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Article de méthode

Préservation de la complexité tissulaire in vivo dans un modèle du système nerveux olfactif de souris à l'aide d'une analyse en montage entier pour l'étude de la régénération neuronale

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DOI :

10.3791/72036

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18 août 2026

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1Griffith Institute for Biomedicine and Glycomics, Griffith University, 2Clem Jones Centre for Neurobiology and Stem Cell Research, Griffith University

Dans cet article

Résumé

Ce protocole décrit un flux de travail complet permettant de préserver la complexité anatomique du système nerveux olfactif de la souris. Nous détaillons ici l'ensemble du processus, incluant la dissection, la préparation des tissus et l'imagerie. Ce protocole peut être utilisé pour étudier le système olfactif dans des conditions normales ou anormales, y compris dans ses conditions naturelles de réparation.

Résumé

À l'ère de l'imagerie tridimensionnelle (3D), l'immunohistochimie classique est reconnue comme fortement limitée dans les études de pathologie et d'anatomie humaine complexe. En n'analysant que des coupes étroites, des structures plus larges et des aspects essentiels de l'architecture tissulaire peuvent perdre des détails contextuels critiques, conduisant à des interprétations incomplètes ou trompeuses. Bien que les sections bidimensionnelles (2D) aient permis une compréhension de base de l'histoarchitecture, elles sont insuffisantes pour saisir la réalité véritablement tridimensionnelle des tissus biologiques.

Un nombre croissant d'études portant sur plusieurs régions anatomiques adoptent désormais des techniques permettant d'isoler des unités anatomiques intactes — préparations en montage plat, en montage entier ou en coupe en face — combinées à une microscopie fluorescente à haute résolution. Ces approches offrent une visualisation et une interprétation plus complètes de l'organisation structurelle. Ceci revêt une importance particulière dans le système nerveux olfactif, où la définition des mécanismes cellulaires complexes à l'origine de sa remarquable capacité régénérative nécessite un contexte en épaisseur totale. Des coupes minces risquent de manquer des caractéristiques physiopathologiques clés qui restent mal définies.

Étant donné ces limites et le manque de connaissances sur les interactions cellulaires impliquées dans la régénération olfactive, le développement d'une technique améliorée de montage complet capable de préserver la complexité tissulaire en pleine épaisseur était essentiel. Des muqueuses olfactives entières ont été isolées sous forme d'échantillons en pleine épaisseur, accompagnées d'un protocole optimisé de pénétration des anticorps. Une imagerie haute résolution (EVIDENT SpinSR) et une reconstruction en 3D ont permis une visualisation précise des interactions cellulaires in vivo.

Introduction

Le système nerveux olfactif (SNO) constitue un modèle unique et bien établi pour l'étude des mécanismes de régénération neuronale, car il conserve tout au long de la vie la capacité unique de renouvellement neuronal1. Toutefois, le potentiel de traduction clinique de cette capacité neuro-réparatrice reste limité en raison de lacunes importantes dans notre compréhension du comportement des cellules du système olfactif2,3,4. Les réponses cellulaires et l'organisation anatomique du SNO, notamment les neurones olfactifs primaires, les cellules de soutien olfactives (CSO) et les fibroblastes périneuraux, ont été décrites dans plusieurs études animales, basées sur des coupes tissulaires ultraminces (<2 µm) combinées à des modèles de lésions physiques sévères appliquées au SNO de rongeurs1,2. Les animaux de ces études étaient généralement sacrifiés 10 jours après la lésion, offrant ainsi une fenêtre d'observation très restreinte portant uniquement sur un moment précis du remodelage étendu et complexe de ce tissu lors d'une lésion neuronale2. Ces études ont montré que, suite à la mort axonale, les CSO et les fibroblastes persistaient sous forme de canaux continus le long du site de la lésion.

Bien qu'informatives, en raison des nombreuses limitations décrites ci-dessus, l'approche utilisée n'a fourni qu'un aperçu conceptuel à faible résolution et superficiel du SNO, empêchant ainsi une évaluation complète de l'organisation cellulaire réelle au sein du SNO intact3. Par conséquent, des relations spatiales essentielles ont pu être négligées.

La préservation de la structure tissulaire tridimensionnelle est essentielle pour une analyse anatomique et cellulaire précise et a été appliquée avec succès à plusieurs organes et pathologies4,5,6,7,8,9,10,11,12. Des approches de montage entier ont été utilisées pour cartographier l'organisation neuronale au sein de la muqueuse olfactive13,14, toutefois, la visualisation des interactions cellulaires avec une structure ONS en épaisseur totale, incluant une lame propre préservée, n'a pas encore été réalisée.

Dans cette étude, nous établissons un protocole utilisant un modèle murin avec un traitement tissulaire en montage entier, une immunomarquage, un imagerie haute résolution et une reconstruction tridimensionnelle, permettant une analyse détaillée de l'architecture du SNF. Ce protocole a été développé pour combler une lacune dans les méthodes publiées existantes, en conservant et en préservant une muqueuse olfactive en épaisseur totale, y compris la lame propre, ce qui permet l'étude des interactions intercellulaires. Notamment, cette méthode affinée de prélèvement et de traitement des tissus peut être appliquée et combinée à divers modèles du système olfactif.

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Protocole

Toutes les expériences impliquant des animaux et des cellules modifiées de façon transgénique ont été réalisées avec l'approbation du Comité de biosécurité de l'Université Griffith (NLRD/003/2020_var3) et du Comité d'éthique sur les animaux de l'Université Griffith (MHIQ/04/23/AEC), conformément aux lignes directrices du Bureau australien du régulateur de la technologie génétique (OGTR).

REMARQUE : Un total de 15 souris de laboratoire adultes (8 à 9 semaines) des deux sexes ont été utilisées dans l'étude. Plus précisément, des souris transgéniques S100β-DsRed dans lesquelles toutes les cellules olfactives de soutien (OEC) expriment la protéine rouge vif DsRed sous le contrôle du promoteur S100β. S100β fait partie d'une famille plus vaste de protéines liant le calcium et est couramment exprimé dans les cellules gliales du système nerveux central, telles que les OEC. Ce modèle s'est révélé optimal pour les objectifs de ces expériences, permettant une localisation facile des populations cellulaires cibles à l'aide de signaux de fluorescence endogènes. Les souris transgéniques S100β-DsRed avaient été précédemment générées, et il a été démontré que leur utilisation permet une détection améliorée des OEC par rapport à l'immunohistochimie pour les analyses de tissus fixés15,16,17,18.

1. Collecte des têtes et fixation des tissus

  1. Procéder à l'euthanasie des animaux par inhalation croissante de CO2 aux points temporels expérimentaux.
  2. Confirmer la mort par l'absence des réflexes cornéen et de retrait plantaire, suivie d'une dislocation cervicale, ou conformément au protocole opératoire standard approuvé.
  3. Retirer entièrement la tête et les mâchoires à l’aide de ciseaux.
  4. Retirer la peau du crâne et enlever le cartilage à l’extrémité du nez afin d’exposer la cavité nasale et assurer une pénétration efficace de l’agent de fixation.
    REMARQUE : Cette étape, consistant à couper la partie la plus antérieure du cartilage nasal de l’animal, s’est révélée cruciale pour permettre une fixation adéquate du tissu au sein de la cavité nasale.
  5. Rincer rapidement les têtes dans du PBS 1× afin d’éliminer l’excès de sang.
  6. Fixer les tissus par immersion pendant la nuit (12–18 h) dans du paraformaldéhyde à 4 %, pendant au moins 6 h (temps suffisant pour fixer le tissu d’intérêt) à 4 °C sur un rouleau.
    PRÉCAUTION : Le paraformaldéhyde est un produit chimique dangereux qui libère des vapeurs de formaldéhyde. Il est toxique par inhalation, contact cutané et ingestion ; provoque des irritations oculaires, cutanées et respiratoires ; et est un cancérogène suspecté. Manipuler uniquement sous hotte aspirante en portant des équipements de protection individuelle (EPI) appropriés, y compris des gants, une blouse de laboratoire et une protection oculaire. L’élimination sécurisée des produits chimiques dangereux et des déchets biologiques générés pendant le protocole doit être effectuée conformément aux réglementations institutionnelles et locales.
    ​REMARQUE : Lors des optimisations, nous avons observé que 6 h étaient suffisants pour fixer le tissu d’intérêt ; toutefois, une durée supérieure à 12 h risquait de provoquer une sur-fixation et une dégradation des structures muqueuses.
  7. Retirer les têtes de l’agent de fixation et les laver pendant 3 h dans du PBS 1× à température ambiante (20–25 °C) sur un rouleau.
  8. Conserver les têtes dans du PBS frais à 4 °C et prélever le tissu muqueux en montage entier dans les 48 h

2. Prélèvement de tissus en montage entier

  1. Effectuer l'isolement du tissu sous un microscope.
  2. Couper les têtes en deux à l'aide d'un scalpel, en suivant la ligne médiane sagittale.
  3. Exposer l'intérieur de la cavité nasaleFigure 1). Identifier les régions anatomiques et prélever le tissu muqueux tapissant toute la section anatomique (Figure 1B).
  4. À l'aide d'un coupe-os, fracturez doucement et retirez l'os septal recouvrant une partie de la cavité muqueuse.
    REMARQUE : Voir Figure 2A; Cette étape est cruciale pour exposer la cavité concave située sous l'os, où les faisceaux d'axones traversent la paroi dorsale (Figure 1B).
  5. Une fois cette zone exposée, utilisez une pince courbe pour détacher délicatement et prélever le tissu à partir de la paroi dorsale concave. Soulevez le tissu depuis l'os sous-jacent et décollez doucement la muqueuse olfactive résiduelle afin d'obtenir une préparation complète intacte en montage entier.
    REMARQUE : Une extrême prudence était nécessaire à ce stade pour éviter de déchirer le tissu.
  6. Prélevez le tissu d'intérêt provenant des narines droite et gauche : la muqueuse recouvre le septum, les parois dorsales gauche et droite, ainsi que la lame criblée de la cavité nasale (Figure 1A, B). Prélever le tissu des deux narines, y compris le septum, les parois dorsales et la lame criblée, afin d'isoler la région anatomique contenant les structures olfactives primaires (Figure 2C).
  7. Laver les tissus recueillis dans du PBS 1× et éliminer tous les tissus indésirables, y compris les fragments osseux. Conserver les tissus à 4 °C dans du PBS 1× en vue d'une analyse ultérieure par immunohistochimie.
    REMARQUE : Si le tissu doit être conservé à long terme, il est recommandé de le stocker dans une solution de PBS 1× contenant 0,001 % (p/v) d'azoture de sodium, à 4 °C.

3. Protocole de coloration optimisé

REMARQUE : Les protocoles de coloration couramment utilisés sont généralement optimisés pour des sections de faible à moyenne épaisseur (par exemple, jusqu'à 50 µm). Par conséquent, le protocole a dû être adapté à un tissu nettement plus épais.
​Une étape cruciale a consisté à maintenir le tissu en suspension à l'intérieur de tubes Eppendorf pendant tout le processus de coloration, et à placer les tubes sur un rouleau rotatif pendant la pénétration des réactifs. Ainsi, les étapes de coloration n'ont pas été réalisées avec le tissu déposé sur une lame d'imagerie. Le tissu a d'abord été coloré en suspension, puis monté sur des lames d'imagerie. Ces détails ont permis d'éviter tout repliement du tissu et assuré une pénétration homogène des réactifs et des anticorps dans toute la région.

  1. Retirer les tissus du stockage et les placer dans un tube Eppendorf, avec la solution de blocage (la solution utilisée dépendra de la coloration spécifique).
    ​REMARQUE : Solution de blocage : 3 % de BSA, 0,3 % de Triton X-100 dans du PBS. Un autre ajustement important concernait la durée d'exposition du tissu à chaque réactif et cocktail d'anticorps.
  2. Conserver le tissu dans la solution de blocage pendant 3 h à température ambiante sur un rouleau.
    REMARQUE : Il a été observé qu'il n'était pas nécessaire d'augmenter la concentration des anticorps et réactifs de coloration sélectionnés (Tableau 1) si la durée d'exposition était prolongée par rapport à l'approche standard de l'immunohistochimie sur coupes minces. Cela permettait également de réduire l'utilisation de réactifs anticorps coûteux. Les incubations sont réalisées dans un tube Eppendorf de 1,5 mL dont le rabat du couvercle a été retiré afin qu'il puisse rouler sur le rouleau. Le volume de réactif était de 500 µL.
  3. Incuber pendant 72 h à 4 °C avec les anticorps primaires sur rouleau.
  4. Laver le tissu deux fois (1,5 h par lavage) à l’aide de PBS 1× à température ambiante sur rouleau.
  5. Incuber le tissu avec l'anticorps secondaire (enveloppé dans du papier d’aluminium) et le colorant des noyaux pendant au moins 4 h à température ambiante sur rouleau, puis poursuivre l’incubation toute la nuit (12–18 h) à 4 °C sur rouleau.
  6. Laver le tissu deux fois (1,5 h à chaque fois) à l’aide de PBS 1× à température ambiante sur rouleau.

4. Préparation des lames

  1. Retirer délicatement le tissu du tube Eppendorf
  2. Sous un microscope, placer le tissu sur une lame en veillant à ce qu’il ne présente aucun pli.
    NOTE : Il est possible d’identifier, au microscope et sans fluorescence, l’orientation du tissu. Le côté de la lame propria du tissu muqueux doit être placé sur la lame, avec l’épithélium tourné vers la lame en verre et la lame propria tournée vers la lamelle. La lame propria peut être identifiée grâce à la présence de faisceaux épais de nerfs, visibles sans coloration. Une orientation avec la lame propria tournée vers la lamelle et le côté épithélial posé sur la lame en verre facilitera la coloration ainsi que le processus d’imagerie.
  3. Couvrir les lames avec un milieu de montage fluorescent et sceller les lames.
  4. Les lames peuvent être conservées à 4 °C après séchage pendant la nuit (12–18 h) à l’abri de la lumière et à température ambiante

5. Acquisition d'images et post-traitement

  1. Acquisition d'images immunofluorescentes à faible grossissement
    1. Réaliser un assemblage automatique pendant l'acquisition d'images en utilisant un fondu alpha linéaire.
      ​REMARQUE: Le nombre de trames en z doit être ajusté en fonction de l'épaisseur de l'échantillon afin de garantir une couverture complète du volume tissulaire.
    2. Acquérir des champs adjacents avec un recouvrement de 15 %. Acquérir des images en mosaïque en utilisant un motif d'acquisition en serpentin.
    3. Ajuster le nombre total de sections optiques en fonction de l'épaisseur du tissu.
    4. Régler l'étalonnage de l'image à 215,594 nm/pixel sur les axes X et Y. Acquérir les images sous forme de z-stacks avec une taille de pas en z de 0,8 µm.
    5. Placer l'échantillon entier monté sur la platine du microscope confocal. Acquérir des images d'ensemble à l'aide d'un objectif 30x (NA 1,04).
  2. Acquisition d'images immunofluorescentes à fort grossissement.
    1. Acquérir des images détaillées à l'aide d'un objectif 60× (NA 1,5). Régler l'étalonnage de l'image à 107,923 nm/pixel sur les axes X et Y. Acquérir des images en z-stacks avec une taille de pas en z de 0,41 µm.
    2. Ajuster le nombre total de sections optiques en fonction de l'épaisseur du tissu. Et acquérir des images à partir d'un seul champ de vision.
      ​REMARQUE : Aucun assemblage d'images n'est nécessaire pour les acquisitions à 60×, car chaque jeu de données correspond à un unique champ de vision.
  3. Acquisition d'images de référence histologiques
    1. Imager des coupes murines médio-sagittales de tête colorées à l'HE à l'aide d'un microscope à balayage de lames en éclairage en champ clair.
    2. Acquérir les images avec un objectif 40× (NA 0,95) et un grossissement caméra de 0,63x, ce qui donne un grossissement effectif de 25,2×.
    3. Vérifier un étalonnage pixel de 136,905 nm/pixel sur les axes X et Y. Et acquérir l'image comme un plan focal unique.
    4. Assembler automatiquement les images en mosaïque en utilisant un motif d'acquisition en serpentin et un fondu alpha linéaire.
  4. Acquisition d'images de référence immunofluorescentes d'ensemble
    1. Acquérir des images immunofluorescentes complémentaires d'ensemble à l'aide d'un objectif 10x.
    2. Capturer l'échantillon comme une unique coupe en z en utilisant un recouvrement de tuiles de 0 % pendant l'acquisition d'images.
    3. Régler l'étalonnage de l'image à 647,249 nm/pixel sur les axes X et Y. Puis, générer une image d'ensemble englobant toute la région anatomique d'intérêt.
  5. Traitement des images et génération des figures finales.
    1. Exporter les jeux de données d'images acquis vers un logiciel d'analyse d'images. Générer des projections d'intensité maximale (MIP) à partir des jeux de données en z-stacks.
    2. Sélectionner les régions d'intérêt (ROI) pour les analyses ultérieures et la préparation des figures.
    3. Combiner les images immunofluorescentes d'ensemble avec les images HE correspondantes afin de produire des figures de référence anatomique. Ensuite, vérifier l'alignement et la correspondance anatomique entre les jeux de données de fluorescence et histologiques avant la préparation des figures.
      REMARQUE: Tout assemblage d'images doit être effectué automatiquement pendant l'acquisition, à l'aide de paramètres prédéfinis du microscope, et ne doit pas nécessiter de post-traitement supplémentaire. Dans notre cas, la reconstruction 3D a été générée à l'aide du logiciel Imaris : le module de rendu de surface, basé sur un seuil d'intensité pour chaque canal acquis, a été utilisé pour produire la reconstruction 3D. Enfin, les images finales ont été assemblées dans Adobe Illustrator.

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Résultats

Notre approche en montage entier présentée ici a permis l'isolement et la préservation complète de la muqueuse olfactive. Dans notre cas, notre objectif était de comprendre les changements cellulaires et anatomiques à la fois à grande échelle (vue anatomique complète) et à l'échelle microscopique (niveau cellulaire).

L'approche en montage entier nous permet de collecter à la fois les compartiments épithéliaux et la lame propre et de préserver les relations spatiales entre les faisceaux d'axone...

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Discussion

Ces dernières décennies ont progressivement vu l'avènement de l'ère tridimensionnelle, avec de nombreuses approches innovantes se développant dans le domaine scientifique. Par exemple, les méthodes de reconstruction tridimensionnelle, rendues possibles par le développement de techniques complexes d'imagerie en montage entier associées à des microscopes fluorescents à haute résolution, ont permis une meilleure compréhension de plusieurs histoarchitectures tissulaires en pleine épaisseur. Ces approches de rendu tridimensio...

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Déclarations de divulgation

Les auteurs n'ont rien à divulguer.

Remerciements

Ce travail a bénéficié d'un financement de la Clem Jones Foundation, de la Perry Cross Spinal Research Foundation et de la Motor Accident Insurance Commission attribué à JSTJ et RR, d'une bourse du National Injury Insurance Scheme Queensland attribuée à RR, et d'une bourse de la Perry Cross Spinal Research Foundation attribuée à FO. Une partie de ce projet a été soutenue par la « Griffith University Post-Graduate Research Scholarship (GUPRS) » et la « Griffith University International Postgraduate Research Scholarship (GUIPRS) » attribuées à FO.

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
Albumine sérique bovine (BSA)Sigma-AldrichA3294-50GImmunohistochimie
Adobe Illustratorversion 28.5
Anticorps anti-bêta III tubuline - Marqueur neuronalAbcamab18207
Anticorps anti-PDGFR bêta [APB5]Abcamab91066
bisBenzimide H 33342 trihydrochlorureSigma Aldrich14533
LAMELLES 24X50MM NO. 1.5 100PIÈCESBio-strategyEPBRCS245015GPImmunohistochimie
Anticorps secondaire IgG (H+L) de chèvre anti-lapin, hautement adsorbé par croisement, Alexa Fluo 488Thermo FisherA-21206
Coupe-os Dumont n°15A - Revêtement époxyDaniels Health Laboratory Products P/L11215-02Disséction tissulaire
Pinces Dumont n°7 - Biologie/DumostarDaniels Health Laboratory Products P/L11297-10Disséction tissulaire
Anticorps secondaire IgG (H+L) de chèvre anti-rat, adsorbé par croisement, Alexa Fluor™ 647Thermo FisherA-21247
Logiciel ImarisImarisversion 9.5.0Imagerie
Ciseaux de dissection MayoProSciTech420SSDisséction tissulaire
ParaformaldéhydeSigma-AldrichP6148-500GTraitement des tissus
Solution tampon phosphate stérile, comprimés PBS (PBS)Thermo Fisher Scientific18912014Traitement des tissus
Medium de montage antifade ProLong GlassThermo Fisher ScientificP36980Immunohistochimie
Lame de scalpel n°23Scalpel Blades Swann MortonCOS240BDisséction tissulaire
Manche de scalpel n°4ProSciTechT134Disséction tissulaire
Azoture de sodiumSigma-AldrichS2002-25GTraitement des tissus
SaccharoseChem-Supply57-50-1Traitement des tissus
Lames microscopiques TOMO adhésivesProSciTechGEMS63705-09Immunohistochimie
Triton X-100Sigma-AldrichX100-100mLImmunohistochimie

Références

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