Protocoles pour l’élevage efficace et l’analyse fonctionnelle de la guêpe endoparasitoïde Asobara japonica et de son hôte Drosophila melanogaster

Summary

L’objectif de ce protocole est de faciliter l’analyse fonctionnelle des interactions parasitoïde–hôte chez Asobara japonica et Drosophila melanogaster. Grâce à des méthodes d’élevage optimisées, un test d’infection à ovoposition unique et un knockdown génétique médié par l’ARNi.

Abstract

Le parasitisme est une interaction biologique dans laquelle un organisme exploite le corps ou les ressources d’un autre (l’hôte), entraînant des dommages importants ou la mort de l’hôte. Parmi les animaux parasites, les guêpes parasitoïdes sont l’une des lignées les plus riches en espèces, représentant près de 20 % de toutes les espèces d’insectes. En particulier, les guêpes endoparasitoïdes ovipositent directement dans le corps de l’hôte et déploient une grande variété de facteurs venineux pour manipuler le développement, l’immunité et la physiologie de l’hôte. En réponse à une attaque de guêpe, les hôtes tentent d’éliminer les œufs parasitoïdes par des mécanismes immunitaires innés. Cependant, les mécanismes moléculaires et cellulaires par lesquels les composants du venin individuels modulent la biologie de l’hôte et favorisent un parasitisme efficace restent peu compris. Ici, nous décrivons un protocole de laboratoire standardisé pour l’élevage de la guêpe endoparasitoïde Asobara japonica et de son hôte Drosophila melanogaster. Des souches parthénogénétiques et sexuées d’A. japonica sont disponibles, et la souche parthénogénétique présente un taux de réussite parasitaire élevé, permettant un maintien stable des stocks de laboratoire pour l’analyse du génome et les tests de parasitisme. Un test d’infection à ovoposition simple et une méthode de knockdown génétique à double brin à base d’ARN ont été optimisés pour l’analyse fonctionnelle des gènes venineux. Ensemble, ces protocoles fournissent un cadre expérimental pratique pour disséquer les mécanismes moléculaires sous-jacents aux interactions parasitoïde-hôte et faciliteront les recherches futures en biologie du développement, immunologie et physiologie.

Introduction

Le parasitisme est un mode de vie dans lequel un organisme exploite les ressources nutritionnelles d’un autre et est répandu dans tous les taxons. On estime que jusqu’à la moitié de tous les organismes connus présentent du parasitisme au cours de leur cycle^{de vie 1}. Parmi les parasites, les guêpes parasitoïdes constituent un groupe particulièrement diversifié, représentant environ 20 % de tous les^{insectes 2}. Ils exploitent une large gamme d’hôtes arthropodes, tels que les insectes, les araignées et les acariens, et présentent une diversité remarquable dans leur cycle de vie et leurs stratégies^{parasitaires 3}. Ces caractéristiques font des guêpes parasitoïdes l’un des groupes d’insectes les plus réussis sur le plan évolutif et écologique.

Les interactions entre parasitoïdes et leurs hôtes ont été largement étudiées comme systèmes modèles de « courses aux armements » évolutives. En particulier, les guêpes endoparasitoïdes utilisent une grande variété de facteurs, notamment les venins, les virus symbiotiques et les^{tératocytes 4,5}. Ces facteurs manipulent la physiologie et le développement de l’hôte, assurant ainsi un développement réussi au sein de l’hôte. Malgré ces avancées, les mécanismes moléculaires sous-jacents au parasitisme restent mal compris chez la plupart des espèces parasitoïdes. Une limitation majeure est leur petite taille corporelle, ce qui a entravé l’identification biochimique des composants du venin. De plus, il est techniquement difficile de maintenir les parasitoïdes et leurs hôtes avec des stades de développement synchronisés en conditions de laboratoire.

Les avancées récentes dans le séquençage de nouvelle génération et d’autres technologies omiques permettent désormais des analyses à l’échelle du génome, même chez de très petites espèces parasitoïdes. Ces approches ont ouvert de nouvelles voies pour étudier des mécanismes moléculaires auparavant inaccessibles, permettant d’étudier les interactions parasitoïde-hôte à une résolution sans précédent. Dans ce contexte, notre laboratoire se concentre sur Asobara japonica Belokobylskij  (Hymenoptera : Braconidae), une espèce initialement identifiée au^{Japon 6,7,8}. A. japonica comprend une souche parthénogénétique thelytokous, dans laquelle les femelles produisent une descendance sans accouplement. Cette caractéristique nous permet de collecter des quantités substantielles d’ADN génomique génétiquement uniforme pour le séquençage du génome^{entier 9}. De plus, cette espèce parasite un large éventail d’espèces de Drosophila, y compris l’organisme modèle D. melanogaster,  qui offre d’importants avantages expérimentaux grâce à ses conditions d’élevage bien établies et à des stades de développement précisément définis, permettant des tests d’infection reproductibles et un contrôle précis du développement^{parasitoïde 10}.

Lors du parasitisme d’A. japonica, une guêpe femelle injecte du venin avec un œuf unique dans une larve de mouche, à l’intérieur duquel une larve de guêpe pousse aux côtés de son hôte. Notamment, A. japonica présente un taux de réussite de parasitisme élevé sur l’hôte D. melanogaster, faisant de ce couple parasitoïde-hôte un modèle expérimental puissant. Ici, nous décrivons les protocoles pour un élevage stable, un test d’infection à oviposition simple, et une méthode de knockdown génétique basée sur l’ARN double brin (dsRNA) chez A. japonica. Ces protocoles fournissent un cadre fiable pour disséquer les mécanismes moléculaires sous-jacents aux interactions parasitoïde-hôte.

Protocol

Un aperçu schématique de la méthode d’élevage synchronisé pour D. melanogaster et A. japonica est présenté à la Figure 1.

1. Élevage de la mouche hôte Drosophila melanogaster en laboratoire

1. Maintenez tous les animaux d’expérimentation à 25 °C et une humidité relative de 50-60 % selon un cycle clair/obscurité de 12:12. Utilisez la souche sauvage Oregon-R (OR) comme hôte pour A. japonica (Figure 2A).
2. Transférer les mouches adultes dans un nouveau flacon alimentaire contenant un milieu standard de semoule de maïs, levure et agar (0,55 % d’agar, Tableau 1). Étiquetez le flacon avec la date de transfert et le nom de la souche « OR ».
3. Éliminez ces mouches adultes un jour après le transfert pour éviter un nombre excessif d’œufs dans la nourriture. Assurez-vous que les larves de la progéniture se nourrissent à la surface de la nourriture.
   REMARQUE : À titre de recommandation, maintenez environ 200 à 250 œufs par flacon alimentaire (φ30×100 mm). Des densités d’œufs plus élevées peuvent réduire le succès du parasitisme et augmenter la variation du développement de l’hôte et des guêpes.
4. Quatre jours après l’étape 1.2, transférez une cuillerée de larves de mouches (4 jours après la ponte, dAEL) dans un nouveau flacon alimentaire. Gardez ces larves à l’écart des parasitoïdes pour la prochaine génération. Cette procédure aide également à contrôler la densité larvaire de l’hôte dans un flacon.

2. Élevage de la guêpe endoparasitoïde Asobara japonica en laboratoire

1. Utilisez une souche partenogénétique Tokyo (TK) et une souche sexuelle Iriomote-jima (IR) (Figure 2B). La première est composée de femmes, tandis que la seconde est composée de femmes et de mâles. Les mâles émettent deux à quatre jours avant les femelles. Par conséquent, confirmez la présence des femelles par leurs ovipositeurs avant le transfert.
2. Transférez 10 à 20 guêpes adultes directement du flacon de stock vers le flacon contenant des larves de mouches à 4 dAEL. Étiquetez le flacon avec la date de transfert et le nom de la souche « TK » ou « IR ». Maintenez les guêpes dans les mêmes conditions que l’étape 1.1.
3. Laissez les guêpes adultes pondre des œufs dans les larves de mouches. Éliminez ces guêpes un à deux jours plus tard pour éviter le superparasitisme, qui peut entraîner la mort de l’hôte. Retirez les mouches adultes éclosées qui ont échappé au parasitisme 10 jours ou plus après l’étape 2.2.
4. Deux semaines après l’étape 2.2, les guêpes adultes commencent à s’écloquer de la pupe de la mouche hôte. Transférez ces guêpes adultes nouvellement fermées dans un nouveau flacon contenant du papier filtre contenant 25 % de glucose et une solution de 50 mM de vitamine C. Les feuilles de papier filtre doivent être stérilisées à 130 °C pendant 2 heures. Fournir la solution sur du papier filtre favorise les comportements d’oviposition et prolonge la durée de vie des guêpes adultes. Notre approche pour utiliser la vitamine C afin d’améliorer l’oviposition a été inspirée par les observations des études sur Drosophila ¹¹.

3. Essai d’infection à oviposition simple

1. Synchronisez le stade de développement des larves de mouches utilisées pour l’expérience d’infection.
   1. Placez les mouches adultes dans un tube de 50 mL contenant une assiette d’agar de jus de raisin (3 % d’agar) tartinée de pâte de levure fraîche et laissez-les pondre pendant 24 heures.
   2. Collectez les larves de premier stade fraîchement écloses sur l’assiette d’agar de jus de raisin et transférez-les dans un petit flacon (12 mL) contenant 2 à 3 g de pâte alimentaire pour mouches (nourriture pour mouches mélangée à une quantité appropriée d’eau). 20 à 30 larves sont placées dans le flacon. Les larves de mouches sont laissées croître à 25 °C.
2. Au moment opportun, préparez une boîte de Petri de 4 cm contenant une fine couche uniforme de pâte alimentaire pour mouches couvrant une zone d’environ 1,5 à 2,0 cm de diamètre (ci-après appelée arène d’analyse d’infection). En plus de l’arène d’analyse d’infection, préparez un nouveau petit flacon (12 mL) contenant une quantité appropriée de pâte alimentaire pour mouches. Ce flacon est utilisé pour élever les larves hôtes après le test d’infection.
3. Collecter les larves à étages et les transférer dans un plat contenant de l’eau déionisée (résistivité = 15 MΩ·cm, 25 °C). Rincez les larves dans la gamelle avec une agitation douce pour éliminer les résidus de nourriture de leur corps.
4. Après rinçage, retirez doucement l’excès d’humidité des larves à l’aide de lingettes en papier sans peluches, car l’excès d’eau interfère avec le comportement d’oviposition des guêpes dans l’arène du test d’infection. Ensuite, transférez les larves dans l’arène. Cette étape augmente l’activité larvaire pendant l’expérience d’infection.
5. Anesthésiez les guêpes adultes avec du gaz CO₂ à un débit de 5 L·^min-1 et une pression de 0,2 MPa. Ensuite, placez doucement environ trois femelles guêpes dans l’arène du test d’infection. Fermez le couvercle du plat et laissez-les récupérer sur la pâte de mouches.
6. Observez le comportement d’oviposition de ces guêpes sous un stéréomicroscope (zoom : 10× à 15×).
   REMARQUE : Lorsqu’une guêpe touche le corps larvaire d’une mouche en mouvement, elle insère rapidement son ovipositeur dans le corps de la mouche et injecte des composants venineux. Bien que la larve de mouche se tord et se débatte sur son corps, elle devient immédiatement paralysée. Par la suite, la guêpe fait vibrer son abdomen et dépose un œuf dans le corps larvaire de l’hôte, après quoi l’ovipositeur est retiré. Ce comportement d’oviposition est appelé infection.
7. Après l’infection, ouvrez le couvercle et transférez la larve de mouches infectée dans le nouveau petit flacon contenant de la pâte alimentaire préparée à l’étape 3.2. Pour standardiser le moment de l’infection, réalisez l’expérience d’infection dans les 15 minutes.
8. Étiquetez le petit flacon avec des informations expérimentales, telles que la date, le nom de l’échantillon, l’heure d’infection et le nombre d’individus. Ces fioles sont bouchées puis placées dans un récipient humide et conservées à 25 °C.

4. Génération de guêpes par interférence ARN (ARNi) par injection dsRNA

1. Synthétiser des dsRNA de 400 pb ou plus pour un knockdown génique médié par dsRNA (interférence ARN, ARNi) à l’aide d’un système de synthèse dsRNA basé sur la transcription in vitro . Les échantillons dsRNA doivent être maintenus à -20 à -80 °C jusqu’à utilisation. Les protocoles détaillés sont ceux décrits précédemment⁹.
2. Préparez une boîte de Petri de 5,5 cm contenant 2 % d’agar pour placer les corps des guêpes. Remplissez les deux tiers de chaque plat d’agar pour générer une épaisse couche de plaque d’agar pour l’injection.
3. Placez une lingette en papier sans peluches, humidifiée à l’eau, sur le couvercle d’un plat en plastique.
4. Collectez les chrysalides de mouches hôtes 7 jours après l’infection (dpi) à partir du flacon et placez-les sur les lingettes en papier sans peluche préparées à l’étape 4.3. Ajouter une goutte d’eau à la paroi du flacon aide à détacher les chrysalides de mouches hôtes du flacon.
5. Sous le stéréomicroscope (zoom : 20×), retirez la pupe de la mouche hôte et exposez le corps de la guêpe avec une pince. À 7 dpi, la plupart des guêpes sont au stade nymphal, où la tête, le thorax et l’abdomen sont distincts. Le corps d’une guêpe est immobile.
6. Placez les corps de guêpes récupérés sur la plaque d’agar préparée à l’étape 4.2, en alignant leurs axes corporels dans la même orientation. Disposez 20 à 30 corps de guêpes avec leur côté dorsal vers le haut en une à deux lignes. Enlevez l’excès d’humidité sur la plaque d’agar à l’aide d’une lingette en papier sans peluches pour éviter que les guêpes ne glissent.
7. Suivant les instructions du fabricant, installez l’appareil d’injection et le stéréomicroscope (Figure 3A). Utilisez un système de microinjection équipé d’une aiguille capillaire en verre qui permet un contrôle précis du volume et de la vitesse d’injection. Placez la plaque d’agar dans laquelle les têtes de la guêpe sont orientées vers la pointe de l’aiguille d’injection. Le volume d’injection est de 50 nL·^wasp-1 et la vitesse d’injection est de 50 nL·^sec-1 sur l’injecteur.
8. Préparez des aiguilles capillaires en verre à l’aide d’un extracteur d’aiguilles. La forme du capillaire en verre est réglée avec la température du chauffage.
9. Placez l’aiguille capillaire en verre sur le meuleur à aiguilles à un angle de 30-35°. Meuler l’aiguille jusqu’à ce que la longueur de la pointe atteigne 0,04 mm (quatre divisions sur le réticule de l’oculaire, Figure 3B).
10. Juste avant l’injection, décongelez l’ARNd. La concentration dsRNA est de 0,25-1 μg·^μL-1. Pour visualisation, la solution dsRNA est colorée avec un colorant bleu (sel disodium d’Erioglaucine, 2 % poids-volume-1). À l’aide d’une pointe de pipette microchargeuse, remplissez le capillaire en verre avec une solution dsRNA avec un colorant bleu. 4 μL suffisent pour injecter 30 corps de guêpes. Assurez-vous qu’aucune bulle d’air n’est présente à l’intérieur de la solution.
    REMARQUE : Après avoir chargé la solution dsRNA, tapotez doucement le côté de l’aiguille avec un ongle pour éliminer les bulles d’air emprisonnées. Les bulles d’air résiduelles peuvent obstruer le flux de la solution et interférer avec une injection réussie.
11. À l’aide d’une seringue de 1 mL et d’une aiguille, remplissez la partie libre du capillaire en verre d’huile minérale, afin de veiller à ce qu’aucune bulle d’air ne reste à l’intérieur du capillaire.
12. Fixez l’aiguille capillaire en verre contenant la solution dsRNA et l’huile minérale sur le porte-aiguille, puis montez-la sur le dispositif d’injection.
13. Ajustez la position de la plaque d’agar et de l’aiguille capillaire en verre sur l’injecteur, de sorte que l’aiguille en verre soit positionnée à un angle de 30 à 45° par rapport aux corps de la guêpe (Figure 3A).
14. Insérez l’aiguille capillaire en verre dans le côté dorsal du corps de la guêpe, avec le côté légèrement latéral par rapport à la ligne médiane dorsale. Microinjectez la solution dsRNA à l’intérieur du corps. La solution dsRNA injectée est visible avec un colorant  bleu (Figure 3C).
15. Après l’injection, placez les plaques d’agar dans un récipient humide (70-80 % d’humidité relative) et maintenez-les dans un incubateur à 25 °C pendant une semaine, jusqu’à la naissance des guêpes adultes. Les corps de guêpes blessés doivent être retirés de la plaque d’agar pour éviter toute contamination bactérienne.
    POINT DE PAUSE : À l’étape 4.6, les chrysalides de la guêpe peuvent être maintenues sur la plaque d’agar pendant plusieurs heures avant l’injection. Les aiguilles peuvent être préparées à l’avance (Étapes 4.8 et 4.9) ; Cependant, elles ont tendance à se boucher avec le temps. Les aiguilles fraîchement préparées offrent généralement une performance d’injection plus fiable.

Results

Les souches asexuées et sexuelles d’Asobara japonica
A. japonica est largement répandue à travers le Japon. Les souches parthénogénétiques de Thelytokous prédominent dans les îles principales, tandis que les souches sexuelles d’Arrhenotokous se trouvent dans les îles subtropicales, notamment les îles Amami-Oshima et Iriomote-jima ^8,12. Dans les souches sexuées, les mâles émergent quelques jours plus tôt que les femelles, de sorte que le moment du transfert des adultes est distinct entre ces souches. La parthénogenèse de Thelytokous chez A. japonica est induite par une infection à Wolbachia, une bactérie endosymbiotique à transmission^{maternelle 13}. L’élimination de Wolbachia par traitement antibiotique entraîne la production de mâles ^9,14, et la transplantation de Wolbachia en souches sexuelles induit la parthénogenèse¹⁵. Les souches asexuées et sexuées d’A. japonica présentent un fort succès parasitaire chez plusieurs espèces de Drosophila. Par exemple, ils peuvent parasiter D. suzukii, un ravageur fruitier économiquement important, et sont considérés comme des agents potentiels de lutte biologique en^{agriculture 16}. Parmi les souches disponibles, nous avons principalement utilisé la souche TK infectée par Wolbachia pour nos expériences. La souche TK présente une activité parasitaire plus élevée envers les larves hôtes que la souche^{IR 14}, ce qui la rend adaptée à des analyses.

Le succès du parasitisme dépend des conditions d’élevage
Le taux de réussite du parasitisme chez A. japonica est généralement élevé, mais il est fortement influencé par l’état d’élevage des mouches hôtes. Dans des conditions pauvres en nutriments, la période de croissance des larves de mouches est prolongée et le moment de la pupariation est^{retardé de 17}. Dans ces conditions, les guêpes peuvent ne pas exploiter correctement les ressources hôtes et ne pas synchroniser leur développement avec celui des hôtes. Pour examiner cette possibilité, nous avons élevé des mouches et des guêpes dans des conditions de levure normale (1×) et pauvre en levures (0,1×). Nous avons ensuite évalué le succès du parasitisme et le moment du développement (Figures 2C, 2D). Le succès parasitaire a été calculé comme le ratio des guêpes adultes émergées par rapport aux larves hôtes.

Dans des conditions normales de levures, le taux de réussite du parasitisme était de 81,7 % dans le test d’infection à oviposition unique (Figure 2C, à gauche ; Tableau 2). Lorsque la teneur en levure a été réduite à 10 % (condition pauvre en levure), le taux de réussite du parasitisme est tombé à 35,0 % (Figure 2C, à droite ; Tableau 2). Cette réduction peut s’expliquer par le fait qu’environ 50 % des larves hôtes sont mortes après infection. Ces résultats suggèrent que l’allocation des ressources entre l’hôte et le parasitoïde est perturbée dans des conditions pauvres en nutriments.

Notamment, le moment de l’éclosion des guêpes n’a pas été retardé au même degré dans des conditions pauvres en levures qu’en conditions normales. Alors que le moment de l’éclosion des mouches a été retardé jusqu’à 9 jours, celui des guêpes n’a été retardé que de 4 à 5 jours. Ce résultat suggère que la disponibilité des nutriments influence principalement le développement de l’hôte. Le moment de l’éclosion est cohérent aussi bien chez les mouches que chez les guêpes dans des conditions normales de levure, mais pas dans des conditions pauvres en levure, ce qui suggère que le développement synchronisé entre parasitoïdes et hôtes dépend de la disponibilité des nutriments.

Approche basée sur l’ARNi pour l’analyse fonctionnelle des gènes venineux
Bien que les analyses transcriptomiques et protéomiques de la glande venineuse identifient de nombreuses molécules candidates, il reste incertain lesquelles d’entre elles sont nécessaires à la réussite du parasitisme. Pour déterminer les rôles physiologiques de ces molécules candidates, des analyses fonctionnelles in vivo utilisant des approches de knockdown génétique sont nécessaires.

Nous avons récemment rapporté que le parasitisme d’A. japonica induit l’apoptose, l’autophagie et l’arrêt mitotique dans les disques imaginaux des larves de D. melanogaster , entraînant une dégradation sévère des tissus, un phénomène appelé dégradation imaginale des disques (IDD⁾¹⁰. Pour identifier les molécules responsables de la DI, nous avons effectué un criblage ARNi de gènes candidats identifiés à partir d’analyses transcriptomiques, protéomiques et génomiques comparatives. En conséquence, deux gènes, le facteur de dégradation imaginaire du disque (IDDF)-1 et IDDF-2 , ont été identifiés. IDDF-1 et IDDF-2 contiennent tous deux le domaine de fonction inconnue 4803 (DUF4803). Notamment, à la suite de notre rapport initial, une étude indépendante a identifié plusieurs protéines venineuses d’A. japonica (appelées Dégradation induite par le venin, VID) associées à la DI, toutes possédant également le domaine^{DUF4803 18}.

Sur la base de ces résultats, nous avons optimisé davantage le protocole ARNi pour améliorer la reproductibilité et l’efficacité. En particulier, l’utilisation de Nanoject III a permis un contrôle précis du volume et de la vitesse d’injection, aboutissant à des résultats de knockdown plus cohérents.

Pour évaluer l’efficacité du protocole ARNi optimisé, nous avons effectué le knockdown d’IDDF-1. Chez les guêpes adultes éclatées, le niveau d’expression d’IDDF-1 a été significativement diminué par rapport au témoin (Figure 3D). Pour une validation fonctionnelle, nous avons réalisé des tests d’infection à oviposition unique en utilisant ces guêpes ARNi et les larves de mouches hôtes exprimant le rapporteur d’apoptose GC3Ai dans la région¹⁹ de la poche alaire. Un signal GC3Ai a été détecté dans la poche de l’aile après une infection avec des guêpes contrôlées (ARN-GFP ). En revanche, le signal GC3Ai a été significativement réduit après l’infection par les guêpes ARNi IDDF-1 (Figure 3E, 3F). Ces résultats sont cohérents avec les résultats antérieurs, confirmant que la fonction de l’IDDF-1 est effectivement supprimée par l’ARNi.

Figure 1. Aperçu schématique des procédures d’élevage pour D. melanogaster et A. japonica. 
Les procédures par étapes sont montrées selon les stades de développement de D. melanogaster. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figurine.

Figure 2. Parasitisme par Asobara japonica. (A) Schéma de la relation développementale entre D. melanogaster et son parasitoïde A. japonica. Une femelle guêpe dépose des venins et un œuf unique dans une larve de mouche. Après l’éclosion, la larve de la guêpe se développe en parallèle avec la larve hôte, qui se marie par la suite. Après la pupiriation, la guêpe consomme tout le corps de la mouche et finit par s’éclocher à partir de la pupe de la mouche. (B) Guêpes adultes de la souche asexuée (à gauche) et de la souche sexuelle (à droite) de A. japonica. Barre d’écaille, 1 mm. (C) Taux d’émergence des mouches ou guêpes dans des conditions normales (1×) et pauvres en levures (0,1×). Des tests d’infection à ovoposition unique ont été réalisés avec des larves de mouches hôtes 4 jours après la ponte (dAEL). n = 267 (1×, mouches), 120 (0,1×, mouches), 85 (1×, guêpes) et 80 (0,1×, guêpes), respectivement. (D) Synchronisation de l’éclosion des mouches et des guêpes dans les deux conditions nutritionnelles indiquées dans (C). Le ratio adultes/nymphes est indiqué. n = 250, 107, 61 et 41, respectivement. La flèche noire indique le moment de l’infection par la guêpe. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figurine.

Figure 3. Procédure ARN optimisée utilisant Nanoject III. (A) Installation de l’appareil de microinjection sous un stéréomicroscope. L’aiguille capillaire en verre était positionnée à un angle de 30 à 45° par rapport à la plaque d’agar. (B) La pointe de l’aiguille capillaire en verre était aiguisée à l’aide d’un meuleur à aiguilles. (C) Une solution teinte en bleu était microinjectée dans le corps d’une guêpe à l’aide d’une aiguille capillaire en verre. Le côté antérieur de la guêpe est indiqué par A sur l’image. P, postérieur. Barre, 1 mm. (D) Les niveaux d’expression d’IDDF-1 dans les guêpes ARNi GFP et ARNi IDDF-1 ont été quantifiés à l’aide de la méthode delta-delta C_t. Les niveaux d’expression ont été normalisés en RpL32-Aj. Les données représentent la moyenne ± SD avec des points de données individuels (n = 5). P < 0,005 (test t de l’élève). (E et F) Les signaux GC3Ai dans les disques alaires des larves non infectées et des larves hôtes à 6 h post-infection (hpi) suivant l’infection par des guêpes ARNi (GFP ) ou IDDF-1 RNAi. Les disques alaires sont encadrés de lignes pointillées blanches basées sur la coloration DAPI des noyaux (1:10000, 62247 ; Thermo Fisher Scientific). Le rapport entre la surface positive au GC3Ai et la surface de la poche de l’aile a été quantifié. P < 0,005 (ANOVA unidirectionnelle suivie du test de comparaisons multiples de Tukey). n = 11 réplications biologiques par groupe. Barre d’échelle, 100 μm. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Composants	Montant
Eau	1 L
Agar	5,5 g
Levure	40 g
Semoule de maïs	90 g
Glucose	100 g
Acide propionique	3 mL
10 % de butyle p-hydroxybenzoate dans 70 % d’EtOH	3,5 mL

Tableau 1 : Composants du milieu standard de semoule de maïs, levure-agar (nourriture pour mouches).

Type d’alimentation	État	# de l’ensemble des individus	# D’individus éclosés ou morts				Taux d’émergence des mouches ou des guêpes ( %)
			Fly	Wasp	Létale nymphale	Létale larvaire
1×	Non infectés	267	248	0	2	17	92.88389513
	A. japonica infectée	120	0	98	9	13	81.66666667
0,1×	Non infectés	85	38	0	23	24	44.70588235
	A. japonica infectée	80	0	28	13	39	35

Tableau 2 : Nombre d’individus et taux d’émergence dans des conditions normales (1x) et pauvres en levures (0,1x).

Nom d’introduction	Séquence (1,75 m > m)	Objectif
AjRpL32_qPCR_Fwd	CCCGTCACATGCTTCCTACT	qRT-PCR
AjRpL32_qPCR_Rev	GAATTTGCGATTCTGCATCA	qRT-PCR
qPCR_gene007424_Fwd	TGGGCAATGATTGTGTGAGT	qRT-PCR
qPCR_gene007424_Rev	GCGTCCCTCTGTATCGAAGGTA	qRT-PCR
Aj_gene007424_ex1_Fwd	ATGAGCATCAAGCAAGCAGTGCTAG	Clonage CDS
Aj_gene007424_ex10_Rev	TCAGCACCTTCTCGGCAAATT	Clonage CDS, modèle dsRNA
Aj_gene007424_RNAi_Fwd	GAGGAGTGGAAGCCAGTTGTAG	Modèle dsRNA
T7_Aj_gene007424_ex10_Rev	GGATCCTAATACGACTCACTATAGGT CAGCACCTTCTCCCGGCAAATT	Modèle dsRNA
T7_Aj_gene007424_ RNAi_Fwd	GGATCCTAATACGACTCACTATAGGGAG GAGAGTGGAAGCCAGTTGTAG	Modèle dsRNA
※ Ces amorces et modèles dsRNA sont rapportés dans Kamiyama et al. 2022.
※ gene007424 signifie IDDF-1.

Tableau 3 : Séquences d’amorces et de modèles dsRNA utilisés dans cette étude.

Discussion

Dans cette étude, nous avons mis en place une plateforme expérimentale polyvalente pour étudier les interactions parasitoïde-hôte au niveau moléculaire. En optimisant les conditions d’élevage, un test d’infection à oviposition unique et le protocole ARNi, nous fournissons un système robuste pour les études fonctionnelles de facteurs dérivés des parasitoïdes. Cette plateforme facilitera de futures études visant à découvrir les mécanismes par lesquels les guêpes parasitoïdes manipulent le développement de l’hôte et pourrait également contribuer au développement de stratégies biologiques de lutte antiparasitaire.

La souche TK d’A. japonica infectée par Wolbachia fournit un système expérimental hautement reproductible pour analyser le parasitisme. Dans de nombreuses études parasitoïde-hôte, les résultats expérimentaux sont souvent variables, la survie de l’hôte et le succès parasitoïde dépendant sensiblement des conditions environnementales et physiologiques. En revanche, la souche TK présente un succès parasitaire constamment élevé, créant effectivement une condition « dominée par les parasitoïdes » dans laquelle le résultat de l’infection est largement uniforme. De plus, en tant que souche partenogénétique, elle réduit la variation expérimentale entre individus grâce à son fond génétique uniforme. Cette reproductibilité permet un suivi fiable du processus de parasitisme et facilite des analyses quantitatives des réponses de l’hôte et des facteurs dérivés des parasitoïdes.

De plus, la reproduction du thelytokous facilite grandement les analyses génomiques en permettant la génération d’ADN génomique hautement homogène, ce qui est essentiel pour un assemblage génomique^{de haute qualité 9}. Bien que ces souches parthénogénétiques ne soient pas disponibles chez toutes les espèces parasitoïdes, nos résultats mettent en lumière le potentiel du thelytoky induit par Wolbachia comme stratégie pour améliorer les ressources génomiques. L’établissement de lignées infectées par Wolbachia chez d’autres espèces parasitoïdes pourrait donc être une approche puissante pour étendre les ressources génomiques et accélérer les études moléculaires comparatives entre parasitoïdes.

Les résultats du parasitisme sont fortement influencés par les conditions nutritionnelles de l’hôte, ce qui indique que les conditions d’élevage sont un facteur déterminant critique du succès parasitoïde. Parce que le parasitisme réussi dépend d’une coordination temporelle précise avec le développement de l’hôte et de la guêpe, des conditions nutritionnelles non contrôlées risquent de perturber ce processus et de réduire la reproductibilité. Par conséquent, une standardisation rigoureuse des conditions d’élevage de l’hôte est essentielle pour établir un système expérimental fiable d’étude des interactions parasitoïde-hôte. De plus, les fioles de stock de mouches doivent être maintenues séparément des fioles de guêpes, car la présence de guêpes réduit les comportements d’oviposition^{des mouches 20,21}.

Pour permettre une évaluation quantitative des interactions parasitoïde-hôte, nous avons conçu un test d’infection à ovoposition unique dans lequel un seul œuf est déposé dans chaque hôte. Ce test contraste avec les tests conventionnels d’infection en masse, qui impliquent souvent plusieurs événements d’oviposition conduisant à des dommages excessifs à l’hôte et à la mortalité. Pour favoriser une oviposition efficace dans un délai limité (~15 min.), les adultes de guêpes nouvellement fermées ont été préconditionnés avec une solution de glucose et de vitamine C, améliorant ainsi l’efficacité de l’oviposition et la reproductibilité globale.

De plus, nous avons optimisé le protocole ARNi pour l’analyse de la fonction génique chez les guêpes parasitoïdes. En utilisant le système de microinjection, nous avons obtenu un contrôle précis du volume d’injection et amélioré la constance de l’efficacité du knockdown. La validation fonctionnelle utilisant IDDF-1 a confirmé que cette méthode supprime efficacement l’expression génique et produit des résultats phénotypiques reproductibles. Étant donné que les études transcriptomiques et protéomiques continuent d’identifier un grand nombre de facteurs de venin candidats, la disponibilité d’une plateforme de dépistage fonctionnelle sera essentielle pour déterminer leur rôle biologique.

Une limitation de ce protocole ARNi est qu’il n’est pas adapté à l’analyse de gènes qui fonctionnent aux premiers stades du développement des guêpes, car il est techniquement difficile d’injecter des ARNd dans les œufs de guêpe présents à l’intérieur du corps hôte. Pour surmonter cela, mettre en place un système d’élevage ex vivo peut constituer une approche^{utile 22.} Alternativement, les approches de knockout génétique utilisant Direct Parental (DIPA)-CRISPR peuvent fournir une stratégie complémentaire, par laquelle des réactifs sont injectés chez les femelles adultes pour générer une descendance²³ modifiée par le génome. En effet, cette approche a permis de générer des individus knockout génique dans l’ectoparasitoïde nymphal Nasonia vitripennis en injectant des réactifs chez des femelles adultes ou des individus au stade^{avancé de la nymphe 24}. Avec notre méthode de knockdown génétique basée sur l’ARNi, ces approches faciliteront des analyses plus complètes des fonctions géniques impliquées dans le processus de parasitisme.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
50 mL tube	Greiner Bio-One	210261	Assay d'infection
1 mL syringe	TERUMO	SS-01T	Injection d'ARNri
Agar	Daisin, Ltd.	P-700	Elevage
Asnol Petri Dish φ40×13.5mm	As One Corporation	1-8549-01	Assay d'infection
Asnol Petri Dish φ55×17mm	As One Corporation	1-8549-02	Injection d'ARNri
Blue dye (Erioglaucine disodium salt)	Sigma-Aldrich Co. Llc.	861146-25G	Injection d'ARNri
Butyl p-Hydroxybenzoate	Nacalai Tesque, Inc.	06327-15	Elevage
CO2 pressure regulator	YAMATOSANGYO	YR-507F-2	Assay d'infection
Confocal laser scanning microscope	Zeiss	LSM700	Analyse d'image
Corn meal	Sunny Maize Co., Ltd.	No.4M	Elevage
DAPI	Thermo Fisher Scientific Inc.	PI62247	Coloration des noyaux, 1:10000
Deionized water	Millipore Inc.	ZLXEV030WW	Assay d'infection
Dual-Stage Glass Micropipette Puller	Narishige	PC-10	Injection d'ARNri
Fiji	NA	https://fiji.sc	Analyse d'image
Filter paper	Advantec	ITEM 526	Elevage
Fly food vial	Chiyoda Science Co., Ltd.	KFB-3M	Elevage
Fly food vial plug	Chiyoda Science Co., Ltd.	AS-275	Elevage
Forceps	Dumont Biologie	11252-20	Dissection
Freezer, -20 °C	Nihon Freezer	GS-3120HC	Stockage d'échantillons
Freezer, -80 °C	Nihon Freezer	CLN-52UD2	Stockage d'échantillons
Glass slides	Matsunami Glass Ind., Ltd	S7213	Assay d'infection
Glucose	Showa Sangyo Co., Ltd.	Non disponible	Elevage
KOD Plus Neo	Toyobo	KOD-401	Synthèse d'ARNri
Incubator	Panasonic	MIR-254-PJ	Elevage
Ligation high Ver.2	Toyobo	LGK-201	Synthèse d'ARNri
Micropipette Grinder	Narishige	EG-401	Injection d'ARNri
Mineral oil	Nacalai Tesque, Inc.	23306-84	Injection d'ARNri
Nanoject III	Drummond Scientific Company	3-000-207	Injection d'ARNri
Nanoject Glass Capillaries	Drummond Scientific Company	3-000-203-G/X	Injection d'ARNri
pBluescript KS (+) plasmid	Non disponible	Non disponible	Synthèse d'ARNri
pBluescript SK (-) plasmid	Non disponible	Non disponible	Synthèse d'ARNri
PrimeScript reverse Transcriptase	Takara	2680A	Synthèse d'ARNri
Propionic acid	Nacalai Tesque, Inc.	29018-55	Elevage
PROWIPE	Daio Paper Corporation	2-2624-02	Assay d'infection, Injection d'ARNri.
ReverTra Ace qPCR RT Master Mix with gDNA Remover	Toyobo	FSQ-301	qRT-PCR
RNAiso Plus reagent	Takara	9108	qRT-PCR
Small vial (Test tube 12 mL)	Sarstedt	REF 58.487	Assay d'infection
Small vial plug	Chiyoda Science Co., ltd.	QD-S4	Assay d'infection
Spatula	As One Corporation	6-522-02	Elevage
Square petri dish	Eiken Chemical Co., Ltd.	64-2192-55, AW2000	Injection d'ARNri
Stereomicroscope	Leica Microsystems	lvesta3 (C-Mount)	Assay d'infection
Stereomicroscope	Nikon Solutions Co., Ltd.	SMZ1000	Injection d'ARNri
T7 RiboMAX Express RNAi System	Promega	P1700	Synthèse d'ARNri
Thermal Cycler Dice Real Time System	Takara	TP815	qRT-PCR
Thermal Cycler GeneAtlas	Astel	G02	Synthèse d'ARNri, qRT-PCR
THUNDERBIRD SYBR qPCR Mix	Toyobo	QPS-201	qRT-PCR
TissueLyser II	Qiagen	Non disponible	qRT-PCR
Vitamin C, L-Ascorbic Acid	Nacalai Tesque, Inc.	03420-65	Elevage
Welch's grape 100 juice	Asahi Soft drinks Co., Ltd.	32390	Assay d'infection
Yeast	Asahi Group Foods, Ltd.	HB-P02	Elevage