Cardioïdes d’origine pluripotente des cellules souches induits par l’humain comme modèle pour évaluer la délivrance d’oligonucléotides

Résumé

Ce protocole permet la génération de cardioïdes auto-organisés à partir de cellules souches pluripotentes induites par l’humain pour une évaluation microscopique de l’absorption des oligonucléotides marqués par fluorescence.

Résumé

Les traitements à base d’oligonucléotides représentent une classe de médicaments en pleine évolution avec un potentiel significatif pour traiter les maladies cardiovasculaires ; Cependant, atteindre une livraison efficace du tissu cardiaque reste un défi critique et non résolu. Un obstacle majeur est la disponibilité limitée de modèles humains in vitro robustes et physiologiquement pertinents, capables de soutenir une évaluation quantitative de l’absorption cellulaire des oligonucléotides et de la distribution intracellulaire. Un protocole détaillé, étape par étape, est présenté pour générer des cardioïdes 3D auto-organisés à partir de cellules souches pluripotentes induites par l’humain (iPSC) et les appliquer comme plateforme pour évaluer l’absorption d’oligonucléotides marqués par la fluorescence. Le protocole guide les utilisateurs dans la différenciation cardiaque dirigée en culture en suspension en modulant temporellement la signalisation Wnt/β-caténine, permettant une spécification séquentielle des iPSC via les stades progéniteurs du mésoderme, du mésoderme cardiaque et du cardiomyocyte. Dans ces conditions, les cellules s’auto-assemblent spontanément en structures tridimensionnelles battantes, contenant des cavités, qui expriment des marqueurs cardiomyocytaires canoniques. Les cardioïdes résultants fournissent une plateforme évolutive et expérimentale pour l’évaluation par imagerie de l’efficacité de l’absorption des oligonucléotides, soutenant le développement et l’optimisation de stratégies d’administration pour des applications cardiaques.

Introduction

Les traitements à base d’oligonucléotides, principalement les oligonucléotides antisens (ASO) et les petits ARN interférents (siRNA), émergent rapidement comme une approche transformatrice et très spécifique pour le traitement d’un large éventail de maladies, y compris les affections héréditaires et ^{acquises 1,2,3}. Ces modalités permettent une modulation directe de l’expression génique au niveau de l’ARNm par une liaison spécifique à la séquence aux transcriptes cibles, permettant la correction du silence ou du splicing génique de gènes associés à la maladie, souvent inaccessibles aux thérapies conventionnelles à petites^{molécules 4,5}. Ainsi, les thérapies géniques à base d’oligonucléotides offrent une plateforme polyvalente pour cibler divers mécanismes pathogènes dans de multiples domaines pathologiques, y compris les troubles^{cardiovasculaires 6}. À ce jour, plusieurs traitements à base d’oligonucléotides, incluant les ASO, les siRNA et les agents de commutation de splice, ont été approuvés pour une utilisation^{clinique 7}. Malgré ces progrès, leur efficacité thérapeutique en contexte préclinique et clinique reste limitée par une délivrance intracellulaire^{inefficace 8}. Les estimations actuelles indiquent que moins de 1 % des oligonucléotides intériorisés s’échappent des compartiments endosomaux pour atteindre le cytosol et engager leur ARN cible, limitant ainsi l’activité^{fonctionnelle 9,10}. Cette limitation est particulièrement marquée dans les tissus cardiaques, où l’absorption et le trafic intracellulaire sont mal compris.

Historiquement, l’évaluation préclinique des traitements cardiovasculaires s’est largement appuyée sur des modèles animaux, qui restent indispensables pour évaluer la pharmacocinétique, la biodistribution, l’efficacité et la sécurité in vivo. Cependant, d’importantes différences interespèces dans la physiologie cardiaque, la régulation des gènes et les réponses cellulaires limitent souvent leur capacité à prédire avec précision l’efficacité thérapeutique et la toxicité chez l’humain. Ces limitations ont conduit au développement de modèles in vitro basés sur l’humain, avec une pertinence physiologique accrue. Parmi celles-ci, la technologie des cellules souches pluripotentes induites par l’humain (iPSC) a révolutionné la modélisation des maladies cardiovasculaires en fournissant une source quasiment illimitée de cellules pouvant être différenciées en lignées cardiovasculaires. Les cardiomyocytes humains dérivés de l’iPSC (iPSC-CM) reproduisent de nombreuses propriétés moléculaires, structurelles et fonctionnelles du myocarde humain et sont devenus une plateforme largement adoptée pour étudier les mécanismes de la maladie, les réponses aux médicaments et les modalités thérapeutiques^{émergentes 11}. Cependant, les cultures bidimensionnelles conventionnelles d’iPSC-CM humaines présentent des limites importantes. La plupart des protocoles de différenciation génèrent des cardiomyocytes qui ressemblent à des cellules fœtales plutôt qu’à des cellules adultes, présentant des propriétés structurales, électrophysiologiques, métaboliques et contractiles^{immatures 12}.

De plus, les cultures monocouches manquent de l’architecture tissulaire tridimensionnelle (3D), des interactions multicellulaires et de la composition de la matrice extracellulaire qui influencent la fonction cardiomyocytaire in vivo. Pour relever ces défis, des modèles cardiaques 3D de plus en plus sophistiqués ont été^{développés 13}. Parmi ceux-ci, les tissus cardiaques modifiés (EHT), générés par l’intégration des iPSC-CM dans des échafaudages biomatériels et l’application d’une stimulation mécanique et électrique, favorisent la maturation structurelle et fonctionnelle tout en reproduisant plus fidèlement l’environnement biomécanique du myocarde^{natif 13}. Bien que les EHT fournissent des plateformes hautement pertinentes sur le plan physiologique pour la modélisation des maladies et les tests de médicaments, leur génération nécessite généralement une expertise spécialisée en bio-ingénierie et des équipements dédiés. À l’autre extrémité du spectre, les tranches de tissu cardiaque ex vivo préservent le plus fidèlement l’architecture et la composition cellulaire des tissus natifs mais dépendent de l’accès au tissu cardiaque primaire, ont une viabilité limitée en culture et ne sont pas facilement scalables.

Plus récemment, les organoïdes cardiaques sont apparus comme des systèmes modèles 3D accessibles qui reprennent des aspects clés de l’organisation et de la fonction des tissus^{cardiaques 14}. Les cardioïdes sont des organoïdes cardiaques auto-assemblants composés principalement de cardiomyocytes qui subissent une spécification intrinsèque, un motif spatial et une morphogenèse pour former des structures en forme de chambre contenant^{des cavités 15,16}. Les méthodes de formation des cardioïdes reposent généralement sur une activation initiale de la signalisation Wnt pour induire la spécification du mésoderme, suivie d’une inhibition ultérieure pour favoriser l’engagement de la lignée cardiaque. Les cardioïdes peuvent être générés en cultures statiques ou en suspension agitées, ce qui soutient une production évolutive et améliore l’auto-organisation^tissulaire 15,16,17,18,19. Des organoïdes cardiaques plus complexes et multi-lignées incorporant des types cellulaires endothéliaux, épicardiques ou autres augmentent encore leur pertinence physiologique mais nécessitent des protocoles de différenciation plus élaborés, des périodes de culture plus longues et une optimisation^{étendue 13,14}.

Un protocole simple, reproductible et efficace est présenté pour générer des cardioïdes auto-organisés à partir de cardiomyocytes à partir d’iPSC humains et leur application pour évaluer l’absorption des oligonucléotides marqués par fluorescence. Le protocole devrait s’avérer précieux pour les chercheurs cherchant à optimiser la chimie des oligonucléotides et les stratégies d’administration pour des applications cardiovasculaires. Tous les matériaux utilisés dans cette étude sont listés dans le tableau des matériaux.

Protocole

1. Culture et préparation des iPSC pour la différenciation

ATTENTION : Effectuer toute manipulation à l’air libre des cellules et des milieux dans un cabinet de biosécurité certifié Classe II. Portez une blouse de laboratoire et des gants. Décontaminez les surfaces de travail et les déchets liquides avec un désinfectant approprié.

1. Maintenez des iPSC.
   1. Enduit les plaques de culture avec une matrice membranaire basale appropriée selon les instructions du fabricant.
   2. Nourrissez les iPSC avec un milieu pluripotent défini et sans alimentation et remplacez le milieu toutes les 24 heures.
   3. Maintenir les cultures en dessous de la surconfluence et des cellules de passage lorsqu’elles atteignent 70–80 % de confluence.
      REMARQUE : Assurez-vous que les iPSC conservent une morphologie de haute qualité, non différenciée, et sont confirmés exempts de mycoplasme avant d’initier la différenciation.
2. Pré-différenciation du passage.
   1. Décongeler les iPSC et étendre les cellules sur au moins deux passages avant d’initier la différenciation cardiaque.
   2. Les cellules du passage utilisent une méthode de dissociation sans enzymes, PBS-EDTA, compatible avec le maintien de l’iPSC.
      POINT DE PAUSE : Maintenir les iPSC en culture jusqu’à atteindre 70–80 % de confluence et conserver la morphologie typique sans signes de différenciation spontanée.

2. Préparation des agrégats d’iPSC dans les plaques de micropuits

1. Dissociez les iPSC à une suspension monocellulaire.
   1. Aspirez le milieu et lavez les cellules une fois avec 1 mL de 1× PBS.
   2. Ajouter la solution de décollement cellulaire (Accutase) à 500 μL par puits d’une plaque à 6 puits et incuber à 37 °C pendant 5 à 7 minutes.
   3. Ajoutez 1,5 mL de substrat de lavage par puits, puis resuspendez doucement pour obtenir une suspension monocellule.
   4. Transférez la suspension dans un tube conique de 15 mL et centrifugez à 200 × g pendant 3 minutes à température ambiante.
   5. Aspirez le surnageant et resuspendez la pellete cellulaire dans un milieu iPSC sans alimentation, complété par un inhibiteur de ROCK (10 μM finaux).
      REMARQUE : Ajustez le temps d’incubation de dissociation pour chaque ligne iPSC en vérifiant le décollement à 5 minutes et en prolongeant par petits incréments si nécessaire.
2. Comptez les cellules et préparez la densité de placage.
   1. Compter les cellules viables en utilisant une méthode standard de comptage cellulaire.
   2. Préparez une suspension monocellule à 0,9 × 10⁶ cellules/mL pour chaque puits d’une plaque d’agrégation de micropuits de 800 μm (format 24 puits, ~300 micropuits par puits).
      REMARQUE : Optimisez le nombre de cellules par puits, car la taille globale ou l’efficacité de différenciation varient selon les lignes iPSC.
3. Amorce la plaque micropuits et enlève les bulles.
   1. Ajoutez 500 μL de milieu iPSC sans alimentation contenant un inhibiteur de ROCK (10 μM finaux) à chaque puits.
   2. Centrifugez la plaque du micropuits à 300 × g pendant 3 minutes à température ambiante pour éliminer les bulles d’air des micropuits.
      ESSENTIEL : Retirez complètement toutes les bulles afin de permettre un dépôt cellulaire uniforme au fond de chaque micropuits et soutenir une formation efficace des agrégats.
4. Ensemencer des iPSC dans des micropuits.
   1. Ajoutez 1,0 mL de la suspension monocellule préparée (0,9 × 10⁶ cellules/mL) à chaque puits, correspondant à 0,9 × 10⁶ cellules par puits.
   2. Resuspendez doucement dans le puits 3 à 5 fois avec un P1000 et évitez d’introduire des bulles d’air.
   3. Centrifugez la plaque à 200 × g pendant 3 minutes à température ambiante pour les pelleter dans les micropuits.
   4. Vérifiez au microscope que les cellules se sont déposées dans les micropuits avant de placer la plaque à 37 °C avec 5 % de CO₂ pendant 24 heures.
      CRITIQUE : Manipulez la plaque avec précaution après centrifugation. Ne bousculez pas et ne secouez pas la plaque, car cela pourrait faire soulever les cellules hors des micropuits.

3. Expansion des agrégats iPSC dans les micropuits

1. Aspirez soigneusement et remplacez le milieu sans déranger ni déloger les granulats.
   1. Inclinez la plaque et aspirez lentement environ 1,0 mL de milieu de chaque puits à l’aide d’une pipette P1000, afin de garantir que les agrégats restent bien placés dans les micropuits.
   2. Aspirez lentement les ~500 μL restants du milieu à l’aide d’une pipette P1000.
   3. Ajoutez 1,5 mL de milieu iPSC sans alimentation à chaque puits en le distribuant lentement le long du côté du puits à l’aide d’une pipette sérologique.
   4. Incubez à 37 °C, 5 % de CO₂ et répétez le changement de milieu quotidiennement.
      ESSENTIEL : Distribuez le milieu sur la paroi du puits et évitez l’écoulement direct sur les granulats.

4. Différenciation cardiaque des agrégats d’iPSC (jour 0 à jour 12)

1. Induction du mésoderme (jour 0).
   1. Retirez le milieu en utilisant la méthode d’aspiration douce décrite aux étapes 3.1.1–3.1.2.
   2. Ajouter 1,5 mL par puits de milieu basal complété avec 2 % de B27 moins insuline et l’activateur de la voie Wnt/β-caténine (CHIR99021, concentration finale : 11 μM).
      REMARQUE : Préparez une solution de 10 mM de CHIR99021, un inhibiteur de petite molécule de la glycogène synthase kinase-3 (GSK-3). Pour obtenir une concentration finale de 11 μM, ajoutez 1,65 μL de la solution standard à 1,5 mL de milieu.
2. Changement de médium après induction (jour 1).
   1. À 24 heures après l’ajout de CHIR99021, aspirez doucement le milieu de chaque puits.
   2. Ajoutez 1,5 mL par puits de milieu basal frais complété avec 2 % de B27 moins insuline, puis incubez pendant 48 heures.
      CRITIQUE : Respectez strictement le timing des étapes de modulation Wnt, car les écarts peuvent compromettre l’efficacité de la différenciation.
      REMARQUE : Une certaine mort cellulaire est attendue après exposition à l’activateur de la voie Wnt/β-caténine. Si une perte globale d’agrégats est observée, envisagez de réduire la concentration de l’activateur dans de futures expériences.
3. Internement cardiaque via inhibition WNT (jour 3).
   1. Préparez le milieu conditionné en transférant 760 μL de milieu usé de chaque puits vers un tube conique stérile de 50 mL.
   2. Pour chaque puits, ajoutez 760 μL de milieu basal frais complété avec 2 % de B27 moins insuline au tube contenant le milieu conditionné en pool, puis mélangez doucement.
   3. Ajoutez l’inhibiteur de la voie Wnt, IWP4, au milieu mixte jusqu’à une concentration finale de 5 μM, puis inversez doucement le tube plusieurs fois pour mélanger.
   4. Aspirez soigneusement le milieu restant de chaque puits, puis ajoutez 1,5 mL par puits de milieu conditionné complété par IWP4.
   5. Incuber à 37 °C avec 5 % de CO₂ pendant 48 heures.
      REMARQUE : Préparez une solution de 1 mM de l’inhibiteur de la voie Wnt IWP4. Pour obtenir une concentration finale de 5 μM, ajoutez 7,6 μL de la solution d’origine par 1,52 mL de milieu total (760 μL de milieu conditionné + 760 μL de milieu basal frais) pour chaque puits.
4. Changement de milieu dans les micropuits (jour 5).
   1. Remplacer le milieu par l’approche d’aspiration douce décrite aux étapes 3.1.1–3.1.2.
   2. Ajouter 1,5 mL de milieu basal complété à 2 % de B27 moins insuline à chaque puits, puis incuber à 37 °C avec 5 % de CO₂ pendant 48 heures.
5. Transférer les agrégats des micropuits vers les plaques à 6 puits (jour 7).
   1. Aspirez soigneusement le milieu de chaque puits en utilisant la méthode d’aspiration douce décrite aux étapes 3.1.1–3.1.2.
   2. Ajoutez 1,0 mL de milieu basal complété avec 2 % de B27 contenant de l’insuline dans chaque puits de la plaque micropuits. À l’aide d’une pipette P1000, pipetez doucement le milieu de haut en bas cinq fois tout en déplaçant la pointe de la pipette en cercle sur la surface du puits pour déloger les granulats dans les micropuits et les transférer en suspension.
   3. Transférez la suspension d’agrégats dans un puits unique d’une plaque de culture à 6 puits non traitée.
   4. Rincez chaque puits de la plaque de micropuits avec 1,0 mL supplémentaire de milieu frais deux à trois fois pour récupérer les agrégats restants, transférant chaque rinçage dans le même puits de la plaque à 6 puits.
   5. Incubez à 37 °C avec 5 % de CO₂ pendant 72 heures.
      REMARQUE : La présence de cellules mortes et de débris cellulaires après le transfert d’agrégats est attendue. La plupart des débris seront enlevés lors du changement de milieu qui suit.
6. Changement moyen lors de la culture de suspension (jour 10).
   1. Agitez doucement la plaque pour déloger les granulats mal attachés.
   2. Inclinez la plaque pour permettre aux agrégats de se déposer au fond du puits par gravité.
   3. Aspirez soigneusement le milieu usé sans déranger ni aspirer les agrégats.
   4. Ajouter 2,0 mL de milieu basal frais complété à 2 % de B27 d’insuline dans chaque puits et incuber à 37 °C avec 5 % de CO₂ pendant 48 à 72 heures.
      REMARQUE : Des coups spontanés sont généralement observés à partir d’environ le 10e jour.
      POINT DE PAUSE : Les cardioïdes battants peuvent être maintenus en culture en suspension pour une maturation prolongée en remplaçant le milieu tous les 2 à 3 jours.

5. Caractérisation microscopique des cardioïdes

REMARQUE : Cette méthode fournit un flux de travail pour la caractérisation histologique des cardioïdes à l’aide de cryosections. Les sections résultantes peuvent être utilisées pour diverses analyses histologiques, notamment la coloration de l’hématoxyline et de l’éosine (H&E) pour évaluer l’architecture tissulaire globale et le marquage par immunofluorescence pour évaluer l’identité des cardiomyocytes.

1. Fixation et cryosection.
   1. Fixez les cardioïdes dans du paraformaldéhyde à 4 % pendant la nuit à 4 °C.
      ATTENTION : Le paraformaldéhyde est toxique et probablement un cancérogène ; Manipulez-la dans une hotte chimique tout en portant un équipement de protection individuelle approprié. Collectez tous les déchets contenant du paraformoldéhyde (fixatifs et lavages) dans un récipient clairement étiqueté pour les déchets aldéhydes/produits chimiques dangereux, et éliminez-les conformément aux procédures institutionnelles de gestion des déchets dangereux.
      SÉCURITÉ : Effectuez toute la fixation et la manipulation du paraformoldéhyde dans une hotte chimique tout en portant un équipement de protection individuelle approprié.
   2. Laver trois fois avec PBS et cryoprotect les cardioïdes fixes à 30 % (p/v) de saccharose dans PBS pendant la nuit à 4 °C.
   3. Intégrez les cardioïdes dans la gélatine, congelez-les et découpez des cryosections de 10 μm d’épaisseur sur des lames de microscope. Conservez les sections à −20 °C jusqu’à utilisation.
2. Immunomarquage.
   1. Décongelez les sections pendant 15 minutes à température ambiante.
   2. Lavez les sections en PBS à 37 °C pendant 10 minutes, deux fois.
   3. Encerclez la zone d’intérêt sur chaque diapositive avec un stylo hydrophobe pour créer un puits qui retient les solutions de blocage et d’anticorps.
   4. Réhydrater les coupes pendant 2 à 3 minutes dans un tampon de perméabilisation (PB ; PBS contenant 0,1 % Tween-20) dans un pot de Coplin.
   5. Retirez les lames du PB, évacuez l’excès de solution, puis placez les lames dans une chambre humide.
      CRITICAL : À partir de maintenant, il est crucial de ne pas laisser les sections sécher.
   6. Bloquez les sections contenant 200 à 300 μL de PB contenant 5 % de sérum bovin fœtal (FBS) pendant 90 minutes à température ambiante dans une chambre humide.
   7. Retirez la solution bloqueante et incubez les sections toute la nuit à 4 °C avec 100 μL d’anticorps primaire (anti-cMYBP-C ; 1:50) dilué dans une solution bloqueante (PB contenant 1 % de FBS).
   8. Lavez les lames trois fois avec du PB et faites couver pendant 2 h à température ambiante avec un anticorps secondaire anti-souris fluorescent vert (1:200), une phalloïdine fluorescente rouge lointain (1:400) et un DAPI (1 μg/mL).
   9. Laver trois fois dans du PB et monter avec un support antifondu.
      ATTENTION : Collectez toutes les solutions contenant des colorants fluorescents (anticorps secondaires, phalloïde et solutions de coloration DAPI ainsi que les lavages correspondants) dans un récipient et jetez-les comme déchets chimiques conformément aux directives institutionnelles.
3. Acquisition d’images.
   1. Acquérir des images confocales à l’aide d’un microscope confocal à balayage laser équipé d’un détecteur à matrice pour une imagerie à super-résolution utilisant un objectif d’immersion à l’huile de 10×× et 63/1,40.
   2. Excitez le fluorophore rouge lointain, le fluorophore vert et la coloration nucléaire en utilisant des lignes laser de 639 nm, 488 nm et 405 nm à 4,0 %, 4,0 % et 1,0 % de transmission laser respectivement.
   3. Acquérir des sections optiques uniques avec une taille de pixel de 0,0353 × 0,0353^{μm 2}, balayage unidirectionnel, vitesse de balayage 6, zoom 1,7, moyenne de ligne 1, et temps de maintien des pixels de 0,935 μs par pixel.
   4. Appliquer un traitement d’image super-résolution avec détecteur de réseau en utilisant un filtrage automatique de Wiener.

6. Essai d’absorption des oligonucléotides fluorescents

1. Préparez une solution base d’oligonucléotide marqué par fluorescence conjuguée à l’acide palmitique pour augmenter la lipophilicité.
   1. Reconstituer l’oligonucléotide liopiophilisé marqué par fluorescence dans de l’eau sans nucléase à une concentration finale de 1 mM. Vortex brièvement puis centrifugeuse à 3 000 × g pendant 30 secondes pour collecter la solution au fond du tube.
   2. Préparez des aliquotes à usage unique de la solution de 1 mM et stockez à −20 °C à l’abri de la lumière.
   3. Le jour de l’expérience, ajoutez 1 μL du stock de 1 mM à 1 mL de milieu de culture cardioïde pour obtenir une concentration finale d’oligonucléotide de 1 μM. Mélangez par agitation douce de la plaque.
2. Incubez les cardioïdes avec l’oligonucléotide marqué fluorescentement (concentration finale de 1 μM) dans un milieu sans sérum à 37 °C avec 5 % de CO₂ pendant 24 heures.
3. Rincez les cardioïdes trois fois avec du sérum physiologique tamponné phosphate (PBS) pour éliminer les oligonucléotides extracellulaires.
4. Fixez les cardioïdes dans du paraformoldéhyde à 4 % pendant 20 minutes à température ambiante, lavez-les trois fois avec PBS, puis continuez avec un marquage fluorescent avant l’imagerie.
5. Incubez des cardioïdes fixes intacts toute la nuit à 4 °C, protégés de la lumière, dans des PBS contenant 5 μg/mL d’agglutinine germinale de blé (WGA) conjuguée avec un fluorophore vert et 1 μg/mL de DAPI. Laver trois fois dans PBS et monter avec un support antifondu.
   ATTENTION : Collectez tous les milieux et lavages contenant des oligonucléotides et des colorants fluorescents, y compris le milieu d’incubation oligonucléotidique marqué de l’étape 6.2 et la solution de coloration WGA/DAPI, dans un contenant séparé et jetez-les comme déchets chimiques/biohazardés conformément aux directives institutionnelles.
6. Acquérir des images confocales de l’absorption et de la distribution des oligonucléotides.
   1. Acquérir des images confocales à l’aide d’un microscope confocal à balayage laser équipé d’un détecteur à matrice pour une imagerie à super-résolution et d’un objectif d’immersion dans l’eau de 40×. Acquérir les images sous forme de piles z à 8 sections avec une taille de pas z de 2 μm, couvrant une profondeur totale de 16 μm.
   2. Excitez la coloration nucléaire, le marqueur membranaire et l’oligonucléotide marqué fluorescentement rouge lointain à l’aide de lignes laser de 405 nm, 488 nm et 639 nm à 0,9 %, 0,2 % et 3,0 % de transmission laser, respectivement.
   3. Acquérir des images avec une taille voxel de 0,0449 × 0,0449 × 2^{μm 3}, balayage bidirectionnel, vitesse de balayage 5, moyenne de ligne 1, et temps de permanence de 1,51 μs par pixel. Appliquez Airyscan/traitement d’image super-résolution en utilisant un filtrage automatique de Wiener.
   4. Gardez tous les réglages d’acquisition (puissance laser, gain du détecteur, pas z et taille du voxel) constants sur toutes les positions z et sur tous les échantillons afin de permettre une comparaison valide du signal oligonucléotidique entre les conditions.

Résultats

La Figure 1 résume le flux de travail de différenciation et illustre les changements morphologiques caractéristiques attendus à chaque étape du protocole, de l’agrégation des iPSC à la formation de cardioïdes auto-organisés. L’agrégation de micropuits basée sur la suspension offre une approche simple et standardisée pour la génération parallèle d’un grand nombre de cardioïdes contrôlés par la taille. La différenciation réussie se caractérise par la génération d’agrégats de taille uniforme, suivie du développement de cavités internes et de l’apparition de battements spontanés, généralement à partir du jour 10 environ. Ensemble, ces caractéristiques morphologiques fournissent des points de contrôle qualité pratiques pour évaluer l’efficacité et la reproductibilité de la génération de cardioïdes.

L’architecture cardioïde et l’organisation tissulaire peuvent être évaluées par analyse histologique des cryosections. Comme montré à la Figure 2, la coloration à l’hématoxyline et à l’éosine (H&E) de cardioïdes différenciés avec succès révèle des tissus tridimensionnels bien organisés contenant une ou plusieurs cavités internes entourées de couches cellulaires compactes, cohérentes avec une organisation en chambre. Les cardioïdes réussis ne présentent généralement pas de régions nécrotiques et une fragmentation structurelle minimale. En revanche, des différenciations sous-optimales produisent fréquemment des structures irrégulières ou effondrées dépourvues de cavités discernables, ce qui indique une altération de l’auto-organisation tissulaire.

La différenciation des cardiomyocytes peut être évaluée davantage par coloration par immunofluorescence des cryosections. Comme illustré dans la figure 3A–B, les cardioïdes réussis présentent une expression généralisée du marqueur sarcomérique cMYBP-C, organisé en stries périodiques très ordonnées caractéristiques des sarcomères. Ces structures striées sont largement réparties dans tout le tissu et sont souvent alignées le long de l’axe longitudinal des cardiomyocytes, reflétant une différenciation cardiaque efficace. En revanche, les cardioïdes sous-optimaux présentent une coloration sarcomérique faible, fragmentaire ou régionalement restreinte, souvent confinée aux régions périphériques, avec de vastes zones dépourvues de signal détectable, indiquant une différenciation inefficace des cardiomyocytes.

L’absorption des oligonucléotides marqués par fluorescence peut être évaluée soit par imagerie de cellules vivantes, soit par microscopie confocale de cardioïdes fixes. Comme montré à la Figure 4, l’absorption réussie se caractérise par une fluorescence intracellulaire facilement détectable associée aux oligonucléotides, distribuée sous forme de points discrets, compatibles avec une localisation endosomiale. La WGA délimite les membranes cellulaires et la DAPI contre-colorant les noyaux, permettant la confirmation de la localisation intracellulaire des oligonucléotides. En plus de fournir une visualisation qualitative de l’absorption des oligonucléotides, les piles d’images acquises peuvent être utilisées pour des analyses quantitatives, notamment l’intensité de fluorescence par punctum, le nombre de puncta par cellule et le pourcentage de cellules positives aux oligonucléotides. Comme montré à la figure 5A–C, l’imagerie par pile en Z permet d’évaluer davantage la distribution des oligonucléotidiques dans le tissu tridimensionnel, la fluorescence étant détectée sur plusieurs sections optiques s’étendant de la surface jusqu’à l’intérieur du cardioïde, indiquant une pénétration efficace des tissus.

Figure 1 : Flux de travail pour la génération de cardioïdes dérivés de l’iPSC humain. Les cellules souches pluripotentes induites par l’humain (iPSC) sont agrégées dans des microplaques de puits (Day−2) et soumises à une différenciation cardiaque dirigée par modulation temporelle de la signalisation Wnt. L’induction du mésoderme est initiée au jour 0 par traitement avec l’activateur de la voie Wnt CHIR99021 dans un milieu basal complété en B27 moins insuline, suivi du retrait de l’activateur au jour 1. La spécification cardiaque est induite au jour 3 par traitement avec l’inhibiteur de la voie Wnt IWP4, qui est retiré au jour 5. Au jour 7, les granulats sont transférés sur des plaques à 6 puits et maintenus dans un milieu basal complété par de l’insuline contenant de la B27. Au jour 14, les cardioïdes auto-organisés sont établis et adaptés aux applications en aval, y compris les tests d’absorption des oligonucléotides. Cette image a été créée par les auteurs à l’aide de Biorender, et la licence de copyright requise est attachée. Des images représentatives en champ clair acquises aux points temporels indiqués illustrent la progression morphologique attendue des agrégats iPSC de taille uniforme vers des cardioïdes cavités et auto-organisés. Barre d’échelle = 500 μm. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 2 : Caractérisation histologique des cardioïdes humains dérivés de l’iPSC. Cryosections représentatives colorées à l’hématoxyline et à l’éosine (H&E) des cardioïdes du jour 14 montrant des cavités internes entourées de couches cellulaires compactes, cohérentes avec une organisation tissulaire en forme de chambre. Les images ont été prises à l’aide d’un microscope d’imagerie. La quantification des résultats de différenciation a montré que 94,0 ± 2,6 % des cardioïdes présentaient des battements spontanés et 60,3 ± 20,6 % présentaient une ou plusieurs cavités internes visibles. Les données sont présentées en moyenne ± SD issues de trois différenciations indépendantes, avec environ 115 cardioïdes analysés par différentiation. Barre-échelle = 100 μm. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 3 : Caractérisation par immunofluorescence de la différenciation des cardiomyocytes. Cryosections représentatives des cardioïdes du jour 14. (A) La coloration DAPI montrant la distribution des noyaux cellulaires. (B) Image d’immunofluorescence montrant des noyaux marqués avec DAPI (bleu) et des sarcomères marqués avec un anticorps contre la protéine de liaison à la myosine cardiaque C (cMYBP-C, vert), démontrant des structures sarcomériques organisées dans des cardiomyocytes différenciés. Les images ont été obtenues par microscopie à fluorescence confocale à balayage laser à l’aide d’un objectif sec 10×/0,30 (gauche) et d’un objectif d’immersion à l’huile 63×/1,40 (à droite). Barres d’échelle = 10 μm. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 4 : Imagerie de l’absorption des oligonucléotides par les cardioïdes. Images confocales montrant la localisation intracellulaire des oligonucléotides antisens marqués fluorescentement (ASO, jaune) chez les cardioïdes du jour 14. Les membranes cellulaires sont marquées avec des agglutinines fluorescentes du germe de blé (WGA, magenta), et les noyaux sont colorés avec du DAPI (bleu). La fluorescence associée à l’ASO est détectée par des points intracellulaires discrets (flèches). Les panneaux inférieurs montrent des cardioïdes témoins négatifs qui n’ont pas été incubés avec des ASO fluorescents. Les images dans les panneaux de droite correspondent à des vues à plus grand grossissement des régions encapsulées dans les panneaux de gauche. Des images représentatives ont été obtenues par microscopie confocale à balayage laser avec imagerie à super-résolution par détecteur de réseau utilisant un objectif d’immersion dans l’eau de 40×. Barres d’échelle = 10 μm (gauche) et 5 μm (droite). Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figurine.

Figure 5 : Évaluation de la pénétration des oligonucléotides à travers les cardioïdes. (A) Schéma illustrant l’acquisition de sections optiques à des profondeurs croissantes au sein du cardioïde. Cette image a été créée par les auteurs à l’aide de Biorender, et la licence de copyright requise est attachée. (B) Images confocales représentatives montrant la distribution des ASO marqués fluorescentement aux positions z de 0 μm, 6 μm et 10 μm par rapport à la surface tissulaire. Les réglages d’imagerie étaient maintenus constants sur toutes les positions z. Barre d’échelle = 10 μm. (C) La quantification du pourcentage de cellules contenant au moins un signal poncté associé à l’ASO à chaque profondeur d’imagerie a montré une captation comparable des oligonucléotides dans tout le tissu, avec 83,1 ± 2,5 %, 84,9 ± 4,5 %, et 84,0 ± 4,5 % de cellules ASO positives à 0 μm, 6 μm et 10 μm respectivement. Les données sont présentées en moyenne ± de la DS provenant de trois cardioïdes, avec trois coupes optiques analysées par cardioïde et un total de 1 305 cellules quantifiées. Des images représentatives ont été obtenues par microscopie confocale à balayage laser avec imagerie à super-résolution par détecteur de réseau utilisant un objectif d’immersion dans l’eau de 40×. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figurine.

Vidéo 1 : Séquence en accéléré. Une vidéo acquise à 40 images par seconde montre une activité contractile spontanée chez les cardioïdes. L’imagerie était réalisée à l’aide d’un microscope grand champ équipé d’une caméra sCMOS. Veuillez cliquer ici pour télécharger cette vidéo.

Discussion

Les thérapeutiques à base d’oligonucléotides sont apparues comme une puissante catégorie de modalités de ciblage génétique, soutenues par des décennies d’avancées en chimie des oligonucléotides qui ont amélioré la spécificité de la cible, la stabilité métabolique et la tolérabilité^{immunogénique 7,8}. Malgré le nombre croissant de traitements à ARN cliniquement approuvés, leur application plus large reste limitée par une livraison intracellulaire^{inefficace 7,8}. En raison de leur taille, charge et hydrophilicité, les oligonucléotides ne peuvent pas diffuser passivement à travers la membrane plasmique et sont internalisés via des voies endocytaires ^9,10. Après l’absorption, la grande majorité (~99 %) des oligonucléotides internisés restent enfermés dans les compartiments endosomaux ^9,10. Le trafic endosomal se déroule par un processus de maturation allant des endosomes précoces aux endosomes tardifs et finalement des lysosomes ; Cependant, les compartiments précis d’où les oligonucléotides s’échappent vers le cytosol restent incomplètement compris et peuvent impliquer plusieurs populations endosomiques⁹. Cette libération cytosolique limitée représente une barrière limitante de vitesse critique et souligne la nécessité de systèmes expérimentaux physiologiquement pertinents permettant une évaluation quantitative de l’absorption des oligonucléotidiques, du trafic intracellulaire et de l’échappement^{endosomal 20}.

Le protocole décrit ici a été développé pour répondre à ce besoin en combinant des cardioïdes dérivés de l’iPSC humain avec des relevés par imagerie de l’absorption des oligonucléotides. La robustesse de ce système repose sur plusieurs étapes critiques qui influencent directement la reproductibilité et les résultats expérimentaux. Premièrement, la qualité des cultures d’iPSC initiales est un facteur clé pour la réussite de la différenciation cardiaque. Les auteurs recommandent une analyse périodique des caryotypes afin d’assurer une stabilité génomique à long terme et une évaluation de routine de la morphologie, de l’intégrité et de la dynamique de croissance des colonies. Les cultures de haute qualité se caractérisent par des colonies compactes et bien définies avec des bordures lisses, une différenciation spontanée minimale et une prolifération constante. Les cultures présentant des bords de colonie irréguliers, une morphologie cellulaire hétérogène ou des zones de différenciation doivent être écartées et remplacées par des stocks gelés à faible passage avant d’initier la différenciation.

Une deuxième étape critique est la formation contrôlée d’agrégats iPSC à l’aide de plaques micropuits, ce qui favorise la génération de structures tridimensionnelles uniformes, définies par taille, essentielles à la différenciation cardiaque^{reproductible 21}. L’agrégation basée sur les micropuits génère des corps embryoïdes avec des diamètres définis (optimalement 200–230 μm), standardisant ainsi les interactions cellule-cellule et l’exposition aux gradients de morphogènes lors de la modulation temporelle de la signalisation Wnt. D’après notre expérience, cette taille est systématiquement atteinte en ensemençant environ 3 000 cellules par micropuits individuel (Étape 2.2), une condition qui a été optimisée empiriquement et validée sur plusieurs lignes iPSC humaines, y compris des lignes disponibles dans le commerce et des lignes reprogrammées en interne. Cependant, comme les taux de prolifération des iPSC peuvent varier, la densité optimale d’ensemencement peut nécessiter un ajustement pour maintenir la taille d’agrégat souhaitée. Le manque de contrôle de ces paramètres peut entraîner des structures hétérogènes, une viabilité réduite et une efficacité de différenciation altérée.

L’analyse histologique, comme illustrée à la Figure 2, offre une évaluation pratique du contrôle qualité de la formation cardioïde. En particulier, l’absence de cavités internes ou la présence de structures effondrées ou fragmentées peut indiquer une formation sous-optimale des agrégats ou un contrôle temporel insuffisant de la signalisation Wnt lors des étapes de différenciation (étapes 4.1–4.3). Dans certaines différenciations infructueuses, des populations cellulaires non contractiles apparaissent à l’intérieur ou autour des cardioïdes. Ces cellules apparaissent généralement jaunâtres à la microscopie en champ clair et ont tendance à s’attacher à des plaques de culture à faible attachement, tandis que les cardioïdes riches en cardiomyocytes sont généralement gris, restent des structures compactes en trois dimensions et ne s’attachent pas facilement. Si une proportion substantielle des agrégats présente ce phénotype adhésif et non contractile, la différenciation doit être considérée comme sous-optimale. Dans ce cas, le dépannage doit commencer par examiner la morphologie de la colonie iPSC avant la différenciation, en confirmant la taille de l’agrégat entre le jour −1 et le jour 0, et, si nécessaire, en réoptimisant la densité de semis et les concentrations de CHIR99021 et IWP4 pour la lignée spécifique de l’iPSC.

Un battement spontané faible ou absent entre les jours 10 et 12 reflète généralement une induction inefficace du mésoderme ou une spécification cardiaque, le plus souvent en raison d’une concentration ou d’un timing inappropriés du modulateur Wnt, ou d’une mort cellulaire excessive après CHIR99021 traitement (Étape 4.2). D’après notre expérience, la titrage CHIR99021 dans une plage de 9 à 13 μM pour chaque ligne iPSC et la vérification de la concentration et de l’activité des solutions stock peuvent considérablement améliorer l’efficacité de la différenciation. L’analyse par immunofluorescence de l’organisation des protéines sarcomériques, comme illustré à la Figure 3, offre une évaluation pratique du contrôle qualité de la différenciation des cardiomyocytes. Une coloration faible ou fragmentaire des protéines sarcomériques, en particulier lorsqu’elle est restreinte aux régions périphériques du cardioïde, indique généralement une différenciation cardiomyocytaire incomplète ou hétérogène. Dans ces cas, il est recommandé de prolonger la période de maturation en suspension-culture (étape 4.6 et point de pause) avant fixation et de vérifier les conditions de fixation et de coloration par anticorps.

Bien que ce modèle cardioïde offre un microenvironnement cardiaque humain tridimensionnel qui améliore substantiellement les cultures cardiomyocytaires bidimensionnelles conventionnelles, il ne reproduit pas pleinement la complexité du cœur humain adulte. Les cardioïdes représentent un stade précoce du développement cardiaque humain, les cardiomyocytes conservant un phénotype¹⁴ immature, semblable à un fœtal. De plus, les tissus manquent de perfusion vasculaire, d’innervation, de cellules immunitaires résidentes et de l’architecture spécifique à la chambre complète du myocarde mature. Par conséquent, bien que cette plateforme soit bien adaptée à l’étude de l’absorption cellulaire et de la distribution intracellulaire des oligonucléotides dans des conditions expérimentales contrôlées, il convient de faire preuve de prudence lors de l’extrapolation de la cinétique d’absorption et des mécanismes de délivrance directement vers le contexte in vivo . L’intégration future de nouveaux types cellulaires cardiaques, de réseaux vasculaires et de stratégies de maturation tissulaire devrait renforcer la pertinence physiologique de cette plateforme.

L’évaluation fiable de l’absorption des oligonucléotides par les cardioïdes décrits dans ce protocole nécessite une optimisation et une standardisation de la concentration d’ASO, du temps d’incubation et des paramètres d’acquisition d’imagerie, comme illustré aux figures 4 et 5. Le choix du fluorophore est particulièrement important, car les colorants diffèrent en luminosité, photostabilité et sensibilité aux effets environnementaux. Dans cette étude, nous avons utilisé Janelia Fluor 646 (JF646)²², un fluorophore de silicium-rhodamine rouge lointain, doté d’une grande luminosité et photostabilité, qui offre une détection robuste du signal tout en minimisant l’autofluorescence tissulaire dans les échantillons tridimensionnels. Ces propriétés le rendent particulièrement adapté à l’imagerie de l’absorption des oligonucléotides dans des cardioïdes vivants ou fixes. Notamment, la conjugaison des fluorophores peut influencer le comportement des oligonucléotidiques, y compris l’absorption et le trafic, et doit donc être validée pour chaque système expérimental.

Dans sa forme actuelle, ce protocole fournit à la fois une évaluation qualitative et quantitative de l’absorption des oligonucléotides. L’imagerie confocale des points intracellulaires associés à l’ASO permet de visualiser la localisation des oligonucléotides dans les cardioïdes, tandis que l’efficacité d’absorption est quantifiée en déterminant manuellement le pourcentage de cellules ASO positives à l’aide du plugin Cell Counter in Fiji/ImageJ. Bien que cette approche soit bien adaptée aux analyses à débit modéré présentées ici, l’analyse manuelle d’images est laborieuse et peut être sujette à un biais de l’observateur, en particulier lorsqu’elle est appliquée à de grands ensembles de données. Les avancées récentes en apprentissage profond auto-supervisé pour la microscopie tridimensionnelle offrent des opportunités prometteuses pour surmonter ces limites. L’analyse d’images basée sur l’IA peut segmenter, identifier et suivre avec précision des structures subcellulaires hétérogènes dans des environnements complexes tridimensionnels, permettant la quantification automatisée de l’absorption des oligonucléotides et du trafic intracellulaire, y compris la dynamique endosomale²³. L’intégration de ces approches dans les futures implémentations du protocole devrait améliorer le débit, la reproductibilité et la précision analytique.

En regardant vers l’avenir, l’intégration des cardioïdes dérivés de l’iPSC humain avec l’imagerie quantitative, l’analyse d’images basée sur l’apprentissage automatique et les méthodologies à particule unique offre un cadre puissant pour étudier les mécanismes qui régissent l’administration des oligonucléotides dans le tissu cardiaque humain. La combinaison de modèles cardiaques tridimensionnels physiologiquement pertinents avec des outils analytiques avancés capables de résoudre l’organisation et la dynamique subcellulaires permettra une caractérisation quantitative complète de l’absorption des oligonucléotides, du trafic intracellulaire et, avec des tests complémentaires appropriés, de l’évasion endosomal. Ces approches intégrées devraient faciliter l’identification systématique des facteurs déterminant l’efficacité de la délivrance, soutenir l’optimisation rationnelle des chimies et véhicules de délivrance des oligonucléotides, et fournir une plateforme évolutive pour évaluer les thérapies émergentes aux oligonucléotidiques dans le contexte des maladies cardiovasculaires.

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
4', 6-diamidino-2'-phenylindole, dihydrochloride	Thermo Scientific	62248	DAPI
10× dry objective	Zeiss		EC Plan-Neofluar 10×/0.30
40× water objective	Zeiss		LD C-Apochromat 40×/1.10 Corr
63× oil-immersion objective	Zeiss		Plan-Apochromat 63×/1.40 Oil DIC M27
800-µm microwell aggregation plate	STEMCELL Technologies	34815	AggreWell 800
Andor Neo 5.5 sCMOS camera	Andor		Andor Neo 5.5
Antifade mounting medium	Vector Laboratories	H-1000-10	VECTASHIELD Antifade Mounting Medium
B27 supplement minus insulin, 50×	Gibco	A18956-01	B27 Minus Insulin 50×
B27 supplement with insulin, 50×	Gibco	17504-044	B27 Supplement 50×
Basal Medium	Gibco	21875-034	RPMI 1640
Basement-membrane matrix	Gibco / Corning	A14132-02 / 354230	Geltrex LDEV-Free / Matrigel LDEV-Free
brightfield microscope	EVOS		EVOS XL Core Imaging Microscope
Cell detachment solution	STEMCELL Technologies	07922	ACCUTASE
confocal microscope	ZEISS		ZEISS LSM 980 with Airyscan 2 Microscope
Defined feeder-free iPSC maintenance medium	STEMCELL Technologies	100-0276	mTeSR Plus
DMEM/F12	Gibco	31331-028	DMEM/F12
Non-treated 6-well plate	Avantor (VWR)	734-2777	Untreated 6-well Plate
Phalloidin	Thermo Scientific	A22287	Phalloidin Labeling Probes ALexa 647
Phosphate-buffered saline (1× PBS)	Gibco	14190-144	DPBS 1×
primary antibody c-MYBPC3	Santa Cruz	sc-137181	MYBPC3 Antibody (F-1)
ROCK inhibitor	STEMCELL Technologies	72304	ROCK Inhibitor (Y-27632)
Secondary antibody (green)	Thermo Scientific	A-11017	F(ab')2-Goat anti-Mouse IgG (H+L) Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 488
Washing medium supplement	Gibco	10828028	KnockOut Serum Replacement
WGA, Alexa Fluor™ 488 conjugate	Invitrogen	W11261	WGA
widefield microscope	Nikon		Nikon Eclipse Ti
WNT pathway inhibitor	STEMCELL Technologies	72552	IWP4
Wnt/β-catenin pathway activator	Sigma	SML1046	CHIR99021