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Article de méthode

Ouverture de la barrière hémato-encéphalique (BHE) contrôlée par ultrasons dans une puce microfluidique BHE-glioblastome pour des études de délivrance de médicaments

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DOI :

10.3791/72041

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18 août 2026

 ,  , 
1Ningbo No.2 Hospital, 2Innovation Center for Diagnosis and Treatment of Neurological Diseases, Ningbo Institute of Life and Health Industry, University of Chinese Academy of Sciences, 3Lab of Nanopharmacology Research for Neurodegeneration, Department of Research and Development of Science and Technology, Ningbo Institute of Life and Health Industry, University of Chinese Academy of Sciences, 4Lab of Dementia and Neurorehabilitation Research, Department of Research and Development of Science and Technology, Ningbo Institute of Life and Health Industry, University of Chinese Academy of Sciences

* These authors contributed equally

Dans cet article

Résumé

Ce protocole décrit la conception d'un modèle de puce microfluidique de barrière hémato-encéphalique-glioblastome (BBB-GBM). Le modèle est validé quant à l'intégrité de la barrière hémato-encéphalique et permet d'étudier l'ouverture transitoire et largement réversible de celle-ci induite par des ultrasons de faible intensité, permettant ainsi une évaluation quantitative du transport de nanomicelles à travers la barrière hémato-encéphalique grâce aux ultrasons, ainsi que de l'efficacité du ciblage tumoral.

Résumé

La barrière hémato-encéphalique (BHE) constitue un obstacle majeur au traitement du glioblastome (GBM) en limitant l'entrée de la plupart des molécules thérapeutiques dans le cerveau. Les différences interspécifiques au niveau de la structure et de la fonction de la BHE compliquent la traduction clinique des modèles animaux, soulignant ainsi la nécessité de plateformes in vitro de la BHE pertinentes pour l'humain afin d'évaluer la perméabilité des médicaments dans le cadre du traitement du GBM. Nous décrivons ici un protocole permettant de construire un modèle de puce microfluidique BHE-GBM. Ce modèle établit un système de tricoculture composé de cellules endothéliales microvasculaires cérébrales humaines (HCMECs), d'astrocytes primaires (ACs) et de cellules U87-MG au sein d'une plateforme microfluidique incluant du Matrigel. L'intégrité de la BHE est vérifiée par une immunomarquage continu de la zonula occludens-1 (ZO-1) et par un test de perméabilité au dextran marqué par la FITC. Une ultrasonothérapie de faible intensité (US) (1 MHz, 1 W/cm2, 30 s) est ensuite utilisée pour induire une ouverture transitoire et largement réversible de la BHE, permettant à des nanomicelles ciblant la tumeur (SFN@RB@SPMs) de traverser efficacement la barrière et de s'accumuler dans les cellules de GBM. Une caractéristique essentielle de ce protocole réside dans l'intégration de mesures en temps réel de la perméabilité de la BHE et de l'administration du médicament au sein d'une seule puce sensible aux ultrasons, offrant ainsi une plateforme puissante pour analyser les mécanismes de délivrance de médicaments assistée par ultrasons dans le GBM.

Introduction

Le traitement du glioblastome (GBM) est fortement limité par la BHE, qui restreint sévèrement l'entrée de presque tous les agents thérapeutiques dans le cerveau1,2. La BHE est constituée de cellules endothéliales non fenêtrées reliées par des protéines de jonctions serrées (par exemple, l'occludine, ZO-1), avec un soutien supplémentaire assuré par les péricytes et les prolongements des astrocytes3. Bien que les modèles animaux aient fourni des informations précieuses sur le fonctionnement de la BHE, les variations physiologiques et métaboliques propres à chaque espèce limitent leur capacité à prédire avec précision les réponses humaines aux médicaments4,5. Par conséquent, des modèles humains de la BHE physiologiquement pertinents sont indispensables pour évaluer la perméabilité des médicaments dans le traitement du GBM.

Les modèles in vitro traditionnels de la BHE, tels que le système de culture Transwell, ne parviennent pas à reproduire la complexité de la BHE, notamment les interactions entre cellules, les changements dynamiques du fluide et les contraintes de cisaillement induites par l'écoulement6. En revanche, les modèles microfluidiques de la BHE se sont imposés comme des plates-formes supérieures capables de reproduire fidèlement ces caractéristiques proches de l'in vivo7. Ces systèmes de type « BHE-sur-puce » ont été largement utilisés pour étudier la métastase des tumeurs cérébrales8, analyser la dysfonction de la BHE dans les maladies neurodégénératives telles que la maladie d’Alzheimer9, et évaluer le transport de médicaments à travers la BHE10,11. Toutefois, la plupart des modèles existants de puces BHE sont principalement destinés aux tests de perméabilité aux médicaments et ne permettent pas d'intégrer des stimuli physiques externes capables de moduler la perméabilité de la BHE. À ce jour, l'ultrason focalisé (FUS) s'est révélé être une stratégie prometteuse pour ouvrir temporairement la BHE avec une récupération substantielle, permettant ainsi un meilleur acheminement d'agents thérapeutiques vers le cerveau12,13. Des études mécanistiques antérieures ont démontré que la stimulation mécanique induite par ultrasons peut moduler de façon transitoire la fonction barrière en remodelant les jonctions entre cellules et en augmentant la perméabilité endothéliale. Par exemple, Silvani et al. ont montré que les forces mécaniques induites par ultrasons provoquent de manière réversible la formation d'interstices entre cellules endothéliales dans un modèle in vitro de vaisseau-sur-puce14. Conformément à ces observations, Beekers et al. ont démontré que les effets biologiques mécaniques induits par ultrasons entraînent une ouverture transitoire des contacts entre cellules endothéliales, augmentant ainsi la perméabilité endothéliale15. Plus récemment, Qiao et al. ont rapporté que la perméabilité de la barrière endothéliale est régulée de manière critique par les paramètres d'exposition aux ultrasons, en particulier la durée des impulsions, soulignant l'importance d'optimiser les paramètres acoustiques afin d'obtenir une modulation de la BHE sûre et contrôlable16. Malgré ces progrès, les plates-formes in vitro permettant simultanément une analyse quantitative de l'ouverture de la BHE induite par ultrasons et de son impact sur la délivrance de nanomédicaments restent limitées.

Pour combler cette lacune, un protocole est présenté pour la construction d'une puce microfluidique BBB-GBM. Le dispositif microfluidique permet une triculture de cellules HCMEC, d'AC primaires et de cellules GBM U87-MG incluses dans du Matrigel. La BBB reconstruite présente des caractéristiques structurelles et fonctionnelles d'une barrière intacte, comme en témoignent la localisation continue de ZO-1 le long des jonctions intercellulaires et la diffusion limitée du dextran-FITC de 40 kDa à travers l'interface vasculaire. Importamment, cette puce peut être couplée à une stimulation par ultrasons contrôlés afin d'induire une ouverture transitoire de la BBB, améliorant ainsi le transport ultérieur et l'efficacité ciblant la tumeur des nanomicelles. À l'aide de ce système, le transport et l'efficacité ciblant la tumeur des nanomicelles SFN@RB@SPM peuvent être évalués de manière quantitative. Dans l'ensemble, cette plateforme constitue un outil utile pour étudier la relation entre les paramètres des ultrasons, la modulation de la BBB avec des caractéristiques réversibles et l'administration améliorée de nanomicelles dans le traitement du GBM.

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Protocole

Toutes les procédures animales ont respecté les Lignes directrices (GB/T35892-2018) pour l'évaluation éthique du bien-être des animaux de laboratoire et ont été approuvées par le Comité institutionnel de soins et d'utilisation des animaux (IACUC) de l'Institut Ningbo de l'industrie de la vie et de la santé, UCAS (Numéro d'approbation : GK-2023-XM-0073). Les réactifs et l'équipement utilisés sont indiqués dans le Tableau du matériel.

1. Fabrication et préparation du dispositif organe-sur-puce BBB-GBM

  1. Conception de la puce et disposition du photomask
    1. Concevoir la puce à l'aide d'un logiciel de CAO.
      ​REMARQUE : La puce comprend trois canaux microfluidiques parallèles, notamment un canal sanguin, un canal cérébral et un canal tumoral. Les largeurs du canal sanguin et du canal tumoral sont toutes deux de 1000 µm, tandis que la largeur du canal cérébral est de 1300 µm. La hauteur des trois canaux est de 150 µm, et les canaux adjacents sont séparés par des réseaux de micropiliers trapézoïdaux de 200 µm de large, permettant la diffusion moléculaire intercompartimentale et la communication cellulaire. La disposition détaillée du photomask est fournie dans la figure supplémentaire 1 et la figure supplémentaire 2. Le photo-résist SU-8 utilisé dans la présente étude est le 3050.
  2. Confection d'un moule maître en silicium par photolithographie standard à l'aide de photo-résist SU-8.
    1. Placer une plaquette de silicium vierge sur le mandrin du tour d'application et activer le vide pour immobiliser fermement la plaquette.
    2. Distribuer lentement 10 mL de photo-résist SU-8 au centre de la plaquette.
    3. Effectuer un procédé de dépôt par rotation en deux étapes afin d'obtenir une couche uniforme de photo-résist : d'abord à 500 tr/min pendant 10 s, puis à 2500 tr/min pendant 90 s.
    4. Transférer la plaquette recouverte sur une plaque chauffante et effectuer un pré-cuisson à 95 °C pendant 30 min afin d'évaporer le solvant.
    5. Laisser refroidir la plaquette à température ambiante et mesurer l'épaisseur de la couche SU-8 à l'aide d'un micromètre.
      REMARQUE : Pour une formation optimale de la BHE, une hauteur de canal comprise entre 110 et 150 µm est recommandée. Un seul dépôt par rotation (étape 1.2.3) donne généralement une épaisseur de film de 40 à 50 µm ; par conséquent, deux à trois cycles de dépôt par rotation sont nécessaires pour atteindre l'épaisseur totale souhaitée.
  3. Gravure photolithographique
    1. Régler l'intensité lumineuse ultraviolette (UV) de l'aligneur de masque à 14–15 mW/cm2.
    2. Aligner le photomask en chrome avec la plaquette de silicium recouverte de SU-8 et effectuer une exposition UV pendant 10 s.
    3. Transférer immédiatement la plaquette de silicium sur une plaque chauffante pour un post-cuisson après exposition dans les conditions suivantes : 65 °C pendant 10 s, puis 95 °C pendant 300 s.
    4. Après refroidissement de la plaquette à température ambiante, l'immerger dans une solution de développement (acétate de propylène glycol monométhyl éther, PGMEA) et la laisser développer pendant 4 à 6 min.
    5. Rincer la plaquette à l'isopropanol pour interrompre le développement, puis la laver à l'eau déionisée.
    6. Sécher la plaquette à l'aide d'azote gazeux et examiner les structures de microcanaux gravées au microscope optique.
      ​REMARQUE : Si des résidus de photo-résist non développés persistent, répéter l'étape de développement jusqu'à ce que les microstructures soient clairement définies.
    7. Cuire le moule maître en silicium terminé dans un four à 200 °C pendant 1 h afin d'améliorer l'adhérence entre le photo-résist SU-8 et la surface de la plaquette de silicium.
  4. Confection de la puce en PDMS
    1. Préparer le polydiméthylsiloxane (PDMS) en mélangeant soigneusement le prépolymère de base et l'agent de réticulation dans un rapport pondéral de 10:1 (p/p) pendant 30 min afin d'obtenir un prépolymère PDMS homogène.
    2. Verser le mélange de PDMS sur le moule maître en silicium fabriqué, en veillant à ce que les microstructures soient entièrement recouvertes.
    3. Placer le moule maître dans un dessiccateur sous vide pour dégazer et éliminer les bulles d'air.
    4. Transférer le moule maître dans un four et le réticuler à 65 °C pendant 1,5 à 2 h.
    5. Après réticulation, découper soigneusement la couche de PDMS le long des bords de la puce à l'aide d'un scalpel et la détacher délicatement du moule maître en silicium.
    6. Immerger la puce en PDMS dans de l'éthanol à 70 %–75 % pendant 30 min pour une stérilisation préliminaire, puis rincer à l'eau déionisée et laisser sécher à l'air.
    7. Perforer les orifices d'entrée et de sortie à l'aide d'un poinçon biopsique de 2 mm.
  5. Assemblage par collage au plasma et montage du dispositif
    1. Placer la puce en PDMS et une lame de verre propre dans la chambre d'un nettoyeur au plasma, en veillant à ce que le côté des microcanaux du PDMS soit orienté vers le haut.
    2. Évacuer la chambre jusqu'à ce que la pression descende en dessous de 30 Pa, puis introduire de l'oxygène gazeux.
    3. Maintenir le débit d'oxygène pendant 90 s tout en conservant la pression dans la chambre inférieure à 40 Pa.
    4. Régler la puissance Radio Fréquence (RF) à 55 % et effectuer un traitement au plasma pendant 90 s afin d'activer les surfaces du PDMS et du verre.
    5. Mettre immédiatement en contact la puce en PDMS activée avec la lame de verre et appuyer doucement pour obtenir un collage irréversible.
    6. Placer le dispositif assemblé dans un four à 65 °C pendant 24 h afin de stabiliser le collage et restaurer son hydrophobicité.
    7. Avant l'ensemencement cellulaire, stériliser le dispositif collé par irradiation ultraviolette pendant 30 min.
      REMARQUE : Maintenir des conditions stériles en conservant les puces stérilisées dans des boîtes de Pétri scellées à l'intérieur d'une cabine de sécurité biologique jusqu'à utilisation.

2. Semis des cellules et mise en place du modèle BBB-GBM

  1. Préparer les réactifs suivants :
    1. Milieu de culture des AC (pour le canal cérébral) : milieu basal DMEM/F12 contenant 20 % de sérum de veau fœtal (FBS) et 1 % de pénicilline/streptomycine (P/S).
    2. Milieu de culture des HCMEC (pour le canal vasculaire) : milieu pour cellules endothéliales (ECM) supplémenté avec 1 % de P/S.
    3. Milieu de culture des cellules GBM (pour le canal gliome) : milieu basal MEM contenant 10 % de FBS et 1 % de P/S.
    4. Réactif de dissociation cellulaire : utiliser une solution de trypsine-EDTA à 0,25 % pour détacher les cellules adhérentes.
      NOTE : Une exposition prolongée à la trypsine peut réduire la viabilité cellulaire. Surveiller le détachement cellulaire au microscope et neutraliser rapidement la trypsine avec le milieu complet.
    5. Maintenir toutes les cellules (AC, HCMEC et U87-MG) dans des boîtes de culture de 100 mm avant leur semis dans le dispositif microfluidique.
  2. Isolation des AC primaires
    1. Isoler les AC primaires à partir des cortices cérébraux de rats néonatals (jour postnataux 1–3). Après avoir soigneusement retiré les méninges et les vaisseaux sanguins sur glace, hacher le tissu cortical avec des ciseaux chirurgicaux stériles et soumettre le tissu à une digestion enzymatique.
    2. Laver la suspension cellulaire dissociée avec du PBS glacé, traiter avec de la trypsine pour obtenir une dissociation en cellules individuelles, puis recueillir les culots par centrifugation (400 x g, 5 min, température ambiante).
    3. Resuspendre les cellules et les semer dans des flacons de culture T25 contenant le milieu de culture des AC.
    4. Identifier les AC par coloration immunofluorescente contre GFAP. L'image est fournie dans la Figure supplémentaire 3.
  3. Semis des cellules
    ​NOTE : Jour 1 - Semis des AC dans le canal cérébral.
    1. Introduire 1 mL de solution de trypsine-EDTA à 0,25 % dans la boîte de culture contenant les AC. Agiter doucement pour assurer une couverture uniforme.
    2. Incuber à 37 °C pendant 1–2 min jusqu'au détachement des cellules de la boîte de culture.
    3. Ajouter 3 mL de milieu de culture des AC (étape 2.1.1) pour neutraliser la trypsine. Prélever doucement pour obtenir une suspension monocellulaire.
    4. Recueillir la suspension cellulaire dans un tube à centrifuger et centrifuger à 300 × g pendant 3 min à 4 °C.
    5. Éliminer le surnageant et resuspendre le culot cellulaire dans 200 µL de milieu pour AC.
    6. Déterminer la concentration cellulaire à l’aide d’un compteur cellulaire automatisé et ajuster la densité à 2,5 × 106 cellules/mL.
    7. Mélanger la suspension cellulaire des AC avec du Matrigel dans un rapport 3:5 (v/v) (cellules AC : Matrigel).
    8. À l’aide d’une micropipette, déposer 10 µL du mélange Matrigel-AC dans le canal cérébral.
      NOTE : Effectuer la procédure de chargement en maintenant la puce sur glace afin d’éviter la polymérisation prématurée du Matrigel.
    9. Incuber la puce à 37 °C dans une étuve à 5 % de CO2 pendant 30 min pour permettre la polymérisation du Matrigel et la stabilisation des cellules.
      NOTE : Jour 1 - Semis des HCMEC dans le canal vasculaire.
    10. Appliquer 1 mL de trypsine-EDTA à 0,25 % et incuber à 37 °C pendant environ 30 s jusqu’au détachement des cellules.
    11. Ajouter 3 mL de milieu pour HCMEC (étape 2.1.2) pour arrêter la digestion enzymatique.
    12. Prélever doucement pour obtenir une suspension monocellulaire homogène.
    13. Recueillir la suspension et centrifuger à 300 × g pendant 3 min à 4 °C.
    14. Éliminer le surnageant et resuspendre le culot cellulaire dans 200 µL de milieu pour HCMEC.
    15. Compter les cellules et ajuster la concentration à 2 × 106 cellules/mL.
    16. Introduire soigneusement 10 µL de la suspension de HCMEC dans le canal vasculaire de la puce.
    17. Placer la puce sur le côté pendant 30 min dans l’incubateur cellulaire afin de favoriser l’attachement des cellules endothéliales le long de la paroi du canal.
    18. Semer un supplément de 10 µL de suspension de HCMEC dans le canal vasculaire afin d’augmenter la densité endothéliale dans ce canal.
    19. Incuber la puce pendant 30 à 60 min supplémentaires pour permettre l’adhésion des HCMEC.
    20. Ajouter 100 µL de milieu de culture mixte à l’entrée de la puce.
      NOTE : Le milieu mixte est composé de milieu pour AC et de milieu pour HCMEC dans un rapport 1:1 (v/v).
      Jour 3 - Semis des cellules U87-MG dans le canal gliome.
    21. Ajouter 1 mL de trypsine-EDTA à 0,25 % dans la boîte de culture et incuber à 37 °C pendant 1–2 min.
    22. Ajouter 3 mL de milieu pour U87-MG (étape 2.1.3) pour arrêter la digestion.
    23. Prélever doucement pour obtenir une suspension monocellulaire homogène.
    24. Transférer la suspension cellulaire dans un tube à centrifuger et centrifuger à 300 × g pendant 3 min.
    25. Jeter le surnageant et resuspendre le culot cellulaire dans 200 µL de milieu pour U87-MG.
    26. Compter la concentration cellulaire et ajuster la densité à 2 × 106 cellules/mL.
    27. Introduire 10 µL de la suspension de cellules U87-MG dans le canal gliome de la puce.
    28. Incuber la puce à 37 °C avec 5 % de CO2 pendant 30–60 min pour permettre l’attachement cellulaire.
    29. Ajouter 100 µL de milieu de culture U87-MG à l’entrée de la puce.
    30. Maintenir le dispositif microfluidique à 37 °C avec 5 % de CO2 pendant 48 h supplémentaires afin de permettre la formation des jonctions serrées endothéliales.

3. Évaluation de l'intégrité de la BHE

  1. Essai de perméabilité
    1. Préparer la dextrane marquée par l'isothiocyanate de fluorescéine (FITC-dextrane) de masses moléculaires de 40 kDa dans un milieu de culture mixte (milieu ACs : milieu HCMEC = 1:1, v/v) à une concentration finale de 10 µg/mL.
    2. Introduire 10 µL de la solution de FITC-dextrane dans le canal vasculaire.
    3. Placer la puce microfluidique sur la platine d'un microscope à fluorescence inversé afin d'acquérir des images de fluorescence des canaux vasculaire et cérébral adjacent à des intervalles de 20 min pour suivre la diffusion du dextrane à travers la barrière endothéliale.
    4. Quantifier le coefficient de perméabilité (Papp, cm/s) à l'aide de la formule suivante :
      Papp (cm/s) = Équation pour l'efficacité du processus, incluant Fs, Fc, Δt ; formule mathématique pour la recherche scientifique.
      Où Papp est le coefficient de perméabilité apparent (cm/s), FS est l'intensité de fluorescence au temps initial dans le canal sanguin, FC est l'intensité de fluorescence dans le canal cérébral à la fin de l'intervalle de diffusion, Δt est la durée de diffusion (s), VT est le volume de diffusion du FITC-dextrane dans le canal cérébral (cm3), et A est la surface endothéliale (cm2).
      REMARQUE : Un coefficient de perméabilité plus faible indique une intégrité plus élevée de la BHE et une formation plus étroite de la barrière endothéliale.
    5. Réaliser l'analyse des données et définir les paramètres.
      REMARQUE : Les valeurs d'intensité de fluorescence des canaux sanguin et cérébral ont été corrigées du fond en utilisant des mesures obtenues à partir de régions de la puce sans cellules. Des régions d'intérêt (ROIs) ont été définies de chaque côté de l'interface sang-cerveau en fonction de la longueur de diffusion de la fluorescence. La surface endothéliale (A) a été calculée à partir de la surface d'interface entre les canaux vasculaire et cérébral (en utilisant l'espace entre deux micropiliers comme référence) : 200 µm × 150 µm = 30 000 µm2 = 3 × 10-6 cm2. Le volume de diffusion du FITC-dextrane (VT) a été déduit de la distance de pénétration de la diffusion dans le canal cérébral multipliée par A. Des images de fluorescence ont été acquises toutes les 20 min (1200 s) pendant une période de 60 min ; le coefficient de perméabilité a été calculé à partir des données de l'intervalle de 20 min. Les valeurs de perméabilité ont été calculées à partir de trois puces indépendantes pour chaque groupe expérimental. Toutes les conversions d'unités ont été effectuées avant d'exprimer la perméabilité en cm/s.
  2. Analyse d'immunofluorescence de la ZO-1
    1. Laver les canaux microfluidiques trois fois avec du tampon phosphate salin (PBS) pour éliminer le milieu de culture résiduel.
    2. Fixer les cellules en introduisant du paraformaldéhyde à 4 % (PFA) dans les canaux et en incubant pendant 10 min à température ambiante.
    3. Perméabiliser les cellules avec du Triton X-100 à 0,1 % dans le PBS pendant 15 min à température ambiante.
    4. Bloquer la liaison non spécifique des anticorps en incubant les canaux avec de l'albumine sérique bovine (BSA) à 2 % dans le PBS pendant 45 min à température ambiante.
    5. Introduire l'anticorps primaire anti-ZO-1 (dilution 1:200) dans les canaux et incuber à 4 °C toute la nuit.
    6. Laver soigneusement le canal avec du PBS pour éliminer l'anticorps primaire non lié.
    7. Incuber les puces avec un anticorps secondaire marqué à l’Alexa Fluor 555 anti-lapin (dilution 1:1000) pendant 45 min à température ambiante à l’abri de la lumière.
    8. Contrastation des noyaux avec du 4’6-diamidino-2-phénylindole (DAPI) à 1 µg/mL pendant 1 min à température ambiante à l’abri de la lumière.
      REMARQUE : Le DAPI est sensible à la lumière et doit être protégé de la lumière pendant la coloration.
    9. Laver les canaux trois fois avec du PBS.
    10. Imager le dispositif microfluidique à l’aide d’un microscope à fluorescence inversé et d’un microscope confocal à balayage laser pour visualiser la localisation de la ZO-1 le long des jonctions des cellules endothéliales.

4. Administration de nanomicelles améliorée par ultrasons à travers la BHE vers les cellules de GBM

  1. Stimulation par ultrasons
    1. Retirer délicatement la lame du plat de culture et la placer à l'intérieur d'une cabine de sécurité.
    2. Appliquer une stimulation par ultrasons à l'aide d'un système thérapeutique à ultrasons équipé d'un transducteur de 1 MHz (surface émettrice effective : 5 cm²)2).
    3. Appliquer un coussin acoustique médical de 3 mm d'épaisseur entre la sonde d'échographie et la surface de la puce microfluidique afin d'assurer une transmission acoustique efficace.
    4. Positionner la sonde d'échographie directement au-dessus de la région du canal vasculaire du dispositif microfluidique.
      REMARQUE : Les bulles d'air entre le transducteur et la puce réduisent considérablement la transmission de l'énergie acoustique et doivent être évitées.
    5. Régler les paramètres de l'échographie comme suit : cycle de travail : 60 % ; fréquence : 1 MHz ; intensité : 1 W/cm²2; durée d'exposition : 30 s ; fréquence de répétition des impulsions (PRF) : 100 Hz. Les paramètres détaillés des ultrasons sont fournis dans Tableau supplémentaire 1.
    6. Pour le groupe témoin non traité, placer le transducteur ultrasonore à la même position, mais s'assurer qu'il reste inactif afin de servir de témoin factice, en garantissant des procédures de manipulation identiques sans exposition acoustique.
    7. Après l'exposition aux ultrasons, retirez le coussinet de couplage et replacez immédiatement la puce dans une boîte de culture stérile.
    8. Ajouter du milieu de culture frais dans les orifices d'entrée de la puce.
    9. Incuber l'appareil à 37 °C avec 5 % de CO₂2 jusqu'à une analyse ultérieure.
  2. Évaluation de la modulation de la BHE induite par les ultrasons
    1. Effectuer une coloration immunofluorescente de la ZO-1 immédiatement après le traitement par ultrasons (0 h) et 24 h après le traitement afin d'évaluer les modifications de l'intégrité des jonctions serrées.
    2. Suivez la procédure de coloration immunofluorescente décrite à l'étape 3.2.
    3. Comparer la distribution de la coloration de la ZO-1 selon l'axe z afin d'évaluer l'effet de la stimulation par ultrasons sur l'intégrité des jonctions serrées de la BHE.
  3. Préparation et caractérisation de nanomicelles SFN@RB@SPM
    1. Préparer les nanomicelles SFN@RB@SPM selon le protocole établi précédemment17. Brièvement, des solutions mères du peptide amphiphile (désigné comme SPM, 6 mg/mL), du RB (0,6 mg/mL) et du SFN (6 mM) ont été mélangées selon un rapport volumétrique de 1:1:1.
    2. Placer le mélange dans un sonicateur et soniquer à 28 kHz, 25 °C pendant 30 min.
    3. Dialyser le mélange (coupure de poids moléculaire : 1000 Da) pendant 48 h afin d'éliminer le RB et le SFN libres.
    4. Mesurer la taille et le potentiel zêta des nanomicelles par diffusion dynamique de la lumière (DLS). Les données de caractérisation sont fournies dans Figure supplémentaire 4.
  4. Évaluation de la délivrance de nanomicelles stimulées par ultrasons et de leur accumulation dans les cellules de gliome
    1. Immédiatement après l'exposition aux ultrasons, introduire le milieu de culture contenant les nanomicelles dans le canal vasculaire du dispositif microfluidique.
    2. Pour évaluer le transport des nanomicelles à travers la BHE, placer la puce microfluidique sur la platine d'un microscope à fluorescence inversé et acquérir des images de fluorescence du canal vasculaire et du canal cérébral adjacent à des intervalles de 20 minutes pendant 60 minutes.
    3. Quantifier les images de fluorescence dans le canal cérébral afin d'évaluer la perméabilité des nanomicelles améliorée par ultrasons.
    4. Pour évaluer l'accumulation de nanomicelles dans les cellules de gliome, incuber l'appareil dans des conditions standard de culture (37 °C, 5 % CO₂2) pendant 3 h après exposition aux ultrasons, puis observer le canal du gliome au microscope à fluorescence afin d'évaluer l'absorption intracellulaire des nanomicelles.
  5. Analyse statistique
    1. Exprimez toutes les données quantitatives sous la forme moyenne ± erreur standard de la moyenne (ESM).
    2. Réalisez chaque expérience avec trois réplicats biologiques indépendants (n = 3 puces par condition expérimentale). Pour chaque réplicat biologique, au moins trois réplicats techniques (zones d'intérêt par canal) ont été mesurés afin de garantir la fiabilité des données.
    3. Calculer le coefficient de perméabilité (Papplication, cm/s) provenant de chaque puce indépendante a servi d'unité d'analyse principale pour toutes les comparaisons statistiques.
      REMARQUE : Les comparaisons entre deux groupes ont été effectuées à l'aide d'un test t de Student non apparié bilatéral test tLes comparaisons entre trois groupes ou plus ont été analysées à l'aide d'une analyse de variance unifactorielle (ANOVA) suivie du test a posteriori de Tukey pour les comparaisons multiples. Pour les expériences impliquant deux variables indépendantes, une ANOVA à deux facteurs suivie du test de comparaisons multiples de Tukey a été réalisée. Les analyses statistiques ont été effectuées à l'aide d'un logiciel d'analyse et de graphisme statistiques. Un p-valeur de

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Résultats

Pour résumer les in vivo structure de la BHE, une puce microfluidique à tri-culture a été développée en intégrant des cellules endothéliales microvasculaires cérébrales humaines (HCMECs), des astrocytes primaires (AC) et des cellules U87-MG (désignée « modèle puce »). Comme illustré dans Figure 1A,B, trois canaux parallèles sont disposés dans le dispositif : le canal vasculaire (à gauche, en bleu), le canal cérébral rempli de Matrigel (central, en rose) et le canal ...

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Discussion

Ce protocole décrit la mise en place d'une puce microfluidique BBB-GBM pour évaluer la modulation par ultrasons de la barrière hémato-encéphalique (BHE) et la délivrance de nanomicelles. Comparé aux modèles conventionnels in vitro de BHE (par exemple, Transwell), cette plateforme microfluidique permet une co-culture spatialement définie de cellules endothéliales, d'astrocytes (AC) et de cellules gliomateuses, permettant ainsi d'étudier le transport de médicaments à travers une BHE physiologiquement pertinente. P...

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Déclarations de divulgation

Durant la préparation de ce manuscrit, les auteurs ont utilisé ChatGPT (OpenAI) uniquement pour la révision linguistique et l'amélioration du texte. Les auteurs ont relu et modifié l'ensemble du contenu assisté par l'IA et assument l'entière responsabilité de l'exactitude et de l'intégrité du manuscrit. Aucun outil d'intelligence artificielle n'a été utilisé pour la génération ou l'analyse des données, ni pour la préparation des figures.

Remerciements

Nous remercions sincèrement la Fondation naturelle provinciale du Zhejiang (LQ24H160003), la Fondation de recherche scientifique médicale de la province du Zhejiang (2024KY351), la Fondation naturelle de Ningbo (2023J365), le Programme d'introduction des talents de Yongjiang (Projet de jeunes talents innovants, 2021A-012-G) et le Programme de talents Bei’An du district de Jiangbei à Ningbo (2023RC004) pour leur soutien financier.

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
Anticorps secondaire anti-lapin conjugué à l’Alexa Fluor 555Cell Signaling Technology, Inc.4413
Anticorps anti-ZO-1Thermo Fisher Scientific Co., Ltd.40-2200
Poinçon à biopsieZhejiang YoungChip Technology Co., Ltd.10305130004
Albumine de sérum bovinAbsin Bioscience Inc.9048-46-8
Compteur de cellulesThermo Fisher Scientific Co., Ltd.Countess TM3
Plaque de culture cellulaire (100 mm)Corning Inc.430167
CentrifugeuseBeckman Coulter, Inc.Avanti J-15R
Masque chroméSuzhou Chip Scientific Instrument Co.,Ltd.ZX-GBYM
Microscope à balayage laser confocalCarl Zeiss AGZeiss LSM900
DAPIBeyotime Biotech Inc.C1002
RévélateurSuzhou Chip Scientific Instrument Co., Ltd.RCD-400
DMEM/F12ScienCell Research LaboratoriesC3130-0500
ECMScienCell Research Laboratories1001
ÉthanolNingbo Zhenhai Yongfeng Chemical Plant6923193900015
Sérum de veau fœtalScienCell Research LaboratoriesC04001-500
Fiji (Fiji Is Just ImageJ)Projet open-sourceN/A
Dextrane-FITC (40 kDa)Thermo Fisher Scientific Co., Ltd.GC19938
Lames en verreCitotest Scientific Co., Ltd.188105W
GraphPad Prism 9.5GraphPad Software, Inc.N/A
Cellules endothéliales microvasculaires cérébrales humaines (HCMECs)BeNa Culture CollectionBNCC337717
IncubateurEsco Lifesciences Co., LtdCLM-170B-8-CN
Microscope à fluorescence inverséNikon Instruments Inc.TS2-FL
IsopropanolSinopharm Chemical Reagent Co., Ltd.80109218
MatrigelCorning Inc.354234
MEMPricella Life Science & Technology Co., Ltd.PM150410
AzoteNingbo Baifang Gas CO., Ltd.N/A
OxygèneNingbo Baifang Gas CO., Ltd.N/A
Paraformaldéhyde (PFA, 4 %)Wuhan Servicebio Technology Co., Ltd.G1101-500mL
PBSScienCell Research LaboratoriesC3580-0500
PDMSCorning Inc.220777
Pénicilline/streptomycinePricella Life Science & Technology Co., Ltd.PB180120
PhotolithographieInstitute of Optics and Electronics, Chinese Academy of SciencesURE-2000\AL
Plaque chauffante pour photolithographieSuzhou Wenhao Microfluidic Technology Co., Ltd.WH-HP-02
Plasma ashing (gravure au plasma)TIANKECHUANGDA Co., Ltd.PT-05-LF
Astrocytes primairesN/AN/AIsolés du cerveau de rat nouveau-né (jour 1-3)
Wafer de siliciumZhejiang YoungChip Technology Co., Ltd.10204040001
Coupleur de rotation (spin coater)Suzhou Wenhao Microfluidic Technology Co., Ltd.WH-SC-01
SU-8Kayaku Advanced Materials Inc.1030403002
Triton X-100Beijing Solarbio Science & Technology Co., Ltd.9002-93-1
TrypsineScienCell Research LaboratoriesC3530-0100
Cellules U87-MGPricella Life Science & Technology Co., Ltd.CL-0238
Dispositif à ultrasons Shenzhen Dongdixin Technology Co., Ltd.Sonic-Stimu Pro UT1041
Zen 3.4 (édition bleue)Carl Zeiss AGN/A

Références

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