Pharmacologie en réseau et recherche expérimentale du β-sitostérol dans le traitement de la maladie pulmonaire obstructive chronique via le récepteur glucocorticoïde

Résumé

β-sitosterol a soulagé la MPOC et potentialisé l’efficacité de la dexaméthasone, le récepteur glucocorticoïde médiant cet effet. De plus, le β-sitosterol a réduit l’inflammation, le stress oxydatif et la sénescence cellulaire chez les cellules épithéliales bronchées stimulées par l’ECS et chez les souris BPCO induite par la fumée de cigarette.

Résumé

La maladie pulmonaire obstructive chronique (MPOC) est un trouble respiratoire répandu caractérisé par une inflammation persistante, un stress oxydatif et un déclin progressif de la fonction pulmonaire. Le potentiel thérapeutique du β-sitostérol dans la MPOC reste incertain. Cette étude visait à étudier les effets protecteurs du β-sitostérol contre la MPOC et à élucider son mécanisme sous-jacent. Le dépistage de la base de données a identifié le récepteur glucocorticoïde (GR) comme une cible potentielle du β-sitosterol. Un modèle de souris pour la MPOC induit par la fumée de cigarette et un modèle de cellules BEAS-2B stimulé par extrait de fumée de cigarette (CSE). La fonction pulmonaire, les marqueurs liés aux lésions pulmonaires, l’inflammation, le stress oxydatif et la sénescence cellulaire ont été évalués à l’aide de tests (RT-qPCR), d’analyses fluorescentes DFH-DA et de kits de détection de la sénescence. Les effets du β-sitotérol seul ou en combinaison avec la dexaméthasone (DEX) ont également été évalués. β-sitosterol a significativement amélioré la fonction pulmonaire, a normalisé les marqueurs liés aux lésions pulmonaires et a atténué l’inflammation, le stress oxydatif et la sénescence cellulaire chez les cellules BEAS-2B stimulées par le CSE et chez les souris exposées à la fumée de cigarette. Ces effets protecteurs s’accompagnaient d’une expression accrue de la RG. De plus, le β-sitotérol a amélioré la réactivité au DEX, et un traitement combiné avec β-sitosterol et DEX a produit des améliorations plus importantes de la fonction pulmonaire, des marqueurs de lésions pulmonaires, de l’inflammation, des niveaux d’espèces réactives de l’oxygène et de la sénescence cellulaire que le traitement du DEX seul. Collectivement, ces résultats suggèrent que le β-sitosterol atténue les changements pathologiques associés à la BPCO, au moins en partie, en augmentant l’expression de la GR et en renforçant l’efficacité thérapeutique de la DEX, soulignant son potentiel comme stratégie adjuvante pour le traitement de la BPCO.

Introduction

La maladie pulmonaire obstructive chronique (MPOC) est une maladie respiratoire progressive caractérisée par une inflammation persistante des voies respiratoires, des lésions alvéolaires et une obstruction irréversible du flux d’air qui altère la fonction respiratoire et réduit la qualité^{de vie 1}. Sa prévalence augmente significativement avec l’âge, et le risque pour les personnes âgées de soixante-cinq ans et plus est environ cinq fois supérieur à celui des moins de^{quarante-vingt-deux} ans. Cette tendance démographique est associée à une augmentation de l’incidence des maladies, de la mortalité et du handicap³. Les projections épidémiologiques indiquent qu’en 2030, la BPCO pourrait devenir la quatrième cause de mortalité mondiale, représentant environ 5 % de tous les décès^(4,5,6). À l’heure actuelle, les facteurs de risque identifiés incluent la susceptibilité génétique, la dysplasie pulmonaire, l’exposition aux particules, la bronchite chronique et les infections^{respiratoires 7}.

Parmi les facteurs de risque, la fumée de cigarette est le facteur pathogène le plus important de la^{BPCO 8}. Il contient des milliers de substances chimiques qui peuvent causer des dommages à l’épithélium bronchique, favoriser l’infiltration des cellules inflammatoires et conduire à la remodelation du tissu^{pulmonaire 9}. Une exposition prolongée peut induire des lésions épithéliales persistantes et irréversibles, favoriser la libération d’un grand nombre de chimiokines pro-inflammatoires, augmenter significativement la production (ROS) et induire l’apoptose cellulaire¹⁰. De nombreuses études ont montré que les niveaux accrus de chimiokines pro-inflammatoires telles que l’interleukine-8 (IL-8) et le facteur de nécrose tumorale α (TNF-α), ainsi que la production excessive d’ROS et la sénescence cellulaire, sont étroitement liées à la gravité de la MPOC^11,12. Cela souligne la nécessité d’agents capables de moduler efficacement et en toute sécurité ces facteurs pathogènes clés pour exercer des effets protecteurs et thérapeutiques dans la MPOC.

Les phytostérols sont des composés bioactifs naturels omniprésents dans les membranes cellulaires végétales. Parmi eux, le β-sitosterol est le plus abondant et largement distribué dans les aliments d’origine végétale riches en lipides tels que les légumes, les noix, les graines et^{l’huile d’olive} 13,14,15,16. Des études ont confirmé que l’administration de β-sitotérol à des doses allant jusqu’à 1000 mg/kg chez les rats et les souris n’est pas associée à la cytotoxicité ni à la^{génotoxique 17}. De plus, des recherches ont montré que le β-sitostérol présente des propriétés antioxydantes grâce à ses effets sur les enzymes antioxydantes et les récepteurs humains à l’œstrogène¹⁸.

β-sitostérol présente un large éventail d’activités pharmacologiques, incluant des effets^{anti-inflammatoires 19},^{antipyrétiques 20}, analgésiques²¹ et^{antidiabétiques 13}. Il a également montré un potentiel thérapeutique dans divers modèles pathologiques, tels que la colite et l’inflammation^{intestinale 22}, et possède des propriétés anti-athérosclérosclérosiques²³ et^{immunomodulatrices 24}. De plus, il présente un profil de sécurité favorable. Compte tenu de ces caractéristiques, le β-sitosterol a suscité un intérêt considérable en tant que candidat médicamenteux potentiel. Cependant, son rôle précis et ses mécanismes sous-jacents dans la BPCO restent largement incertains.

Par conséquent, la présente étude visait à étudier les effets thérapeutiques potentiels et les mécanismes sous-jacents du β-sitosterol dans la MPOC. Plus précisément, un modèle de lésion des cellules BEAS-2B induit par l’extrait de fumée de cigarette (CSE) a été utilisé pour évaluer si le β-sitosterol pouvait atténuer efficacement les dommages cellulaires médiés par le CSE, identifiant ainsi une nouvelle molécule candidate pour les stratégies thérapeutiques de la MPOC.

Protocole

L’étude a été menée conformément aux directives de Pharmacologie et Toxicologie Cliniques de Base et de Toxicologie pour les études expérimentales^{et cliniques 25}. Tous les protocoles expérimentaux sur les animaux ont été approuvés par le Comité d’éthique animale du Second Hôpital Affilié de la Faculté de Médecine de l’Université du Zhejiang (Approbation n° 20230102), et toutes les expériences ont été réalisées conformément aux directives du Comité d’éthique animale. L’étude a été menée conformément aux directives de l’ARRIVE.

Dépistage des composants clés et cibles via la pharmacologie en réseau

Composantes actives de Fritillaria cirrhosa D. Don, Lonicera japonica Thunb., Glehnia littoralis F. Schmidt ex Miq., et Adenophora stricta Miq. ont été consultés depuis la base de données des systèmes de pharmacologie de médecine traditionnelle chinoise (TCMSP ; consulté le 12 mars 2024). Les composés candidats ont été dépistés selon les critères suivants de l’ADME : biodisponibilité orale (OB) ≥ 30 %, ressemblance du médicament (DL) ≥ 0,18, et perméabilité au Caco-2 ≥ −0,4²⁵. Les composés répondant aux trois critères ont été conservés comme principes actifs candidats pour des analyses ultérieures.

La structure canonique SMILES, le système simplifié de saisie de lignes moléculaires d’entrée (SMILES) du β-sitosterol a été obtenue sur PubChem (consulté le 18 mars 2024) et importée dans SwissTargetPrediction (consulté le 21 mars 2024) pour la prédiction de cibles. Homo sapiens a été choisi comme espèce ciblée. Les cibles potentielles ont été prédites sur la base de la similarité structurelle 2D et 3D entre β-sitosterol et les ligands connus dans la base de données. Les cibles prédites avec une probabilité supérieure à 0 ont été conservées, et les entrées en double ont été supprimées.

Les gènes associés à la BPCO ont été extraits de la Therapeutic Target Database (TTD ; consultée le 25 mars 2024) et de la Comparative Toxicogenomics Database (CTD ; consultée le 28 mars 2024) en utilisant le mot-clé « chronic obstructive pulmonary disease ». Après la suppression des gènes dupliqués, les gènes associés à la MPOC ont été croisés avec les cibles β-sitosterol prévues afin d’identifier des cibles candidates potentiellement impliquées dans les effets thérapeutiques du β-sitosterol contre la BPCO.

Amarrage moléculaire du β-sitosterol et de la RG

La structure tridimensionnelle du β-sitotérol au format SDF a été extraite de la base de données PubChem (consulté le 2 juin 2026), tandis que la structure cristalline du récepteur glucocorticoïde (GR) a été obtenue auprès de la Research Collaboratory for Structural Bioinformatics Protein Data Bank (RCSB PDB ; consulté le 3 juin 2026). Après la préparation standard des structures du ligand et des récepteurs, l’amarrage moléculaire a été réalisé via la plateforme en ligne CB-Dock2 (consulté le 3 juin 2026). Les fichiers de ligands et de récepteurs préparés ont été téléchargés sur la plateforme, et les calculs d’amarrage ont été effectués en utilisant les paramètres par défaut.

Analyse d’enrichissement fonctionnel de l’ontologie génique (GO) et Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes (KEGG)

Tous les gènes cibles prédits du β-sitosterol ont été soumis à des analyses d’enrichissement fonctionnel GO et d’enrichissement des voies KEGG. Les résultats d’enrichissement, incluant des processus biologiques significativement enrichis, des composants cellulaires, des fonctions moléculaires et des voies de signalisation, ont été triés et stockés dans le Fichier Supplémentaire 1 pour une analyse bioinformatique ultérieure.

Modélisation animale et regroupement

La taille de l’échantillon a été fixée à six animaux par groupe sur la base d’une étude antérieure ayant réalisé une analyse de puissance a priori à l’aide du logiciel G*Power (α = 0,05, puissance = 0,80) et démontré que n = 6 était suffisant pour détecter des différences biologiquement pertinentes dans des conditions expérimentales^{comparables 26}. Les mâles C57BL/6 souris âgées de 6 à 8 semaines (20 ± 2 g) ont été répartis aléatoirement dans cinq groupes : groupe témoin, groupe modèle BPCO, groupe MPOC + dexaméthasone (DEX), groupe BPOC + β-sitosterol, et groupe MPOC + DEX + β-sitotérol. Les souris étaient hébergées dans des conditions de laboratoire standard (25 °C, cycle clair/obscurité de 12 heures) avec un accès libre à la nourriture et à l’eau standard, et ont été laissées à s’acclimater pendant une semaine avant l’expérimentation.

Pour l’établissement du modèle BPCO, les souris ont été placées dans une chambre d’exposition à la fumée de cigarette intégrale (63 cm × 55 cm × 45 cm) et exposées à la fumée de cigarette traditionnelle pendant 12 semaines. Chaque cigarette contenait 10 mg de goudron, 0,9 mg de nicotine et 10 mg de monoxyde de carbone. L’exposition à la fumée a été réalisée deux fois par jour (5 jours par semaine) à 9h30 et à 15h00, avec de la fumée générée par 18 cigarettes injectées dans la chambre pendant 90 minutes par session²⁷.

Pour évaluer les effets thérapeutiques des interventions, l’administration de médicaments a été initiée après 8 semaines d’exposition à la fumée de cigarette et s’est poursuivie pendant les 4 semaines restantes. À partir de la 9e semaine, les souris des groupes traités respectifs ont reçu quotidiennement une administration intragastrique de DEX (1 mg/kg)²⁸ ou de β-sitosterol (50 mg/kg)^29,30 1 h avant l’exposition à la fumée de cigarette. Des études pharmacocinétiques antérieures ont rapporté une biodisponibilité orale d’environ 4 % pour le β-sitotérol chez^{les rongeurs 31}. De plus, plusieurs études sur la souris ont utilisé des doses allant de 20 à 50 mg/^{kg 32}. Par conséquent, une dose de 50 mg/kg a été choisie afin d’assurer une exposition systémique adéquate tout en restant dans la fourchette couramment utilisée dans les études précliniques.

Les souris du groupe témoin ont été exposées à l’air filtré de la pièce, tandis que celles des groupes modèle et traité ont reçu un volume équivalent de solution physiologique normale en véhicule. À la fin de la période expérimentale, les souris étaient profondément anesthésiées avec de l’isoflurane jusqu’à la perte du réflexe pédal, puis euthanasiées par exsanguination via la collecte sanguine de l’aorte abdominale. La cavité thoracique a été immédiatement ouverte, et les tissus pulmonaires bilatéraux intacts ont été soigneusement excisés, rincés avec du sérum physiologique phosphaté (PBS) glacé, puis placés sur la glace. Pour la collecte du liquide de lavage bronchoalvéolaire (BALF), la trachée a été canulée et lavée avec du PBS froid stérile, qui a été doucement instillé puis retiré à plusieurs reprises pour collecter le liquide de lavage. Les tissus pulmonaires et les échantillons de BALF ont été conservés sur la glace puis traités pour des analyses en aval.

Culture cellulaire BEAS-2B

Les cellules épithéliales bronquiques humaines BEAS-2B ont été maintenues dans le Modified Eagle Medium/F12 (DMEM/F12) de Dulbecco, contenant 10 % de sérum bovin fœtal (FBS) et 1 % de pénicilline/streptomycine sous 5 % de CO₂ à 37 °C.

Préparation de l’ESC et exposition aux cellules BEAS-2B

Les cellules BEAS-2B ont été lavées avec du sérum physiologique tamponné phosphate et ensemées en plaques à 24 puits en triple liaison à une densité de 5 × 10⁴ cellules par puits. Après 12 heures de culture, les cellules ont atteint environ 60 % de confluence et ont ensuite été exposées à l’EEC. Le CSE a été préparé de manière fraîche comme décrit précédemment, avec des modifications^{mineures 33}. Pendant un court moment, une cigarette commerciale non filtrée était continuellement brûlée, et la fumée principale était projetée en bulle dans 10 mL de milieu sans sérum à l’aide d’une pompe à vide à un débit constant de 1,05 L/min (environ −11 kPa de pression négative) pendant environ 5 minutes jusqu’à ce que la cigarette soit complètement brûlée. La solution obtenue a d’abord été soumise à une préfiltration pour éliminer les grosses particules impures, puis stérilisée via un filtre microporeux stérile de 0,22 μm pour éliminer les particules résiduelles ; la solution d’origine résultante a été définie comme 100 % CSE. Tout le CSE fraîchement préparé était utilisé pour le traitement cellulaire immédiatement après filtration sans stockage. Les cellules ont été stimulées avec un milieu contenant 2,5 % de CSE. Après 24 heures de traitement de l’ECS, les surnadants de culture ont été collectés et stockés à -40 °C pour une analyse^{ultérieure 34}.

Réaction en chaîne quantitative en temps réel par polymérase (RT-qPCR)

L’ARN total a été extrait des cellules BEAS-2B à l’aide d’un kit d’extraction totale d’ARN et transcrit en ADN c à l’aide d’un kit de transcription inverse selon les instructions du fabricant. La RT-qPCR a ensuite été réalisée à l’aide d’un système de détection PCR en temps réel et d’un mix maître qPCR basé sur SYBR Green. Toutes les expériences RT-qPCR ont été menées avec trois réplicés biologiques et trois réplications techniques par échantillon afin d’assurer la fiabilité des données.

Chaque réaction qPCR a été effectuée sur un volume total de 20 μL, contenant 10 μL de mélange maître SYBR Green qPCR, 0,4 μL d’amorce directe, 0,4 μL d’amorce inverse, 2 μL de gabarit d’ADNc dilué et 7,2 μL d’eau sans RNase. Les conditions d’amplification étaient les suivantes : dénaturation initiale à 95 °C pendant 3 minutes, suivie de 40 cycles de dénaturation à 95 °C pendant 10 s et de recuit/extension à 60 °C pendant 30 s. Les niveaux relatifs d’expression génique ont été calculés à l’aide de la méthode 2^−ΔΔCt, le GAPDH servant de gène de référence interne. Les séquences d’amorces utilisées dans cette étude sont mentionnées dans le Tableau Supplémentaire 1.

Analyse des espèces réactives intracellulaires de l’oxygène (ROS)

La production intracellulaire de ROS dans les cellules BEAS-2B a été évaluée à l’aide du diacétate fluorogénique de sonde fluorogénique 2′,7′-dichlorodihydroescéine (DCFH-DA) et analysée par cytométrie en flux. Lors de l’acquisition cytométrique en écoulement, une stratégie standard de diffusion directe (FSC) et de diffusion latérale (SSC) a été appliquée pour exclure les débris cellulaires et sélectionner des cellules uniques intactes. Un total de 10 000 événements cellulaires valides ont été obtenus pour chaque échantillon. Les longueurs d’onde d’excitation et d’émission ont été réglées respectivement à 488 nm et 525 nm. Les données cytométriques en flux ont ensuite été analysées pour quantifier l’intensité de fluorescence ROS intracellulaire.

Détermination du niveau de malondiadéhyde (MDA)

La teneur en MDA intracellulaire a été mesurée à l’aide d’un kit de test de peroxydation lipidique selon les instructions du fabricant. En résumé, des cellules BEAS-2B traitées ont été prélevées et lysées, puis centrifugées à basse température pour collecter le surnageant. La réaction colorimétrique à l’acide thiobarbiturique (TBA) a ensuite été réalisée, et l’absorption a été mesurée à 532 nm à l’aide d’un lecteur de microplaques. Les niveaux relatifs de MDA ont été calculés selon la courbe standard.

Évaluation de la sénescence cellulaire

La sénescence cellulaire a été évaluée à l’aide d’un test de détection de sénescence basé sur l’activité β-galactosidase (SA-β-gal) associée à la sénescence. Les cellules SA-β-gal-positives ont été quantifiées par cytométrie en flux. Parallèlement, les niveaux d’expression de l’ARNm des marqueurs associés à la sénescence p53 et p21 ont été déterminés par RT-qPCR.

Essai de prolifération cellulaire

La prolifération cellulaire a été évaluée à l’aide d’un kit de test de viabilité cellulaire colorimétrique. L’absorbance a été mesurée à 450 nm à l’aide d’un lecteur de microplaques.

Analyse de démontage GR

La transfection cellulaire a été réalisée à l’aide d’un réactif de transfection à base de lipides. Les oligonucléotides suivants ont été transfectés : l’ARN interférant petit (si-GR) ciblant les récepteurs glucocorticoïdes et le petit ARN interférant témoins négatif (si-NC). Les séquences siRNA candidates ciblant la RG ont été conçues à l’aide de la plateforme de bioinformatique en ligne siDirect 2.0. Après la transfection, les cellules ont été cultivées pendant 48 heures, et tous les siARN ont été utilisés à une concentration finale de 50 nM. L’efficacité du knockdown a été vérifiée en mesurant l’expression de l’ARNm de la GR à l’aide de RT-qPCR.

Les groupes témoins des véhicules ont été inclus à la fois dans les expériences de traitement au β-sitosterol et de transfection. Pour une intervention β-sitosterol, les cellules traitées uniquement avec le solvant du véhicule servaient de groupe témoin du véhicule (noté CSE+0). L’analyse statistique a confirmé qu’aucune différence significative n’a été observée entre les groupes témoins du véhicule et témoins vierge.

Analyse statistique

Tous les résultats quantitatifs ont été exprimés en moyenne ± écart-type de trois expériences in vitro biologiquement indépendantes. Les analyses statistiques ont été réalisées à l’aide d’un logiciel d’analyse statistique. Le test de Shapiro–Wilk a été utilisé pour examiner la normalité de la distribution des ensembles de données avant les tests statistiques ; La correction post-hoc de Bonferroni a été adoptée pour ajuster les valeurs de P lors des comparaisons multiples après analyse de la variance (ANOVA). Les comparaisons entre deux groupes ont été évaluées par un test t de Student non apparié, tandis qu’une ANOVA unidirectionnelle ou bidirectionnelle a été utilisée pour les comparaisons multi-groupes. Une valeur p ≤ 0,05 était considérée comme statistiquement significative.

Résultats

β-sitostérol était un produit naturel potentiel pour traiter la MPOC

En raison des effets curatifs rapportés de Fritillaria cirrhosa D. Don, fleur séchée de Lonicera japonica Thunb., racine séchée de Glehnia littoralis F. Schmidt ex Miq., et Adenophora stricta Miq. dans le traitement des maladies^pulmonaires 35,36,37,38, cette étude a utilisé la base de données TCMSP pour identifier systématiquement les composants actifs de ces plantes de la médecine traditionnelle chinoise (MTC). β-sitosterol a été identifié comme un ingrédient actif important partagé par ces plantes de la MTC (Figure 1A). Pour explorer systématiquement le mécanisme moléculaire sous-jacent du β-sitosterol, ses informations structurelles SMILES ont été extraites de la base de données PubChem et importées dans la base de données SwissTargetPrediction pour la prédiction des cibles ; toutes les cibles prédites avec une probabilité prédictive supérieure à 0 ont été conservées pour des analyses ultérieures. Le réseau d’interaction ingauré-cible résultant entre le β-sitosterol et ses cibles candidates a été visualisé et présenté dans la Figure 1B. Un total de 43 gènes cibles présumés du β-sitostérol ont été prédits à l’aide de la base de données SwissTargetPrediction. Par la suite, des analyses d’enrichissement fonctionnel GO et d’enrichissement des voies KEGG ont été réalisées sur les gènes cibles du β-sitosterol, et tous les ensembles de données complets d’enrichissement ont été archivés dans le Fichier Supplémentaire 1. Notamment, les processus métaboliques des stéroïdes ont été identifiés comme l’une des voies les plus significativement enrichies. La littérature accumulée a démontré la forte corrélation entre le métabolisme anormal des stéroïdes et la résistance aux glucocorticoïdes dans la^{BPCO 39}. De plus, la RG était nettement enrichie dans les clusters fonctionnels liés au métabolisme des stéroïdes. Cette découverte fournit un soutien bioinformatique clé pour nos expériences cellulaires ultérieures explorant le mécanisme par lequel le β-sitosterol améliore la sensibilité à la DEX et modifie les niveaux d’expression de la GR.

Les gènes liés à la MPOC ont été extraits des bases de données TTD et CTD. L’analyse d’intersection de Venn ultérieure (Figure 1C) a révélé deux gènes qui se chevauchent entre des cibles β-sitosterol et des gènes liés à la MPOC dérivés de la DTT, deux autres gènes qui se chevauchent entre des cibles de β-sitostérol et des gènes liés à la MPOC dérivés de la DTC, et cinq gènes de la MPOC partagés entre les ensembles de données TTD et CTD. En fin de compte, la GR était le seul gène commun aux trois ensembles de données et a été définie comme la cible principale du β-sitosterol contre la BPCO. Les données numériques détaillées de l’analyse de Venn sont listées dans le Fichier Supplémentaire 2. Pour une vérification plus approfondie de l’affinité de liaison, un amarrage moléculaire du β-sitostérol avec la GR a été réalisé (Figure 1D). Les poches de liaison avec des scores de Vina inférieures à −7,0 kcal/mol ont été considérées comme présentant une affinité de liaison favorable. Les scores Vina des poches C1 et C5 étaient respectivement de −8,8 et −7,2 kcal/mol, indiquant une forte interaction prédite entre β-sitosterol et la GR.

β-sitosterol protégeait les cellules BEAS-2B des dommages au CSE, pouvant être associés à une expression élevée de la GR

β-sitosterol a montré un effet protecteur significatif dans le modèle de lésion des cellules BEAS-2B induite par l’ECS. Le groupe CSE + 0 a été conçu comme un véhicule de contrôle recevant le CSE plus un volume égal de solvant médicamenteux sans β-sitosterol. Comme prévu, aucune différence significative n’a été trouvée entre les groupes CSE et CSE + 0. Le composé inhibait la production induite par le CSE de TNF-α et d’IL-6 de manière dépendante de la concentration (Figure 2A). Il a également réduit les niveaux d’OS intracellulaires (Figure 2B). β-sitosterol a également significativement réduit la teneur en MDA (Figure 2C), supprimé la sénescence cellulaire induite par l’ECS (Figure 2D) et régulé à la baisse les marqueurs liés à la sénescence p53 et p21 (Figure 2E). Ces effets étaient accompagnés d’une expression à la hausse de l’ARNm de la GR (Figure 2F), suggérant que sa fonction protectrice pourrait être étroitement liée à la hausse transcriptionnelle de la GR. Dans la plage de concentration testée, le β-sitotérol n’a exercé aucune cytotoxicité évidente sur la viabilité des cellules BEAS-2B (Figure 2G), indiquant une tolérance cellulaire favorable à ce composé. Étant donné que 20 μg/mL (environ 48,2 μM) présentait les effets inhibiteurs les plus puissants, cette dose a été sélectionnée pour les expériences ultérieures. Bien qu’aucune différence statistiquement significative n’ait été observée entre les groupes 10 μg/mL et 20 μg/mL concernant la suppression des cytokines pro-inflammatoires, le 20 μg/mL de β-sitosterol a montré une légère tendance à la baisse des niveaux de facteurs inflammatoires. De plus, comparé à 10 μg/mL, 20 μg/mL a obtenu une efficacité supérieure pour inhiber l’accumulation de ROS et de MDA induite par l’ECS, réduire la sénescence cellulaire et augmenter l’expression de l’ARNm de la GR. Cela permettait de sélectionner 20 μg/mL comme concentration de travail optimale pour les essais de sauvetage de suivi.

Les résultats de la RT-qPCR (Figure 2H) ont confirmé le knockdown réussi de la GR. Les niveaux d’ARNm de GR dans le groupe si-GR ont été réduits d’environ 78 % par rapport au contrôle si-NC, ce qui a confirmé l’efficacité du silencieux GR pour les essais de sauvetage ultérieurs. Après la réduction de la GR, les effets inhibiteurs du β-sitosterol sur les facteurs inflammatoires et les ROS ont été significativement inversés (Figure 2I, J). De même, l’atténuation de la sénescence cellulaire par le β-sitosterol a également été abrogée (Figure 2K). Pris ensemble, ces résultats ont montré que le β-sitosterol jouait un rôle protecteur contre les lésions des cellules épithéliales bronchiques induites par l’ECS, grâce à des mécanismes anti-inflammatoires, anti-oxydants et anti-âge médiés par la GR.

β-sitosterol a renforcé les effets thérapeutiques de la DEX sur la fonction pulmonaire et l’inflammation dans un modèle murin de MPOC

Dans un modèle murin de MPOC établi par exposition à la fumée de cigarette, le traitement par β-sitosterol, DEX ou leur combinaison a tous exercé des effets protecteurs évidents. Des comparaisons statistiques entre plusieurs groupes ont été analysées à l’aide d’ANOVA unidirectionnelle, suivies du test post-hoc de Tukey. Cinq styles de symboles distincts ont été appliqués pour distinguer les cohortes expérimentales : cercles pour le groupe témoin, triangles pour le groupe modèle, astérisques pour le groupe modèle + DEX, carrés pour le groupe modèle + β-sitosterol, et losanges pour le groupe modèle + DEX + β-sitosterol. Chaque crochet horizontal représente une comparaison statistique entre deux groupes expérimentaux liés.

Comparées au groupe témoin, les souris du groupe modèle BPCO ont montré des réductions marquées du volume expiratoire forcé en 0,1 s (FEV₀.₁), de la capacité vitale forcée (FVC), du débit expiratoire de pointe (PEF) et du rapport FEV₀.₁/FVC. Comme montré à la figure 3A–D, un ratio FEV₀.₁/CVC inférieur à 70 % a confirmé l’établissement réussi du modèle BPCO. L’administration de DEX ou de β-sitosterol seule a significativement inversé ces troubles pulmonaires par rapport aux souris modèles, et un traitement combiné a conduit à d’autres améliorations par rapport à l’administration mono-agent. De plus, un rapport MMP-9/TIMP-1 modifié est un marqueur moléculaire caractéristique du remodelage des voies respiratoires, et une expression élevée de MUC5AC représente une hypersécrétion excessive^{de mucus 40,41}. Nous avons également détecté les niveaux d’ARNm de MMP-9, TIMP-1 et le marqueur mucus MUC5AC, et calculé le rapport MMP-9/TIMP-1 (Figure 3E, F). Le groupe modèle a montré un rapport MMP-9/TIMP-1 nettement augmenté et une expression élevée de MUC5AC. DEX ou β-sitosterol seuls réduisaient efficacement les deux paramètres, et le traitement combiné a permis d’obtenir une efficacité inhibitrice supérieure par rapport à la monothérapie.

Les souris modèles de MPOC ont montré des élévations marquées des niveaux de BALF en TNF-α et IL-6, ainsi qu’une augmentation de la teneur en ROS pulmonaire par rapport aux souris témoins. DEX ou β-sitosterol à lui seul a considérablement réduit à la fois les niveaux de cytokines inflammatoires et le stress oxydatif, et un traitement combiné a produit des effets inhibiteurs plus forts (Figure 3G, H). De plus, l’expression pulmonaire de l’ARNm de la GR a été nettement sous-régulée chez les souris modèles de MPOC. Le DEX ou β-sitosterol à lui seul a significativement augmenté l’expression de la GR, et le traitement combiné a encore élevé les niveaux de GR (Figure 3I).

Collectivement, ces résultats ont indiqué que le β-sitosterol protégeait contre les altérations pathologiques liées à la BPCO chez la souris en maintenant la fonction pulmonaire, en inhibant l’inflammation, en atténuant le stress oxydatif et en augmentant l’expression de la GR. De plus, l’administration combinée de β-sitosterol a renforcé l’efficacité protectrice de la DEX dans ce modèle.

Efficacité thérapeutique accrue du DEX par β-sitosterol, potentiellement grâce à la régulation de la voie de la RG dans le modèle de cellules BEAS-2B induit par le CSE

Dans le modèle de cellules BEAS-2B induit par le CSE, la monothérapie DEX a significativement réduit l’expression de l’ARNm des cytokines pro-inflammatoires, réduit les niveaux intracellulaires de ROS et MDA, et réduit la proportion de cellules sénécentes ainsi que l’expression des marqueurs de sénescence p53 et p21. Ces résultats confirment les activités anti-inflammatoires, antioxydantes et anti-sénescences de DEX. Notamment, la co-administration de β-sitosterol a encore renforcé les effets protecteurs de la DEX, entraînant une meilleure suppression de l’inflammation, du stress oxydatif et de la sénescence cellulaire comparée à la monothérapie DEX. Lors du knockdown de la GR (si-GR) dans le groupe de co-traitement DEX + β-sitosterol, la réponse cellulaire à la thérapie combinée a été nettement atténuée. Comme montré à la figure 4A–E, l’inhibition co-médiée par le DEX et le β-sitosterol de l’inflammation, du stress oxydatif et de la sénescence a été significativement inversée, indiquant que la carence en GR affaiblait les effets bénéfiques du β-sitostérol sur l’efficacité du DEX.

Collectivement, ces résultats ont démontré que le β-sitosterol augmentait l’efficacité de la DEX, peut-être en régulant les processus liés à la RG, augmentant ainsi les effets protecteurs de la DEX contre les lésions des cellules épithéliales induites par l’ECS.

DISPONIBILITÉ DES DONNÉES :

Toutes les données brutes soutenant les résultats de cette étude sont fournies dans les documents complémentaires (Fichier Supplémentaire 1, Fichier Supplémentaire 2).

Figure 1 : Rôle clé du β-sitostérol dans la thérapie de la BPCO. (A) Composants actifs de Fritillaria cirrhosa D. Don, fleur séchée de Lonicera japonica Thunb., et racine séchée de Glehnia littoralis F. Schmidt ex Miq. et Adenophora stricta Miq. ont été examinés via la base de données TCMSP. (B) Les cibles potentielles du β-sitosterol. (C) Analyse d’intersection des cibles en aval de β-sitosterol et des gènes liés à la MPOC. (D) Analyse du docking moléculaire entre β-sitosterol et la protéine RG. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figurine.

Figure 2 : Implication de la GR dans la protection liée au β-sitotérol contre les lésions cellulaires induites par l’ECS. (A) Modulation dépendante de la concentration des médiateurs inflammatoires induits par l’ESC (TNF-α, IL-6) par β-sitosterol. (B)Effets de la dose de β-sitostérol sur le niveau ROS dans les cellules exposées à l’ECS. (C) Effets du β-sitosterol sur la teneur en MDA surrégulée par les EEC. (D) L’influence du β-sitotérol sur la sénescence cellulaire promue par l’ECS. (E) Modulation de p53 et p21 liés à la sénescence par β-sitosterol sous stimulation du CSE. (F) Régulation de l’expression de la GR dépendante de la concentration de β-sitosterol sous stimulation de la CSE. (G) Viabilité cellulaire du β-sitostérol à travers les concentrations testées dans les cellules BEAS-2B. (H) Détection RT-qPCR de l’expression d’ARNm de la GR afin de vérifier l’efficacité de la réduction après la transfection de siRNA ciblant la GR. (I) Association régulatrice entre la GR et le β-sitosterol contre les facteurs inflammatoires induits par l’ECS. (J) Association régulatrice entre la GR et le β-sitosterol contre l’accumulation de ROS induite par le CSE. (K) Association régulatrice entre la GR et le β-sitosterol contre la sénescence cellulaire induite par l’ESC. *p < 0,05 ; **p < 0,01 ; p < 0,001 ; NS, pas significatifs. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figurine.

Figure 3 : Effets du β-sitosterol combiné à la DEX sur la fonction pulmonaire, l’inflammation, le stress oxydatif et l’expression de la GR chez les souris modèles BPCO. (A) Modifications du volume expiratoire forcé en 0,1 s (FEV₀.₁) chez les souris atteintes de BPCO. (B) Altérations de la capacité vitale forcée (CVF) chez les souris atteintes de BPCO. (C) Effets sur le débit expiratoire maximal (PEF) chez les souris atteintes de BPCO. (D)Rapport FEV₀.₁/FVC chez les souris modèles BPCO. (E) Rapport relatif d’ARNm entre MMP-9/TIMP-1 reflétant le remodelage des voies respiratoires. (F) L’expression relative de l’ARNm de MUC5AC indique une hypersécrétion de mucus dans les tissus pulmonaires de la souris. (G) Niveaux de TNF-α et d’IL-6 dans le liquide de lavage bronchoalvéolaire (BALF). (H)Production de ROS dans le tissu pulmonaire des souris atteintes de BPCO. (I) Expression relative de l’ARNm de la RG dans le tissu pulmonaire de souris. *p < 0,05 ; **p < 0,01 ; p < 0,001. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figurine.

Figure 4 : Effet du β-sitosterol sur la résistance à la DEX médiée par la GR dans les cellules BEAS-2B induites par le CSE. (A) Expression relative de facteurs inflammatoires (TNF-α, IL-6) dans chaque groupe. (B) Niveau ROS dans chaque groupe. (C)Contenu MDA dans chaque groupe expérimental. (D) Pourcentage de cellules BEAS-2B sénescentes dans chaque groupe. (E) Niveaux relatifs d’ARNm des marqueurs associés à la sénescence p53 et p21. **p < 0,01 ; p < 0,001. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figurine.

Tableau complémentaire 1 : Séquences d’amorces utilisées pour l’analyse RT-qPCR. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.

Fichier supplémentaire 1 : Ensemble des ensembles de données d’analyse d’enrichissement GO et KEGG pour les gènes cibles β-sitosterol. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.

Fichier supplémentaire 2 : Résultats numériques détaillés de l’analyse de Venn identifiant les cibles chevauchantes entre β-sitosterol et MPOC. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.

Discussion

La BPCO impose un fardeau mondial important en matière de maladie et reste un défi majeur pour la santé^{mondiale 1}. La prise en charge actuelle de la MPOC englobe à la fois des interventions pharmacologiques et non^{pharmacologiques 42}. Parmi les traitements pharmacologiques, les glucocorticostéroïdes (GC) sont largement utilisés dans les troubles inflammatoires chroniques. Ils agissent en se liant à la GR et en recrutant la déacétylase de l’histone 2 dans des complexes transcriptionnels pour inverser l’acétylation^{des histones 43}. Cependant, plusieurs études ont démontré une sensibilité réduite à la GC chez les patients atteints de^{BPCO 44,45}, et des études ont fourni des preuves d’une résistance à la GC dans cette^{maladie 46}. Ces résultats indiquent que surmonter la résistance à la GC constitue un défi clinique important, soulignant la nécessité de nouveaux agents thérapeutiques. Par conséquent, il est d’une grande importance d’identifier des options thérapeutiques plus efficaces pour la BPCO.

Des études antérieures ont démontré que le γ-sitosterol exerce un effet antiprolifératif sur les cellules épithéliales bronchiques dans la^{BPCO 47}. Comme le γ-sitosterol et le β-sitosterol sont deux composants bioactifs courants des phytostérols, la présente étude approfondit la compréhension actuelle des actions des phytostérols dans la MPOC et met en lumière la valeur protectrice potentielle du β-sitosterol dans la pathogenèse des maladies. Nos résultats ont révélé que le β-sitosterol inhibait significativement la libération des facteurs inflammatoires, réduisait le stress oxydatif et supprimait la sénescence cellulaire. Cela est cohérent avec des rapports antérieurs montrant que le β-sitosterol supprime efficacement la régulation à la hausse des médiateurs inflammatoires induits par les lipopolysaccharides tels que l’IL-6, la synthase inductible d’oxyde nitrique et le TNF-α⁴⁸. Ces résultats confirment son activité anti-inflammatoire et soutiennent sa cohérence à travers différents modèles inflammatoires.

Les GC inhalés sont des agents anti-inflammatoires efficaces pour contrôler l’inflammation des voies respiratoires. Ils agissent principalement en se liant et en activant le GR⁴⁹. Cependant, une caractéristique pathologique clé de la MPOC est la sensibilité réduite des cellules aux effets anti-inflammatoires des GC⁴⁴. La régulation à la baisse ou l’altération fonctionnelle de la GR est considérée comme un mécanisme majeur sous-jacent au développement de la résistance à la GC chez les patients atteints de^{BPCO 50}. Des études antérieures ont montré que certains médicaments peuvent améliorer la sensibilité au GC. Par exemple, la combinaison d’azithromycine et de budésonide produit un effet inhibiteur nettement plus important sur la production d’IL-4 et de CXCL8 que l’un ou l’autre agent^{seul, 51}.

Notamment, la présente étude a révélé que dans les modèles murins de BPCO exposés à la fumée de cigarette et dans les modèles de cellules BEAS-2B induits par l’ECS, la combinaison de β-sitosterol avec DEX produisait des effets inhibiteurs significativement plus forts sur les facteurs inflammatoires, le stress oxydatif et la sénescence cellulaire que la DEX seule. Cette combinaison a également considérablement renforcé l’efficacité protectrice de DEX contre les modifications pathologiques liées à la BPCO et les lésions des cellules épithéliales bronchiques chez la souris. Ce résultat suggère que le β-sitotérol pourrait améliorer la sensibilité des cellules épithéliales bronches à la DEX, offrant une approche novatrice pour traiter l’insensibilité ou la résistance à la GC chez certains patients atteints de BPCO. Conformément aux résultats de la PCR quantitative in vitro , le β-sitosterol élève les niveaux d’ARNm de la GR de manière dépendante de la concentration, plutôt que de servir directement comme agoniste ou antagoniste de la GR. L’efficacité de réduction du si-GR vérifiée et les tests de sauvetage fonctionnel confirment également que le β-sitosterol améliore la réactivité cellulaire au GC en augmentant les niveaux totaux intracellulaires de GR plutôt qu’en activant directement la GR, générant ainsi des effets thérapeutiques accrus lorsqu’ils sont combinés avec DEX, un agoniste canonique de la GR. En conséquence, les changements d’expression de la RG pourraient être liés à l’action du β-sitosterol, ce qui est cohérent avec des observations antérieures d’une réduction significative de la RG et de son isoforme active GRα dans les cellules musculaires lisses des voies respiratoires chez des patients atteints de^{BPCO 52}. Il est important de noter que les expériences de knockdown de la RG ont également révélé le rôle central de ce récepteur dans la cytoprotection médiée par le β-sitosterol, indiquant que certaines fonctions biologiques du β-sitosterol dépendent de l’intégrité de la voie de la RG.

Pris ensemble, la présente étude révèle non seulement que la RG pourrait jouer un rôle clé de médiateur du β-sitosterol dans l’intervention contre la BPCO, mais offre également une nouvelle approche potentielle pour surmonter le défi clinique de la résistance à la DEX, posant ainsi les bases expérimentales pour le développement de thérapies complémentaires naturelles ciblant la voie de la RG.

Cependant, la présente étude présentait plusieurs limitations. Premièrement, la fonction pulmonaire n’a été évaluée que pour confirmer l’établissement réussi du modèle murin de BPCO, et les colorations hématoxyline-éosine (HE) et Masson n’ont pas été réalisées pour vérifier davantage les caractéristiques pathologiques typiques, notamment l’emphysème, le remodelage des voies respiratoires et l’hypersécrétion de mucus. Comme tous les échantillons pulmonaires fixes ont été consommés lors des expériences précédentes, la reconstruction du modèle murin de la MPOC induite par la fumée de cigarette à 12 semaines n’a pas été réalisable dans la période d’étude disponible. Pour répondre partiellement à cette limitation, le rapport MMP-9/TIMP-1 et les niveaux d’expression d’ARNm MUC5AC ont été quantifiés à l’aide d’échantillons d’ARN pulmonaire préservés. Deuxièmement, seule une dose combinée de β-sitosterol et de DEX a été évaluée in vivo, et les effets dose-réponse ou synergiques n’ont pas été systématiquement étudiés. D’autres études intégrant plusieurs combinaisons de doses sont nécessaires pour caractériser les interactions synergiques potentielles. Troisièmement, en raison des contraintes expérimentales et des coûts de recherche, seulement six souris étaient incluses dans chaque groupe. La taille relativement faible de l’échantillon a pu avoir augmenté la susceptibilité à la variabilité interanimale et limité la robustesse statistique des résultats. De futures études avec des échantillons plus importants sont nécessaires pour valider davantage les résultats actuels. Quatrièmement, les lignées cellulaires stables résistantes à la DX n’ont pas été établies ; Par conséquent, la capacité du β-sitosterol à inverser la résistance établie aux glucocorticoïdes n’a pas pu être évaluée directement. Des études supplémentaires utilisant des modèles validés résistants aux glucocorticoïdes sont nécessaires pour approfondir ce mécanisme potentiel.

En conclusion, ces résultats suggèrent que la signalisation de la RG pourrait être impliquée dans les effets protecteurs du β-sitosterol contre les lésions induites par l’ECS chez les cellules BEAS-2B, notamment l’inhibition de la libération de facteurs inflammatoires, le stress oxydatif et la sénescence cellulaire, ainsi que des améliorations de la fonction pulmonaire et des biomarqueurs des lésions pulmonaires. De plus, le β-sitosterol a renforcé la sensibilité thérapeutique de ces cellules à la DEX. Collectivement, ces résultats identifient le β-sitosterol comme une molécule candidate naturelle potentielle pouvant contribuer au développement de nouvelles stratégies thérapeutiques pour la MPOC.

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
BEAS-2B human bronchial epithelial cells	SunnCell, China	SC-0218	Ligne cellulaire d'épithélium bronchique humain pour l'étude in vitro
C57BL/6 mice	Vital River Laboratories, China	213	Modèle animal pour expérience in vivo de BPCO
CB-DOCK2	China	https://cadd.labshare.cn/cb-dock2/php/index.php	pour la simulation de dock moléculaire entre ligand et protéine récepteur
Cell Counting Kit-8 (CCK-8)	Beyotime Biotechnology, China	C0038	Détection de la viabilité et de la prolifération cellulaire
CellEvent™ Senescence Green Detection Kit	Thermo Fisher, USA	C10851	Détection de la sénescence cellulaire
Cigarettes	Hongta, China	Not provided	Cigarette utilisée pour l'exposition à la fumée et la préparation du CSE
CTD	USA	https://ctdbase.org/	pour récupérer les gènes liés à la BPCO
DCFH-DA fluorescent probe	Sigma-Aldrich, USA	D6883-50MG	Détection du niveau de ROS intracellulaire
Dexamethasone (DEX)	Yeasen, China	40323ES03	Glucocorticoïde pour l'intervention combinée
DMEM/F12 medium	Gibco, USA	11330032	Milieu de base pour la culture cellulaire BEAS-2B
Fetal bovine serum (FBS)	Gibco, USA	10270106	Supplément pour le milieu de culture cellulaire
GraphPad Prism	GraphPad Software, USA	9.3.1	Analyse statistique des données et dessin de graphiques
Isoflurane	RWD Life Science, China	R510-22-10	Anesthésique inhalé pour l'euthanasie animale
Lipid Peroxidation MDA Assay Kit	Beyotime Biotechnology, China	S0131S	Détection de la teneur en malondialdehyde (MDA) intracellulaire
Lipofectamine 2000	Thermo Fisher, USA	11668030	Réactif de transfection pour la livraison de siRNA
Multimode microplate reader	Thermo Fisher, USA	VL0000D0	Détection de la valeur d'absorbance et de fluorescence
Navios EX Flow Cytometer	Beckman Coulter, USA	B80912	Analyse des ROS et des cellules sénescentes
Penicillin/streptomycin	HyClone, USA	SV30010	Antibiotiques pour prévenir la contamination bactérienne
Power SYBR™ Green Master Mix	Thermo Fisher, USA	4367659	Amplification PCR quantitative fluorescente
PrimeScript™ RT reagent Kit	Takara, Japan	RR037Q	Transcription inverse pour la synthèse de l'ADNc
PubChem database	USA	https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/	pour acquérir la séquence SMILES canonique et télécharger les informations structurelles 3D SDF du bêta-sitostérol
QuantStudio Dx PCR Instrument	Thermo Fisher, USA	4479889	Détection RT-qPCR en temps réel
RCSB PDB	USA	https://www.rcsb.org/	pour obtenir le fichier de structure 3D du cristal GR
RNA/Protein Isolation Kit	Beyotime Biotechnology, China	R0018S	Extraction d'ARN total à partir de cellules et de tissus pulmonaires
si-GR	Designed in silico via siDirect 2.1	Custom synthesis	Guide: 5′-UUUUGAAUGGGUGUAGCAA-3′; Passager: 5′-GCUUUCACCCAUUCAAAAGG-3′, knockdown pour GR
si-NC	Thermo Fisher, USA	4390843	utilisé comme contrôle de transfection négatif pour les tests cellulaires et in vivo
SwissTargetPrediction database	Switzerland	http://swisstargetprediction.ch/	pour la prédiction in silico des cibles protéiques potentiellement liées aux médicaments
TCMSP database	China	https://www.tcmsp-e.com/	pour le criblage des ingrédients à base de plantes et la prédiction des cibles
TTD	Singapore	https://db.idrblab.net/ttd/	pour la collecte de gènes de maladie associés à la BPCO validés
Whole-body smoke exposure chamber	Teague Enterprise, USA	TE-2	Établissement d'un modèle de BPCO induite par la fumée de cigarette
β-sitosterol	ChemicalBook, China	83-46-5	Phytostérol actif pour le traitement médicamenteux