Cette étude examine les lésions de la muqueuse gastrique associées au traitement par le clopidogrel chez le rat et les cellules épithéliales gastriques, en mettant en évidence leur lien avec les modifications moléculaires liées au stress du réticulum endoplasmique, à l'apoptose et à l'inflammation systémique.
Article de recherche
Lésions de la muqueuse gastrique induites par le clopidogrel associées au stress du réticulum endoplasmique chez le rat
* These authors contributed equally
Dans cet article
Résumé
Résumé
Le clopidogrel est largement utilisé comme agent antiplaquettaire pour la prévention et le traitement des maladies thrombotiques artérielles, mais son utilisation clinique peut être limitée par des effets indésirables gastro-intestinaux, notamment des lésions de la muqueuse gastrique. Étant donné que la survie des cellules épithéliales est essentielle au maintien de l'intégrité de la muqueuse gastrique, nous avons émis l'hypothèse que les lésions épithéliales gastriques induites par le clopidogrel s'accompagneraient de modifications des marqueurs liés au stress du réticulum endoplasmique et à l'apoptose. Pour tester cette hypothèse, des cellules épithéliales gastriques humaines GES-1 ont été traitées avec différentes concentrations de clopidogrel, et la viabilité cellulaire, l'apoptose, la distribution dans le cycle cellulaire et les modifications moléculaires ont été évaluées à l'aide du test au kit de comptage cellulaire-8 (CCK-8), de la cytométrie en flux, de la réaction de polymérisation en chaîne en temps réel quantitative (qRT-PCR) et du Western blot. Parallèlement, des rats Sprague-Dawley ont reçu du clopidogrel par gavage afin de créer un modèle de lésion gastrique in vivo. Les modifications pathologiques de la muqueuse gastrique ont été évaluées par coloration à l'hématoxyline-éosine, et les niveaux sériques de cytokines inflammatoires ont été mesurés par dosage immunoenzymatique (ELISA). Le clopidogrel a réduit la viabilité des cellules GES-1, favorisé l'apoptose et modifié la progression du cycle cellulaire. Chez les rats, le clopidogrel a induit une érosion, un œdème et une infiltration de cellules inflammatoires au niveau de la muqueuse gastrique, accompagnés d'une augmentation des concentrations sériques d'interleukine (IL)-1β, d'IL-6 et de facteur de nécrose tumorale-α (TNF-α). Le clopidogrel a également augmenté l'expression des marqueurs du stress du réticulum endoplasmique que sont la protéine homologue à C/EBP (CHOP) et le facteur de transcription activateur 5 (ATF5), augmenté l'expression de la protéine Bcl-2 associée à X (Bax), diminué l'expression de la lymphome de cellules B 2 (Bcl-2) et augmenté le rapport Bax/Bcl-2 dans les tissus gastriques ainsi que dans les cellules GES-1. Ces résultats suggèrent que la lésion de la muqueuse gastrique induite par le clopidogrel est associée à une augmentation de l'expression des marqueurs liés au stress du réticulum endoplasmique et à une perturbation de l'équilibre Bax/Bcl-2, bien qu'une voie causale directe reliant le stress du réticulum endoplasmique à l'apoptose mitochondriale n'ait pas été établie dans cette étude.
Introduction
Les systèmes immunitaires inné et adaptatif de la muqueuse gastrique, composés de cellules épithéliales, de cellules immunitaires et de molécules de signalisation, agissent de concert pour maintenir l'intégrité de la muqueuse et constituent une barrière physiologique essentielle contre les facteurs nocifs1,2. Cette fonction protectrice est essentielle à l'homéostasie gastro-intestinale, et sa perturbation peut contribuer au développement de maladies gastriques, notamment la gastrite3. Cliniquement, les lésions médicamenteuses de la muqueuse gastrique sont une complication fréquente, les anti-inflammatoires non stéroïdiens et les agents antiplaquettaires figurant parmi les causes les plus courantes4. L'intégrité de la muqueuse gastrique dépend d'un équilibre dynamique entre la prolifération cellulaire et l'apoptose5. Une exposition chronique à des facteurs environnementaux, notamment les médicaments, peut perturber cet équilibre, favoriser l'apoptose et entraîner des lésions de la muqueuse6,7. Le réticulum endoplasmique joue un rôle central dans le maintien de l'homéostasie intracellulaire. En cas de stress cellulaire, l'accumulation de protéines mal repliées ou non repliées active la réponse aux protéines mal repliées, incluant la voie de signalisation PERK/eIF2α/ATF4/CHOP, qui peut induire l'apoptose et modifier l'expression des protéines de la famille de la lymphome B-cellulaire 2 (Bcl-2)8. ATF5 est également impliqué dans les réponses au stress mitochondrial et dans la communication entre le dysfonctionnement mitochondrial et le stress du réticulum endoplasmique9. De récentes données cliniques indiquent que le maintien d'un traitement antiplaquettaire, notamment par le clopidogrel, est associé à des lésions progressives de la muqueuse gastrique et intestinale10.
Le clopidogrel est un agent antiplaquettaire largement prescrit qui nécessite une activation métabolique avant de se lier de façon irréversible aux récepteurs plaquettaires P2Y12, inhibant ainsi l'agrégation plaquettaire induite par le diphosphate d'adénosine et produisant des effets antithrombotiques11. Cette bioactivation se produit principalement par l'intermédiaire des enzymes hépatiques du cytochrome P450. Par conséquent, l'exposition directe de cellules épithéliales gastriques en culture au composé parent du clopidogrel ne reproduit pas le contexte métabolique et pharmacocinétique complet du traitement par clopidogrel in vivo. Toutefois, des données croissantes suggèrent que le traitement par le clopidogrel pourrait être associé à des ulcères gastriques récidivants et à des saignements gastro-intestinaux, soulignant l'importance d'un équilibre entre l'efficacité antithrombotique et la sécurité gastro-intestinale12,13,14. Bien que ces effets indésirables aient été rapportés, les mécanismes sous-jacents aux lésions de la muqueuse gastrique associées au clopidogrel restent incomplètement compris, ce qui limite le développement de stratégies préventives et thérapeutiques ciblées. Dans la présente étude, nous avons examiné les effets du clopidogrel sur la muqueuse gastrique à l'aide de rats Sprague–Dawley et de cellules GES-1. Les rats ont reçu du clopidogrel par gavage, et des expériences complémentaires in vitro ont été réalisées à l'aide de cellules GES-1. Des analyses histopathologiques, moléculaires et cellulaires ont été menées afin d'évaluer si les lésions de la muqueuse gastrique induites par le clopidogrel sont associées à un stress du réticulum endoplasmique et à l'apoptose. Ainsi, cette étude s'est concentrée sur la caractérisation des modifications moléculaires associées aux lésions gastriques induites par le clopidogrel, plutôt que sur l'établissement d'une voie de signalisation causale. Nos résultats apportent des connaissances supplémentaires sur les changements moléculaires associés aux lésions de la muqueuse gastrique induites par le clopidogrel et pourraient contribuer à des études futures visant à prévenir et à gérer ces effets indésirables.
Protocole
Toutes les procédures expérimentales sur les animaux ont été examinées et approuvées par le comité d'éthique pour les expérimentations animales du laboratoire de la société Dr. Can Biotechnology (Zhejiang) Co., Ltd. L'étude a été menée conformément aux directives institutionnelles relatives aux soins et à l'utilisation des animaux de laboratoire. Le numéro d'approbation en matière d'éthique animale était DRK-20251015210.
Animaux et lignées cellulaires
L'approbation éthique couvrait l'utilisation de 20 rats Sprague-Dawley de qualité SPF. Un total de 12 rats mâles Sprague-Dawley de qualité SPF, âgés de 6 à 8 semaines et pesant entre 280 et 300 g au début de l'expérience, ont été inclus dans la présente étude. Les rats ont été obtenus auprès de la société Hangzhou Ziyuan Laboratory Animal Technology Co., Ltd. (Hangzhou, Chine ; numéro de licence de production SCXK [Zhejiang] 2024-0004) et répartis aléatoirement en deux groupes, témoin et traité au clopidogrel, avec six rats par groupe. Les rats ont été logés dans un environnement contrôlé à environ 22 °C, sous un cycle lumière/obscurité de 12 h, avec un accès libre à une nourriture standard et à de l'eau de boisson stérilisée. Tous les rats ont été laissés en période d'acclimatation d'une semaine avant le début de l'expérience. Le clopidogrel hydrogénosulfate a été suspendu dans du carboxyméthylcellulose sodique (CMC-Na) à 0,5 % à une concentration de 0,781 mg/mL. Les rats du groupe traité au clopidogrel ont reçu du clopidogrel hydrogénosulfate par gavage oral à 10 mL/kg de poids corporel (équivalent à 1 mL/100 g de poids corporel et à une dose de 7,81 mg/kg) une fois par jour pendant 3 jours consécutifs. Les rats du groupe témoin ont reçu un volume équivalent de CMC-Na à 0,5 %. La dose et la durée du traitement de 3 jours ont été choisies selon un modèle rapporté précédemment de modèle rat chez le rat soumis à une administration orale de clopidogrel à court terme. Après le dernier gavage effectué le jour 3, la nourriture a été retirée pendant 12 h, tandis que l'eau a été fournie ad libitum. Les rats ont été anesthésiés dans une chambre d'induction avec 3 % d'isoflurane dans l'oxygène, puis l'anesthésie a été maintenue avec 1,5 % à 2,0 % d'isoflurane administré par un embout nasal. La profondeur adéquate de l'anesthésie a été confirmée par l'absence de réflexes cornéen et de retrait plantaire. Le sang a été prélevé par ponction cardiaque terminale sous anesthésie profonde. Alors qu'ils restaient profondément anesthésiés, les rats ont été euthanasiés par exsanguination suivie d'une thoracotomie bilatérale. Le décès a été confirmé par l'absence de respiration spontanée et d'activité cardiaque pendant au moins 5 minutes, ainsi que par l'absence de réflexes cornéen et de retrait plantaire. L'estomac a ensuite été rapidement prélevé, ouvert le long de la grande courbure et rincé délicatement avec une solution saline glacée.
La lignée cellulaire épithéliale de la muqueuse gastrique humaine GES-1 a été obtenue auprès de iCell Bioscience Inc. (Shanghai, Chine ; n° de catalogue iCell-h062) et a été authentifiée par profilage des répétitions tandem courtes par le fournisseur. Les cellules ont été cultivées en milieu RPMI-1640 complété avec 10 % de sérum bovin fœtal (SBF) et 1 % de pénicilline–streptomycine, dans un incubateur humidifié à 37 °C avec 5 % de CO₂. Les cellules de bas passage, comprises entre les passages 3 et 10, ont été utilisées pour les expériences. Lorsque la confluence cellulaire atteignait environ 80 % à 90 %, les cellules étaient repiquées selon un ratio de division de 1:3. Les cellules en phase de croissance logarithmique ont été utilisées pour les expériences ultérieures. Pour le test CCK-8, les cellules ont été ensemencées dans des plaques de 96 puits à raison de 6 × 103 cellules/puits. Pour l’analyse de l’apoptose et du cycle cellulaire, les cellules ont été ensemencées dans des plaques de 6 puits à environ 5 × 105 cellules/puits et ont été laissées s’attacher avant le traitement par le clopidogrel.
Produits chimiques et solutions
Du clopidogrel hydrogénosulfate (n° de catalogue C874834 ; pureté ≥ 99 %) a été utilisé pour les expériences animales et cellulaires. Une solution mère de clopidogrel a été préparée en dissolvant 100 mg de poudre de clopidogrel dans du diméthylsulfoxyde (DMSO) afin d'obtenir une solution mère à 1 M. Cette solution mère a ensuite été diluée aux concentrations de travail requises avant utilisation. La solution mère à 1 M a été diluée de façon sériée avec du DMSO pour préparer des solutions d'administration à 1000× aux concentrations de 10, 100, 200, 400, 600, 800 et 1000 mM. Juste avant le traitement, chaque solution d'administration à 1000× a été ajoutée au milieu de culture complet dans un rapport de 1:1000 (v/v) afin d'obtenir des concentrations finales de clopidogrel respectivement de 0,01, 0,1, 0,2, 0,4, 0,6, 0,8 et 1,0 mM. Le groupe contrôle au véhicule a reçu un volume équivalent de DMSO sans clopidogrel. Ainsi, la concentration finale de DMSO a été maintenue à 0,1 % (v/v) dans tous les groupes. Les cellules GES-1 en culture ne reproduisent pas la bioactivation hépatique du clopidogrel médiée par le cytochrome P450. Par conséquent, un traitement direct au clopidogrel a été utilisé comme modèle exploratoire d'exposition au composé parent. La gamme de concentrations a été choisie afin de caractériser les réponses cellulaires dépendantes de la concentration dans les conditions expérimentales, et ne doit pas être interprétée comme équivalente aux concentrations plasmatiques ou tissulaires gastriques cliniquement atteignables.
Subculture cellulaire
Le milieu complet a été préparé en ajoutant au milieu de culture basal du sérum de veau fœtal (FBS) et de la pénicilline-streptomycine. Lorsque la confluence cellulaire a atteint environ 80 %, le milieu de culture a été retiré et les cellules ont été lavées trois fois avec une solution saline tamponnée au phosphate stérile (PBS). Les cellules ont ensuite été digérées avec une solution de trypsine–acide éthylènediaminotétraacétique (EDTA) pendant environ 1 à 2 minutes. Après un détachement partiel des cellules, du milieu complet a été ajouté pour interrompre la digestion. La suspension cellulaire a été centrifugée à 1 200 × g pendant 3 minutes. Après élimination du surnageant, le culot cellulaire a été resuspendu dans 1 à 2 mL de milieu complet et semé dans de nouvelles boîtes de culture selon les besoins expérimentaux.
Dosage de viabilité cellulaire au CCK-8
Des cellules GES-1 en phase de croissance logarithmique ont été semées dans des plaques de 96 puits à raison de 6 × 103 cellules/puit et cultivées toute la nuit afin de permettre l'attachement cellulaire. Après adhérence, les cellules ont été traitées avec différentes concentrations de clopidogrel (0, 0,01, 0,1, 0,2, 0,4, 0,6, 0,8 et 1,0 mM) pendant 24 h. Le groupe témoin a reçu la même concentration finale de solvant. Après traitement, une solution CCK-8 a été ajoutée à chaque puit et incubée à 37 °C selon les instructions du kit. L'absorbance à 450 nm a été mesurée à l'aide d'un lecteur de microplaques. La viabilité cellulaire a été calculée en pourcentage par rapport au groupe témoin. Sur la base des résultats de la relation concentration-réponse, un traitement avec 0,1 mM de clopidogrel pendant 24 h a été sélectionné pour les analyses ultérieures d'apoptose, du cycle cellulaire, de qPCR et de Western blot.
Analyse par cytométrie en flux
Les cellules GES-1 ont été ensemencées dans des plaques de 6 puits et traitées avec du clopidogrel à 0,1 mM pendant 24 h après l'attachement des cellules. Après le traitement, les cellules en suspension et les cellules adhérentes ont été collectées. Les cellules adhérentes ont été digérées par la trypsine sans EDTA, lavées deux fois avec du PBS froid et resuspendues dans du tampon de liaison. Les cellules ont été marquées à l’aide d’un kit d’apoptose Annexine V-FITC/PI selon les instructions du fabricant. Après une incubation à température ambiante à l’abri de la lumière, les cellules apoptotiques ont été détectées à l’aide d’un cytomètre en flux RaiseCyte 2L6C. Les données ont été acquises à l’aide du logiciel RaiseFlower et analysées avec le logiciel FlowJo (version 10.8.1). Les populations de cellules apoptotiques précoces, tardives et l’apoptose totale ont été quantifiées à l’aide du logiciel FlowJo.
Analyse cytométrique en flux de la distribution du cycle cellulaire
Les cellules GES-1 ont été ensemencées dans des plaques de 6 puits et traitées avec du clopidogrel à 0,1 mM pendant 24 h. Après le traitement, les cellules ont été récoltées, lavées avec du PBS et fixées dans de l'éthanol à 70 % prérefroidi à 4 °C. Les cellules fixées ont ensuite été lavées pour éliminer l'éthanol résiduel et incubées avec une solution de coloration contenant la RNase A et l'iodure de propidium, à l'abri de la lumière, selon les instructions du fabricant. La distribution du cycle cellulaire a été analysée à l'aide d'un cytomètre en flux. Les données ont été acquises à l'aide du logiciel d'acquisition et analysées avec le logiciel FlowJo. Les distributions du cycle cellulaire ont été ajustées selon le modèle de Watson, et les pourcentages de cellules présentes dans les phases G0/G1, S et G2/M ont été calculés.
PCR quantitatif en temps réel (qPCR)
L'ARN total a été extrait des cellules GES-1 et des échantillons de tissu gastrique de rat à l'aide d'un kit d'extraction d'ARN, conformément aux instructions du fabricant. Pour les échantillons de tissu, les muqueuses gastriques ont été rapidement collectées, homogénéisées en conditions de basse température, puis soumises à l'extraction d'ARN. La concentration et la pureté de l'ARN ont été déterminées par mesure de l'absorbance à 260 et 280 nm. Des quantités équivalentes d'ARN ont été rétrotranscrites en ADN complémentaire (ADNc) à l'aide d'un kit de rétrotranscription avec élimination de l'ADN génomique. Une PCR quantitative en temps réel a été réalisée en utilisant un mélange maître PCR à base de SYBR Green. Chaque réaction a été effectuée dans un volume total de 20 µL contenant 10 µL de mélange maître 2×, 1 µL d'ADNc, 0,4 µL d'amorce sens, 0,4 µL d'amorce antisens et 8,2 µL d'eau ddH₂O sans RNase. Les conditions de cyclage thermique étaient les suivantes : dénaturation initiale à 95 °C pendant 10 min, suivie de 40 cycles de dénaturation à 95 °C pendant 10 s, d'hybridation à 60 °C pendant 30 s et d'élongation à 72 °C pendant 30 s. Les niveaux d'expression de CHOP, ATF5, Bcl-2 et Bax ont été déterminés. Le gène GAPDH a été utilisé comme gène de référence interne. L'expression relative des gènes a été calculée selon la méthode 2−ΔΔCt. Les séquences des amorces sont indiquées dans le Tableau supplémentaire 1.
Immunotransfert par méthode Western Blot
Des protéines totales ont été extraites à partir de cellules GES-1 et d'échantillons de tissus gastriques de rat. Pour les échantillons cellulaires, les cellules GES-1 traitées ont été lavées avec du PBS froid et lysées à l'aide d'un tampon de lyse RIPA (radioimmunoprécipitation assay) contenant un inhibiteur de protéase. Pour les échantillons tissulaires, les tissus de la muqueuse gastrique ont été homogénéisés dans du tampon RIPA en conditions de basse température, puis centrifugés afin de récupérer le surnageant. Les concentrations protéiques ont été déterminées à l'aide d'un dosage protéique BCA. Un total de 20 µg de protéine par piste a été séparé par électrophorèse sur gel de polyacrylamide en présence de dodécylsulfate de sodium (SDS-PAGE) et transféré sur des membranes de polyvinylidène difluorure (PVDF). Après blocage avec de l'albumine sérique bovine (BSA), les membranes ont été incubées toute la nuit à 4 °C avec des anticorps primaires dirigés contre CHOP (1:1000), ATF5 (1:1000), Bcl-2 (1:1000), Bax (1:1000) et β-actine (1:5000). Après lavage, les membranes ont été incubées avec les anticorps secondaires marqués à la peroxydase de raifort correspondants (1:10000). Les bandes protéiques ont été visualisées à l'aide d'un réactif d'amplification de la chimiluminescence et capturées à l'aide d'un système d'imagerie chimiluminescente. Les intensités des bandes ont été quantifiées à l'aide d'un logiciel d'analyse d'images et normalisées par rapport à la β-actine.
Évaluation histopathologique
Des échantillons de tissu gastrique ont été prélevés sur des rats Sprague–Dawley après un traitement par le clopidogrel et fixés dans du formol tamponné neutre à 10 %. Les échantillons ont été déshydratés, clarifiés, inclus en paraffine et coupés à une épaisseur de 4 µm. Les coupes en paraffine ont été colorées à l'hématoxyline et à l'éosine. Les modifications histopathologiques ont été évaluées de manière qualitative au microscope optique en fonction de la morphologie de la muqueuse, de l'intégrité épithéliale, de l'œdème et de l'infiltration par les cellules inflammatoires. Des images représentatives ont été capturées. Aucun système de notation histologique n'a été appliqué.
Immunohistochimie
Des coupes de tissu gastrique incluses dans la paraffine ont été déparaffinisées dans le xylène et réhydratées à l’aide d’une série d’éthanol à concentration décroissante. Une récupération antigénique induite par la chaleur a été réalisée dans un tampon citrate. L’activité peroxydasique endogène a été bloquée avec un peroxyde d’hydrogène à 3 % pendant 10 minutes, et la liaison non spécifique a été bloquée avec un sérum de chèvre normal pendant 30 minutes à température ambiante. Les coupes ont ensuite été incubées toute la nuit à 4 °C avec des anticorps primaires dirigés contre CHOP, ATF5, Bcl-2 et Bax. Après un lavage au PBS, les coupes ont été incubées avec l’anticorps secondaire marqué à la peroxydase de raifort correspondant. Les signaux immunoréactifs ont été visualisés à l’aide d’une solution chromogène DAB, suivie d’une contre-coloration à l’hématoxyline. Les coupes ont été déshydratées, clarifiées, montées et examinées au microscope optique. Des images représentatives ont été prises, et la surface colorée positive a été quantifiée à l’aide d’un logiciel d’analyse d’image.
Coloration en immunofluorescence
Des coupes de tissu gastrique incluses dans la paraffine ont été déparaffinisées, réhydratées, puis soumises à une récupération d'antigène induite par la chaleur dans un tampon citrate. Après blocage par un sérum de chèvre normal pendant 30 min, les coupes ont été incubées toute la nuit à 4 °C avec des anticorps primaires dirigés contre CHOP (1:50), ATF5 (1:100), Bcl-2 (1:50) et Bax (1:200). Après lavage au PBS, les coupes ont été incubées pendant 1 h à température ambiante à l'abri de la lumière avec les anticorps secondaires fluorescents correspondants (1:500), puis contre-colorées avec le DAPI. Les images ont été acquises à l’aide d’un microscope à fluorescence avec un grossissement ×200. Trois champs choisis aléatoirement et non superposés par animal ont été analysés à l’aide du logiciel Image-Pro Plus 6.0, et l’intensité de fluorescence a été exprimée sous la forme IOD/Surface. Trois animaux par groupe ont été inclus dans l’analyse.
Dosage immuno-enzymatique (ELISA)
Des échantillons sanguins ont été prélevés chez des rats Sprague–Dawley après traitement et laissés à coaguler à température ambiante. Le sérum a été séparé par centrifugation et stocké à −80 °C jusqu'à l'analyse. Les concentrations sériques d'IL-1β, d'IL-6 et de TNF-α ont été mesurées à l'aide de kits ELISA conformément aux instructions du fabricant. L'absorbance a été mesurée à l'aide d'un lecteur de microplaques, et les concentrations en cytokines ont été déterminées à partir des courbes standards.
Analyse statistique
Les analyses statistiques ont été effectuées à l'aide d'un logiciel d'analyse statistique. Les données sont présentées sous la forme de la moyenne ± écart-type (SD). La normalité et l'homogénéité des variances ont été évaluées à l'aide du test de Shapiro–Wilk et du test de Levene, respectivement. Les comparaisons entre deux groupes ont été réalisées à l'aide du test t de Student. Les comparaisons entre plusieurs groupes ont été effectuées à l'aide d'une analyse de variance à un facteur suivie du test a posteriori (post hoc) de Dunnett. Une valeur de P < 0,05 a été considérée comme statistiquement significative. Toutes les expériences sur cellules ont été réalisées à partir d'au moins trois réplicats biologiques indépendants.
Résultats
Le clopidogrel réduit la viabilité des cellules GES-1 et augmente l'apoptose in vitro
Nous avons d'abord étudié si le clopidogrel affecte la viabilité et l'apoptose des cellules GES-1. Des tests CCK-8 ont montré que le traitement par le clopidogrel réduisait significativement la viabilité des cellules GES-1 (Figure 1A,B), indiquant une diminution de la viabilité cellulaire. Compte tenu de la réduction globale de la viabilité cellulaire dans la gamme de concentrations testées, un traitement par 0,1 mM de clopidogrel pendant 24 h a été sélectionné pour toutes les expériences cellulaires ultérieures. La cytométrie en flux a ensuite été réalisée afin d'analyser l'apoptose et la distribution du cycle cellulaire (Figure 1C–F). L'analyse par cytométrie en flux a révélé une proportion accrue de cellules en phase S, accompagnée d'une diminution de la population en phase G0/G1 et d'aucune augmentation notable de la population en phase G2/M, indiquant une accumulation en phase S plutôt qu'un arrêt en phase G2/M. Les résultats ont démontré que le clopidogrel augmentait significativement l'apoptose et modifiait la distribution du cycle cellulaire dans les cellules GES-1 par rapport au groupe témoin. Dans leur ensemble, ces résultats indiquent que le clopidogrel réduit la viabilité des cellules GES-1 et est associé à une augmentation de l'apoptose ainsi qu'à des modifications de la progression du cycle cellulaire. Ces observations mettent en évidence des réponses cytotoxiques après une exposition directe au composé parent du clopidogrel dans les conditions expérimentales choisies. Elles n'établissent toutefois pas que des effets comparables se produisent à des niveaux d'exposition cliniquement pertinents, ni que les réponses observées sont médiées par le métabolite actif du clopidogrel.
Figure 1. Le clopidogrel réduit la viabilité des cellules GES-1 et augmente l'apoptose. (A) La viabilité cellulaire de la lignée cellulaire épithéliale gastrique humaine GES-1 a été évaluée à l'aide du test CCK-8 après un traitement avec des concentrations croissantes de clopidogrel (0–1,0 mM) pendant 24 h. (B) Comparaison quantitative de la viabilité cellulaire entre le groupe témoin et le groupe traité avec 0,1 mM de clopidogrel pendant 24 h. (C) Profils représentatifs du cycle cellulaire analysés par cytométrie en flux à l'aide du modèle de Watson. (D) Quantification des pourcentages de cellules dans les phases G0/G1, S et G2/M. Le traitement au clopidogrel a augmenté la population en phase S sans augmentation évidente de la population en phase G2/M. (E) Diagrammes en nuage de points représentatifs de l'apoptose obtenus par cytométrie en flux après coloration par l'annexine V-fluorescéine isothiocyanate (FITC) et l'iodure de propidium (PI). (F) Quantification de la population totale de cellules apoptotiques. Toutes les expériences cellulaires ont été réalisées en trois réplicats biologiques indépendants (n = 3). Les données sont exprimées comme moyenne ± écart-type (SD). La significativité statistique a été déterminée par comparaison avec le groupe témoin. ***P < 0,001. Veuillez cliquer ici pour consulter une version agrandie de cette figure.
Les lésions gastriques induites par le clopidogrel sont associées à une inflammation systémique
Des rats Sprague–Dawley ont été répartis aléatoirement en deux groupes (n = 6 par groupe) : un groupe témoin et un groupe traité au clopidogrel ayant reçu une administration quotidienne par gavage. La dose de clopidogrel et le régime de traitement de 3 jours ont été choisis en se basant sur un modèle de rat précédemment décrit de lésion gastrique induite par le clopidogrel16. Après 3 jours, les tissus gastriques ont été prélevés pour une coloration à l'hématoxyline et à l'éosine (H&E). L'examen histopathologique a révélé des érosions de la muqueuse gastrique, un œdème et une infiltration de cellules inflammatoires dans le groupe traité au clopidogrel par rapport au groupe témoin (Figure 2A). Les taux sériques de cytokines inflammatoires ont été mesurés par ELISA. Le groupe traité au clopidogrel présentait des concentrations sériques significativement plus élevées d'interleukine (IL)-1β, d'IL-6 et de facteur de nécrose tumorale-α (TNF-α) que le groupe témoin (Figure 2B–D). Ces résultats indiquent que le traitement par le clopidogrel est associé à une lésion de la muqueuse gastrique et à une augmentation des réponses inflammatoires systémiques15,16.
Figure 2. Le clopidogrel induit une lésion de la muqueuse gastrique et augmente les concentrations circulantes de cytokines inflammatoires chez le rat. (A) Sections représentatives de la muqueuse gastrique colorées à l'hématoxyline et à l'éosine (H&E) provenant de rats Sprague–Dawley témoins et traités au clopidogrel. L'examen histologique montre une architecture préservée de la muqueuse gastrique dans le groupe témoin et des altérations morphologiques dans le groupe traité au clopidogrel. Les flèches jaunes indiquent les cellules épithéliales de la muqueuse gastrique, les flèches rouges indiquent une congestion focale au sein de la couche muqueuse, et les flèches noires indiquent une infiltration modérée de cellules inflammatoires. Grossissement initial, ×200 ; échelle = 100 µm. n = 6 animaux par groupe. (B–D) Les concentrations sériques d'interleukine (IL)-1β, d'IL-6 et de facteur de nécrose tumorale-α (TNF-α) ont été mesurées par dosage immunoenzymatique (ELISA). Les données sont exprimées comme moyenne ± écart-type (SD) ; n = 6 animaux par groupe. ***P < 0,001 par rapport au groupe témoin. Veuillez cliquer ici pour consulter une version agrandie de cette figure.
Le clopidogrel modifie les marqueurs liés au stress du réticulum endoplasmique et à l'apoptose dans la muqueuse gastrique de rat
Afin d'étudier les modifications moléculaires associées aux lésions gastriques induites par le clopidogrel, une coloration immunohistochimique a été réalisée sur des coupes de tissu gastrique. Des images représentatives ont montré une coloration plus intense pour CHOP, ATF5 et Bax dans le groupe traité au clopidogrel par rapport au groupe témoin, tandis que la coloration de Bcl-2 apparaissait plus faible (Figure 3A). L'analyse quantitative de l'IOD/surface a démontré une augmentation significative de la coloration de CHOP, ATF5 et Bax après traitement au clopidogrel (Figure 3B,C,E). La coloration de Bcl-2 présentait une tendance à la diminution, bien que la différence n'ait pas atteint la signification statistique (Figure 3D). Ces résultats indiquent que le traitement par clopidogrel est associé à une modification de l'expression de protéines liées au stress et à l'apoptose dans la muqueuse gastrique de rat. Une analyse en immunofluorescence a révélé des signaux plus intenses pour CHOP et ATF5 dans le tissu de la muqueuse gastrique du groupe traité au clopidogrel. L'analyse quantitative a confirmé des augmentations significatives de CHOP (Figures 4A et 5A) et d'ATF5 (Figures 4B et 5B), tandis que Bcl-2 (Figures 4C et 5C) et Bax (Figures 4D et 5D) présentaient respectivement des tendances à la diminution et à l'augmentation, sans atteindre la signification statistique. Dans leur ensemble, ces résultats indiquent que le traitement par clopidogrel est associé à une modification de l'expression de marqueurs liés au stress du réticulum endoplasmique et à l'apoptose dans la muqueuse gastrique de rat.
Figure 3. Détection immunohistochimique de protéines liées au stress du réticulum endoplasmique et à l'apoptose dans le tissu gastrique. (A) Images représentatives de colorations immunohistochimiques de la protéine homologue à C/EBP (CHOP), du facteur de transcription activateur 5 (ATF5), de la protéine de lymphome de cellules B (Bcl-2) et de la protéine Bcl-2 associée à X (Bax) dans le tissu muqueux gastrique de rats Sprague–Dawley témoins et traités au clopidogrel. La coloration brune indique une immunoréactivité positive, et les noyaux ont été contre-colorés à l'hématoxyline. Les images présentées sont représentatives de tous les échantillons analysés, avec trois animaux par groupe. Grossissement initial, ×200 ; échelle = 100 µm. (B–E) Analyse quantitative de la densité optique intégrée par unité de surface (IOD/Area) pour CHOP, ATF5, Bcl-2 et Bax, respectivement. Les données sont exprimées en moyenne ± écart-type. *P < 0,05 et **P < 0,01 par rapport au groupe témoin. Veuillez cliquer ici pour visualiser une version agrandie de cette figure.
Figure 4. Détection par immunofluorescence de protéines liées au stress du réticulum endoplasmique et à l'apoptose dans le tissu gastrique. Images représentatives d'immunofluorescence montrant la localisation de la protéine homologue à C/EBP (CHOP), du facteur de transcription activateur 5 (ATF5), de la lymphome B-cellulaire 2 (Bcl-2) et de la protéine Bcl-2 associée à X (Bax) dans le tissu de la muqueuse gastrique de rats Sprague–Dawley témoins et traités au clopidogrel. Les noyaux ont été contre-colorés avec le 4′,6-diamidino-2-phénylindole (DAPI) (en bleu), et la coloration positive en immunofluorescence apparaît en rouge. Les images fusionnées sont présentées dans la colonne de droite. (A) CHOP. (B) ATF5. (C) Bcl-2. (D) Bax. Grossissement initial, ×200 ; échelle = 100 µm. Les images présentées sont représentatives de l'ensemble des échantillons analysés, avec n = 3 animaux par groupe. Veuillez cliquer ici pour consulter une version agrandie de cette figure.
Figure 5. Analyse quantitative de l'immunofluorescence des protéines liées au stress du réticulum endoplasmique et à l'apoptose dans le tissu gastrique. (A–D) Quantification de la densité optique intégrée par unité de surface (IOD/Surface) de la protéine homologue à C/EBP (CHOP), du facteur de transcription activateur 5 (ATF5), de la lymphome B-cellulaire 2 (Bcl-2) et de la protéine Bcl-2 associée à X (Bax) dans le tissu de la muqueuse gastrique de rats Sprague–Dawley témoins et traités au clopidogrel. Pour chaque animal, trois champs microscopiques non superposés choisis aléatoirement par section tissulaire ont été analysés à l’aide d’un logiciel d’analyse d’image, et la valeur moyenne a été utilisée pour l’analyse statistique. Les données sont exprimées comme moyenne ± ÉT ; n = 3 animaux par groupe. *P < 0,05 et **P < 0,01 par rapport au groupe témoin. Veuillez cliquer ici pour visualiser une version agrandie de cette figure.
Le clopidogrel modifie l'expression des gènes et des protéines liés au stress du réticulum endoplasmique et à l'apoptose dans les cellules GES-1 et les tissus gastriques de rat
Des études antérieures ont indiqué que le stress du réticulum endoplasmique joue un rôle clé dans les réponses cellulaires au stress et dans l'apoptose17,18. Afin d'évaluer les modifications des marqueurs liés au stress du réticulum endoplasmique après un traitement par le clopidogrel, l'expression de CHOP et d'ATF5 a été analysée dans les cellules GES-1. La qRT-PCR a révélé une augmentation de l'expression des ARNm de CHOP et d'ATF5 suite au traitement par le clopidogrel. L'analyse par immunoblotting a confirmé une augmentation de l'expression protéique de CHOP et d'ATF5 (Figure 6A–E). L'expression des protéines liées à l'apoptose a ensuite été évaluée dans les cellules GES-1 et dans le tissu gastrique de rat. Par rapport au groupe témoin, le traitement par le clopidogrel a augmenté l'expression de Bax et diminué celle de Bcl-2, entraînant un rapport Bax/Bcl-2 accru (Figure 6A–J). Ces profils d'expression ont été observés de manière constante au niveau des ARNm et des protéines dans les cellules GES-1 et le tissu gastrique de rat. Dans leur ensemble, ces résultats démontrent que le traitement par le clopidogrel est associé à une modification de l'expression des marqueurs liés au stress du réticulum endoplasmique et à l'apoptose dans les deux modèles expérimentaux.
Figure 6. Expression de marqueurs liés au stress du réticulum endoplasmique et à l'apoptose dans les cellules GES-1 et le tissu gastrique de rat après traitement par le clopidogrel. (A–D) Expression relative de l'ARN messager (ARNm) de la protéine homologue à C/EBP (CHOP), du facteur de transcription activateur 5 (ATF5), de la protéine de lymphome de cellules B 2 (Bcl-2) et de la protéine Bcl-2 associée à X (Bax) dans la lignée cellulaire épithéliale gastrique humaine GES-1, déterminée par réaction de polymérisation en chaîne en temps réel quantitative (qRT-PCR). (E) Images représentatives de western blot avec quantification densitométrique correspondante de l'expression protéique de CHOP, ATF5, Bcl-2 et Bax dans les cellules GES-1. Les niveaux d'expression protéique ont été normalisés à la β-actine. Les expériences cellulaires ont été réalisées à partir de trois réplicats biologiques indépendants (n = 3). (F–I) Expression relative de l'ARNm de CHOP, ATF5, Bcl-2 et Bax dans le tissu gastrique de rat, déterminée par qRT-PCR. (J) Images représentatives de western blot avec quantification densitométrique correspondante de l'expression protéique de CHOP, ATF5, Bcl-2 et Bax dans le tissu gastrique de rat. Les niveaux d'expression protéique ont été normalisés à la β-actine. Les expériences sur tissus comprenaient n = 3 animaux par groupe. Les données sont présentées sous forme de moyenne ± écart-type (SD). La signification statistique a été déterminée par comparaison avec le groupe témoin. *P < 0,05, **P < 0,01 et ***P < 0,001. Veuillez cliquer ici pour consulter une version agrandie de cette figure.
Dans leur ensemble, les résultats démontrent que le traitement par le clopidogrel réduit la viabilité des cellules GES-1, augmente l'apoptose, modifie l'expression des marqueurs liés au stress du réticulum endoplasmique et à l'apoptose, et est associé à une lésion de la muqueuse gastrique accompagnée d'une augmentation des niveaux circulants de cytokines inflammatoires chez les rats. Ces résultats confirment l'hypothèse de l'étude selon laquelle le traitement par le clopidogrel est associé à une lésion de la muqueuse gastrique et à des modifications concomitantes des marqueurs liés au stress du réticulum endoplasmique et à l'apoptose.
Disponibilité des données :
Toutes les données générées ou analysées au cours de cette étude sont incluses dans cet article publié et ses matériaux supplémentaires. Les séquences d'amorces utilisées pour la RT-PCR sont fournies dans le Tableau supplémentaire 1. Les données brutes soutenant toutes les figures et tous les panneaux de figures individuels, y compris les jeux de données expérimentaux originaux et les fichiers sources, sont fournies dans l'archive supplémentaire Données brutes accompagnante (fichier compressé).
Tableau supplémentaire 1. Séquences des amorces utilisées pour l'analyse par RT-PCR. Les séquences des amorces sens (S) et antisens (A) utilisées pour l'analyse par RT-PCR de GAPDH, CHOP, ATF5, Bcl-2 et Bax dans cette étude sont indiquées selon l'orientation 5′–3′.Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.
Discussion
Le clopidogrel est largement utilisé pour la prévention et le traitement des maladies cardiovasculaires ; toutefois, son utilisation clinique est associée à des risques de saignement et à des complications gastro-intestinales, notamment des ulcères peptiques, des hémorragies et des perforations19. Par conséquent, comprendre les modifications moléculaires associées aux lésions gastriques induites par le clopidogrel est essentiel pour améliorer la prévention et la prise en charge de ces effets indésirables. Dans la présente étude, nous avons examiné les effets du clopidogrel sur les cellules épithéliales gastriques et sur le tissu gastrique de rat, et observé des modifications de la viabilité cellulaire, de l'apoptose, des réponses inflammatoires, ainsi que de l'expression de marqueurs liés au stress du réticulum endoplasmique et à l'apoptose. Ces résultats suggèrent que les lésions de la muqueuse gastrique induites par le clopidogrel sont associées à des altérations de l'expression de marqueurs liés au stress du réticulum endoplasmique et à l'apoptose. Toutefois, en l'absence d'expériences pharmacologiques de sauvetage ou de perte de fonction génétique, ces résultats n'établissent pas de relation de causalité entre le stress du réticulum endoplasmique et l'apoptose.
Des études antérieures ont indiqué que le clopidogrel pourrait altérer la réparation de la muqueuse gastrique et retarder la cicatrisation des ulcères gastriques20. Dans la présente étude, les tests CCK-8 ont montré que le clopidogrel réduisait la viabilité des cellules GES-1, et la cytométrie en flux a démontré une augmentation de l'apoptose et une modification de la progression du cycle cellulaire (Figure 1). Ces résultats sont conformes aux rapports antérieurs concernant l'apoptose induite par le clopidogrel dans les cellules épithéliales gastriques21. Ces observations suggèrent que le traitement par le clopidogrel est associé à une altération de la viabilité des cellules épithéliales gastriques et à une augmentation de l'apoptose, ce qui pourrait contribuer à une lésion de la muqueuse gastrique11. Dans le modèle rat, la coloration H&E a mis en évidence une lésion de la muqueuse gastrique après traitement par le clopidogrel (Figure 2A). Les concentrations sériques d'IL-1β, d'IL-6 et de TNF-α étaient également significativement augmentées (Figure 2B–D), indiquant une réponse inflammatoire associée à la lésion de la muqueuse gastrique22. De plus, des analyses immunohistochimiques et d'immunofluorescence ont montré une expression modifiée de marqueurs liés au stress du réticulum endoplasmique et à l'apoptose dans le tissu gastrique de rats traités par le clopidogrel par rapport au groupe témoin (Figure 3, Figure 4, Figure 5).
CHOP, ATF5, Bcl-2 et Bax sont des régulateurs importants des réponses cellulaires au stress et de l'apoptose23,24,25,26. Dans cette étude, le traitement par le clopidogrel a été associé à une augmentation de l'expression de CHOP et d'ATF5, ainsi qu'à une modification de l'expression de Bax et de Bcl-2, tant dans les cellules GES-1 que dans le tissu gastrique de rat (Figure 6). Ces résultats indiquent des modifications concomitantes des marqueurs liés au stress et à l'apoptose. Toutefois, la présente étude a évalué uniquement les changements d'expression, sans déterminer si ces molécules médient directement les lésions de la muqueuse gastrique induites par le clopidogrel. De même, bien qu'un ratio Bax/Bcl-2 accru ait été observé, l'étude n'a pas démontré directement l'activation de la voie mitochondriale de l'apoptose. Par conséquent, ces résultats doivent être interprétés comme des associations, et non comme une preuve d'un mécanisme de signalisation causal.
La présente étude combine un modèle in vivo chez le rat avec des expériences exploratoires d'exposition directe sur des cellules GES-1 afin d'évaluer les modifications morphologiques et moléculaires associées au traitement par le clopidogrel. Le modèle in vivo fournit la preuve principale de lésions de la muqueuse gastrique, tandis que les expériences sur les cellules GES-1 apportent des éléments complémentaires concernant les réponses cellulaires après exposition directe au composé parent. La combinaison de l'analyse histopathologique, de la mesure des cytokines inflammatoires, de l'immunohistochimie, de l'immunofluorescence, de la qRT-PCR et du Western blot permet une évaluation complète des modifications morphologiques et moléculaires associées aux lésions gastriques. Cette approche expérimentale pourrait être utile pour étudier les effets gastro-intestinaux des agents antiplaquettaires et pour évaluer d'éventuelles interventions protectrices dans des études futures.
Plusieurs limites doivent être reconnues. Le clopidogrel est un médicament proforme qui nécessite une activation métabolique hépatique, alors que l'exposition directe des cellules GES-1 au composé parent n'entraîne pas ce processus ni ne reflète pleinement la pharmacocinétique clinique. De plus, les concentrations relativement élevées utilisées in vitro ont pu provoquer une cytotoxicité non spécifique. Par conséquent, les expériences menées sur les cellules GES-1 doivent être considérées comme une preuve exploratoire des réponses cellulaires dans des conditions d'exposition directe. Le test CCK-8 n'incluait pas de contrôle positif de viabilité cellulaire réduite, ce qui limite la vérification indépendante des performances du test. Les mécanismes en amont responsables des modifications liées au stress du réticulum endoplasmique observées n'ont pas été étudiés, et aucune expérience d'inhibition pharmacologique, d'interférence génique ou de délétion génique n'a été réalisée pour déterminer si le stress du réticulum endoplasmique régule directement l'équilibre Bax/Bcl-2 et l'apoptose. De futures études devraient comparer le composé parent à son métabolite actif, intégrer un système d'activation métabolique approprié et réaliser des expériences d'intervention fonctionnelle afin de préciser ces relations. En outre, aucun témoin positif bien établi d'induction de l'apoptose n'a été inclus dans le test Annexin V-FITC/PI. Par conséquent, bien que le traitement par le clopidogrel ait été associé à une augmentation de la population de cellules positives à l'Annexine V par rapport au témoin véhicule, les performances techniques du test d'apoptose n'ont pas été vérifiées indépendamment à l'aide d'une condition témoin positive. De futures études devraient inclure un inducteur d'apoptose, tel que la staurosporine, dans le même lot expérimental.
En conclusion, le traitement oral par le clopidogrel a provoqué une lésion de la muqueuse gastrique chez les rats et s'est accompagné de modifications des marqueurs liés au stress du réticulum endoplasmique et à l'apoptose. L'exposition directe des cellules GES-1 au composé parent du clopidogrel a également réduit la viabilité cellulaire et altéré les marqueurs moléculaires associés dans les conditions expérimentales. Toutefois, comme le modèle cellulaire ne reproduit pas l'activation hépatique et que des concentrations relativement élevées ont été utilisées, les résultats in vitro ne peuvent pas être directement extrapolés à l'exposition clinique, et une cytotoxicité non spécifique ne peut être exclue. Dans l'ensemble, ces résultats indiquent que la lésion de la muqueuse gastrique induite par le clopidogrel est associée à des modifications de l'expression des marqueurs liés au stress du réticulum endoplasmique et à l'apoptose, bien que des études mécanistiques supplémentaires soient nécessaires pour établir des relations de causalité.
Déclarations de divulgation
Conflit d'intérêts :
Les auteurs déclarent ne pas avoir d'intérêts financiers concurrents connus ni de relations personnelles pouvant avoir semblé influencer les travaux rapportés dans cette étude.
Remerciements
Ce travail a été soutenu par le projet « Recherche fondamentale sur la voie de signalisation CHOP/ATF5/Bcl-2 dans l'apoptose des cellules épithéliales de la muqueuse gastrique induite par le clopidogrel » (numéro de projet 2023BWKY009).
Matériaux
| Nom | Entreprise | Numéro de catalogue | Commentaires |
|---|---|---|---|
| Kit de détection de l'apoptose Annexine V-FITC/PI | Elabscience | E-CK-A211 | Kit de détection de l'apoptose |
| Anticorps anti-ATF5 | Proteintech | 67066-1-AP | Anticorps primaire |
| Kit d'essai BCA pour protéines | Solarbio | PC0020 | Dosage de la concentration en protéines |
| Anticorps anti-Bax | Proteintech | 50599-1-AP | anticorps primaire |
| Anticorps anti-Bcl-2 | Proteintech | 26593-1-AP | Anticorps primaire |
| βAnticorps anti-actine | Proteintech | 66009-1-Ig | anticorps primaire |
| Tampon de blocage | Beyotime | P0252 | Solution de blocage pour immunotransfert Western blot |
| Kit de comptage cellulaire CCK-8 | KeyGen Biotech | KGA317 | Essai de viabilité cellulaire |
| Kit de synthèse d'ADNc | TransGen Biotech | AU341 | Kit de synthèse de l'ADN complémentaire de premier brin avec élimination de l'ADN génomique |
| Kit de détection du cycle cellulaire | Lianke Biotechnology | CCS012 | Kit d'analyse du cycle cellulaire |
| Anticorps CHOP | Proteintech | 15204-1-AP | anticorps primaire |
| Clopidogrel hydrogénosulfate (Pureté ≥99%) | Macklin | C874834 | Médicament expérimental |
| Kit de chromogène DAB | Beyotime | P0201M | Substrat pour immunohistochimie |
| Diméthylsulfoxyde (DMSO) | MedChemExpress | HY-Y0320C | Solvant |
| Réactif de chimiluminescence améliorée (ECL) | Meilunbio | MA0186 | Substrat chimiluminescent |
| Sérum fœtal bovin (SFB) | Gibco | 10099-141 | Supplément pour culture cellulaire |
| Ligne cellulaire épithéliale gastrique humaine GES-1 | iCell Bioscience | iCell-h062 | Ligne cellulaire épithéliale gastrique humaine |
| Hématoxyline et Éosine (H&E) Kit de coloration | Beyotime | C0105S | Coloration histologique |
| Anticorps secondaire conjugué à la peroxydase de raifort (HRP) | Proteintech | RGAM001/RGAR001 | Anticorps secondaire |
| Solution de peroxyde d'hydrogène | Absinthe | ABS9333-100mL | Réactif de blocage de la peroxydase endogène |
| IL-1β Kit ELISA | MEIMIAN | MM-0047R2 | Dosage des cytokines sériques |
| Kit ELISA pour l'IL-6 | MEIMIAN | MM-0190R2 | Dosage des cytokines sériques |
| Lecteur de microplaques | Beijing Liuyi Biotechnology | WD-2102B | Mesure de l'absorbance |
| Solution de pénicilline-streptomycine | Solarbio | P1400 | Solution d'antibiotique |
| Solution saline tamponnée au phosphate (PBS) | Servicebio | G4202-500ML | 1× PBS |
| Membrane de polyfluorure de vinylidène (PVDF) | Millipore | IPVH00010 | Membrane pour immunotransfert |
| Diluant pour anticorps primaire | Beyotime | P0023A | Diluant d'anticorps |
| Marqueur de poids moléculaire des protéines | Yeasen | WJ103 | Échelle de protéines pré-étiquetées |
| Mix maîtresse de PCR quantitative en temps réel (SYBR Green) | CWBio | CW3008 | réactif de qPCR |
| Tampon de lyse RIPA (Radioimmunoprecipitation Assay) | Solarbio | R0010 | Tampon d'extraction des protéines |
| RNase A | Lianke Biotechnology | CCS012 | Réactif pour l'analyse du cycle cellulaire |
| Milieu RPMI-1640 | Servicebio | G4535-500ML | Milieu de culture basal pour cellules |
| Rats Sprague-Dawley | Hangzhou Ziyuan Laboratory Animal Technology Co., Ltd. | N/A | qualité SPF |
| TNF-α Kit ELISA | MEIMIAN | MM-0180R2 | Dosage des cytokines sériques |
| Kit de purification d'ARN total | TransGen Biotech | ER501-01 | kit d'extraction d'ARN |
| Solution de trypsine-EDTA | Solarbio | T1300 | Réactif de dissociation cellulaire |
Références
- Mills JC, Shivdasani RA. Gastric epithelial stem cells. Gastroenterology. 2011;140(2):412-424.
- Zhou CB, et al. The role of pyroptosis in gastrointestinal cancer and immune responses to intestinal microbial infection. Biochim Biophys Acta Rev Cancer. 2019;1872(1):1-10.
- Boltin D, Niv Y. Pharmacological and alimentary alteration of the gastric barrier. Best Pract Res Clin Gastroenterol. 2014;28(6):981-994.
- Kwon DA, et al. Protective effects of a standardized extract (HemoHIM) using indomethacin- and ethanol/HCl-induced gastric mucosal injury models. Pharm Biol. 2019;57(1):543-549.
- Guo XZ, et al. Effect of Bax, Bcl-2 and Bcl-xL on regulating apoptosis in tissues of normal liver and hepatocellular carcinoma. World J Gastroenterol. 2002;8(6):1059-1062.
- Gomi A, et al. Effect of Bifidobacterium bifidum BF-1 on gastric protection and mucin production in an acute gastric injury rat model. J Dairy Sci. 2013;96(2):832-837.
- Chiou SK, et al. Suppression of growth arrest and DNA damage-inducible 45alpha expression confers resistance to sulindac- and indomethacin-induced gastric mucosal injury. J Pharmacol Exp Ther. 2010;334(3):693-702.
- Chen X, et al. Endoplasmic reticulum stress: molecular mechanism and therapeutic targets. Signal Transduct Target Ther. 2023;8(1):352.
- Lian X, et al. ATF5-regulated mitochondrial unfolded protein response attenuates neuronal damage in epileptic rats by reducing endoplasmic reticulum stress through mitochondrial ROS. Neurochem Res. 2024;49(2):388-401.
- He C, et al. Progression of gastrointestinal injury during antiplatelet therapy after percutaneous coronary intervention: a secondary analysis of the OPT-PEACE randomized clinical trial. JAMA Netw Open. 2023;6(11):e2343219.
- Zongdan J, et al. The mechanism of miR-363-3p/DUSP10 signaling pathway involved in the gastric mucosal injury induced by clopidogrel. Toxicol Mech Methods. 2021;31(2):150-158.
- Chan FK, et al. Clopidogrel versus aspirin and esomeprazole to prevent recurrent ulcer bleeding. N Engl J Med. 2005;352(3):238-244.
- Taha AS, et al. Upper gastrointestinal mucosal abnormalities and blood loss complicating low-dose aspirin and antithrombotic therapy. Aliment Pharmacol Ther. 2006;23(4):489-495.
- Wu HL, et al. Increased endoplasmic reticulum stress response is involved in clopidogrel-induced apoptosis of gastric epithelial cells. PLoS One. 2013;8(9):e74381.
- Forsgard RA, et al. Intestinal permeability to iohexol as an in vivo marker of chemotherapy-induced gastrointestinal toxicity in Sprague-Dawley rats. Cancer Chemother Pharmacol. 2016;78(4):863-874.
- Wu H, et al. Clopidogrel-induced gastric injury in rats is attenuated by stable gastric pentadecapeptide BPC 157. Drug Des Devel Ther. 2020;14:5599-5610.
- Zhu XM, et al. The involvement of endoplasmic reticulum stress response in immune dysfunction of dendritic cells after severe thermal injury in mice. Oncotarget. 2017;8(6):9035-9052.
- Oakes SA, Papa FR. The role of endoplasmic reticulum stress in human pathology. Annu Rev Pathol. 2015;10:173-194.
- Abrignani MG, et al. Gastroprotection in patients on antiplatelet and/or anticoagulant therapy: a position paper of the National Association of Hospital Cardiologists (ANMCO) and the Italian Association of Hospital Gastroenterologists and Endoscopists (AIGO). Eur J Intern Med. 2021;85:1-13.
- Takahashi K, et al. Influence of antiplatelet drugs on gastric ulcer healing after endoscopic submucosal dissection in patients with early gastric cancer. DEN Open. 2025;5(1).
- Wu H, et al. Role of MKP-5-p38/MAPK pathway in clopidogrel-induced gastric mucosal epithelial cells apoptosis and tight junction dysfunction. Am J Transl Res. 2020;12(5):1741-1753.
- Fu X, et al. Protective effect of teprenone on gastric mucosal injury induced by dual antiplatelet therapy in rats. Am J Transl Res. 2021;13(4):2702-2709.
- Oyadomari S, Mori M. Roles of CHOP/GADD153 in endoplasmic reticulum stress. Cell Death Differ. 2004;11(4):381-389.
- Sears TK, Angelastro JM. The transcription factor ATF5: role in cellular differentiation, stress responses, and cancer. Oncotarget. 2017;8(48):84595-84609.
- Zhang Y, et al. Puerarin attenuates neurological deficits via Bcl-2/Bax/cleaved caspase-3 and Sirt3/SOD2 apoptotic pathways in subarachnoid hemorrhage mice. Biomed Pharmacother. 2019;109:726-733.
- Manas A, et al. Immunohistochemical detection of the pro-apoptotic BaxΔ2 protein in human tissues. Histochem Cell Biol. 2020;154(1):41-53.
Réimpressions et autorisations
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