Démonstration du ciblage des inhibiteurs de peptidyles fluorescents du ClpXP mitochondrial par microscopie à fluorescence dans les cellules de mammifères

Résumé

Ce protocole établit un flux de travail d’imagerie quantitative qui comprend l’application de la microscopie confocale pour surveiller la localisation sélective de l’inhibiteur fluorescent du peptidyl ClpP FAM-FAPAL-CMK (Carboxyfluorescein-FAPAL-chlorométhyl cétone) dans les mitochondries pour cibler ClpP, ainsi que les modifications morphologiques subséquentes des mitochondries dans les cellules intactes causées par l’inhibition de ClpP.

Résumé

Les protéases mitochondriales dépendantes de l’ATP sont essentielles pour maintenir l’homéostasie des protéines par la dégradation des protéines endommagées ou mal repliées. Parmi ceux-ci, le complexe protéase ClpXP se situe dans la matrice mitochondriale et contribue au contrôle de la qualité mitochondriale dans des conditions physiologiques et de stress. Ce travail démontre un flux de travail de microscopie quantitative à fluorescence pour évaluer le ciblage mitochondrial de l’inhibiteur du peptidyle fluorescent FAM-FAPAL-CMK et évaluer les changements morphologiques mitochondriaux associés à l’inhibition de ClpXP chez les cellules mammifères. Les cellules HeLa ont été traitées avec FAM-FAPAL-CMK et analysées par microscopie confocale combinée à une coloration par immunofluorescence des marqueurs mitochondriaux et à une analyse quantitative d’images. L’analyse de colocalisation utilisant le seuil de Costes et les coefficients de chevauchement de Manders a démontré des enrichissements mitochondriaux du signal inhibiteur. En conséquence, l’inhibition de ClpP a modifié la morphologie mitochondriale. L’analyse immunoblot n’a montré aucun changement significatif de l’abondance de la protéine ClpP lors du traitement par inhibiteur. Pris ensemble, ce travail décrit un flux de travail reproductible basé sur l’imagerie qui permettra d’interroger les fonctions mitochondriales de ClpXP dans des cellules intactes en réponse à des perturbations de l’homéostasie, telles que le stress oxydatif.

Introduction

Les protéases mitochondriales dépendantes de l’ATP sont centrales dans l’homéostasie des protéines, dégradant les protéines mal repliées ou^endommagées 1,2,3,4,5,6. Parmi ceux-ci, ClpXP est un complexe protéase AAA+ hétéro-oligomérique situé dans la matrice mitochondriale. L’ATPase ClpX reconnaît et déplie les protéines, puis les transloce dans la chambre protéolytique^{ClpP 7,8,9}. Avec d’autres protéases mitochondriales, ClpXP maintient le contrôle de la qualité des protéines dans des conditions normales et de stress, incluant le stress oxydatif et les perturbations^{métaboliques 1,2,4}. La perturbation de l’homéostasie des protéines mitochondriales a été liée à des maladies telles que la neurodégénérescence et le cancer, soulignant l’importance de comprendre ces activités protéasiques dans des systèmes cellulaires^{intacts 3,6,10}.

Un défi majeur dans ce domaine est l’absence de méthodes permettant de surveiller directement l’activité des protéases mitochondriales avec une résolution spatiale dans les cellules intactes. Les approches existantes reposent principalement sur des tests biochimiques utilisant des protéines purifiées ou des lysats cellulaires, qui fournissent des informations cinétiques détaillées mais ne préservent pas le contexte subcellulaire 11,12,13,14. Les stratégies de biologie chimique ont notamment répondu à cette limitation en développant des substrats peptidiques fluorogéniques et des inhibiteurs orientés vers le site actif. Les substrats peptidyles fluorescents permettent une mesure quantitative de l’activité peptidase dépendante de l’ATP, tandis que les inhibiteurs peptidyles forment des interactions covalentes réversibles avec le site protéolytique pour atteindre une inhibition^sélective 13,15,16,17,18,19. Auparavant, l’inhibiteur de ClpXP synthétisé en laboratoire FAPAL-CMK a été démontré comme formant une liaison covalente avec^{ClpP 20}. Dans cette étude, FAM-FAPAL-CMK, un dérivé marqué à la fluorescéine de FAPAL-CMK, a été développé comme inhibiteur mécanique de ClpP, permettant la visualisation de sa localisation intracellulaire.

Comparée aux tests biochimiques, la microscopie à fluorescence confocale permet une évaluation spatiale résolue de la distribution des sondes et de la morphologie mitochondriale dans des cellules intactes, fournissant des informations qui ne peuvent être obtenues uniquement à partir de lysats. Cependant, contrairement aux tests enzymatiques, la localisation de fluorescence ne mesure pas directement l’activité catalytique ni les événements de liaison moléculaire et peut être influencée par l’efficacité de l’absorption de la sonde, la dynamique mitochondriale et les conditions d’imagerie. De plus, une mise en œuvre réussie dépend d’une accumulation adéquate de la sonde et de réseaux mitochondriaux suffisamment résolus, ce qui rend ce flux de travail particulièrement adapté aux cellules cultivées adhérentes présentant une morphologie mitochondriale clairement distinguable.

L’objectif de cette étude est d’établir un flux de travail quantitatif intégrant des sondes fluorescentes basées sur des mécanismes avec la microscopie confocale pour surveiller la localisation et la fonction de la protéase mitochondriale dans des cellules intactes. En combinant des sondes chimiques sélectives avec l’imagerie confocale à haute résolution, ce flux de travail permet d’évaluer la localisation mitochondriale, la distribution des sondes et les réponses morphologiques aux perturbations de l’homéostasie mitochondriale dans des cellules intactes. Elle peut compléter les tests biochimiques existants qui mesurent directement l’activité des protéases mais manquent de résolution spatiale.

Protocole

Des expériences ont été menées avec des cellules HeLa disponibles dans le commerce. Aucun participant humain, vertébré animal, ni matériel biologique primaire d’origine humaine ou vertébrée n’a été utilisé. Les réactifs et l’équipement utilisés sont listés dans le tableau des matériaux.

1. Culture cellulaire et traitement

1. Cultivez des cellules HeLa dans le Médium Eagle modifié (DMEM) de Dulbecco, complétées avec un sérum fœtal bovin à 10 % (FBS) à 37 °C dans un incubateur humidifié contenant 5 % de CO₂.
2. Placez les cellules sur des gaines de verre stériles et écouvent pendant 24 heures pour permettre l’attachement cellulaire.
3. Dissoudez l’inhibiteur FAM-FAPAL-CMK dans du DMSO pour préparer une crosse de 50 μM et congelez à -20 °C pour le stockage.
4. Ajoutez 50 nM FAM-FAPAL-CMK au milieu de croissance cellulaire des échantillons cellulaires traités.
5. Ajouter un volume égal de DMSO aux échantillons de contrôle afin de correspondre à la concentration finale de solvant des échantillons traités par inhibiteurs, afin de s’assurer que les effets ne sont pas dus à la DMSO.
6. Incubez les cellules pendant 18 heures supplémentaires sous les mêmes conditions de culture avant le traitement en aval.
   Note : L’inhibiteur FAM-FAPAL-CMK est conçu et synthétisé en laboratoire, et la méthode de synthèse a été rapportée^{auparavant 20}.

2. Fixation et perméabilisation

1. Lavez les cellules avec du D-PBS préchauffé pendant 5 minutes et répétez une fois.
2. Fixez les cellules pendant 15 minutes à température ambiante à l’aide d’un tampon PHEM (68 mM PIPES, 25 mM HEPES, 15 mM d’EGTA, 3 mM de_{MgCl 2}, pH 6,9) contenant 2,4 % (v/v) de formaldéhyde, 0,05 % (v/v) de glutaraldéhyde et 0,5 % (v/v) de saponine.
3. Préparez une solution fraîche de borohydrure de sodium (5 mg/mL dans D-PBS).
4. Incubez les cellules dans la solution de borohydrure de sodium pendant 15 minutes à température ambiante pour neutraliser les résidus de glutaraldéhyde.
5. Rincez les cellules trois fois avec du D-PBS pendant 5 minutes chacune avant la coloration.
   REMARQUE : Le formaldéhyde et le glutaraldéhyde sont des fixateurs toxiques. Effectuez les étapes de fixation dans la capuche et portez un équipement de protection individuelle approprié (gants, blouse de laboratoire et protection oculaire). Le borohydrure de sodium est un agent réducteur réactif et doit être manipulé avec précaution. Le tampon de fixation à base de PHEM contenant du formaldéhyde, du glutaraldéhyde et de la saponine a été sélectionné pour préserver la morphologie mitochondriale tout en maintenant l’accessibilité aux antigènes lors de l’immunocoloration. Le formaldéhyde et le glutaraldéhyde assurent la réticulation des protéines pour la préservation structurelle, tandis que la composition tampon et le pH du PHEM aident à stabiliser l’ultrastructure mitochondriale²¹. La saponine facilite la perméabilisation membranaire afin d’améliorer la vitesse de pénétration du fixateur. Cette stratégie de fixation minimise la distorsion des réseaux mitochondriaux et est particulièrement adaptée à l’analyse quantitative de la morphologie mitochondriale.

3. Coloration par immunofluorescence

1. Bloquez les cellules pendant 1 h à température ambiante dans un tampon de blocage contenant 3 % (p/v) d’albumine sérique bovine (BSA) dans PBS (137 mM de NaCl, 2,7 mM KCl, 10 mM_{Na 2HPO 4}, 1,8 mM_{KH 2}PO₄, pH 7,4) avec 0,1 % (v/v) de Triton X-100.
2. Incubez les cellules avec des anticorps primaires dilués dans un tampon bloquant pendant 1 h à température ambiante. Utilisez l’anti-TOMM20 de la souris (1:500) et l’anti-ClpP de la lapin (1:500).
3. Lavez les cellules trois fois avec du PBS pendant 5 minutes chacune pour éliminer les anticorps primaires non liés.
4. Incubez les cellules avec des anticorps secondaires dilués dans un tampon bloquant pendant 1 h à température ambiante. Utilisez l’anticorps secondaire de souris conjugué CF405S (1:500) et l’anticorps secondaire de lapin conjugué Alexa Fluor 647 (1:500).
5. Protéger les échantillons de la lumière pendant et après l’incubation secondaire des anticorps.
6. Répétez l’étape 3.3.
7. Montez les couvercles sur des glissières en verre avec un support de montage.
   REMARQUE : ClpP et TOMM20 ont été visualisés sous 405 nm et 647 nm afin d’éviter tout chevauchement spectral avec les signaux FAM.

4. Acquisition d’images

1. Acquiert les images à l’aide d’un microscope laser confocal équipé d’un objectif d’immersion à haute ouverture numérique.
2. Excitez les fluorophores en utilisant des lignes laser de 405 nm et 633 nm. Utilisez des séparateurs de faisceau dichroïque appropriés pour réfléchir la lumière d’excitation et transmettre la fluorescence émise aux détecteurs.
3. Réglez la taille du pixel à 35,3 nm (X, Y) et le pas Z à 0,1 μm pour garantir un échantillonnage axial suffisant des structures mitochondriales.
4. Acquérir des images d’une taille d’image de 1900 x 1900 pixels (X, Y) et collecter 5 sections optiques par pile Z, commençant par le signal mitochondrial supérieur et se terminant en dessous du signal mitochondrial afin de garantir que le signal mitochondrial prédominant soit collecté.
   REMARQUE : Les réglages représentatifs d’acquisition du microscope sont fournis dans la Figure Supplémentaire 1. Pour les cellules HeLa, les mitochondries sont généralement de fines structures tubulaires, d’environ 0,5 à 1 μm de^{diamètre 22}. Ainsi, un Z-volume de 0,5 μm suffit à capturer une fraction substantielle de la matrice mitochondriale individuelle, mais pas nécessairement la cellule entière. Une pile en Z à 5 sections a été sélectionnée pour équilibrer un échantillonnage suffisant des structures mitochondriales avec une acquisition rapide d’images afin de minimiser les artefacts liés au mouvement lors de l’imagerie cellulaire.

5. Traitement et imagerie par cellules vivantes

1. Cultivez des cellules HeLa sur des plats à fond en verre de 35 mm dans du DMEM avec 10 % de FBS à 37 °C dans un incubateur humidifié contenant 5 % de CO₂.
2. Ajouter un inhibiteur (concentration finale : 50 nM) ou un volume équivalent de DMSO aux cellules 24 heures après la sémination. Incubez les cellules pendant 18 heures supplémentaires dans des conditions de culture standard.
3. Retirez le milieu de culture contenant l’inhibiteur ou DMSO et rincez les cellules une fois avec du D-PBS préchauffé pendant 5 minutes.
4. Ajoutez une solution d’imagerie à cellules vivantes contenant 20 nM MitoTracker DeepRed.
5. Réalisez l’imagerie de cellules vivantes à température ambiante en utilisant les mêmes réglages de microscope décrits ci-dessus. Acquérir des images en mode balayage par image avec un débit d’environ 4,72 s par section optique (environ 24 s au total par pile Z à 5 sections).
   REMARQUE : Cinq sections optiques par pile Z sont réglées pour équilibrer un échantillonnage suffisant des structures mitochondriales avec des temps d’acquisition gérables. De plus, une solution d’imagerie cellulaire vivante à température ambiante est utilisée pour réduire la motilité mitochondriale comparée à l’imagerie à 37 °C. Bien que le mouvement mitochondrial lors de l’imagerie de cellules vivantes puisse encore contribuer à la variabilité des mesures de colocalisation, des réglages d’acquisition cohérents sur tous les échantillons contribuent à réduire le biais systématique. Les paramètres logiciels représentatifs sont présentés dans la Figure 2 supplémentaire.

6. Analyse de la morphologie mitochondriale

1. Ouvrez des fichiers image dans Fiji²³ et générez des projections d’intensité maximale à partir des piles Z en sélectionnant Piles d’images → → projet Z et en choisissant Intensité maximale.
2. Appliquez la méthode de seuil Otsu en naviguant dans Image → Ajustez → Seuil et sélectionnez Otsu parmi les options de seuil. Appliquez le seuil aux mitochondries segmentées.
3. Exécutez le plugin Mitochondria^{Analyzer 24} et sélectionnez le mode analyse 2D par mito.
4. Mesurez la taille (surface) et le périmètre mitochondriaux à l’aide de la sortie de l’analyseur mitochondrial.
5. Obtenez les valeurs du facteur de forme mitochondrial directement à partir de la sortie de l’analyseur de mitochondries, où le facteur de forme est calculé comme P²/(4πA), P représentant le périmètre et A la surface.
6. Mesurez la longueur totale des branches par mitochondrie en utilisant la fonction d’analyse de réseau dans le plugin pour évaluer la connectivité mitochondriale.
7. Présenter les données sous forme de distributions de mesures mitochondriales individuelles ainsi que des valeurs moyennes dérivées de 30 cellules par condition sur trois réplications biologiques indépendantes.
8. Évaluer la signification statistique en utilisant le test t de Welch dans un logiciel d’analyse statistique.

7. Analyse de colocalisation

1. Ouvrez des fichiers image aux Fidji et générez des projections 2D à intensité maximale à partir de piles d’images 3D. Pour la cohérence, analysez tous les échantillons en utilisant la même stratégie de projection et d’acquisition.
2. Séparez les canaux de fluorescence en sélectionnant Image → Couleur → Split Channels.
3. Lancez le plugin Coloc 2 en sélectionnant Plugins → Colocalization → Coloc 2.
4. Attribuez les canaux appropriés pour l’analyse et activez la régression de seuil de Costes dans les paramètres du plugin. Effectuez l’analyse par cellule.
5. Enregistrez les coefficients de chevauchement de Mander (M1 et M2) pour évaluer la fraction de signal dans chaque canal qui coïncide spatialement avec l’autre.
6. Activez la randomisation de Costes dans les paramètres Coloc 2 et réglez le nombre de randomisations à 50 pour évaluer la signification statistique.

8. Génération de lysat cellulaire

1. Semez les cellules HeLa dans le DMEM avec 10 % de FBS et incubez à 37 °C dans un incubateur humidifié avec 5 % de CO₂.
2. Ajouter un inhibiteur de 50 nM ou un volume équivalent de DMSO aux cellules 24 heures après l’ensemencement, puis incuber pendant 18 heures supplémentaires dans des conditions de culture standard.
3. Retirez le milieu de culture et rincez les cellules avec du D-PBS préchauffé pendant 5 minutes, puis trypsinez pour décoller.
4. Trempez la trypsinisation avec un milieu de croissance cellulaire frais et centrifugez à 300 x g pendant 3 minutes à température ambiante. Jetez le surnageant.
5. Resuspendez la granule cellulaire dans D-PBS et centrifugez à 300 x g pendant 3 minutes pour laver les cellules. Jetez le surnageant.
6. Resuspendez la pellete cellulaire dans un tampon de lyse pré-refroidi (50 mM Tris-HCl, pH 7,6, 150 mM chlorure de sodium, 0,1 % SDS, 0,5 % désoxycholate de sodium, 2 % CHAPS, 10 mM TCEP, 1 mM PMSF, 1x cocktail inhibiteur de protéase).
7. Incubez les lysates sur la glace pendant 20 minutes et soniez les lysates dans un bain d’eau glacée pendant 2 minutes pour assurer une lyse complète.
8. La centrifugeuse lyse à 13 000 x g, 4 °C pendant 20 minutes.
9. Transférer le surnageant dégagé dans un tube frais pré-refroidi pour une analyse en aval.
   REMARQUE : Le PMSF est toxique et doit être manipulé dans une hotte à fumée avec un équipement de protection individuelle approprié. La SDS est un irritant, et la sonication génère de la chaleur et des aérosols. Effectuer des étapes de lyse et de sonication sur la glace et suivre les consignes de sécurité institutionnelles.

9. Essai de Bradford

1. Préparez un ensemble de solutions standard en utilisant du BSA dans 0,15 M chlorure de sodium. Les concentrations sont : 0, 0,02 mg/mL, 0,04 mg/mL, 0,06 mg/mL, 0,08 mg/mL, 0,10 mg/mL.
2. Diluez le lysat cellulaire inconnu 50 fois et 100 fois dans 0,15 M chlorure de sodium.
3. Pipette réplique chaque solution de courbe standard et des échantillons inconnus dans une plaque de 96 puits.
4. Ajoutez du réactif Bradford à chaque puits. Pour chaque puits, utilisez une solution protéique de 160 μL avec 40 μL de réactif Bradford 5x (disponible commercialement). Mélangez doucement en pipotette.
5. Incubez la plaque à température ambiante pendant 10 minutes et mesurez l’absorbance à 595 nm à l’aide d’un lecteur de plaques.
6. Générez une courbe standard en traçant les concentrations de BSA sur l’axe des x et l’absorbance moyenne à 595 nm à partir de mesures de réplication sur l’axe des y.
7. Déterminez les concentrations de protéines des échantillons en utilisant la courbe standard. Multipliez les valeurs calculées par le facteur de dilution pour obtenir la concentration initiale.

10. Immunoblottage

1. Chargez des quantités égales de lysat cellulaire sur un gel de polyacrylamide à 12 % et séparez les protéines par SDS-PAGE.
2. Activez la membrane PVDF en l’immergeant brièvement dans l’éthanol. Équilibrez à la fois la membrane et les papiers buvants dans le tampon de transfert.
3. Transférez les protéines du gel vers une membrane PVDF en utilisant un système de transfert semi-sec.
4. Bloquez la membrane dans un lait écrémé à 5 % (p/v) dans TBS (20 mM Tris, 150 mM NaCl, pH 7,6) à température ambiante pendant 1 h avec une légère agitation.
5. Incubez la membrane avec l’anticorps primaire dilué dans un tampon de blocage à température ambiante pendant 1 h avec une légère agitation. Utilisez l’anti-ClpP pour le lapin (1:2000) et l’anti-bêta-actine de souris (ACTB, 1:10 000).
6. Lavez la membrane trois fois avec TBST (20 mM Tris, 150 mM NaCl, 0,1 % (v/v) Tween 20, pH 7,6) pendant 5 minutes par lavage pour éliminer les anticorps non liés.
7. Incubez la membrane avec un anticorps secondaire conjugué à HRP dilué dans un tampon de blocage (1:3000) à température ambiante pendant 1 h avec une légère agitation.
8. Répétez l’étape de lavage.
9. Détectez les bandes protéiques à l’aide de réactifs de détection chimiluminescente.

11. Analyse densitométrique

1. Ouvrez l’image de la tache occidentale aux Fidji.
2. Changez le type d’image en 8 bits selon le type Image → → 8 bits.
3. Soustrayez l’arrière-plan de l’image par Process → soustrayez le fond. Vérifie l’arrière-plan lumineux et règle le rayon de la boule roulante à 50,0 pixels.
4. Encerclez la bande à la première voie avec l’outil rectangle, puis sélectionnez analyser → gel → sélectionnez la première voie.
5. Déplacez l’outil rectangle vers la deuxième voie, puis sélectionnez analyser → gel → sélectionnez voie suivante. Répétez cette étape jusqu’à ce que toutes les voies soient sélectionnées.
6. Tracez la densité de bandes en analysant → gel → tracez les voies.
7. Utilisez l’outil ligne droite pour tracer une ligne en bas du pic de densité de bande, et utilisez l’outil baguette pour lire la densité de bande.
8. Répétez la même procédure des étapes 11.1 à 11.8 sur l’image de contrôle de chargement.
9. Rapportez la densité de bandes relative en divisant la densité (ClpP) par la densité (ACTB).

Résultats

L’inhibition de ClpP modifie la morphologie mitochondriale et l’organisation du réseau
La morphologie mitochondriale a été évaluée afin de déterminer si l’inhibition de ClpP modifie l’organisation mitochondriale dans les cellules HeLa. Des images fluorescentes représentatives ont montré des différences nettes dans l’organisation mitochondriale entre les cellules témoins et celles traitées par FAM-FAPAL-CMK (Figure 1A). L’analyse quantitat...

Discussion

La cétone peptidyl chlorométhyl FAPAL-CMK¹⁵ a déjà été démontrée comme un inhibiteur irréversible potentiel de la sous-unité protéase (ClpP) de la protéase mitochondriale dépendante de l’ATP ClpXP. Bien que les expériences cinétiques aient démontré la puissance de l’inhibiteur et son mécanisme d’action, l’approche in vitro n’a pas pu évaluer l’efficacité de FAPAL-CMK en tant qu’inhibiteur sélectif mitochondrial de ClpP dans des cellules intactes. La micro...

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Alexa Fluor 647-conjugated rabbit secondary antibody	Jackson Immuno Research	711-607-003
Beta Actin mouse antibody	Proteintech	66009
bovine serum albumin	Fisher bioreagents	BP1600
CHAPS	VWR	M127
ClpP rabbit PolyAb	Proteintech	15698
cOmplete protease inhibitor cocktail	Roche	11697498001
D-PBS	Corning	21-031-CV
Dulbecco’s Modified Eagle Medium	Corning	10-013-CV
Dylight405-conjugated mouse secondary antibody	Jackson Immuno Research	715-475-150
ECL Select Western Blotting Detection Reagent	Cytiva	RPN2235
EGTA	Calbiochem	4100
fetal bovine serum	R&D Systems	S11550
glutaraldehyde, 70% solution	Polysciences, Inc	01201-2
GraphPad Prism	11.0.2 (100)
HEPES	Dot Scientific, Inc	DSH75030
HRP-conjugated nouse antibody	Cell Signaling Technology	7076S
HRP-conjugated rabbit antibody	Cell Signaling Technology	7074S
ImageJ/Fiji	2.16.0/1.54p
Live cell imaging solution	Gibco	A59688DJ
Magnesium Chloride Hexahydrate	Fisher	BP214
Mitochondria-Analyzer plugin for Fiji	https://github.com/AhsenChaudhry/Mitochondria-Analyzer
MitoTracker DeepRed	Life Technologies	M22426
mouse anti-TOMM20	Santa Cruz Biotechnology	SC17764
paraformaldehyde, 16% solution	Electron Microscopy Sciences	15710
PIPES	Dot Scientific, Inc	DSP40140
PMSF	RPI research products	P20270
Potassium Chloride	Alfa Aesar	11595
potassium phosphate monobasic	VWR	BDH9268
ProLong mounting medium	Invitrogen	P36930
Protein Assay Dye	Bio-Rad	5000006
saponin	Thermo Scientific	A18820.14
sodium borohydride	Thermo Scientific	200050250
Sodium Chorlde	VWR	BDH9286
sodium deoxycholate	Sigma	D6750
Sodium Dodecyl Sulfate	VWR	0227
sodium phosphate dibasic	AMERSCO	0348
Software name	Version information
Tris	Dot Scientific, Inc	DST60040
Tris(2-carboxyethyl)phosphine hydrochloride (TCEP)	GOLD BIOTECHNOLOGY INC	TCEP-10
Triton X-100	Sigma	X100
Tween 20	VWR	0777
ZEISS Zen	2.3