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Article de méthode

Rythmes circadiens en boîte de Petri : synchronisation des cellules mHypoE-42 de l'hypothalamus de souris pour l'analyse de l'expression des gènes de l'horloge circadienne

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DOI :

10.3791/72039

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3 septembre 2026

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1CNC-UC-Center for Neuroscience and Cell Biology, University of Coimbra, 2CiBB-Centre for Innovative Biomedicine and Biotechnology, University of Coimbra, 3Faculty of Pharmacy, University of Coimbra, 4Gene Therapy Center of Excellence (GeneT), University of Coimbra, 5Institute for Interdisciplinary Research (IIIUC), University of Coimbra

Dans cet article

Résumé

Ce protocole fournit un flux opérationnel pratique et reproductible pour synchroniser des cellules en culture, effectuer un prélèvement échelonné dans le temps sur une durée de 24 à 72 heures sans prélèvement nocturne, et analyser l'expression des gènes de l'horloge circadienne.

Résumé

Les rythmes circadiens sont des oscillations endogènes d'environ 24 heures qui régulent un large éventail de processus cellulaires et physiologiques, notamment l'expression des gènes, le métabolisme et le comportement. Ces rythmes résultent de boucles de rétroaction transcriptionnelles et traductionnelles interconnectées qui répondent à des signaux temporels et environnementaux. Étant donné que la régulation circadienne est hautement dynamique, même de légères variations expérimentales peuvent influencer la phase, l'amplitude et la rythmicité, ce qui rend essentiel l'utilisation de protocoles expérimentaux standardisés afin d'obtenir des résultats fiables et reproductibles. L'objectif du présent protocole est de fournir un protocole pratique et reproductible pour synchroniser des cellules en culture, effectuer un prélèvement échelonné dans le temps et analyser l'expression des gènes de l'horloge circadienne dans des conditions standards de laboratoire. Le protocole décrit la synchronisation par choc sérique, la collecte échelonnée d'échantillons sur une période de 24 à 72 heures afin d'éviter les prélèvements nocturnes, l'extraction des acides ribonucléiques, la synthèse d'acide désoxyribonucléique complémentaire, la réaction de polymérisation en chaîne en temps réel quantitative et l'analyse des rythmes circadiens à l'aide d'approches statistiques appropriées. Le protocole met également en évidence des considérations expérimentales critiques, telles que les conditions de synchronisation, l'évaluation de la qualité des échantillons, le choix des gènes de référence et l'analyse des données, afin d'améliorer la reproductibilité entre les expériences. Cette méthode offre une approche accessible pour étudier les mécanismes moléculaires circadiens et évaluer l'expression rythmique des gènes dans des cellules en culture, facilitant ainsi les études sur la régulation circadienne dans des modèles expérimentaux physiologiques ou liés à des maladies.

Introduction

Les rythmes circadiens sont des cycles endogènes d'une période d'environ 24 h qui régulent un large éventail de processus physiologiques, métaboliques et cellulaires1. Dans les systèmes mammaliens, ces rythmes sont coordonnés par une horloge centrale située dans le noyau suprachiasmatique (SCN) de l'hypothalamus et par des horloges moléculaires autonomes au niveau cellulaire. Ces horloges sont constituées de boucles de rétroaction transcriptionnelles et traductionnelles imbriquées impliquant des gènes horloges fondamentaux, notamment la protéine circadienne des cycles d'activité locomotrice Clock, le facteur de transcription à motif hélice-boucle-hélice Bmal1 (aryl hydrocarbon receptor nuclear translocator-like 1), les gènes Per (period ) et la cryptochrome (Cry)2. Étant donné le rôle central de l'horloge circadienne dans divers processus biologiques, les modèles cellulaires in vitro sont devenus des outils importants pour étudier les mécanismes moléculaires de la régulation temporelle dans des conditions expérimentales contrôlées.

L'objectif du présent protocole est de fournir un flux opératoire fiable, pratique et reproductible pour synchroniser des cellules cultivées à l'aide d'un protocole de choc sérique, effectuer des prélèvements échelonnés dans le temps et analyser l'expression des gènes de l'horloge circadienne, tout en évitant la collecte d'échantillons pendant la nuit. En améliorant la faisabilité de l'échantillonnage circadien sans compromettre la qualité des données, ce flux opératoire vise à faciliter l'étude des processus biologiques rythmiques à l'aide de techniques de laboratoire standard.

Des études circadiennes ont été menées sur un large éventail de modèles in vitro, notamment des lignées cellulaires humaines cancéreuses3, des fibroblastes de rat-14, des explants de SCN 5 et des organoïdes6. Bien que la plupart des cellules de mammifères possèdent des horloges circadiennes fonctionnelles, l'absence de signaux synchronisateurs, tels que la lumière, entraîne rapidement une désynchronisation en culture, limitant ainsi l'étude des rythmes circadiens in vitro7. Par conséquent, les techniques de synchronisation sont essentielles pour étudier les mécanismes de l'horloge moléculaire et leurs implications dans la santé et la maladie.

Plusieurs stratégies de synchronisation ont été mises au point pour les cellules de mammifères en culture. La synchronisation basée sur les glucocorticoïdes à l'aide de la dexaméthasone fait partie des approches les plus largement utilisées, car elle réinitialise de manière robuste les rythmes circadiens dans de nombreux types cellulaires tout en réduisant certaines des variabilités associées à la stimulation par le sérum8. De façon similaire, l'activation médiée par la forskoline de la voie de signalisation du monophosphate d'adénosine cyclique a été utilisée avec succès pour synchroniser les horloges périphériques dans certains modèles cellulaires sélectionnés9. D'autres approches incluent le traitement par des signaux circulants dans le sang4, différents composés chimiques8,10, le renouvellement du milieu3, le choc thermique11, les cycles d'oxygène12 et la stimulation mécanique13. Dans leur ensemble, ces méthodes ont considérablement fait progresser la recherche circadienne ; toutefois, elles peuvent nécessiter des équipements spécialisés, des conditions expérimentales spécifiques ou des optimisations supplémentaires, ce qui rend essentiel de valider la stratégie de synchronisation choisie pour chaque modèle biologique et chaque application expérimentale14.

Le choc sérique est l'une des approches de synchronisation les plus largement établies et consiste à exposer des cellules en culture à un stimulus transitoire riche en sérum4. Étant donné que le stimulus est transitoire, la perturbation prolongée des voies de signalisation cellulaire est minimisée4, réduisant ainsi les effets perturbateurs potentiels sur les analyses ultérieures. Par conséquent, le choc sérique est particulièrement adapté à l'étude de l'expression génique circadienne et du fonctionnement de l'horloge moléculaire. De plus, la procédure est simple à mettre en œuvre et ne nécessite pas d'équipement spécialisé, ce qui la rend accessible et facilement reproductible dans différents laboratoires. Une limitation pratique des expériences de choc sérique réside toutefois dans le calendrier d'échantillonnage intensif requis pour caractériser précisément la rythmicité circadienne. Une analyse fiable de la rythmicité exige généralement la collecte d'échantillons à intervalles réguliers, habituellement toutes les 2 à 6 heures sur un ou plusieurs cycles circadiens (24 à 72 heures)14, ce qui implique souvent des prélèvements nocturnes.

Le flux de travail décrit ici répond à ce défi logistique en échelonnant l'initiation de la synchronisation sur plusieurs plaques de culture, permettant ainsi un échantillonnage circadien complet pendant les heures de travail habituelles, tout en évitant la collecte d'échantillons en dehors de ces heures. Plutôt que de proposer une nouvelle stratégie de synchronisation, ce protocole décrit une mise en œuvre détaillée et reproductible d'une méthode établie de choc sérique, combinée à un calendrier d'échantillonnage pratique et à une analyse en aval de l'expression génique. Ce flux de travail est particulièrement adapté aux études d'expression génique circadienne dans des cellules en culture, en utilisant des techniques de laboratoire largement disponibles. Lors de l'adaptation de ce protocole à d'autres modèles cellulaires, les paramètres expérimentaux — notamment la densité cellulaire, les conditions de synchronisation, les intervalles d'échantillonnage et le choix des gènes de référence — doivent être optimisés et validés pour le type cellulaire spécifique avant sa mise en œuvre.

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Protocole

Le protocole suivant décrit une méthode de synchronisation validée pour la lignée cellulaire embryonnaire hypothalamique de souris mHypoE-42. Validez et optimisez indépendamment le protocole de synchronisation avant de l'appliquer à d'autres types cellulaires en culture. Consultez la Figure 1 pour un aperçu du flux opératoire et la Figure supplémentaire 1 pour le calendrier d'échantillonnage hebdomadaire. Reportez-vous au Tableau des matériaux pour obtenir la liste de tous les réactifs, équipements et instruments utilisés dans ce protocole. Effectuez toutes les manipulations de culture cellulaire dans une hotte de sécurité biologique certifiée, en utilisant des réactifs et du matériel stériles.

Schéma du processus de synchronisation cellulaire, méthode de choc sérique, chronologie, dispositif expérimental, intervalles CT.
Figure 1. Aperçu schématique du protocole de synchronisation par choc sérique décalé. Schéma illustrant le déroulement utilisé pour synchroniser les cellules mHypoE-42 par choc sérique dans deux séries expérimentales décalées. La conception décalée permet la collecte d'échantillons circadiens pendant les heures de travail habituelles tout en évitant les prélèvements nocturnes. Les échantillons sont ensuite traités pour l'extraction d'ARN, la polymérase en chaîne quantitative en temps réel (qRT-PCR) et l'analyse des rythmes circadiens. Créé avec Biorender.com. Veuillez cliquer ici pour visualiser une version agrandie de cette figure.

1. Culture cellulaire

  1. Cultiver les cellules adhérentes mHypoE-42 dans le milieu de Dulbecco modifié (DMEM), à forte teneur en glucose (4500 mg/L), supplémenté avec 10 % (v/v) de sérum bovin fœtal inactivé par la chaleur (FBS), 3,7 g/L de bicarbonate de sodium et 1 % de solution antibiotique.
  2. Conserver les cellules à 37 °C dans un incubateur humide contenant 95 % d'air et 5 % de dioxyde de carbone (CO2) en utilisant des flacons de culture T75 avec un volume final de culture de 10 mL.
    REMARQUE : Tester chaque nouveau lot de FBS avant de commencer les expériences, car les lots de sérum peuvent varier.
  3. Repasser les cellules lorsqu'elles atteignent une confluence d'environ 80 à 90 %. Laver les cellules avec du sérum physiologique tamponné au phosphate stérile 1× (PBS ; pH 7,4), ajouter 3 mL de solution de trypsine à 0,5 % et incuber pendant 3 à 5 minutes pour détacher les cellules.
  4. Ajouter au moins deux fois le volume de trypsine de milieu de culture complet contenant 10 % (v/v) de FBS afin de neutraliser la trypsine.
  5. Diluer les cellules avec du milieu de croissance frais selon un ratio allant jusqu'à 1:2.
    REMARQUE : Éviter d'utiliser des cellules ayant subi un nombre excessif de passages (par exemple, passages supérieurs à 40 pour les cellules mHypoE-42). Préchauffer toutes les solutions avant utilisation. Tester régulièrement les cultures pour détecter une contamination par les mycoplasmes.
  6. Procéder aux tests de synchronisation 24 heures après la mise en culture des cellules à raison de 2,0 × 105 cellules par puits, comme décrit à l'étape 2. Maintenir les cultures cellulaires de routine à une confluence d'environ 80 à 90 % avant chaque passage.

2. Synchronisation de la lignée cellulaire mHypoE-42

  1. Préparation des cellules
    1. Après la trypsination, centrifuger les cellules à 700 × g pendant 5 min.
    2. Jeter le surnageant et resuspendre le culot cellulaire dans 10 mL de milieu de culture frais.
    3. Mélanger la suspension cellulaire avec du colorant bleu de trypan en rapport 1:1 (volume total de 20 μL) et déterminer la concentration cellulaire à l’aide d’un hématimètre.
      NOTE : Éliminer les solutions contenant du bleu de trypan conformément aux directives institutionnelles de gestion des déchets chimiques. Ne pas verser le colorant inutilisé dans l’évier.
  2. Ensemencement cellulaire et conception expérimentale décalée
    1. Ensemencer 2,0 × 105 cellules par puits dans des plaques à 6 puits ou des boîtes de culture de 35 mm. Incuber les cultures à 37 °C pendant 24 h.
      NOTE : Démarrer la synchronisation par sérum 24 h après l’ensemencement des cellules. Par conséquent, une confluence cellulaire prédéfinie n’est pas nécessaire avant la synchronisation. Examiner plutôt les cultures au microscope afin de confirmer que les cellules sont complètement attachées et présentent une morphologie appropriée avant de commencer la procédure de synchronisation.
    2. Répartir aléatoirement les plaques de culture en deux séries expérimentales. Utiliser la première série pour générer les points temporels circadiens (CT) CT0, CT4, CT8, CT24, CT28 et CT32. Utiliser la deuxième série pour générer CT12, CT16, CT20, CT36, CT40, CT44 et CT48 (Figure 1 ; Figure supplémentaire 1).
    3. Augmenter le nombre de puits ou de plaques selon les besoins afin d’inclure des réplicats techniques.
      NOTE : Minimiser la variabilité en préparant toutes les plaques à partir de la même suspension cellulaire, en maintenant des densités d’ensemencement et des conditions de culture identiques, et en effectuant la synchronisation avec les mêmes réactifs et paramètres expérimentaux. Ajuster le format des récipients de culture et la densité d’ensemencement selon les besoins pour d’autres types cellulaires. Lors de l’utilisation de plaques à 6 puits, combiner les CTs collectés simultanément afin d’optimiser l’utilisation des plaques.
  3. Synchronisation
    1. Après 24 h, aspirer le milieu des premières plaques et ajouter 1 mL de DMEM sans sérum. Incuber pendant 12 h afin d’induire la privation de sérum.
    2. Préparer immédiatement avant utilisation une solution de sérum de cheval à 50 % (v/v) dans du DMEM à haute teneur en glucose.
    3. Aspirer le milieu de privation des premières plaques et exposer les cellules à 1 mL de la solution fraîchement préparée de sérum de cheval à 50 % pendant 2 h.
    4. Simultanément, aspirer le milieu des secondes plaques et le remplacer par 1 mL de DMEM sans sérum. Incuber pendant 12 h.
    5. Après le choc sérique de 2 h, aspirer le milieu et ajouter 1 mL de DMEM à haute teneur en glucose supplémenté en 10 % (v/v) de FBS inactivé par la chaleur. Désigner ce moment comme CT0.
  4. Prélèvement des échantillons
    1. Placer les plaques de culture sur de la glace. Aspirer le milieu, laver les cellules deux fois avec 1 mL de PBS 1× froid et stérile, jeter la solution de lavage, puis lyser les cellules mécaniquement en utilisant jusqu’à 1 mL de réactif de lyse.
      ATTENTION : Le réactif de lyse contient des produits chimiques dangereux. Effectuer toutes les manipulations dans une hotte chimique certifiée, en portant des équipements de protection individuelle adaptés. Éliminer les déchets conformément aux directives institutionnelles de sécurité chimique.
    2. Transférer chaque lysat dans un tube stérile et conserver les échantillons à −80 °C jusqu’à l’extraction de l’ARN.
    3. Répéter les étapes 2.4.1 et 2.4.2 pour prélever des échantillons aux temps CT4 et CT8.
    4. Au temps CT8, répéter l’étape 2.3.2 pour la deuxième série expérimentale afin de synchroniser les autres cellules.
    5. Après 2 h de choc sérique, arrêter la synchronisation de la deuxième série expérimentale en remplaçant le milieu par 1 mL de DMEM à haute teneur en glucose supplémenté en 10 % (v/v) de FBS inactivé par la chaleur.
    6. Prélever alternativement des échantillons des deux séries expérimentales afin d’obtenir CT12, CT24, CT16, CT28, CT20 et CT32. Le jour suivant, répéter la procédure de prélèvement pour obtenir CT36, CT40, CT44 et CT48.
      NOTE : La privation de sérum et la synchronisation ont été initiées selon le calendrier expérimental après l’ensemencement des cellules, et non à une confluence cellulaire prédéfinie. Confirmer que les cellules sont complètement attachées et présentent une morphologie appropriée avant de commencer la synchronisation. Bien que les CTs consécutifs diffèrent de 4 h, les prélèvements ne sont pas effectués à intervalles réguliers de 4 h. Se référer à Figure supplémentaire 1 pour le calendrier complet de prélèvement hebdomadaire.

3. Traitement des échantillons : extraction de l'ARN

REMARQUE : Les protocoles peuvent varier selon le contexte expérimental et l'application. Le flux de travail suivant décrit un exemple de procédure efficace pour l'extraction d'ARN, la synthèse d'ADN complémentaire (ADNc) et la réaction de polymérisation en chaîne par transcription inverse en temps réel (qRT-PCR). Extraire l'ARN total à l'aide d'une méthode combinée de lyse basée sur le phénol et de séparation de phases, suivie d'une purification par colonnes de silice en centrifugation.

  1. Préparation des échantillons et séparation des phases
    1. Dégeler les échantillons, re-homogénéiser les lysats et les incuber à température ambiante pendant 5 min.
    2. Ajouter 200 μL de chloroforme pour chaque 1 mL de réactif de lyse.
      ATTENTION : Le chloroforme est volatil et toxique. Réaliser toutes les manipulations impliquant le chloroforme dans une hotte chimique certifiée, tout en portant des équipements de protection individuelle adaptés.
    3. Agiter vigoureusement les tubes pendant 15 s puis les incuber à température ambiante pendant 3 min.
    4. Centrifuger les échantillons à 12 000 × g pendant 15 min à 4 °C. Laisser les échantillons se séparer en trois phases : une phase inférieure phénol-chloroforme contenant les protéines, une interphase blanche contenant l'ADN, et une phase aqueuse supérieure enrichie en ARN.
    5. Transférer soigneusement la phase aqueuse dans un nouveau tube stérile sans perturber l'interphase. Conserver la phase organique à 4 °C si une isolation ultérieure des protéines ou de l'ADN est prévue.
      REMARQUE : Réaliser l'isolement des protéines ou de l'ADN selon le protocole approprié si ces biomolécules doivent être récupérées à partir de la phase organique.
  2. Purification de l'ARN
    1. Ajouter un volume égal d'éthanol à 70 % (préparé avec de l'eau sans RNase) à la phase aqueuse, puis vortexer deux fois pendant 15 s pour favoriser la liaison de l'ARN.
    2. Charger l'échantillon sur une colonne de silice en centrifugation et purifier l'ARN selon le protocole de purification sur colonne.
    3. Digérer l'ADN génomique contaminant par une DNase pendant 15 min à température ambiante.
    4. Laver la colonne à l'aide des tampons de lavage fournis.
    5. Réaliser un lavage supplémentaire avec 100 μL de tampon de lavage et centrifuger à 11 000 × g pendant 2 min pour sécher la membrane de silice.
    6. Transférer la colonne de centrifugation dans un tube microcentrifuge propre. Éluer l'ARN avec 40–60 μL d'eau sans RNase en appliquant l'eau directement au centre de la membrane de silice, puis centrifuger à 11 000 × g pendant 1 min.
      REMARQUE : Choisir le volume d'élution en fonction du rendement et de la concentration d'ARN souhaités. Un volume d'élution de 60 μL permet généralement une récupération plus complète de l'ARN à partir de la membrane de silice, mais produit une solution d'ARN plus diluée. En revanche, un volume d'élution de 40 μL donne une préparation d'ARN plus concentrée, mais peut réduire le rendement total d'ARN. Optimiser le volume d'élution selon les recommandations du fabricant et les besoins de l'application en aval.
  3. Évaluation de la qualité de l'ARN
    1. Placer les échantillons d'ARN sur de la glace et transférer 5 μL de chaque échantillon dans un nouveau tube microcentrifuge stérile pour l'évaluation de la qualité.
    2. Évaluer l'intégrité de l'ARN par électrophorèse sur gel d'agarose à 1,5 % ou par électrophorèse capillaire. Vérifier la présence de bandes ribosomiques 28S et 18S bien définies.
    3. Déterminer la concentration et la pureté de l'ARN en mesurant l'absorbance à l'aide d'un spectrophotomètre.
      REMARQUE : Éliminer les déchets contenant du phénol conformément aux directives institutionnelles de gestion des déchets chimiques. Ne pas jeter les déchets chimiques dangereux dans l'évier. Pour les échantillons de cellules en culture, les concentrations d'ARN se situent généralement entre 200 et 1000 ng/μL et sont adaptées à la synthèse d'ADN complémentaire et à la qRT-PCR. Accepter les échantillons d'ARN dont le rapport A260/230 est compris entre 2,0 et 2,2 et dont le rapport A260/280 est d'environ 2,0 (voir Tableau supplémentaire 1).
  4. Stockage de l'ARN
    1. Conserver les échantillons d'ARN purifiés à −80 °C jusqu'à la synthèse d'ADN complémentaire.

4. Traitement des échantillons : synthèse d'ADN complémentaire

REMARQUE : synthétisez de l'ADNc à partir de 1 μg d'ARN total en utilisant un kit de synthèse du brin complémentaire. Ajustez les volumes de réaction et les conditions d'incubation conformément aux instructions du fabricant.

  1. Transcription inverse
    1. Dégeler les échantillons d'ARN sur de la glace. Préparer une réaction de transcription inverse de 20 μL contenant 1 μg d'ARN total, 10 μL de mélange maître 2× (contenant un inhibiteur de ribonucléase, des hexamères aléatoires, des amorces oligo(désoxythymidine), des ions magnésium [Mg2+] et des désoxynucléotides triphosphates), 2 μL de mélange enzymatique (contenant la transcriptase inverse) et de l'eau traitée au pyrocarbonate de diéthyle jusqu'à un volume final de 20 μL.
    2. Incuber la réaction dans un thermocycleur pendant 10 min à 25 °C afin d'hybrider les amorces, puis pendant 30 min à 50 °C pour la synthèse d'ADN complémentaire (ADNc). Inactiver la transcriptase inverse en incubant la réaction à 85 °C pendant 5 min.
    3. Ajouter 1 μL de RNase H et incuber la réaction pendant 20 min à 37 °C pour dégrader le brin d'ARN de l'hybride ARN–ADN.
    4. Effectuer une dilution de la préparation d'ADNc jusqu'à 1:20 avec de l'eau stérile, selon les besoins d'optimisation du test, puis conserver l'ADNc dilué à −20 °C jusqu'à l'analyse par réaction de polymérisation en chaîne en temps réel quantitative (qRT-PCR).

5. Traitement des échantillons : réaction de polymérisation en chaîne en temps réel (qRT-PCR)

REMARQUE : Mesurer l'expression des gènes de l'horloge circadienne à l'aide de la qRT-PCR. Se référer au Tableau supplémentaire 2 pour les séquences de primers validées, les températures d'hybridation et les concentrations de primers.

  1. Optimisation du test
    1. Valider et optimiser la concentration des amorces, la température d'hybridation et la quantité d'ADNc en utilisant des échantillons d'ADNc regroupés et une courbe standard avant d'analyser les échantillons expérimentaux. Réaliser l'optimisation et la validation du test comme décrit précédemment15,16.
  2. Préparation des réactions
    1. Préparer chaque réaction de qRT-PCR de 10 μL en combinant 5 μL de mix maître 2×, 0,4 μL de chaque amorce (sens et antisens), 0,2 μL d'eau traitée au diéthylpyrocarbonate et 4 μL de matrice d'ADNc dans une plaque PCR 96 puits.
    2. Fermer la plaque avec un film ou un cache optiquement transparent. Centrifuger la plaque à 700 × g pendant 5 min maximum à 4 °C pour éliminer les bulles et rassembler le mélange réactionnel au fond de chaque puits.
    3. Analyser tous les échantillons d'ADNc afin de déterminer l'expression des gènes cibles Bmal1 et Per2.
    4. Analyser le gène de référence sélectionné (B2m) en utilisant la même dilution d'ADNc afin de normaliser l'expression génique entre les échantillons.
  3. Cyclage thermique
    1. Réaliser la qRT-PCR selon les conditions de cyclage suivantes : dénaturation initiale et activation de la polymérase ADN à départ chaud à 95 °C pendant 2 min, suivies de 39 cycles de 95 °C pendant 5 s et 60 °C pendant 30 s.
    2. Réaliser une analyse de la courbe de fusion en chauffant les réactions à 95 °C pendant 5 s, puis en augmentant progressivement la température par incrément de 0,5 °C jusqu'à 95 °C, avec une pause de 5 s à chaque incrément.
      NOTE : Ajuster les durées de pause et les paramètres de la courbe de fusion selon les recommandations du mix maître si nécessaire.
  4. Validation du gène de référence
    NOTE : Dans les expériences de synchronisation par sérum, évaluer les gènes de référence candidats car le traitement au sérum peut modifier l'expression des gènes ménagers17. Évaluer la stabilité d'expression à l'aide de méthodes telles que BestKeeper18, geNorm19, NormFinder20 ou la méthode comparative ΔCt21. Sélectionner le ou les gènes les plus stables pour la normalisation. Dans cette étude, β-actin (Actb) et β-2-microglobulin (B2m) ont été évalués à l'aide du logiciel RefFinder22, qui intègre plusieurs algorithmes de validation de gènes de référence. B2m a montré la plus grande stabilité d'expression au cours du cycle circadien et a donc été sélectionné pour la normalisation.
  5. Vérification du produit
    1. Vérifier la spécificité de l'amplification en analysant les produits PCR par électrophorèse sur gel d'agarose à 2 %.
      NOTE : Déterminer la température d'hybridation optimale en testant plusieurs températures (par exemple, 58 °C, 60 °C et 62 °C). Choisir la température qui produit la valeur la plus faible de cycle de quantification (Cq) tout en maintenant un pic unique sur la courbe de fusion et sans signe de formation de dimères d'amorces.
      NOTE : Accepter les tests dont l'efficacité d'amplification est comprise entre 90 % et 110 % et dont le coefficient de détermination (R2) est égal ou supérieur à 0,99. Vérifier que les températures de fusion diffèrent d'au plus 0,5 °C entre les réplicats techniques. N'accepter pour l'analyse que les réplicats techniques dont la différence de Cq est ≤ 0,5, et utiliser ces valeurs pour calculer les niveaux moyens d'expression. Réaliser toutes les réactions en réplicats techniques (par exemple, en triplicats) et inclure à la fois un témoin sans matrice et un témoin sans reverse transcriptase.

6. Analyse des données

  1. Analyse de l'expression génique
    1. Faire la moyenne des réplicats techniques pour chaque échantillon avant l'analyse en aval.
    2. Calculer la valeur ΔCq pour chaque échantillon et chaque point temporel à l’aide de l’équation suivante :
      ΔCq   = Cqgène cible  -  Cqgène de référence
    3. Calculer la valeur ΔΔCq pour chaque échantillon et chaque point temporel à l’aide de l’équation suivante :
      ΔΔCq   = ΔCqéchantillon  -  ΔCqtémoin  
      REMARQUE : Pour le calcul de ΔΔCq, ΔCqtémoin a été défini comme la valeur moyenne de ΔCq obtenue en faisant la moyenne de tous les échantillons témoins à travers tous les CT.
    4. Évaluer les paramètres circadiens, notamment la MESOR (statistique d'estimation de la ligne médiane du rythme), l'amplitude, le pic et la phase, à l'aide de CircaCompare23. Réaliser l'analyse soit avec l'application en ligne, soit avec l'implémentation du package R.
  2. Analyse CircaCompare en ligne
    REMARQUE : L'implémentation en ligne fournit des estimations complètes des paramètres circadiens uniquement lorsque le jeu de données satisfait aux critères statistiques de rythmicité. Lorsque la rythmicité est faible ou non statistiquement significative, utiliser l'implémentation R pour obtenir les estimations de paramètres pour tous les jeux de données.
    1. Préparer un fichier de valeurs séparées par des virgules (.csv).
      1. Saisir la variable temporelle (numérique ; heures) dans la colonne 1.
      2. Saisir la variable de regroupement (deux groupes expérimentaux uniquement) dans la colonne 2.
      3. Saisir la variable résultat (numérique ; ΔΔCq) dans la colonne 3.
    2. Charger le fichier .csv dans l'application en ligne CircaCompare.
    3. Attribuer les variables temporelle, de groupe et de résultat aux colonnes correspondantes.
    4. Sélectionner Exécuter pour effectuer l'analyse.
  3. Analyse CircaCompare dans R
    1. Réaliser l'analyse avec la version 4.5.1 de R et la version 0.2.0 du package CircaCompare24.
    2. Installer les packages R requis.
      1. Installer le package devtools (version 2.5.2).
      2. Installer le package circacompare (version 0.2.0).
      3. Installer le package ggplot2 (version 4.0.3).
      4. Installer le package svglite (version 2.2.2).
    3. Charger le fichier d'entrée .csv.
    4. Exécuter l'analyse CircaCompare après avoir défini alpha_threshold = 1.
      REMARQUE : Définir alpha_threshold = 1 permet d'obtenir les estimations des paramètres circadiens pour toutes les oscillations ajustées, indépendamment de leur signification statistique. Toutefois, seules les oscillations ayant une valeur-p < 0,05 doivent être interprétées comme rythmiques et statistiquement significatives.
    5. Personnaliser le fichier supplémentaire 1 avant d'exécuter le script.
      1. Remplacer « XXX.csv » par le nom du fichier de données d'entrée.
      2. Remplacer « YYY.csv » par le nom souhaité pour le fichier de résultats.
      3. Remplacer « ZZZ.svg » par le nom souhaité pour le fichier du graphique.
      4. Ajuster les limites de l’axe des ordonnées (ylim) et tout autre paramètre de tracé selon le jeu de données.
    6. Se référer au tableau supplémentaire 3 pour un exemple de fichier d'entrée.

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Résultats

Une synchronisation réussie est indiquée par une rythmicité circadienne statistiquement significative des gènes horloges analysés dans la condition contrôle (p < 0,05). Dans cette étude, trois expériences biologiques indépendantes ont été réalisées, le diméthylsulfoxyde à 0,1 % servant de contrôle négatif. Les gènes Bmal1 et Per2 ont été choisis comme marqueurs circadiens représentatifs car ils sont des composants essentiels de l'horloge circadienne moléculaire et présentent un profil d'expr...

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Discussion

Les rythmes circadiens sont des cycles endogènes d'environ 24 h qui régulent un large éventail de processus physiologiques, métaboliques et cellulaires par des mécanismes moléculaires d'horloge conservés1,2. Les modèles de synchronisation in vitro offrent un environnement expérimental contrôlé pour l'étude de ces mécanismes et se sont révélés des outils précieux pour analyser la régulation circadienne dans des conditions normales et pathologiques, notamm...

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Déclarations de divulgation

Les auteurs déclarent qu'ils n'ont aucun conflit d'intérêts.

Remerciements

Ce travail a été cofinancé par le Fonds européen de relance et de résilience de l'Union européenne (UE) et par des fonds nationaux portugais dans le cadre de la FCT – Fundação para a Ciência e a Tecnologia, au titre des projets LA/P/0058/2020 (DOI : 10.54499/LA/P/0058/2020), UID/04539/2025, UID/PRR/04539/2025 (DOI : 10.54499/UID/PRR/04539/2025) et UID/PRR2/04539/2025 (DOI : 10.54499/UID/PRR2/04539/2025) ; par le Fonds européen de développement régional (FEDER) dans le cadre du Programme opérationnel régional Centro 2030, au titre du projet CENTRO2030-FEDER-02360200 ; et par des fonds nationaux portugais dans le cadre de la FCT, au titre des subventions 2023.17896.ICDT (DOI : 10.54499/2023.17896.ICDT), 2023.12355.PEX (DOI : 10.54499/2023.12355.PEX), 2021.02220.CEECIND/CP1656/CT0008 (DOI : 10.54499/2021.02220.CEECIND/CP1656/CT0008), 2020.04850.BD (DOI : 10.54499/2020.04850.BD) et 2021.05334.BD (DOI : 10.54499/2021.05334.BD).

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
Plaque de culture cellulaire 6 puitsNest Biotechnology15140122Plaque de culture cellulaire
AgaroseNZYtechMB02702Évaluation de la qualité de l'ARN
Mélange d'antibiotiques (pénicilline/streptomycine)Gibco, Thermo Fisher ScientificD5648Complément pour culture cellulaire
Kit de synthèse d'ADN complémentaire (premier brin)NZYtechMB12502Transcription inverse
ChloroformeSigma-AldrichA5256701Réactif de séparation des phases
DMEM, glucose élevé (4500 mg/L de glucose, L-glutamine)Sigma-Aldrich26050088Milieu de culture cellulaire
Microtubes EppendorfEppendorf30120086Stockage des échantillons
Éthanol (96 %)Fisher Bioreagents15552393Purification de l'ARN
Sérum de veau fœtal, inactivé par la chaleurGibco, Thermo Fisher ScientificJ62692.K7Complément pour culture cellulaire
Plaque PCR 96 puits rigideBio-Rad LaboratoriesHSP9601Plaque pour qRT-PCR
Sérum de cheval, inactivé par la chaleurGibco, Thermo Fisher Scientific15400054Synchronisation par choc sérique
Ligne cellulaire mHypoE-42 (CVCL_D443)CELLutions Biosystems Inc.MB13402Ligne cellulaire embryonnaire hypothalamique de souris
Amorces oligonucléotidiquesNZYtechMB12501Amorces pour qRT-PCR
Solution tampon phosphate (PBS)Thermo Fisher ScientificMB18502Lavage cellulaire
qPCR Green Master Mix (2×)NZYtechMB22403Réactif pour qRT-PCR
Système de détection de PCR en temps réelBio-Rad LaboratoriesEP0030108116Appareil pour qRT-PCR
Kit d'isolement de l'ARNNZYtech288306Purification sur colonne en silice
Réactif de lyse d'ARNNZYtechMB18502Réactif d'extraction d'ARN à base de phénol
Bicarbonate de sodiumSigma-AldrichMB22401Complément pour milieu de culture cellulaire
Boîte de culture stérile de 35 mmThermo Fisher Scientific121VBoîte de culture cellulaire
Cycleur thermique T100Bio-Rad Laboratories1861096Synthèse d'ADN complémentaire
Flacon de culture tissulaire T75Corning430641URécipient de culture cellulaire
Solution de bleu de trypan (0,4 %)Gibco, Thermo Fisher Scientific15250061Comptage cellulaire
Tripsine-EDTA (0,5 %)Gibco, Thermo Fisher Scientific15400054Dissociation cellulaire

Références

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