques TCGA, les annotations des échantillons, les spécifications de récupération des données et le manifeste d'analyse utilisés pour les analyses bioinformatiques. Des données supplémentaires sont disponibles auprès de l'auteur correspondant sur demande raisonnable.

Figure 1 : Schéma du flux de sélection des patients et d'inclusion des tissus pour l'analyse par qRT-PCR. Veuillez cliquer ici pour visualiser une version agrandie de cette figure.

Figure 2. Flux de travail des analyses bioinformatiques réalisées pour évaluer l'expression de YTHDC2 et sa signification pronostique dans le CBNPC Veuillez cliquer ici pour visualiser une version agrandie de cette figure.

Figure 3 : Expression du gène YTHDC2 dans la base de données TCGA. Les niveaux d'expression de YTHDC2 dans l'adénocarcinome pulmonaire (LUAD) et le carcinome pulmonaire à cellules squameuses (LUSC) ont été comparés à ceux des tissus pulmonaires normaux à l'aide de données de séquençage ARN provenant de The Cancer Genome Atlas (TCGA), obtenues via le portail de données Genomic Data Commons (GDC), et analysées à l'aide de la plateforme web GEPIA. Les données ont été analysées à l'aide de la plateforme GEPIA. La significativité statistique a été déterminée par une valeur p < 0,05. Veuillez cliquer ici pour visualiser une version agrandie de cette figure.

Figure 4 : Expression différentielle de YTHDC2 dans le CBNPC selon l'analyse de la base de données GEPIA. Les niveaux d'expression de YTHDC2 dans l'adénocarcinome pulmonaire (LUAD) et le carcinome pulmonaire à cellules squameuses (LUSC) ont été comparés à ceux des tissus pulmonaires normaux à l'aide de données provenant de The Cancer Genome Atlas (TCGA) et des projets Genotype-Tissue Expression (GTEx) via la plateforme GEPIA. Les diagrammes en boîte représentent les niveaux d'expression génique normalisés. La signification statistique a été déterminée avec une valeur p < 0,05. Veuillez cliquer ici pour visualiser une version agrandie de cette figure.

Figure 5 : Analyse d'expression selon les stades de YTHDC2 dans le CBNPC à l'aide de la base de données GEPIA. Les niveaux d'expression de YTHDC2 ont été analysés à travers différents stades pathologiques (I à IV) du CBNPC en utilisant la plateforme GEPIA. Le graphique par stade illustre la variation de l'expression génique selon les stades tumoraux. Aucune différence statistiquement significative de l'expression de YTHDC2 n'a été observée entre les stades (p = 0,644). Veuillez cliquer ici pour visualiser une version agrandie de cette figure.

Figure 6 : Analyse de survie de Kaplan-Meier de l'expression de YTHDC2 chez des patients atteints de CBNP (Kaplan-Meier Plotter). (A) Survie globale (SG) : courbes de survie de Kaplan-Meier comparant la survie globale chez des patients atteints de CBNP répartis en groupes d'expression élevée (n = 140) et faible (n = 364) de YTHDC2, en utilisant le seuil optimal fourni par l'outil Kaplan-Meier Plotter (« auto-select best cutoff »). Le test du log-rank a été utilisé pour évaluer la signification statistique (p = 0,0093) ; le risque relatif (RR) = 0,61 ; intervalle de confiance à 95 % (IC) : 0,42–0,89. Une expression élevée de YTHDC2 est associée à une survie globale significativement meilleure. (B) Survie après progression (SAP) : courbes de survie de Kaplan-Meier comparant la survie après progression chez des patients atteints de CBNP répartis en groupes d'expression élevée (n = 181) et faible (n = 296) de YTHDC2, en utilisant le seuil optimal fourni par l'outil Kaplan-Meier Plotter (« auto-select best cutoff »). Le test du log-rank a été utilisé pour la comparaison statistique (p = 4,2 × 10⁻⁵) ; le risque relatif (RR) = 0,63 (intervalle de confiance à 95 % : 0,51–0,79). Une forte expression de YTHDC2 est associée à une survie après progression significativement plus longue. Veuillez cliquer ici pour visualiser une version agrandie de cette figure.

Figure 7 : Modèle de prédiction du taux de survie de YTHDC2. Courbes caractéristiques de fonctionnement du récepteur (ROC) évaluant la précision prédictive de YTHDC2 pour la survie globale chez les patients atteints de TCGA-LUAD et de TCGA-LUSC, pour lesquels des données d'expression par séquençage de l'ARN et de survie sont disponibles aux points temporels de 1, 3, 5 et 8 ans. Valeurs de la surface sous la courbe (AUC) : 1 an = 0,50, 3 ans = 0,51, 5 ans = 0,52 et 8 ans = 0,52. La ligne diagonale en pointillés indique le hasard (AUC = 0,5). L'analyse a été réalisée à l'aide du package survival ROC dans R. Veuillez cliquer ici pour visualiser une version agrandie de cette figure.

Figure 8 : Expression de YTHDC2 dans des tissus tumoraux de CBNP appariés et des tissus normaux adjacents mesurée par RT-qPCR. L'expression relative de YTHDC2 a été calculée selon la méthode 2^–ΔCt et normalisée à GAPDH. Les valeurs d'expression représentent des niveaux d'expression normalisés plutôt que des variations d'expression par rapport à un échantillon témoin. Une analyse statistique a été réalisée à partir des 19 paires appariées de tissus tumoraux et tissus normaux adjacents disponibles pour comparaison appariée. Les données sont présentées sous forme d'observations appariées individuelles avec moyenne ± écart-type. Les différences entre les échantillons appariés ont été analysées à l'aide du test de Wilcoxon pour échantillons appariés (p = 0,537). Veuillez cliquer ici pour visualiser une version agrandie de cette figure.

Figure 9 : Association entre l'expression de YTHDC2 et les caractéristiques clinicopathologiques chez les patients atteints de CBNPC. (A) Expression de YTHDC2 dans différents types histopathologiques, montrant une expression plus élevée dans le carcinome épidermoïde que dans l'adénocarcinome (p < 0,05). (B) Expression de YTHDC2 selon le statut de métastase ganglionnaire, révélant une expression plus élevée chez les patients présentant une métastase ganglionnaire que chez ceux sans métastase (p < 0,05). (C) Expression de YTHDC2 selon les différents grades de différenciation histologique, sans différence statistiquement significative (p = 0,181). (D) Expression de YTHDC2 selon les stades cliniques CSCO, sans différence statistiquement significative (p = 0,08). Les niveaux d'expression de YTHDC2 ont été mesurés par PCR quantitative en temps réel (qRT-PCR) et calculés selon la méthode 2^–ΔCt, normalisés à GAPDH. Les données sont présentées sous forme de moyenne ± écart-type (ET). Les comparaisons statistiques ont été effectuées à l'aide du test de Wilcoxon. *p < 0,05 était considéré comme statistiquement significatif. Veuillez cliquer ici pour consulter une version agrandie de cette figure.

N°	Critères d'inclusion	Critères d'exclusion
1	Âge ≥18 ans, quel que soit le sexe.	Diagnostic d'autres tumeurs malignes.
2	Diagnostic confirmé de CBNPC selon les lignes directrices cliniques de l'Association médicale chinoise pour le cancer du poumon (édition 2024).	Présence de maladies respiratoires ou cardiovasculaires chroniques (par exemple, BPCO, cœur pulmonaire, insuffisance cardiaque).
3	Disponibilité de données cliniques complètes, incluant les caractéristiques démographiques, les marqueurs sériques de tumeur et l'imagerie thoracique par tomodensitométrie avec contraste, accompagnées d'un consentement éclairé signé.	Dysfonctionnement sévère d'un organe, incluant une insuffisance rénale (DFG <30 ml/min/1,73m²) ou une cirrhose hépatique.
4	Patients naïfs de traitement, sans thérapie antérieure dirigée contre la tumeur.	Populations particulières, incluant les femmes enceintes ou allaitantes (confirmé par test β-hCG si applicable).
5	Disponibilité d'échantillons tumoraux et/ou de tissus adjacents suffisants, adaptés à une analyse moléculaire.	Mauvaise qualité des échantillons, incluant un tissu insuffisant ou un ARN dégradé (confirmé par examen histopathologique).

Tableau 1 : Critères d'inclusion et de exclusion pour les patients atteints de CBNP dans l'étude

Type de tissu	Échantillons appariés analysés (n)	Expression relative (moyenne ± ÉT)
Tissu tumoral	19	3.24 ± 2.34
Tissu normal adjacent apparié	19	3.60 ± 1.70

Tableau 2 : Expression de YTHDC2 dans des tissus tumoraux de CBNP appariés et des tissus normaux adjacents. L'expression relative de YTHDC2 a été mesurée à l'aide de la méthode 2^–ΔCt et normalisée à GAPDH. Les données sont présentées sous forme de moyenne ± écart-type (ET). La comparaison statistique des 19 paires appariées de tissus tumoraux et tissus normaux adjacents a été réalisée à l'aide du test de Wilcoxon (p = 0,537).

Gène cible	Amorce/Sonde	Séquence (5′→3′)
YTHDC2	Forward (F)	CCTGTCACCAATAAAGAGCG
	Reverse (R)	CACTGGAATCTGAGGTATGCC
	Probe (P)	AGCAAGACAAGTGGGCGACTCAA
GAPDH	Forward (F)	AATCCCATCACCATCTTCCAG
	Reverse (R)	ATGACCCTTTTGGCTCCC
	Probe (P)	CCAGCATCGCCCCACTTGATTTT

Tableau 3 : Séquences des amorces et des sondes utilisées pour la PCR quantitative en temps réel (qRT-PCR). L'expression de YTHDC2 a été quantifiée à l'aide de la chimie TaqMan, avec GAPDH comme témoin interne.

Caractéristique	Catégorie	n	%
Type pathologique	Adénocarcinome	41	82
	Carcinome épidermoïde	9	18
Stade CSCO	I–II	28	56
	III–IV	22	44
Métastase ganglionnaire	Absente	24	48
	Présente	26	52
Degré de différenciation	Faible différenciation	9	18
	Différenciation modérée à élevée	41	82
Âge	≥60 ans	36	72
	<60 ans	14	28
Sexe	Homme	32	64
	Femme	18	36
Antécédents de tabagisme	Oui	25	50
	Non	25	50

Tableau 4 : Caractéristiques cliniques et pathologiques des patients atteints de CBNPC. Les données sont présentées sous forme de nombres (n) et de pourcentages (%) basés sur la population totale de l'étude (n = 50).

Caractéristique clinicopathologique	Groupe	n	Expression de YTHDC2 (moyenne ± ÉT)	p-valeur
Type de tissu	Tumeur	30	3,24 ± 2,34	0,537
	Tissu normal adjacent	19	3,60 ± 1,70
Type pathologique	Adénocarcinome	26	4,13 ± 1,29	0,022*
	Carcinome épidermoïde	4	7,50 ± 3,41
Stade CSCO	I–II	22	4,29 ± 1,94	0,08
	III–IV	8	5,05 ± 1,51
Métastase ganglionnaire	Absente	19	3,83 ± 0,91	0,027*
	Présente	11	5,70 ± 2,53
Différenciation histologique	Modérément à bien différenciée	25	4,33 ± 1,90	0,181
	Mal différenciée	5	5,18 ± 1,60
Âge	≥60 ans	20	4,62 ± 2,10	0,835
	<60 ans	10	4,16 ± 1,12
Antécédent de tabagisme	Oui	12	4,62 ± 2,40	0,845
	Non	18	4,38 ± 1,40

Tableau 5 : Association entre l'expression de YTHDC2 et les caractéristiques clinicopathologiques chez les patients atteints de CBNPC. L'expression de YTHDC2 a été mesurée par RT-qPCR et calculée selon la méthode 2^–ΔCt, normalisée à GAPDH. Les données sont présentées sous forme de moyenne ± écart-type (ET). Les tailles des groupes (n) représentent le nombre d'échantillons valides analysés. Des comparaisons statistiques entre les groupes ont été effectuées à l'aide du test de somme des rangs de Wilcoxon. *p < 0,05 était considéré comme statistiquement significatif.

Variable	β	Wald	Valeur-p	OR	IC à 95 %
Âge (≥60 vs <60)	0.07	0.01	0.93	1.08	0.20–5.68
Sexe (Féminin vs Masculin)	0.53	0.4	0.525	1.7	0.33–8.67
Antécédents de tabagisme (Oui vs Non)	0.54	0.46	0.496	1.71	0.36–8.09
Stade de la tumeur (III–IV vs I–II)	3.3	7.38	0.007*	27	2.50–291.18
Differentiation (faible vs modérée–bonne)	–1.29	1.62	0.204	0.28	0.04–2.02
Expression de YTHDC2	0.83	4.91	0.027*	2.29	1.10–4.75

Tableau 6 : Analyse de régression logistique multivariée des facteurs associés à la métastase ganglionnaire chez les patients atteints de CBNPC. Une régression logistique binaire a été réalisée en utilisant la métastase ganglionnaire comme variable dépendante. Les rapports de cotes (OR) avec intervalles de confiance à 95 % (IC) sont indiqués. Catégories de référence : âge (<60 ans), sexe (homme), antécédents de tabagisme (non), stade tumoral (I–II) et différenciation (modérée–bonne). *p < 0,05 indique une signification statistique.

Discussion

YTHDC2, la plus grande protéine de liaison à la N6-méthyladénosine (m6A) de la famille YTH, est unique en raison de son activité d'hélicase à ARN dépendante de l'ATP, ce qui en fait un régulateur clé du métabolisme de l'ARN¹³. Contrairement aux autres membres de la famille YTH, YTHDC2 se trouve à la fois dans le noyau et le cytoplasme, où elle régule la traduction des ARNm et la stabilité de l'ARN¹⁴. Des études expérimentales antérieures ont montré que YTHDC2 supprime la progression du carcinome adénoïde pulmonaire (LUAD) en inhibant l'expression des ARNm ADIRF et MRPL12, en favorisant l'apoptose et en réduisant la prolifération cellulaire et les métastases^15,16. Des études expérimentales antérieures ont également suggéré que YTHDC2 stabilise des ARNl non codants tels que ZNRD1-AS1 afin de supprimer la prolifération du LUAD, et module des ARNm modifiés par la m6A tels que CYLD et SLC7A11, inhibant ainsi la voie de signalisation NF-κB, la capture de cystéine et les processus antioxydants, tout en favorisant la ferroptose et l'activité anticancéreuse^17,18.

Dans cette étude, l'expression et la signification clinique de la protéine liseuse d'm6A YTHDC2 dans le CBNPC ont été analysées à l'aide d'une approche intégrative combinant des analyses de bioinformatique et une validation expérimentale. Cette analyse de bioinformatique des bases de données TCGA et GEPIA a révélé une régulation négative significative de YTHDC2 dans les tissus tumoraux du CBNPC par rapport aux tissus pulmonaires normaux, et une expression plus élevée de YTHDC2 était associée à une meilleure survie globale et post-progression, suggérant un rôle pronostique potentiel. Curieusement, nos expériences de qRT-PCR utilisant les 19 échantillons appariés de tumeur et de tissu normal adjacent disponibles dans la cohorte actuelle n'ont pas mis en évidence de différence statistiquement significative de l'expression de YTHDC2 entre les tissus tumoraux et les tissus normaux adjacents. Cette discordance met en lumière les difficultés liées à la traduction des résultats provenant de grandes bases de données publiques vers des cohortes cliniques indépendantes, et souligne la nécessité d'une interprétation prudente des analyses in silico. Comprendre les raisons sous-jacentes à ces différences est essentiel pour évaluer avec précision l'utilité de YTHDC2 comme biomarqueur et cible thérapeutique dans le CBNPC. L'accent mis par la présente étude sur YTHDC2 s'aligne sur son activité d'hélicase unique parmi les lecteurs de la famille YTH¹⁹, mais des analyses pancancéreuses récentes révèlent des rôles dépendants du contexte pour d'autres membres de cette famille. Par exemple, Li et al. ont démontré que YTHDF1/2 sont surexprimés dans la plupart des cancers (par exemple, LIHC, LUAD) et sont associés à un mauvais pronostic, tandis que YTHDC1/2 présentent des effets suppresseurs de tumeur dans KIRC et BRCA²⁰. Notamment, le rôle oncogénique de YTHDF1 via l'activation de la voie Wnt/β-caténine contraste avec la fonction anti-métastatique de YTHDC2 dans le CBNPC, ce qui souligne la nécessité de stratégies de biomarqueurs spécifiques aux sous-types. Comparé aux marqueurs pronostiques établis (par exemple, PD-L1 pour la réponse à l'immunothérapie), le pouvoir prédictif de YTHDC2 pourrait être amélioré en le combinant avec d'autres régulateurs d'm6A (par exemple, METTL3, YTHDF1) ou des gènes de points de contrôle immunitaires, comme le suggèrent les analyses pancancéreuses d'infiltration immunitaire. Bien que des études antérieures aient suggéré que YTHDC2 régule la voie NF-κB/CYLD¹², la présente étude était limitée par l'absence de validation au niveau protéique par immunohistochimie ou Western blot, ainsi que par une validation fonctionnelle. De futures recherches devraient combiner des essais d'extinction génique avec un séquençage m6A afin de cartographier les cibles directes.

Des analyses antérieures ont révélé que l'expression de YTHDC2 est régulée à la baisse dans les tissus de CBNPC et qu'elle est associée à un mauvais pronostic²¹. Une analyse de Kaplan-Meier a indiqué une survie plus longue chez les patients présentant une expression élevée de YTHDC2, mais une analyse de la courbe ROC a suggéré une faible puissance prédictive pour la survie²⁰. L'analyse ROC de survie menée dans la présente étude a été réalisée à l'aide des données d'expression en RNA-séquençage et de survie de TCGA, car aucune information de suivi à long terme n'était disponible pour notre cohorte clinique locale. Il est important de noter que les faibles valeurs de la surface sous la courbe (AUC) (~0,5) observées dans cette étude suggèrent que l'expression de YTHDC2 manque de sensibilité et de spécificité suffisantes pour être utilisée cliniquement comme biomarqueur isolé²². Cette limitation est conforme aux données émergentes indiquant que les biomarqueurs basés sur un seul gène sont souvent insuffisants pour des maladies complexes telles que le CBNPC, où des approches multi-omiques et des panels intégrés de biomarqueurs sont de plus en plus nécessaires pour atteindre une performance prédictive cliniquement significative. Une expression plus élevée de YTHDC2 a été observée dans les tissus de CBNPC présentant une métastase ganglionnaire, suggérant une association potentielle entre l'expression de YTHDC2 et le statut métastatique ganglionnaire dans la cohorte actuelle. Bien que des différences d'expression de YTHDC2 aient également été observées entre l'adénocarcinome et le carcinome épidermoïde, cette comparaison doit être interprétée avec prudence, car seulement 4 échantillons de carcinome épidermoïde étaient disponibles pour l'analyse, limitant considérablement la puissance statistique de cette comparaison de sous-groupe. Aucune différence significative n'a été observée selon le stade clinique, le degré de différenciation, l'âge ou l'histoire de tabagisme, probablement en raison des limites de l'étude, notamment la taille de l'échantillon et la conception monocentrique. Bien que l'association observée entre une expression réduite de YTHDC2 et la métastase ganglionnaire suggère un rôle biologique potentiel dans le CBNPC, sa faible capacité discriminante (AUC ~0,5) et sa détection inconstante par RT-qPCR excluent son utilisation comme marqueur clinique isolé. De futures études devraient explorer si la combinaison de YTHDC2 avec d'autres protéines liées à la m6A améliore la valeur prédictive.

Les analyses de bioinformatique ont suggéré que l'expression de YTHDC2 est réduite dans le CBNPC et pourrait être associée à de meilleurs résultats chez les patients. Bien qu'une expression réduite ait également été observée chez les patients présentant une métastase ganglionnaire et que des différences aient été notées entre les sous-types histopathologiques, ces résultats obtenus dans les sous-groupes doivent être interprétés avec prudence en raison de la taille limitée de l'échantillon, en particulier pour le carcinome épidermoïde. Toutefois, ces résultats n'ont pas été confirmés par l'analyse de qRT-PCR dans notre cohorte clinique, ce qui pourrait refléter des différences dans les caractéristiques de la cohorte, la taille de l'échantillon, la variabilité technique, la régulation post-transcriptionnelle ou l'absence de validation au niveau protéique. De futures recherches devraient explorer les mécanismes de YTHDC2 dans d'autres sous-types de cancer du poumon au moyen d'expériences in vitro et in vivo. De telles études pourraient préciser davantage le rôle biologique de YTHDC2 et déterminer s'il présente une utilité clinique dans le cadre d'une approche multimarqueuse, plutôt que comme biomarqueur isolé.

Limites

Cette étude présente plusieurs limites. Il s'agissait d'une étude rétrospective monocentrique à taille d'échantillon relativement réduite, ce qui pourrait limiter la généralisabilité. L'utilisation de tissus inclus en paraffine (FFPE) a pu affecter la qualité de l'ARN et la sensibilité de la qRT-PCR. De plus, seule l'expression de l'ARNm de YTHDC2 a été évaluée, et aucune validation au niveau protéique par immunohistochimie (IHC) ou immunoblotting (Western blotting) n'a été réalisée. Comme l'expression de l'ARNm ne corrèle pas nécessairement avec l'abondance protéique en raison de la régulation post-transcriptionnelle, cela pourrait partiellement expliquer les divergences entre nos résultats cliniques et les analyses de bases de données publiques. L'étude ne disposait pas non plus de données de suivi à long terme, et les analyses de sous-groupes (par exemple, carcinome épidermoïde) étaient insuffisamment puissantes.

Directions futures

Les recherches futures devraient explorer les mécanismes de YTHDC2 dans le CSNPG au moyen d'expériences in vitro et in vivo afin de mieux comprendre son rôle fonctionnel. Des études multicentriques impliquant des échantillons plus importants sont nécessaires pour valider les résultats et améliorer leur généralisation. En outre, l'intégration de YTHDC2 avec d'autres régulateurs liés à la m6A et avec des variables clinicopathologiques pourrait renforcer son utilité prédictive et pronostique. D'autres études intégrant des approches multi-omiques, notamment la transcriptomique, la protéomique et l'épigénomique, sont nécessaires pour clarifier les mécanismes biologiques sous-jacents à la dysrégulation de YTHDC2. Une validation au niveau protéique par immunohistochimie (IHC) ou par immunobuvardage (Western blotting) devrait également être réalisée afin d'évaluer la concordance entre l'expression de l'ARNm et celle de la protéine. La standardisation des méthodes de traitement des échantillons et des techniques de validation sera également essentielle pour garantir la reproductibilité et l'applicabilité clinique.

Conclusion

Cette étude fournit une évaluation exploratoire de l'expression de YTHDC2 dans le CBNPC en intégrant des analyses de bioinformatique avec une validation clinique par qRT-PCR. Toutefois, sa détection incohérente selon les plates-formes analytiques et sa précision diagnostique limitée (AUC ≈0,5) empêchent actuellement son utilisation comme biomarqueur clinique autonome. Bien que les analyses de bioinformatique suggèrent une signification pronostique potentielle, une validation clinique indépendante n'appuie pas sa fiabilité pour une application diagnostique ou pronostique. Ces résultats doivent être interprétés avec prudence et nécessitent une validation dans de plus grands cohortes multicentriques, accompagnée d'études au niveau protéique et fonctionnelles, avant que toute application clinique puisse être envisagée.

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Amorces et sondes personnalisées	Sangon Biotech Co., Ltd., Shanghai, Chine	Synthèse personnalisée	Séquences des amorces et sondes indiquées dans le tableau 6
DNase I	Magen Biotechnology Co., Ltd., Guangzhou, Chine	DNase I (Kit HiPure FFPE RNA)	Élimination de la contamination par l'ADN génomique
Algorithme ESTIMATE	Yoshihara et al.	Package R (version 1.0.13)	Estimation de la pureté tumorale
Kit d'extraction d'ARN FFPE	Magen Biotechnology Co., Ltd., Guangzhou, Chine	Kit HiPure FFPE RNA (R4130-02)	Extraction d'ARN à partir de tissus FFPE
Portail de données GDC	Institut national du cancer (NCI), NIH, États-Unis	https://portal.gdc.cancer.gov	Téléchargement des jeux de données TCGA
Serveur web GEPIA	Université de Pékin, Chine	http://gepia.cancer-pku.cn	Analyse de l'expression génique
Traceur Kaplan–Meier	Université Semmelweis, Hongrie	https://kmplot.com	Analyse de survie
Microréfrigérant centrifuge	Eppendorf AG, Hambourg, Allemagne	5424 R	Procédures de purification d'ARN
Spectrophotomètre NanoDrop	Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, États-Unis	NanoDrop 2000/2000c	Quantification de l'ARN
Mélange maître de qPCR à base de sondes	Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, États-Unis	TaqMan Universal PCR Master Mix II (4440040)	Amplification de qPCR quantitative
Logiciel statistique R	Fondation R pour l'informatique statistique, Vienne, Autriche	Version 4.4.1	Analyses statistiques et analyse ROC
Système de PCR en temps réel	Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA, États-Unis	CFX Opus 96	PCR quantitative en temps réel
Kit de transcription inverse	Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, États-Unis	Kit RevertAid First Strand cDNA Synthesis (K1622)	Synthèse d'ADN complémentaire (cDNA)
Colonne de purification d'ARN	Magen Biotechnology Co., Ltd., Guangzhou, Chine	HiPure Mini Column I	Colonne de purification d'ARN à membrane de silice
Eau sans RNase	Magen Biotechnology Co., Ltd., Guangzhou, Chine	Eau sans RNase	Élution de l'ARN
SPSS Statistics	IBM Corp., Armonk, NY, États-Unis	IBM SPSS Statistics Version 27.0	Analyses statistiques
Package survivalROC	CRAN (Fondation R pour l'informatique statistique)	Version 1.0.3.1	Analyse ROC dépendante du temps
Base de données TCGA	Institut national du cancer (NCI), NIH, États-Unis	https://portal.gdc.cancer.gov	Base de données publique de génomique du cancer
Buffer de lavage RW1	Magen Biotechnology Co., Ltd., Guangzhou, Chine	Buffer RW1	Buffer de lavage pour purification d'ARN
Buffer de lavage RW2	Magen Biotechnology Co., Ltd., Guangzhou, Chine	Buffer RW2	Buffer de lavage pour purification d'ARN