L’objectif de ce protocole est de faciliter l’analyse fonctionnelle des interactions parasitoïde–hôte chez Asobara japonica et Drosophila melanogaster. Grâce à des méthodes d’élevage optimisées, un test d’infection à ovoposition unique et un knockdown génétique médié par l’ARNi.
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Article de méthode
Protocoles pour l’élevage efficace et l’analyse fonctionnelle de la guêpe endoparasitoïde Asobara japonica et de son hôte Drosophila melanogaster
Dans cet article
Résumé
Résumé
Le parasitisme est une interaction biologique dans laquelle un organisme exploite le corps ou les ressources d’un autre (l’hôte), entraînant des dommages importants ou la mort de l’hôte. Parmi les animaux parasites, les guêpes parasitoïdes sont l’une des lignées les plus riches en espèces, représentant près de 20 % de toutes les espèces d’insectes. En particulier, les guêpes endoparasitoïdes ovipositent directement dans le corps de l’hôte et déploient une grande variété de facteurs venineux pour manipuler le développement, l’immunité et la physiologie de l’hôte. En réponse à une attaque de guêpe, les hôtes tentent d’éliminer les œufs parasitoïdes par des mécanismes immunitaires innés. Cependant, les mécanismes moléculaires et cellulaires par lesquels les composants du venin individuels modulent la biologie de l’hôte et favorisent un parasitisme efficace restent peu compris. Ici, nous décrivons un protocole de laboratoire standardisé pour l’élevage de la guêpe endoparasitoïde Asobara japonica et de son hôte Drosophila melanogaster. Des souches parthénogénétiques et sexuées d’A. japonica sont disponibles, et la souche parthénogénétique présente un taux de réussite parasitaire élevé, permettant un maintien stable des stocks de laboratoire pour l’analyse du génome et les tests de parasitisme. Un test d’infection à ovoposition simple et une méthode de knockdown génétique à double brin à base d’ARN ont été optimisés pour l’analyse fonctionnelle des gènes venineux. Ensemble, ces protocoles fournissent un cadre expérimental pratique pour disséquer les mécanismes moléculaires sous-jacents aux interactions parasitoïde-hôte et faciliteront les recherches futures en biologie du développement, immunologie et physiologie.
Introduction
Le parasitisme est un mode de vie dans lequel un organisme exploite les ressources nutritionnelles d’un autre et est répandu dans tous les taxons. On estime que jusqu’à la moitié de tous les organismes connus présentent du parasitisme au cours de leur cyclede vie 1. Parmi les parasites, les guêpes parasitoïdes constituent un groupe particulièrement diversifié, représentant environ 20 % de tous lesinsectes 2. Ils exploitent une large gamme d’hôtes arthropodes, tels que les insectes, les araignées et les acariens, et présentent une diversité remarquable dans leur cycle de vie et leurs stra....
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Protocole
Un aperçu schématique de la méthode d’élevage synchronisé pour D. melanogaster et A. japonica est présenté à la Figure 1.
1. Élevage de la mouche hôte Drosophila melanogaster en laboratoire
- Maintenez tous les animaux d’expérimentation à 25 °C et une humidité relative de 50-60 % selon un cycle clair/obscurité de 12:12. Utilisez la souche sauvage Oregon-R (OR) comme hôte pour A. japonica (Figure 2A).
- Transférer les mouches adultes dans un nouveau flacon alimentaire contenant u....
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Résultats
Les souches asexuées et sexuelles d’Asobara japonica
A. japonica est largement répandue à travers le Japon. Les souches parthénogénétiques de Thelytokous prédominent dans les îles principales, tandis que les souches sexuelles d’Arrhenotokous se trouvent dans les îles subtropicales, notamment les îles Amami-Oshima et Iriomote-jima 8,12. Dans les souches sexuées, les mâles émergent quelques jo.......
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Discussion
Dans cette étude, nous avons mis en place une plateforme expérimentale polyvalente pour étudier les interactions parasitoïde-hôte au niveau moléculaire. En optimisant les conditions d’élevage, un test d’infection à oviposition unique et le protocole ARNi, nous fournissons un système robuste pour les études fonctionnelles de facteurs dérivés des parasitoïdes. Cette plateforme facilitera de futures études visant à découvrir les mécanismes par lesquels les guêpes parasitoïdes manipulent le .......
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Déclarations de divulgation
Nous n’avons aucun conflit d’intérêts à divulguer.
Remerciements
Les auteurs tiennent à remercier Kanata Tachibana, Shion Kudo, Toshiya Makino, Shunta Yorimoto, Shuji Shigenobu, Akiko Kawamura, Ari Fujinoki et Masako Iida pour leur assistance technique. Nous remercions également tous les autres membres de notre laboratoire.
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Matériaux
| Nom | Entreprise | Numéro de catalogue | Commentaires |
|---|---|---|---|
| 50 mL tube | Greiner Bio-One | 210261 | Infection assay |
| 1 mL syringe | TERUMO | SS-01T | dsRNA injection |
| Agar | Daisin, Ltd. | P-700 | Rearing |
| Asnol Petri Dish φ40×13.5mm | As One Corporation | 1-8549-01 | Infection assay |
| Asnol Petri Dish φ55×17mm | As One Corporation | 1-8549-02 | dsRNA injection |
| Blue dye (Erioglaucine disodium salt) | Sigma-Aldrich Co. Llc. | 861146-25G | dsRNA injection |
| Butyl p-Hydroxybenzoate | Nacalai Tesque, Inc. | 06327-15 | Rearing |
| CO2 pressure regulator | YAMATOSANGYO | YR-507F-2 | Infection assay |
| Confocal laser scanning microscope | Zeiss | LSM700 | Image analysis |
| Corn meal | Sunny Maize Co., Ltd. | No.4M | Rearing |
| DAPI | Thermo Fisher Scientific Inc. | PI62247 | Nuclei staining, 1:10000 |
| Deionized water | Millipore Inc. | ZLXEV030WW | Infection assay |
| Dual-Stage Glass Micropipette Puller | Narishige | PC-10 | dsRNA injection |
| Fiji | NA | https://fiji.sc | Image analysis |
| Filter paper | Advantec | ITEM 526 | Rearing |
| Fly food vial | Chiyoda Science Co., Ltd. | KFB-3M | Rearing |
| Fly food vial plug | Chiyoda Science Co., Ltd. | AS-275 | Rearing |
| Forceps | Dumont Biologie | 11252-20 | Dissection |
| Freezer, -20 °C | Nihon Freezer | GS-3120HC | Sample storage |
| Freezer, -80 °C | Nihon Freezer | CLN-52UD2 | Sample storage |
| Glass slides | Matsunami Glass Ind., Ltd | S7213 | Infection assay |
| Glucose | Showa Sangyo Co., Ltd. | Not availavle | Rearing |
| KOD Plus Neo | Toyobo | KOD-401 | dsRNA synthesis |
| Incubator | Panasonic | MIR-254-PJ | Rearing |
| Ligation high Ver.2 | Toyobo | LGK-201 | dsRNA synthesis |
| Micropipette Grinder | Narishige | EG-401 | dsRNA injection |
| Mineral oil | Nacalai Tesque, Inc. | 23306-84 | dsRNA injection |
| Nanoject III | Drummond Scientific Company | 3-000-207 | dsRNA injection |
| Nanoject Glass Capillaries | Drummond Scientific Company | 3-000-203-G/X | dsRNA injection |
| pBluescript KS (+) plasmid | Not availavle | Not availavle | dsRNA synthesis |
| pBluescript SK (-) plasmid | Not availavle | Not availavle | dsRNA synthesis |
| PrimeScript reverse Transcriptase | Takara | 2680A | dsRNA synthesis |
| Propionic acid | Nacalai Tesque, Inc. | 29018-55 | Rearing |
| PROWIPE | Daio Paper Corporation | 2-2624-02 | Infection assay, dsRNA injection. |
| ReverTra Ace qPCR RT Master Mix with gDNA Remover | Toyobo | FSQ-301 | qRT-PCR |
| RNAiso Plus reagent | Takara | 9108 | qRT-PCR |
| Small vial (Test tube 12 mL) | Sarstedt | REF 58.487 | Infection assay |
| Small vial plug | Chiyoda Science Co., ltd. | QD-S4 | Infection assay |
| Spatula | As One Corporation | 6-522-02 | Rearing |
| Square petri dish | Eiken Chemical Co., Ltd. | 64-2192-55, AW2000 | dsRNA injection |
| Stereomicroscope | Leica Microsystems | lvesta3 (C-Mount) | Infection assay |
| Stereomicroscope | Nikon Solutions Co., Ltd. | SMZ1000 | dsRNA injection |
| T7 RiboMAX Express RNAi System | Promega | P1700 | dsRNA synthesis |
| Thermal Cycler Dice Real Time System | Takara | TP815 | qRT-PCR |
| Thermal Cycler GeneAtlas | Astel | G02 | dsRNA synthesis, qRT-PCR |
| THUNDERBIRD SYBR qPCR Mix | Toyobo | QPS-201 | qRT-PCR |
| TissueLyser II | Qiagen | Not availavle | qRT-PCR |
| Vitamin C, L-Ascorbic Acid | Nacalai Tesque, Inc. | 03420-65 | Rearing |
| Welch's grape 100 juice | Asahi Soft drinks Co., Ltd. | 32390 | Infection assay |
| Yeast | Asahi Group Foods, Ltd. | HB-P02 | Rearing |
Références
- Hasik AZ, et al. Parasitism as a driver of host diversification. Nat Rev Biodivers. 2025;1(6):401-410.
- Pennacchio F, Strand MR. Evolution of developmental strategies in parasitic Hymenoptera. Annu Rev Entomol. 2006;51:233-258.
- Quicke DL. Parasitic Wasps. 1997:221-255.
- Moreau S, Asgari S. Venom proteins from parasitoid wasps and their biological functions. Toxins. 2015;7(7):2385-2412.
- Huang J, Chen XX, Zhan S. Molecular mechanisms underlying parasitoid-derived host manipulation strategies. Annu Rev Entomol. 2026;71:51-68.
- Belokobylskij SA. Key to the Insects of Russian Far East. Tribe Alysiini. In: Ler PA, ed. 1998;4(3):163-....
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Réimpressions et autorisations
