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Article de méthode

Cardioïdes d’origine pluripotente des cellules souches induits par l’humain comme modèle pour évaluer la délivrance d’oligonucléotides

219 vues

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DOI :

10.3791/72013

⸱

11 août 2026

 ,  ,  ,  , 
1Gulbenkian Institute for Molecular Medicine, 2Novo Nordisk Center for Optimized Oligo Escape, University of Copenhagen, 3Faculdade de Medicina da Universidade de Lisboa

* These authors contributed equally

Dans cet article

Résumé

Ce protocole permet la génération de cardioïdes auto-organisés à partir de cellules souches pluripotentes induites par l’humain pour une évaluation microscopique de l’absorption des oligonucléotides marqués par fluorescence.

Résumé

Les traitements à base d’oligonucléotides représentent une classe de médicaments en pleine évolution avec un potentiel significatif pour traiter les maladies cardiovasculaires ; Cependant, atteindre une livraison efficace du tissu cardiaque reste un défi critique et non résolu. Un obstacle majeur est la disponibilité limitée de modèles humains in vitro robustes et physiologiquement pertinents, capables de soutenir une évaluation quantitative de l’absorption cellulaire des oligonucléotides et de la distribution intracellulaire. Un protocole détaillé, étape par étape, est présenté pour générer des cardioïdes 3D auto-organisés à partir de cellules souches pluripotentes induites par l’humain (iPSC) et les appliquer comme plateforme pour évaluer l’absorption d’oligonucléotides marqués par la fluorescence. Le protocole guide les utilisateurs dans la différenciation cardiaque dirigée en culture en suspension en modulant temporellement la signalisation Wnt/β-caténine, permettant une spécification séquentielle des iPSC via les stades progéniteurs du mésoderme, du mésoderme cardiaque et du cardiomyocyte. Dans ces conditions, les cellules s’auto-assemblent spontanément en structures tridimensionnelles battantes, contenant des cavités, qui expriment des marqueurs cardiomyocytaires canoniques. Les cardioïdes résultants fournissent une plateforme évolutive et expérimentale pour l’évaluation par imagerie de l’efficacité de l’absorption des oligonucléotides, soutenant le développement et l’optimisation de stratégies d’administration pour des applications cardiaques.

Introduction

Les traitements à base d’oligonucléotides, principalement les oligonucléotides antisens (ASO) et les petits ARN interférents (siRNA), émergent rapidement comme une approche transformatrice et très spécifique pour le traitement d’un large éventail de maladies, y compris les affections héréditaires et acquises 1,2,3. Ces modalités permettent une modulation directe de l’expression génique au niveau de l’ARNm par une liaison spécifique à la séquence aux transcriptes cibles, permettant la correction du silence ou du splicing génique de gènes associés à la maladie, souvent inaccessibles aux thérapies conventionnelles à petitesmolécules 4,5. Ainsi, les thérapies géniques à base d’oligonucléotides offrent une plateforme polyvalente pour cibler divers mécanismes pathogènes dans de multiples domaines pathologiques, y compris les troublescardiovasculaires 6. À ce jour, plusieurs traitements à base d’oligonucléotides, incluant les ASO, les siRNA et les agents de commutation de splice, ont été approuvés pour une utilisationclinique 7. Malgré ces progrès, leur efficacité thérapeutique en contexte préclinique et clinique reste limitée par une délivrance intracellulaireinefficace 8. Les estimations actuelles indiquent que moins de 1 % des oligonucléotides intériorisés s’échappent des compartiments endosomaux pour atteindre le cytosol et engager leur ARN cible, limitant ainsi l’activitéfonctionnelle 9,10. Cette limitation est particulièrement marquée dans les tissus cardiaques, où l’absorption et le trafic intracellulaire sont mal compris.

Historiquement, l’évaluation préclinique des traitements cardiovasculaires s’est largement appuyée sur des modèles animaux, qui restent indispensables pour évaluer la pharmacocinétique, la biodistribution, l’efficacité et la sécurité in vivo. Cependant, d’importantes différences interespèces dans la physiologie cardiaque, la régulation des gènes et les réponses cellulaires limitent souvent leur capacité à prédire avec précision l’efficacité thérapeutique et la toxicité chez l’humain. Ces limitations ont conduit au développement de modèles in vitro basés sur l’humain, avec une pertinence physiologique accrue. Parmi celles-ci, la technologie des cellules souches pluripotentes induites par l’humain (iPSC) a révolutionné la modélisation des maladies cardiovasculaires en fournissant une source quasiment illimitée de cellules pouvant être différenciées en lignées cardiovasculaires. Les cardiomyocytes humains dérivés de l’iPSC (iPSC-CM) reproduisent de nombreuses propriétés moléculaires, structurelles et fonctionnelles du myocarde humain et sont devenus une plateforme largement adoptée pour étudier les mécanismes de la maladie, les réponses aux médicaments et les modalités thérapeutiquesémergentes 11. Cependant, les cultures bidimensionnelles conventionnelles d’iPSC-CM humaines présentent des limites importantes. La plupart des protocoles de différenciation génèrent des cardiomyocytes qui ressemblent à des cellules fœtales plutôt qu’à des cellules adultes, présentant des propriétés structurales, électrophysiologiques, métaboliques et contractilesimmatures 12.

De plus, les cultures monocouches manquent de l’architecture tissulaire tridimensionnelle (3D), des interactions multicellulaires et de la composition de la matrice extracellulaire qui influencent la fonction cardiomyocytaire in vivo. Pour relever ces défis, des modèles cardiaques 3D de plus en plus sophistiqués ont étédéveloppés 13. Parmi ceux-ci, les tissus cardiaques modifiés (EHT), générés par l’intégration des iPSC-CM dans des échafaudages biomatériels et l’application d’une stimulation mécanique et électrique, favorisent la maturation structurelle et fonctionnelle tout en reproduisant plus fidèlement l’environnement biomécanique du myocardenatif 13. Bien que les EHT fournissent des plateformes hautement pertinentes sur le plan physiologique pour la modélisation des maladies et les tests de médicaments, leur génération nécessite généralement une expertise spécialisée en bio-ingénierie et des équipements dédiés. À l’autre extrémité du spectre, les tranches de tissu cardiaque ex vivo préservent le plus fidèlement l’architecture et la composition cellulaire des tissus natifs mais dépendent de l’accès au tissu cardiaque primaire, ont une viabilité limitée en culture et ne sont pas facilement scalables.

Plus récemment, les organoïdes cardiaques sont apparus comme des systèmes modèles 3D accessibles qui reprennent des aspects clés de l’organisation et de la fonction des tissuscardiaques 14. Les cardioïdes sont des organoïdes cardiaques auto-assemblants composés principalement de cardiomyocytes qui subissent une spécification intrinsèque, un motif spatial et une morphogenèse pour former des structures en forme de chambre contenantdes cavités 15,16. Les méthodes de formation des cardioïdes reposent généralement sur une activation initiale de la signalisation Wnt pour induire la spécification du mésoderme, suivie d’une inhibition ultérieure pour favoriser l’engagement de la lignée cardiaque. Les cardioïdes peuvent être générés en cultures statiques ou en suspension agitées, ce qui soutient une production évolutive et améliore l’auto-organisationtissulaire 15,16,17,18,19. Des organoïdes cardiaques plus complexes et multi-lignées incorporant des types cellulaires endothéliaux, épicardiques ou autres augmentent encore leur pertinence physiologique mais nécessitent des protocoles de différenciation plus élaborés, des périodes de culture plus longues et une optimisationétendue 13,14.

Un protocole simple, reproductible et efficace est présenté pour générer des cardioïdes auto-organisés à partir de cardiomyocytes à partir d’iPSC humains et leur application pour évaluer l’absorption des oligonucléotides marqués par fluorescence. Le protocole devrait s’avérer précieux pour les chercheurs cherchant à optimiser la chimie des oligonucléotides et les stratégies d’administration pour des applications cardiovasculaires. Tous les matériaux utilisés dans cette étude sont listés dans le tableau des matériaux.

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Protocole

1. Culture et préparation des iPSC pour la différenciation

ATTENTION : Effectuer toute manipulation à l’air libre des cellules et des milieux dans un cabinet de biosécurité certifié Classe II. Portez une blouse de laboratoire et des gants. Décontaminez les surfaces de travail et les déchets liquides avec un désinfectant approprié.

  1. Maintenez des iPSC.
    1. Enduit les plaques de culture avec une matrice membranaire basale appropriée selon les instructions du fabricant.
    2. Nourrissez les iPSC avec un milieu pluripotent défini et sans alimentation et remplacez le milieu toutes les 24 heures.
    3. Maintenir les cultures en dessous de la surconfluence et des cellules de passage lorsqu’elles atteignent 70–80 % de confluence.
      REMARQUE : Assurez-vous que les iPSC conservent une morphologie de haute qualité, non différenciée, et sont confirmés exempts de mycoplasme avant d’initier la différenciation.
  2. Pré-différenciation du passage.
    1. Décongeler les iPSC et étendre les cellules sur au moins deux passages avant d’initier la différenciation cardiaque.
    2. Les cellules du passage utilisent une méthode de dissociation sans enzymes, PBS-EDTA, compatible avec le maintien de l’iPSC.
      POINT DE PAUSE : Maintenir les iPSC en culture jusqu’à atteindre 70–80 % de confluence et conserver la morphologie typique sans signes de différenciation spontanée.

2. Préparation des agrégats d’iPSC dans les plaques de micropuits

  1. Dissociez les iPSC à une suspension monocellulaire.
    1. Aspirez le milieu et lavez les cellules une fois avec 1 mL de 1× PBS.
    2. Ajouter la solution de décollement cellulaire (Accutase) à 500 μL par puits d’une plaque à 6 puits et incuber à 37 °C pendant 5 à 7 minutes.
    3. Ajoutez 1,5 mL de substrat de lavage par puits, puis resuspendez doucement pour obtenir une suspension monocellule.
    4. Transférez la suspension dans un tube conique de 15 mL et centrifugez à 200 × g pendant 3 minutes à température ambiante.
    5. Aspirez le surnageant et resuspendez la pellete cellulaire dans un milieu iPSC sans alimentation, complété par un inhibiteur de ROCK (10 μM finaux).
      REMARQUE : Ajustez le temps d’incubation de dissociation pour chaque ligne iPSC en vérifiant le décollement à 5 minutes et en prolongeant par petits incréments si nécessaire.
  2. Comptez les cellules et préparez la densité de placage.
    1. Compter les cellules viables en utilisant une méthode standard de comptage cellulaire.
    2. Préparez une suspension monocellule à 0,9 × 106 cellules/mL pour chaque puits d’une plaque d’agrégation de micropuits de 800 μm (format 24 puits, ~300 micropuits par puits).
      REMARQUE : Optimisez le nombre de cellules par puits, car la taille globale ou l’efficacité de différenciation varient selon les lignes iPSC.
  3. Amorce la plaque micropuits et enlève les bulles.
    1. Ajoutez 500 μL de milieu iPSC sans alimentation contenant un inhibiteur de ROCK (10 μM finaux) à chaque puits.
    2. Centrifugez la plaque du micropuits à 300 × g pendant 3 minutes à température ambiante pour éliminer les bulles d’air des micropuits.
      ESSENTIEL : Retirez complètement toutes les bulles afin de permettre un dépôt cellulaire uniforme au fond de chaque micropuits et soutenir une formation efficace des agrégats.
  4. Ensemencer des iPSC dans des micropuits.
    1. Ajoutez 1,0 mL de la suspension monocellule préparée (0,9 × 106 cellules/mL) à chaque puits, correspondant à 0,9 × 106 cellules par puits.
    2. Resuspendez doucement dans le puits 3 à 5 fois avec un P1000 et évitez d’introduire des bulles d’air.
    3. Centrifugez la plaque à 200 × g pendant 3 minutes à température ambiante pour les pelleter dans les micropuits.
    4. Vérifiez au microscope que les cellules se sont déposées dans les micropuits avant de placer la plaque à 37 °C avec 5 % de CO₂ pendant 24 heures.
      CRITIQUE : Manipulez la plaque avec précaution après centrifugation. Ne bousculez pas et ne secouez pas la plaque, car cela pourrait faire soulever les cellules hors des micropuits.

3. Expansion des agrégats iPSC dans les micropuits

  1. Aspirez soigneusement et remplacez le milieu sans déranger ni déloger les granulats.
    1. Inclinez la plaque et aspirez lentement environ 1,0 mL de milieu de chaque puits à l’aide d’une pipette P1000, afin de garantir que les agrégats restent bien placés dans les micropuits.
    2. Aspirez lentement les ~500 μL restants du milieu à l’aide d’une pipette P1000.
    3. Ajoutez 1,5 mL de milieu iPSC sans alimentation à chaque puits en le distribuant lentement le long du côté du puits à l’aide d’une pipette sérologique.
    4. Incubez à 37 °C, 5 % de CO₂ et répétez le changement de milieu quotidiennement.
      ESSENTIEL : Distribuez le milieu sur la paroi du puits et évitez l’écoulement direct sur les granulats.

4. Différenciation cardiaque des agrégats d’iPSC (jour 0 à jour 12)

  1. Induction du mésoderme (jour 0).
    1. Retirez le milieu en utilisant la méthode d’aspiration douce décrite aux étapes 3.1.1–3.1.2.
    2. Ajouter 1,5 mL par puits de milieu basal complété avec 2 % de B27 moins insuline et l’activateur de la voie Wnt/β-caténine (CHIR99021, concentration finale : 11 μM).
      REMARQUE : Préparez une solution de 10 mM de CHIR99021, un inhibiteur de petite molécule de la glycogène synthase kinase-3 (GSK-3). Pour obtenir une concentration finale de 11 μM, ajoutez 1,65 μL de la solution standard à 1,5 mL de milieu.
  2. Changement de médium après induction (jour 1).
    1. À 24 heures après l’ajout de CHIR99021, aspirez doucement le milieu de chaque puits.
    2. Ajoutez 1,5 mL par puits de milieu basal frais complété avec 2 % de B27 moins insuline, puis incubez pendant 48 heures.
      CRITIQUE : Respectez strictement le timing des étapes de modulation Wnt, car les écarts peuvent compromettre l’efficacité de la différenciation.
      REMARQUE : Une certaine mort cellulaire est attendue après exposition à l’activateur de la voie Wnt/β-caténine. Si une perte globale d’agrégats est observée, envisagez de réduire la concentration de l’activateur dans de futures expériences.
  3. Internement cardiaque via inhibition WNT (jour 3).
    1. Préparez le milieu conditionné en transférant 760 μL de milieu usé de chaque puits vers un tube conique stérile de 50 mL.
    2. Pour chaque puits, ajoutez 760 μL de milieu basal frais complété avec 2 % de B27 moins insuline au tube contenant le milieu conditionné en pool, puis mélangez doucement.
    3. Ajoutez l’inhibiteur de la voie Wnt, IWP4, au milieu mixte jusqu’à une concentration finale de 5 μM, puis inversez doucement le tube plusieurs fois pour mélanger.
    4. Aspirez soigneusement le milieu restant de chaque puits, puis ajoutez 1,5 mL par puits de milieu conditionné complété par IWP4.
    5. Incuber à 37 °C avec 5 % de CO₂ pendant 48 heures.
      REMARQUE : Préparez une solution de 1 mM de l’inhibiteur de la voie Wnt IWP4. Pour obtenir une concentration finale de 5 μM, ajoutez 7,6 μL de la solution d’origine par 1,52 mL de milieu total (760 μL de milieu conditionné + 760 μL de milieu basal frais) pour chaque puits.
  4. Changement de milieu dans les micropuits (jour 5).
    1. Remplacer le milieu par l’approche d’aspiration douce décrite aux étapes 3.1.1–3.1.2.
    2. Ajouter 1,5 mL de milieu basal complété à 2 % de B27 moins insuline à chaque puits, puis incuber à 37 °C avec 5 % de CO₂ pendant 48 heures.
  5. Transférer les agrégats des micropuits vers les plaques à 6 puits (jour 7).
    1. Aspirez soigneusement le milieu de chaque puits en utilisant la méthode d’aspiration douce décrite aux étapes 3.1.1–3.1.2.
    2. Ajoutez 1,0 mL de milieu basal complété avec 2 % de B27 contenant de l’insuline dans chaque puits de la plaque micropuits. À l’aide d’une pipette P1000, pipetez doucement le milieu de haut en bas cinq fois tout en déplaçant la pointe de la pipette en cercle sur la surface du puits pour déloger les granulats dans les micropuits et les transférer en suspension.
    3. Transférez la suspension d’agrégats dans un puits unique d’une plaque de culture à 6 puits non traitée.
    4. Rincez chaque puits de la plaque de micropuits avec 1,0 mL supplémentaire de milieu frais deux à trois fois pour récupérer les agrégats restants, transférant chaque rinçage dans le même puits de la plaque à 6 puits.
    5. Incubez à 37 °C avec 5 % de CO₂ pendant 72 heures.
      REMARQUE : La présence de cellules mortes et de débris cellulaires après le transfert d’agrégats est attendue. La plupart des débris seront enlevés lors du changement de milieu qui suit.
  6. Changement moyen lors de la culture de suspension (jour 10).
    1. Agitez doucement la plaque pour déloger les granulats mal attachés.
    2. Inclinez la plaque pour permettre aux agrégats de se déposer au fond du puits par gravité.
    3. Aspirez soigneusement le milieu usé sans déranger ni aspirer les agrégats.
    4. Ajouter 2,0 mL de milieu basal frais complété à 2 % de B27 d’insuline dans chaque puits et incuber à 37 °C avec 5 % de CO₂ pendant 48 à 72 heures.
      REMARQUE : Des coups spontanés sont généralement observés à partir d’environ le 10e jour.
      POINT DE PAUSE : Les cardioïdes battants peuvent être maintenus en culture en suspension pour une maturation prolongée en remplaçant le milieu tous les 2 à 3 jours.

5. Caractérisation microscopique des cardioïdes

REMARQUE : Cette méthode fournit un flux de travail pour la caractérisation histologique des cardioïdes à l’aide de cryosections. Les sections résultantes peuvent être utilisées pour diverses analyses histologiques, notamment la coloration de l’hématoxyline et de l’éosine (H&E) pour évaluer l’architecture tissulaire globale et le marquage par immunofluorescence pour évaluer l’identité des cardiomyocytes.

  1. Fixation et cryosection.
    1. Fixez les cardioïdes dans du paraformaldéhyde à 4 % pendant la nuit à 4 °C.
      ATTENTION : Le paraformaldéhyde est toxique et probablement un cancérogène ; Manipulez-la dans une hotte chimique tout en portant un équipement de protection individuelle approprié. Collectez tous les déchets contenant du paraformoldéhyde (fixatifs et lavages) dans un récipient clairement étiqueté pour les déchets aldéhydes/produits chimiques dangereux, et éliminez-les conformément aux procédures institutionnelles de gestion des déchets dangereux.
      SÉCURITÉ : Effectuez toute la fixation et la manipulation du paraformoldéhyde dans une hotte chimique tout en portant un équipement de protection individuelle approprié.
    2. Laver trois fois avec PBS et cryoprotect les cardioïdes fixes à 30 % (p/v) de saccharose dans PBS pendant la nuit à 4 °C.
    3. Intégrez les cardioïdes dans la gélatine, congelez-les et découpez des cryosections de 10 μm d’épaisseur sur des lames de microscope. Conservez les sections à −20 °C jusqu’à utilisation.
  2. Immunomarquage.
    1. Décongelez les sections pendant 15 minutes à température ambiante.
    2. Lavez les sections en PBS à 37 °C pendant 10 minutes, deux fois.
    3. Encerclez la zone d’intérêt sur chaque diapositive avec un stylo hydrophobe pour créer un puits qui retient les solutions de blocage et d’anticorps.
    4. Réhydrater les coupes pendant 2 à 3 minutes dans un tampon de perméabilisation (PB ; PBS contenant 0,1 % Tween-20) dans un pot de Coplin.
    5. Retirez les lames du PB, évacuez l’excès de solution, puis placez les lames dans une chambre humide.
      CRITICAL : À partir de maintenant, il est crucial de ne pas laisser les sections sécher.
    6. Bloquez les sections contenant 200 à 300 μL de PB contenant 5 % de sérum bovin fœtal (FBS) pendant 90 minutes à température ambiante dans une chambre humide.
    7. Retirez la solution bloqueante et incubez les sections toute la nuit à 4 °C avec 100 μL d’anticorps primaire (anti-cMYBP-C ; 1:50) dilué dans une solution bloqueante (PB contenant 1 % de FBS).
    8. Lavez les lames trois fois avec du PB et faites couver pendant 2 h à température ambiante avec un anticorps secondaire anti-souris fluorescent vert (1:200), une phalloïdine fluorescente rouge lointain (1:400) et un DAPI (1 μg/mL).
    9. Laver trois fois dans du PB et monter avec un support antifondu.
      ATTENTION : Collectez toutes les solutions contenant des colorants fluorescents (anticorps secondaires, phalloïde et solutions de coloration DAPI ainsi que les lavages correspondants) dans un récipient et jetez-les comme déchets chimiques conformément aux directives institutionnelles.
  3. Acquisition d’images.
    1. Acquérir des images confocales à l’aide d’un microscope confocal à balayage laser équipé d’un détecteur à matrice pour une imagerie à super-résolution utilisant un objectif d’immersion à l’huile de 10×× et 63/1,40.
    2. Excitez le fluorophore rouge lointain, le fluorophore vert et la coloration nucléaire en utilisant des lignes laser de 639 nm, 488 nm et 405 nm à 4,0 %, 4,0 % et 1,0 % de transmission laser respectivement.
    3. Acquérir des sections optiques uniques avec une taille de pixel de 0,0353 × 0,0353μm 2, balayage unidirectionnel, vitesse de balayage 6, zoom 1,7, moyenne de ligne 1, et temps de maintien des pixels de 0,935 μs par pixel.
    4. Appliquer un traitement d’image super-résolution avec détecteur de réseau en utilisant un filtrage automatique de Wiener.

6. Essai d’absorption des oligonucléotides fluorescents

  1. Préparez une solution base d’oligonucléotide marqué par fluorescence conjuguée à l’acide palmitique pour augmenter la lipophilicité.
    1. Reconstituer l’oligonucléotide liopiophilisé marqué par fluorescence dans de l’eau sans nucléase à une concentration finale de 1 mM. Vortex brièvement puis centrifugeuse à 3 000 × g pendant 30 secondes pour collecter la solution au fond du tube.
    2. Préparez des aliquotes à usage unique de la solution de 1 mM et stockez à −20 °C à l’abri de la lumière.
    3. Le jour de l’expérience, ajoutez 1 μL du stock de 1 mM à 1 mL de milieu de culture cardioïde pour obtenir une concentration finale d’oligonucléotide de 1 μM. Mélangez par agitation douce de la plaque.
  2. Incubez les cardioïdes avec l’oligonucléotide marqué fluorescentement (concentration finale de 1 μM) dans un milieu sans sérum à 37 °C avec 5 % de CO₂ pendant 24 heures.
  3. Rincez les cardioïdes trois fois avec du sérum physiologique tamponné phosphate (PBS) pour éliminer les oligonucléotides extracellulaires.
  4. Fixez les cardioïdes dans du paraformoldéhyde à 4 % pendant 20 minutes à température ambiante, lavez-les trois fois avec PBS, puis continuez avec un marquage fluorescent avant l’imagerie.
  5. Incubez des cardioïdes fixes intacts toute la nuit à 4 °C, protégés de la lumière, dans des PBS contenant 5 μg/mL d’agglutinine germinale de blé (WGA) conjuguée avec un fluorophore vert et 1 μg/mL de DAPI. Laver trois fois dans PBS et monter avec un support antifondu.
    ATTENTION : Collectez tous les milieux et lavages contenant des oligonucléotides et des colorants fluorescents, y compris le milieu d’incubation oligonucléotidique marqué de l’étape 6.2 et la solution de coloration WGA/DAPI, dans un contenant séparé et jetez-les comme déchets chimiques/biohazardés conformément aux directives institutionnelles.
  6. Acquérir des images confocales de l’absorption et de la distribution des oligonucléotides.
    1. Acquérir des images confocales à l’aide d’un microscope confocal à balayage laser équipé d’un détecteur à matrice pour une imagerie à super-résolution et d’un objectif d’immersion dans l’eau de 40×. Acquérir les images sous forme de piles z à 8 sections avec une taille de pas z de 2 μm, couvrant une profondeur totale de 16 μm.
    2. Excitez la coloration nucléaire, le marqueur membranaire et l’oligonucléotide marqué fluorescentement rouge lointain à l’aide de lignes laser de 405 nm, 488 nm et 639 nm à 0,9 %, 0,2 % et 3,0 % de transmission laser, respectivement.
    3. Acquérir des images avec une taille voxel de 0,0449 × 0,0449 × 2μm 3, balayage bidirectionnel, vitesse de balayage 5, moyenne de ligne 1, et temps de permanence de 1,51 μs par pixel. Appliquez Airyscan/traitement d’image super-résolution en utilisant un filtrage automatique de Wiener.
    4. Gardez tous les réglages d’acquisition (puissance laser, gain du détecteur, pas z et taille du voxel) constants sur toutes les positions z et sur tous les échantillons afin de permettre une comparaison valide du signal oligonucléotidique entre les conditions.

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Résultats

La Figure 1 résume le flux de travail de différenciation et illustre les changements morphologiques caractéristiques attendus à chaque étape du protocole, de l’agrégation des iPSC à la formation de cardioïdes auto-organisés. L’agrégation de micropuits basée sur la suspension offre une approche simple et standardisée pour la génération parallèle d’un grand nombre de cardioïdes contrôlés par la taille. La différenciation réussie se caractérise par la génératio...

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Discussion

Les thérapeutiques à base d’oligonucléotides sont apparues comme une puissante catégorie de modalités de ciblage génétique, soutenues par des décennies d’avancées en chimie des oligonucléotides qui ont amélioré la spécificité de la cible, la stabilité métabolique et la tolérabilitéimmunogénique 7,8. Malgré le nombre croissant de traitements à ARN cliniquement approuvés, leur application plus large reste limitée par une livraison ...

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Déclarations de divulgation

Les auteurs ne déclarent aucun intérêt concurrent.

Remerciements

Nous remercions les membres du Novo Nordisk Foundation Challenge Center for Optimized Oligo Escape, en particulier Knud Jensen pour la conception et la synthèse des oligonucléotides, ainsi que Nikos S. Hatzakis et Tomas Kirchhausen pour leurs précieuses orientations en imagerie quantitative et analyse du trafic intracellulaire. Ce travail a été financé par le Novo Nordisk Foundation Challenge Center for Optimized Oligo Escape (NNF23OC0081287). M.F. a reçu une bourse de la Fundação para a Ciência e a Tecnologia (FCT), Portugal (2020.04836.BD). Nous remercions le GIMM Bioimaging et les plateformes d’histopathologie GIMM (Lisboa, Portugal) pour leur assistance technique.

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
4', 6-diamidino-2'-phenylindole, dihydrochlorideThermo Scientific62248DAPI
10× dry objectiveZeissEC Plan-Neofluar 10×/0.30
40× water objectiveZeissLD C-Apochromat 40×/1.10 Corr
63× oil-immersion objectiveZeissPlan-Apochromat 63×/1.40 Oil DIC M27 
800-µm microwell aggregation plateSTEMCELL Technologies34815AggreWell 800
Andor Neo 5.5 sCMOS camera AndorAndor Neo 5.5 
Antifade mounting mediumVector LaboratoriesH-1000-10VECTASHIELD Antifade Mounting Medium
B27 supplement minus insulin, 50×GibcoA18956-01B27 Minus Insulin 50×
B27 supplement with insulin, 50×Gibco17504-044B27 Supplement 50×
Basal MediumGibco21875-034RPMI 1640
Basement-membrane matrixGibco / CorningA14132-02 / 354230Geltrex LDEV-Free / Matrigel LDEV-Free
brightfield microscope EVOSEVOS XL Core Imaging Microscope
Cell detachment solutionSTEMCELL Technologies07922ACCUTASE
confocal microscopeZEISSZEISS LSM 980 with Airyscan 2 Microscope
Defined feeder-free iPSC maintenance mediumSTEMCELL Technologies100-0276mTeSR Plus
DMEM/F12Gibco31331-028DMEM/F12
Non-treated 6-well plateAvantor (VWR)734-2777Untreated 6-well Plate
PhalloidinThermo ScientificA22287Phalloidin Labeling Probes ALexa 647
Phosphate-buffered saline (1× PBS)Gibco14190-144DPBS 1×
primary antibody c-MYBPC3Santa Cruzsc-137181MYBPC3 Antibody (F-1)
ROCK inhibitorSTEMCELL Technologies72304ROCK Inhibitor (Y-27632)
Secondary antibody (green)Thermo ScientificA-11017F(ab')2-Goat anti-Mouse IgG (H+L) Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 488
Washing medium supplementGibco10828028KnockOut Serum Replacement
WGA, Alexa Fluor™ 488 conjugateInvitrogen W11261WGA
widefield microscopeNikonNikon Eclipse Ti 
WNT pathway inhibitorSTEMCELL Technologies72552IWP4
Wnt/β-catenin pathway activatorSigmaSML1046CHIR99021

Références

  1. Kulkarni JA, Witzigmann D, Thomson SB, Chen S, Leavitt BR, Cullis PR, et al. The current landscape of nucleic acid therapeutics. Nat Nanotechnol. 2021;16(6):630-43.
  2. Lauffer MC, van Roon-Mom W, Aartsma-Rus A, Collaborative N. Possibilities and limitations of antisense oligonucleotide therapies for the treatment of monogenic disorders. Commun Med (Lond). 2024;4(1):6.
  3. Lee HG, Kim J, Jang CY, Shin M. Antisense Oligonucleotide Therapeutics Targeting Age-Related Diseases. BioDrugs. 2026;40(2):237-61.
  4. Roberts TC, Langer R, Wood MJA. Advances in oligonucleotide drug delivery. Nat Rev Drug Discov. 2020;19(10):673-94.
  5. Corey DR, Damha MJ, Manoharan M. Challenges and Opportunities for Nucleic Acid Therapeutics. Nucleic Acid Ther. 2022;32(1):8-13.
  6. Gotthardt M, Badillo-Lisakowski V, Parikh VN, Ashley E, Furtado M, Carmo-Fonseca M, et al. Cardiac splicing as a diagnostic and therapeutic target. Nat Rev Cardiol. 2023;20(8):517-30.
  7. Liu M, Wang Y, Zhang Y, Hu D, Tang L, Zhou B, et al. Landscape of small nucleic acid therapeutics: moving from the bench to the clinic as next-generation medicines. Signal Transduct Target Ther. 2025;10(1):73.
  8. Sun X, Setrerrahmane S, Li C, Hu J, Xu H. Nucleic acid drugs: recent progress and future perspectives. Signal Transduct Target Ther. 2024;9(1):316.
  9. Dowdy SF, Setten RL, Cui XS, Jadhav SG. Delivery of RNA Therapeutics: The Great Endosomal Escape! Nucleic Acid Ther. 2022;32(5):361-8.
  10. Patra C, Hussein Z, Ace VD, Misnik EV, Rybalko DS, Salimova AA, et al. The efficacy of oligonucleotide-based gene therapeutics in gene silencing. Theranostics. 2026;16(2):599-616.
  11. Lyra-Leite DM, Gutierrez-Gutierrez O, Wang M, Zhou Y, Cyganek L, Burridge PW. A review of protocols for human iPSC culture, cardiac differentiation, subtype-specification, maturation, and direct reprogramming. STAR Protoc. 2022;3(3):101560.
  12. Karbassi E, Fenix A, Marchiano S, Muraoka N, Nakamura K, Yang X, et al. Cardiomyocyte maturation: advances in knowledge and implications for regenerative medicine. Nat Rev Cardiol. 2020;17(6):341-59.
  13. Kim YH, Son YH, Choi Y, Kim MS, Park SJ, Lee KY. Advanced in vitro cardiac models for drug evaluation: integration of organoids, engineered tissues, and microphysiological systems. Microsyst Nanoeng. 2026;12(1).
  14. Mendjan S, Deyett A, Yelon D. Coordination of cardiogenesis in vivo and in vitro. Nat Rev Mol Cell Biol. 2026;27(1):19-34.
  15. Lewis-Israeli YR, Wasserman AH, Gabalski MA, Volmert BD, Ming Y, Ball KA, et al. Self-assembling human heart organoids for the modeling of cardiac development and congenital heart disease. Nat Commun. 2021;12(1):5142.
  16. Hofbauer P, Jahnel SM, Papai N, Giesshammer M, Deyett A, Schmidt C, et al. Cardioids reveal self-organizing principles of human cardiogenesis. Cell. 2021;184(12):3299-317 e22.
  17. Silva AC, Matthys OB, Joy DA, Kauss MA, Natarajan V, Lai MH, et al. Co-emergence of cardiac and gut tissues promotes cardiomyocyte maturation within human iPSC-derived organoids. Cell Stem Cell. 2021;28(12):2137-52 e6.
  18. Drakhlis L, Biswanath S, Farr CM, Lupanow V, Teske J, Ritzenhoff K, et al. Human heart-forming organoids recapitulate early heart and foregut development. Nat Biotechnol. 2021;39(6):737-46.
  19. Prondzynski M, Berkson P, Trembley MA, Tharani Y, Shani K, Bortolin RH, et al. Efficient and reproducible generation of human iPSC-derived cardiomyocytes and cardiac organoids in stirred suspension systems. Nat Commun. 2024;15(1):5929.
  20. Buntz A, Killian T, Schmid D, Seul H, Brinkmann U, Ravn J, et al. Quantitative fluorescence imaging determines the absolute number of locked nucleic acid oligonucleotides needed for suppression of target gene expression. Nucleic Acids Res. 2019;47(2):953-69.
  21. Branco MA, Cotovio JP, Rodrigues CAV, Vaz SH, Fernandes TG, Moreira LM, et al. Transcriptomic analysis of 3D Cardiac Differentiation of Human Induced Pluripotent Stem Cells Reveals Faster Cardiomyocyte Maturation Compared to 2D Culture. Sci Rep. 2019;9(1):9229.
  22. Grimm JB, English BP, Chen J, Slaughter JP, Zhang Z, Revyakin A, et al. A general method to improve fluorophores for live-cell and single-molecule microscopy. Nat Methods. 2015;12(3):244-50, 3 p following 50.
  23. Lavaee A, Jain A, Scanavachi G, Costa-Filho JI, Ingemansson A, Kirchhausen T. SpatialDINO: A Self-Supervised 3D Vision Transformer that enables Segmentation and Tracking in Crowded Cellular Environments. bioRxiv. 2026.

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