Préservation de la complexité tissulaire in vivo dans un modèle du système nerveux olfactif de souris à l'aide d'une analyse en montage entier pour l'étude de la régénération neuronale

Résumé

Ce protocole décrit un flux de travail complet permettant de préserver la complexité anatomique du système nerveux olfactif de la souris. Nous détaillons ici l'ensemble du processus, incluant la dissection, la préparation des tissus et l'imagerie. Ce protocole peut être utilisé pour étudier le système olfactif dans des conditions normales ou anormales, y compris dans ses conditions naturelles de réparation.

Résumé

À l'ère de l'imagerie tridimensionnelle (3D), l'immunohistochimie classique est reconnue comme fortement limitée dans les études de pathologie et d'anatomie humaine complexe. En n'analysant que des coupes étroites, des structures plus larges et des aspects essentiels de l'architecture tissulaire peuvent perdre des détails contextuels critiques, conduisant à des interprétations incomplètes ou trompeuses. Bien que les sections bidimensionnelles (2D) aient permis une compréhension de base de l'histoarchitecture, elles sont insuffisantes pour saisir la réalité véritablement tridimensionnelle des tissus biologiques.

Un nombre croissant d'études portant sur plusieurs régions anatomiques adoptent désormais des techniques permettant d'isoler des unités anatomiques intactes — préparations en montage plat, en montage entier ou en coupe en face — combinées à une microscopie fluorescente à haute résolution. Ces approches offrent une visualisation et une interprétation plus complètes de l'organisation structurelle. Ceci revêt une importance particulière dans le système nerveux olfactif, où la définition des mécanismes cellulaires complexes à l'origine de sa remarquable capacité régénérative nécessite un contexte en épaisseur totale. Des coupes minces risquent de manquer des caractéristiques physiopathologiques clés qui restent mal définies.

Étant donné ces limites et le manque de connaissances sur les interactions cellulaires impliquées dans la régénération olfactive, le développement d'une technique améliorée de montage complet capable de préserver la complexité tissulaire en pleine épaisseur était essentiel. Des muqueuses olfactives entières ont été isolées sous forme d'échantillons en pleine épaisseur, accompagnées d'un protocole optimisé de pénétration des anticorps. Une imagerie haute résolution (EVIDENT SpinSR) et une reconstruction en 3D ont permis une visualisation précise des interactions cellulaires in vivo.

Introduction

Le système nerveux olfactif (SNO) constitue un modèle unique et bien établi pour l'étude des mécanismes de régénération neuronale, car il conserve tout au long de la vie la capacité unique de renouvellement neuronal¹. Toutefois, le potentiel de traduction clinique de cette capacité neuro-réparatrice reste limité en raison de lacunes importantes dans notre compréhension du comportement des cellules du système olfactif^2,3,4. Les réponses cellulaires et l'organisation anatomique du SNO, notamment les neurones olfactifs primaires, les cellules de soutien olfactives (CSO) et les fibroblastes périneuraux, ont été décrites dans plusieurs études animales, basées sur des coupes tissulaires ultraminces (<2 µm) combinées à des modèles de lésions physiques sévères appliquées au SNO de rongeurs^1,2. Les animaux de ces études étaient généralement sacrifiés 10 jours après la lésion, offrant ainsi une fenêtre d'observation très restreinte portant uniquement sur un moment précis du remodelage étendu et complexe de ce tissu lors d'une lésion neuronale². Ces études ont montré que, suite à la mort axonale, les CSO et les fibroblastes persistaient sous forme de canaux continus le long du site de la lésion.

Bien qu'informatives, en raison des nombreuses limitations décrites ci-dessus, l'approche utilisée n'a fourni qu'un aperçu conceptuel à faible résolution et superficiel du SNO, empêchant ainsi une évaluation complète de l'organisation cellulaire réelle au sein du SNO intact³. Par conséquent, des relations spatiales essentielles ont pu être négligées.

La préservation de la structure tissulaire tridimensionnelle est essentielle pour une analyse anatomique et cellulaire précise et a été appliquée avec succès à plusieurs organes et pathologies^{4,5,6,7,8,9,10,11,12}. Des approches de montage entier ont été utilisées pour cartographier l'organisation neuronale au sein de la muqueuse olfactive^13,14, toutefois, la visualisation des interactions cellulaires avec une structure ONS en épaisseur totale, incluant une lame propre préservée, n'a pas encore été réalisée.

Dans cette étude, nous établissons un protocole utilisant un modèle murin avec un traitement tissulaire en montage entier, une immunomarquage, un imagerie haute résolution et une reconstruction tridimensionnelle, permettant une analyse détaillée de l'architecture du SNF. Ce protocole a été développé pour combler une lacune dans les méthodes publiées existantes, en conservant et en préservant une muqueuse olfactive en épaisseur totale, y compris la lame propre, ce qui permet l'étude des interactions intercellulaires. Notamment, cette méthode affinée de prélèvement et de traitement des tissus peut être appliquée et combinée à divers modèles du système olfactif.

Protocole

Toutes les expériences impliquant des animaux et des cellules modifiées de façon transgénique ont été réalisées avec l'approbation du Comité de biosécurité de l'Université Griffith (NLRD/003/2020_var3) et du Comité d'éthique sur les animaux de l'Université Griffith (MHIQ/04/23/AEC), conformément aux lignes directrices du Bureau australien du régulateur de la technologie génétique (OGTR).

REMARQUE : Un total de 15 souris de laboratoire adultes (8 à 9 semaines) des deux sexes ont été utilisées dans l'étude. Plus précisément, des souris transgéniques S100β-DsRed dans lesquelles toutes les cellules olfactives de soutien (OEC) expriment la protéine rouge vif DsRed sous le contrôle du promoteur S100β. S100β fait partie d'une famille plus vaste de protéines liant le calcium et est couramment exprimé dans les cellules gliales du système nerveux central, telles que les OEC. Ce modèle s'est révélé optimal pour les objectifs de ces expériences, permettant une localisation facile des populations cellulaires cibles à l'aide de signaux de fluorescence endogènes. Les souris transgéniques S100β-DsRed avaient été précédemment générées, et il a été démontré que leur utilisation permet une détection améliorée des OEC par rapport à l'immunohistochimie pour les analyses de tissus fixés^15,16,17,18.

1. Collecte des têtes et fixation des tissus

1. Procéder à l'euthanasie des animaux par inhalation croissante de CO₂ aux points temporels expérimentaux.
2. Confirmer la mort par l'absence des réflexes cornéen et de retrait plantaire, suivie d'une dislocation cervicale, ou conformément au protocole opératoire standard approuvé.
3. Retirer entièrement la tête et les mâchoires à l’aide de ciseaux.
4. Retirer la peau du crâne et enlever le cartilage à l’extrémité du nez afin d’exposer la cavité nasale et assurer une pénétration efficace de l’agent de fixation.
   REMARQUE : Cette étape, consistant à couper la partie la plus antérieure du cartilage nasal de l’animal, s’est révélée cruciale pour permettre une fixation adéquate du tissu au sein de la cavité nasale.
5. Rincer rapidement les têtes dans du PBS 1× afin d’éliminer l’excès de sang.
6. Fixer les tissus par immersion pendant la nuit (12–18 h) dans du paraformaldéhyde à 4 %, pendant au moins 6 h (temps suffisant pour fixer le tissu d’intérêt) à 4 °C sur un rouleau.
   PRÉCAUTION : Le paraformaldéhyde est un produit chimique dangereux qui libère des vapeurs de formaldéhyde. Il est toxique par inhalation, contact cutané et ingestion ; provoque des irritations oculaires, cutanées et respiratoires ; et est un cancérogène suspecté. Manipuler uniquement sous hotte aspirante en portant des équipements de protection individuelle (EPI) appropriés, y compris des gants, une blouse de laboratoire et une protection oculaire. L’élimination sécurisée des produits chimiques dangereux et des déchets biologiques générés pendant le protocole doit être effectuée conformément aux réglementations institutionnelles et locales.
   ​REMARQUE : Lors des optimisations, nous avons observé que 6 h étaient suffisants pour fixer le tissu d’intérêt ; toutefois, une durée supérieure à 12 h risquait de provoquer une sur-fixation et une dégradation des structures muqueuses.
7. Retirer les têtes de l’agent de fixation et les laver pendant 3 h dans du PBS 1× à température ambiante (20–25 °C) sur un rouleau.
8. Conserver les têtes dans du PBS frais à 4 °C et prélever le tissu muqueux en montage entier dans les 48 h

2. Prélèvement de tissus en montage entier

1. Effectuer l'isolement du tissu sous un microscope.
2. Couper les têtes en deux à l'aide d'un scalpel, en suivant la ligne médiane sagittale.
3. Exposer l'intérieur de la cavité nasaleFigure 1). Identifier les régions anatomiques et prélever le tissu muqueux tapissant toute la section anatomique (Figure 1B).
4. À l'aide d'un coupe-os, fracturez doucement et retirez l'os septal recouvrant une partie de la cavité muqueuse.
   REMARQUE : Voir Figure 2A; Cette étape est cruciale pour exposer la cavité concave située sous l'os, où les faisceaux d'axones traversent la paroi dorsale (Figure 1B).
5. Une fois cette zone exposée, utilisez une pince courbe pour détacher délicatement et prélever le tissu à partir de la paroi dorsale concave. Soulevez le tissu depuis l'os sous-jacent et décollez doucement la muqueuse olfactive résiduelle afin d'obtenir une préparation complète intacte en montage entier.
   REMARQUE : Une extrême prudence était nécessaire à ce stade pour éviter de déchirer le tissu.
6. Prélevez le tissu d'intérêt provenant des narines droite et gauche : la muqueuse recouvre le septum, les parois dorsales gauche et droite, ainsi que la lame criblée de la cavité nasale (Figure 1A, B). Prélever le tissu des deux narines, y compris le septum, les parois dorsales et la lame criblée, afin d'isoler la région anatomique contenant les structures olfactives primaires (Figure 2C).
7. Laver les tissus recueillis dans du PBS 1× et éliminer tous les tissus indésirables, y compris les fragments osseux. Conserver les tissus à 4 °C dans du PBS 1× en vue d'une analyse ultérieure par immunohistochimie.
   REMARQUE : Si le tissu doit être conservé à long terme, il est recommandé de le stocker dans une solution de PBS 1× contenant 0,001 % (p/v) d'azoture de sodium, à 4 °C.

3. Protocole de coloration optimisé

REMARQUE : Les protocoles de coloration couramment utilisés sont généralement optimisés pour des sections de faible à moyenne épaisseur (par exemple, jusqu'à 50 µm). Par conséquent, le protocole a dû être adapté à un tissu nettement plus épais.
​Une étape cruciale a consisté à maintenir le tissu en suspension à l'intérieur de tubes Eppendorf pendant tout le processus de coloration, et à placer les tubes sur un rouleau rotatif pendant la pénétration des réactifs. Ainsi, les étapes de coloration n'ont pas été réalisées avec le tissu déposé sur une lame d'imagerie. Le tissu a d'abord été coloré en suspension, puis monté sur des lames d'imagerie. Ces détails ont permis d'éviter tout repliement du tissu et assuré une pénétration homogène des réactifs et des anticorps dans toute la région.

1. Retirer les tissus du stockage et les placer dans un tube Eppendorf, avec la solution de blocage (la solution utilisée dépendra de la coloration spécifique).
   ​REMARQUE : Solution de blocage : 3 % de BSA, 0,3 % de Triton X-100 dans du PBS. Un autre ajustement important concernait la durée d'exposition du tissu à chaque réactif et cocktail d'anticorps.
2. Conserver le tissu dans la solution de blocage pendant 3 h à température ambiante sur un rouleau.
   REMARQUE : Il a été observé qu'il n'était pas nécessaire d'augmenter la concentration des anticorps et réactifs de coloration sélectionnés (Tableau 1) si la durée d'exposition était prolongée par rapport à l'approche standard de l'immunohistochimie sur coupes minces. Cela permettait également de réduire l'utilisation de réactifs anticorps coûteux. Les incubations sont réalisées dans un tube Eppendorf de 1,5 mL dont le rabat du couvercle a été retiré afin qu'il puisse rouler sur le rouleau. Le volume de réactif était de 500 µL.
3. Incuber pendant 72 h à 4 °C avec les anticorps primaires sur rouleau.
4. Laver le tissu deux fois (1,5 h par lavage) à l’aide de PBS 1× à température ambiante sur rouleau.
5. Incuber le tissu avec l'anticorps secondaire (enveloppé dans du papier d’aluminium) et le colorant des noyaux pendant au moins 4 h à température ambiante sur rouleau, puis poursuivre l’incubation toute la nuit (12–18 h) à 4 °C sur rouleau.
6. Laver le tissu deux fois (1,5 h à chaque fois) à l’aide de PBS 1× à température ambiante sur rouleau.

4. Préparation des lames

1. Retirer délicatement le tissu du tube Eppendorf
2. Sous un microscope, placer le tissu sur une lame en veillant à ce qu’il ne présente aucun pli.
   NOTE : Il est possible d’identifier, au microscope et sans fluorescence, l’orientation du tissu. Le côté de la lame propria du tissu muqueux doit être placé sur la lame, avec l’épithélium tourné vers la lame en verre et la lame propria tournée vers la lamelle. La lame propria peut être identifiée grâce à la présence de faisceaux épais de nerfs, visibles sans coloration. Une orientation avec la lame propria tournée vers la lamelle et le côté épithélial posé sur la lame en verre facilitera la coloration ainsi que le processus d’imagerie.
3. Couvrir les lames avec un milieu de montage fluorescent et sceller les lames.
4. Les lames peuvent être conservées à 4 °C après séchage pendant la nuit (12–18 h) à l’abri de la lumière et à température ambiante

5. Acquisition d'images et post-traitement

1. Acquisition d'images immunofluorescentes à faible grossissement
   1. Réaliser un assemblage automatique pendant l'acquisition d'images en utilisant un fondu alpha linéaire.
      ​REMARQUE: Le nombre de trames en z doit être ajusté en fonction de l'épaisseur de l'échantillon afin de garantir une couverture complète du volume tissulaire.
   2. Acquérir des champs adjacents avec un recouvrement de 15 %. Acquérir des images en mosaïque en utilisant un motif d'acquisition en serpentin.
   3. Ajuster le nombre total de sections optiques en fonction de l'épaisseur du tissu.
   4. Régler l'étalonnage de l'image à 215,594 nm/pixel sur les axes X et Y. Acquérir les images sous forme de z-stacks avec une taille de pas en z de 0,8 µm.
   5. Placer l'échantillon entier monté sur la platine du microscope confocal. Acquérir des images d'ensemble à l'aide d'un objectif 30x (NA 1,04).
2. Acquisition d'images immunofluorescentes à fort grossissement.
   1. Acquérir des images détaillées à l'aide d'un objectif 60× (NA 1,5). Régler l'étalonnage de l'image à 107,923 nm/pixel sur les axes X et Y. Acquérir des images en z-stacks avec une taille de pas en z de 0,41 µm.
   2. Ajuster le nombre total de sections optiques en fonction de l'épaisseur du tissu. Et acquérir des images à partir d'un seul champ de vision.
      ​REMARQUE : Aucun assemblage d'images n'est nécessaire pour les acquisitions à 60×, car chaque jeu de données correspond à un unique champ de vision.
3. Acquisition d'images de référence histologiques
   1. Imager des coupes murines médio-sagittales de tête colorées à l'HE à l'aide d'un microscope à balayage de lames en éclairage en champ clair.
   2. Acquérir les images avec un objectif 40× (NA 0,95) et un grossissement caméra de 0,63x, ce qui donne un grossissement effectif de 25,2×.
   3. Vérifier un étalonnage pixel de 136,905 nm/pixel sur les axes X et Y. Et acquérir l'image comme un plan focal unique.
   4. Assembler automatiquement les images en mosaïque en utilisant un motif d'acquisition en serpentin et un fondu alpha linéaire.
4. Acquisition d'images de référence immunofluorescentes d'ensemble
   1. Acquérir des images immunofluorescentes complémentaires d'ensemble à l'aide d'un objectif 10x.
   2. Capturer l'échantillon comme une unique coupe en z en utilisant un recouvrement de tuiles de 0 % pendant l'acquisition d'images.
   3. Régler l'étalonnage de l'image à 647,249 nm/pixel sur les axes X et Y. Puis, générer une image d'ensemble englobant toute la région anatomique d'intérêt.
5. Traitement des images et génération des figures finales.
   1. Exporter les jeux de données d'images acquis vers un logiciel d'analyse d'images. Générer des projections d'intensité maximale (MIP) à partir des jeux de données en z-stacks.
   2. Sélectionner les régions d'intérêt (ROI) pour les analyses ultérieures et la préparation des figures.
   3. Combiner les images immunofluorescentes d'ensemble avec les images HE correspondantes afin de produire des figures de référence anatomique. Ensuite, vérifier l'alignement et la correspondance anatomique entre les jeux de données de fluorescence et histologiques avant la préparation des figures.
      REMARQUE: Tout assemblage d'images doit être effectué automatiquement pendant l'acquisition, à l'aide de paramètres prédéfinis du microscope, et ne doit pas nécessiter de post-traitement supplémentaire. Dans notre cas, la reconstruction 3D a été générée à l'aide du logiciel Imaris : le module de rendu de surface, basé sur un seuil d'intensité pour chaque canal acquis, a été utilisé pour produire la reconstruction 3D. Enfin, les images finales ont été assemblées dans Adobe Illustrator.

Résultats

Notre approche en montage entier présentée ici a permis l'isolement et la préservation complète de la muqueuse olfactive. Dans notre cas, notre objectif était de comprendre les changements cellulaires et anatomiques à la fois à grande échelle (vue anatomique complète) et à l'échelle microscopique (niveau cellulaire).

L'approche en montage entier nous permet de collecter à la fois les compartiments épithéliaux et la lame propre et de préserver les relations spatiales entre les faisceaux d'axones, les cellules de soutien olfactives (CSO) et les fibroblastes – nos cellules d'intérêt. Cette approche a permis l'acquisition de grands jeux de données continus qui ont capturé l'épaisseur totale et la vaste surface du tissu muqueux (Figure 3) et nous a permis de saisir les détails de la structure cellulaire complexe et des interactions (Figure 3), ainsi que leurs modifications entre des conditions intactes (n = 3) (Figure 3A, B) et endommagées (n = 12) (Figure 3C, D).

En combinant cette procédure optimisée de manipulation et de coloration des tissus avec une microscopie confocale haute résolution, nous avons pu obtenir des images de régions muqueuses plus étendues, présentant un niveau de détail cellulaire élevé et précis sur toute l'épaisseur du tissu. L'acquisition de piles Z sur plusieurs régions adjacentes a permis la reconstruction de domaines anatomiques étendus sans compromettre la résolution ni l'intégrité du signal (Figure 4A–F). Grâce aux détails cellulaires haute résolution, nous avons également pu utiliser les piles Z acquises sur toute l'épaisseur du tissu (Figure 4G) pour produire des images rendues (Figure 4H) afin de mieux comprendre la micro-architecture du tissu.

La détermination fiable de l'orientation du tissu avant la monture et l'observation a été régulièrement obtenue sans nécessiter d'étiquetage fluorescent. Le côté de la lame propre était facilement identifiable en microscopie en champ clair par la présence de faisceaux nerveux épais, clairement distinguables de la couche épithéliale. L'harmonisation de l'orientation des échantillons en plaçant la lame propre adjacente à la lamelle et la surface épithéliale contre la lame de verre a amélioré la cohérence des images entre les échantillons et facilité la reconstruction tridimensionnelle ultérieure. La pénétration des anticorps peut être déterminée en analysant le signal associé observé à travers l'épaisseur du tissu. Elle est généralement manifeste par l'absence de signal ou par un signal qui diminue progressivement lorsqu'on s'enfonce dans le tissu.

La restitution tridimensionnelle effectuée dans Imaris a permis une visualisation claire des réseaux cellulaires complexes et de l'organisation axonale au sein de la muqueuse intacte. La restitution basée sur les surfaces, appliquée par seuil d'intensité spécifique à chaque canal, a généré des représentations tridimensionnelles précises de l'architecture tissulaire tout en préservant les détails structurels fins.

Pour la coloration et la visualisation, les résultats attendus comprennent une visualisation nette du signal de coloration ciblé, sans perte anormale du signal ni dégradation du signal à travers l'épaisseur des tissus. L'impossibilité de visualiser un objectif coloré connu au microscope doit être considérée comme un résultat infructueux.

Figure 1. Représentation de la région anatomique avec superposition du tissu muqueux monté en entier. (A–C). Vue sagittale de l'intérieur de la narine gauche (coloration par l'hématoxyline et l'éosine, coloration HE) de la souris (A) avec superposition de la coloration en montage entier de la muqueuse provenant de la même région (pour l'orientation anatomique) (B), montrant l'orientation et la position des faisceaux d'axones en vert et les noyaux cellulaires en bleu. Cette technique a permis de préserver l'ensemble de la structure anatomique : il est possible de distinguer clairement les faisceaux d'axones du nerf olfactif principal (ON) et accessoire (nerfs voméronasaux, VNN), ainsi que de suivre leur trajet depuis le septum jusqu'au bulbe olfactif (OB), à travers la lame criblée (B, C). Le tissu présenté ici a été coloré avec l'Hoechst pour les noyaux (bleu) et la β-III-Tubuline pour les faisceaux d'axones (vert). Images représentatives issues de n = 15 préparations indépendantes. Veuillez cliquer ici pour visualiser une version agrandie de cette figure.

Figure 2. Vues macroscopiques et schématiques du système olfactif. (A) À l’aide d’un coupe-os, suivre la ligne pointillée rouge pour retirer l’os septal (région jaune). (B) Une fois exposée la cavité concave de la narine sous-jacente (en brun), on peut prélever l’ensemble du tissu muqueux s’étendant depuis cette région jusqu’aux muqueuses respiratoire et olfactive. (C) Représentation schématique illustrant la continuité de ces structures, s’étendant de l’épithélium olfactif jusqu’au bulbe olfactif. Veuillez cliquer ici pour visualiser une version agrandie de cette figure.

Figure 3. Vue élargie de la zone anatomique obtenue à l’aide d’un protocole de collecte et de coloration en montage entier. (A–D). Des images représentatives de muqueuses saines et lésées sont présentées. De haut en bas : muqueuse intacte issue de tissu sain (n = 3) et muqueuse lésée (n = 12). Dans le tissu sain (A), les cellules olfactives de la gaine (OEC) présentant des morphologies bipolaires allongées (A, à gauche) entourent les faisceaux d’axones (A, au centre), tandis que les fibroblastes forment la couche externe de ces structures en forme de tunnel (A, à droite, flèche blanche). Les trois régions d’intérêt (ROI) sélectionnées illustrent ces détails (B). Dans la muqueuse lésée, les OEC présentent à la fois des morphologies bipolaires et arrondies (C, D, à gauche, flèches blanches). Les faisceaux d’axones apparaissent moins uniformes et compacts (C, D, au centre, flèches blanches). Les fibroblastes sont largement répartis sur toute la région (C, D, à droite, flèches blanches). Échelle = 100 µm. Veuillez cliquer ici pour consulter une version agrandie de cette figure.

Figure 4. Imagerie fluorescente tridimensionnelle de préparations entières de muqueuse. (A–H). Des images à faible grossissement des cellules (A–F) et une image à fort grossissement (G) ont été obtenues à partir de piles d'images de plusieurs régions consécutives à l'aide d'un microscope SpinSR. Les cellules enrobantes olfactives (OEC) sont représentées en rouge, les fibroblastes en magenta, les axones en vert et les noyaux en bleu. Les flèches indiquent différentes morphologies des OEC (A) et une couche externe de fibroblastes entourant les faisceaux d'axones (B et C). Les figures D–F montrent par des flèches des similitudes dans la structure saine des fibroblastes. Ces images mettent en évidence l'organisation spatiale des composants cellulaires, qui a ensuite été reconstruite à l'aide du logiciel Imaris (H). Échelle = 50 µm. Veuillez cliquer ici pour visualiser une version agrandie de cette figure.

Réactif	Cible	Dilution	Conditions d'incubation	Raisonnement
Anticorps primaire
β-III-Tubulin (Lapin)	Axones	1:300	Pendant 72 h à 4 °C, sur rouleau	permettre une pénétration complète à travers toute l'épaisseur
PDGFR-β (Rat)	Fibroblastes	1:100
Anticorps secondaire
Alexa 488	Anticorps primaires de lapin	1:250	Enveloppé dans du papier d'aluminium, pendant au moins 4 h à température ambiante sur rouleau, puis toute la nuit à 4 °C sur rouleau.	Le papier d'aluminium empêche la photodégradation ; la durée, la température et l'agitation induite par le rouleau permettent une bonne pénétration
Alexa 647	Anticorps primaires de rat	1:500
Noyaux
Hoechst	Noyaux cellulaires	1:2500

Tableau 1 : Liste des anticorps avec les dilutions optimisées pour ce protocole. Ce tableau recense les réactifs de marquage avec leurs cibles, leurs dilutions et la justification des conditions d'incubation.

Discussion

Ces dernières décennies ont progressivement vu l'avènement de l'ère tridimensionnelle, avec de nombreuses approches innovantes se développant dans le domaine scientifique. Par exemple, les méthodes de reconstruction tridimensionnelle, rendues possibles par le développement de techniques complexes d'imagerie en montage entier associées à des microscopes fluorescents à haute résolution, ont permis une meilleure compréhension de plusieurs histoarchitectures tissulaires en pleine épaisseur. Ces approches de rendu tridimensionnel ont été utilisées pour définir plusieurs structures du corps humain, telles que les vaisseaux, les glandes et les tumeurs courantes^4,5,6,7,8,9. De plus, des informations sur les différences entre structures pathologiques et normales ont été recueillies, par exemple dans des cerveaux entiers de souris^10,11,12. Cette approche a été identifiée comme une étape cruciale vers une meilleure compréhension des divers systèmes biologiques, facilitant une compréhension approfondie des circuits cellulaires, de leur organisation spatiale structurelle et fonctionnelle, ainsi que de leur contribution potentielle aux pathologies humaines.

Un inconvénient des différentes combinaisons de reconstruction tissulaire tridimensionnelle et d'imagerie est que la plupart des approches impliquent des étapes de clarification des tissus. Bien que cette méthode soit utile pour de nombreux types de tissus, elle n'est pas adaptée à tous les types de tissus^8,9,19. En effet, les procédures de clarification comportent plusieurs étapes de lavage, qui pourraient endommager potentiellement les épitopes ciblés et influencer les signaux endogènes²⁰.

Les approches décrites ci-dessus ont été utilisées pour définir de nombreuses structures cellulaires importantes au sein de différents systèmes. Toutefois, le système olfactif et ses structures d'intérêt présentent une présence minimale de composants osseux à partir desquels ils pourraient être facilement isolés ; par conséquent, des approches sur montage entier n'incluant pas d'étapes de clarification ont été testées ces dernières années^13,14.

Ces études ont reconnu l'importance d'une meilleure définition de l'organisation des structures neuronales dans le système olfactif. En conséquence, leur objectif principal était d'établir une carte topographique claire de la répartition des neurones sensoriels olfactifs en fonction de l'expression de différents marqueurs¹⁴, ainsi que de révéler de nouvelles données sur leurs cils particuliers¹³.

La technique de montage entier développée et présentée ici permet la collecte et la préservation intégrale du tissu muqueux, offrant ainsi la possibilité d'obtenir des informations cruciales sur la structure anatomique et physiologique de cet environnement, avec, dans notre cas, un intérêt particulier pour la relation entre les cellules de l'entonnoir olfactif (OEC), les fibroblastes et les faisceaux d'axones. L'association de cette technique raffinée d'isolement et de coloration à une imagerie confocale haute résolution a permis d'acquérir de grandes images reflétant la structure de toute la région cible et des cellules qui y résident. Plus précisément, notre technique améliorée présente deux avantages distincts : la muqueuse entière est prélevée et traitée, y compris l'architecture de la lame propre¹³, et la méthode de préparation plus douce du tissu contribue à préserver l'anatomie à grande échelle ainsi que les interactions intercellulaires (telles que les cellules de l'entonnoir olfactif, les axones et les fibroblastes), par rapport aux autres protocoles de montage plat¹⁴. C'est également pourquoi ce protocole ne comprend pas de validation par rapport à la coloration sur coupes minces.

Comme mentionné ci-dessus, les techniques de montage entier impliquent généralement de longues périodes de traitement des tissus et l'utilisation de réactifs spécifiques et coûteux. Cette méthode a été développée en mettant l'accent sur un traitement tissulaire minimal afin de réduire à la fois la durée et le risque d'endommager des structures cellulaires importantes. La méthode optimisée représente donc un processus rapide pouvant être réalisé à l'aide de réactifs couramment utilisés en immunohistochimie sur coupes minces, offrant ainsi une alternative valable aux approches nécessitant des temps de traitement plus longs et inadaptées aux structures non ossifiées telles que les tissus muqueux.

L'acquisition d'images et le post-traitement peuvent être réalisés à l'aide de toute plateforme de microscopie confocale capable d'acquérir des z-stacks haute résolution à partir d'échantillons tissulaires épais, avec une pénétration laser suffisante pour imager à travers les muqueuses d'intérêt (se référer à la section des méthodes pour plus de détails sur nos paramètres d'acquisition et de traitement d'images).

Avec des modifications appropriées, nous pensons que ce protocole peut être adapté et appliqué à d'autres modèles courants de rongeurs. Grâce à certaines modifications spécifiques aux tissus, cette méthode peut être utilisée dans divers contextes, notamment l'étude des tissus muqueux et sous-muqueux des voies respiratoires et du tractus gastro-intestinal (GIT) ; l'investigation de l'organisation tissulaire et des interactions multi-systèmes au sein du système nerveux ; l'analyse des processus inflammatoires et des tissus lymphoïdes associés à la muqueuse (MALT) ; ainsi que l'exploration de différents axes multisystémiques, tels que l'axe intestin-cerveau.

La principale force de ce protocole réside dans les améliorations méthodologiques qui permettent un imagerie tridimensionnelle de haute qualité tout en préservant l'intégrité tissulaire, mais aussi en assurant une approche relativement rapide par rapport à d'autres méthodologies sur préparations entières précédemment testées dans le domaine.

La mise en œuvre réussie de cette approche dépendait fortement d'une compréhension approfondie de l'anatomie du tissu étudié. En effet, dans notre cas, la connaissance de la localisation attendue des faisceaux d'axones était essentielle pour minimiser l'invasivité de la procédure de prélèvement une fois l'intérieur du crâne exposé. Cette connaissance anatomique a été cruciale pour localiser rapidement la région et le tissu d'intérêt tout en préservant la structure globale de la muqueuse, soulignant ainsi que le traitement efficace des tissus est intrinsèquement lié à une stratégie de prélèvement éclairée, et non uniquement aux étapes de post-traitement.

Comme mentionné dans la section des méthodes en plusieurs notes, plusieurs ajustements techniques ont été essentiels au développement et à l'optimisation de cette méthode. Maintenir le tissu en suspension libre dans des tubes Eppendorf tout au long du processus de coloration, combiné à une rotation continue pendant l'incubation des réactifs et des anticorps, a constitué une étape clé par rapport aux protocoles plus statiques de montages entiers et de coupes minces. Ce perfectionnement a empêché le repliement du tissu tout en assurant une pénétration homogène des réactifs dans l'échantillon entier, améliorant ainsi la reproductibilité de la coloration sans nécessiter d'étapes de clarification superflues. En outre, une optimisation minutieuse de la durée d'incubation pour chaque cocktail de réactifs et d'anticorps s'est révélée essentielle. Cette dernière étape pourrait nécessiter des ajustements supplémentaires selon le type d'anticorps choisi.

Ensemble, ces facteurs spécifiques ont permis d'améliorer la reproductibilité tout en réduisant le temps de traitement global et les manipulations rigoureuses des échantillons.

Une autre étape méthodologique importante a été la capacité à déterminer de manière fiable l'orientation du tissu avant la monture et l'observation, sans avoir besoin d'un marquage fluorescent. Le côté de la lame propre de tissu muqueux pouvait être facilement identifié en microscopie en champ clair par la présence de gros faisceaux nerveux, clairement distinguables du tissu épithélial environnant. L'harmonisation de l'orientation des échantillons en plaçant la lame propre face au côté de la lamelle et la couche épithéliale reposant sur la lame de verre s'est révélée améliorer la qualité de l'acquisition d'images. Ce réglage simple mais efficace a amélioré la cohérence des images entre les échantillons et a contribué à la qualité des reconstructions tridimensionnelles obtenues.

Il existe toutefois certaines limitations à prendre en compte. Ce protocole n’a pas été testé sur de nombreuses souches courantes de souris ni sur d'autres espèces de rongeurs. De même, les optimisations ont été réalisées dans des conditions expérimentales spécifiques, telles que décrites ci-dessus, et uniquement avec les panels d'anticorps indiqués. Bien que ce protocole devrait fonctionner avec la plupart des souches de souris et de rats, plusieurs anticorps différents, et tout modèle expérimental permettant de prélever les muqueuses en épaisseur totale, une optimisation soigneuse supplémentaire pourrait être nécessaire. Une autre limitation notable est qu'une section entière en montage entier ne peut être marquée qu'avec un seul panel d'anticorps, contrairement aux tissus en sections minces, où chaque section peut être marquée avec un panel d'anticorps distinct, permettant ainsi de tester plusieurs panels d'anticorps différents sur des tissus en sections minces.

Dans l'ensemble, ces innovations méthodologiques montrent comment des ajustements relativement simples dans la manipulation des tissus, les conditions de coloration et l'orientation des échantillons peuvent améliorer considérablement les résultats d'imagerie en montage entier. En évitant les étapes intensives de traitement et de clarification des tissus, cette approche offre une alternative pratique et adaptable pour l'étude de tissus délicats et sans os, tout en permettant l'acquisition de données tridimensionnelles détaillées à grande échelle.

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Albumine sérique bovine (BSA)	Sigma-Aldrich	A3294-50G	Immunohistochimie
Adobe Illustrator		version 28.5
Anticorps anti-bêta III tubuline - Marqueur neuronal	Abcam	ab18207
Anticorps anti-PDGFR bêta [APB5]	Abcam	ab91066
bisBenzimide H 33342 trihydrochlorure	Sigma Aldrich	14533
LAMELLES 24X50MM NO. 1.5 100PIÈCES	Bio-strategy	EPBRCS245015GP	Immunohistochimie
Anticorps secondaire IgG (H+L) de chèvre anti-lapin, hautement adsorbé par croisement, Alexa Fluo 488	Thermo Fisher	A-21206
Coupe-os Dumont n°15A - Revêtement époxy	Daniels Health Laboratory Products P/L	11215-02	Disséction tissulaire
Pinces Dumont n°7 - Biologie/Dumostar	Daniels Health Laboratory Products P/L	11297-10	Disséction tissulaire
Anticorps secondaire IgG (H+L) de chèvre anti-rat, adsorbé par croisement, Alexa Fluor™ 647	Thermo Fisher	A-21247
Logiciel Imaris	Imaris	version 9.5.0	Imagerie
Ciseaux de dissection Mayo	ProSciTech	420SS	Disséction tissulaire
Paraformaldéhyde	Sigma-Aldrich	P6148-500G	Traitement des tissus
Solution tampon phosphate stérile, comprimés PBS (PBS)	Thermo Fisher Scientific	18912014	Traitement des tissus
Medium de montage antifade ProLong Glass	Thermo Fisher Scientific	P36980	Immunohistochimie
Lame de scalpel n°23	Scalpel Blades Swann Morton	COS240B	Disséction tissulaire
Manche de scalpel n°4	ProSciTech	T134	Disséction tissulaire
Azoture de sodium	Sigma-Aldrich	S2002-25G	Traitement des tissus
Saccharose	Chem-Supply	57-50-1	Traitement des tissus
Lames microscopiques TOMO adhésives	ProSciTech	GEMS63705-09	Immunohistochimie
Triton X-100	Sigma-Aldrich	X100-100mL	Immunohistochimie