Profilage des fibres élastiques dans les tissus pulmonaires à l’aide d’analyses d’imagerie quantitative

Résumé

Ici, nous présentons un protocole détaillant la préparation des tissus pour la visualisation des fibres élastiques et le profilage quantitatif dans le tissu pulmonaire murin. Cette méthode permet une évaluation robuste de l’architecture tissulaire, de l’organisation spatiale des fibres et du remodelage de la matrice extracellulaire dans des conditions physiologiques et pathologiques.

Résumé

Le remodelage de la matrice extracellulaire pulmonaire (ECM) est une caractéristique clé des lésions et maladies pulmonaires. Les fibres élastiques sont un composant central de la MEE pulmonaire, fournissant la résilience et le recul nécessaires à une fonction respiratoire normale, et leur perturbation contribue à une altération de la mécanique tissulaire. Ce protocole décrit un flux de travail robuste et reproductible pour la préparation et l’analyse du tissu pulmonaire murin, avec un accent sur la visualisation et le profilage quantitatif des fibres élastiques. Il décrit des méthodes optimisées de traitement tissulaire et de coloration histologique pour préserver et détecter les structures d’élastine. De plus, le protocole détaille une chaîne d’analyse d’images permettant une évaluation quantitative de l’abondance, de l’organisation et de la répartition spatiale des fibres élastiques au sein du poumon. Le flux de travail intègre également l’estimation du vecteur de coloration dans QuPath, la déconvolution des couleurs dans Fiji/ImageJ, et l’analyse d’images basée sur TWOMBLI afin de permettre une évaluation quantitative de l’abondance des fibres élastiques, des branchements et de la complexité du réseau. Des stratégies d’acquisition d’images, de sélection des régions d’intérêt, d’optimisation des paramètres et de contrôle qualité sont incluses afin d’assurer la reproductibilité et de minimiser les biais dépendants de l’utilisateur. Grâce à ce flux de travail, nous avons identifié avec succès des altérations dans l’organisation des fibres élastiques et l’architecture du réseau dans les poumons de souris obèses, démontrant son application pour détecter le remodelage de la ME associée à la maladie. Ensemble, ces approches fournissent un cadre complet pour étudier le remodelage des fibres élastiques et sa contribution à l’architecture tissulaire dans les conditions physiologiques et pathologiques. Cette méthode facilite l’étude des changements structurels causés par les fibroblastes et soutient les connaissances mécanistes sur les altérations de la ME sous-jacentes aux maladies pulmonaires.

Introduction

Les fibres élastiques sont des composants essentiels de la matrice extracellulaire pulmonaire (MEC), composée principalement d’élastine et de protéines microfibrillaires associées qui s’assemblent en réseaux hautement organisés^{et résilients.} Dans le poumon, les fibres élastiques sont disposées le long des cloisons septuaires alvéolaires et des structures péribronchiales, où elles fournissent l’élasticité et le recul nécessaires à la mécanique respiratoire^{normale 1,2}. En tant que l’un des composants structurels ECM les plus abondants dans les tissus tels que le poumon, l’aorte et l’utérus, son intégrité est essentielle pour maintenir la compliance^{tissulaire 1,2}. Une perturbation de l’organisation des fibres élastiques a été observée dans diverses maladies pulmonaires, notamment la fibrose, l’emphysème et les affections inflammatoires chroniques, où une architecture altérée des fibres contribue à une altération de la fonction pulmonaire et des propriétés^{mécaniques 2,3}.

Le matrisome pulmonaire a été récemment caractérisé, révélant des protéines centrales de la MCE telles que les collagènes et les laminines, ainsi que des composants associés au matrisome tels que les cytokines, les régulateurs de la MCE et les protéines affiliées à la MCE (par exemple, les ligands d’intégrine, les galectines)^4,5. Au-delà du soutien structurel, ces composants régulent activement la fonction tissulaire et forment des niches spécialisées qui soutiennent les cellules résidentes et^{migratrices 6,7}. Notamment, des études récentes ont mis en lumière que des conditions métaboliques telles que l’obésité sont associées à des altérations significatives de l’organisation des fibres élastiques, liant la dysrégulation métabolique systémique à des modifications de l’architecture de la MEC pulmonaire et de la fonction^{des fibroblastes 3}. Ces résultats soulignent l’importance de comprendre le remodelage des fibres élastiques comme un processus dynamique et pertinent pour la maladie.

L’évaluation conventionnelle des fibres élastiques repose souvent sur une évaluation histologique qualitative, des systèmes de notation semi-quantitatifs ou des mesures de l’abondance d’élastine, qui fournissent des informations limitées concernant l’organisation des fibres, la connectivité et la complexité^{du réseau 8,9}. Bien que ces approches soient utiles pour détecter des altérations grossières de la teneur en élastine, elles ne permettent pas de saisir les changements architecturaux subtils associés au remodelage tissulaire. Les analyses quantitatives basées sur l’image ont le potentiel de surmonter ces limites en permettant une caractérisation objective et reproductible des réseaux de fibres élastiques et en facilitant des comparaisons entre conditions expérimentales et études. Pour y remédier, le protocole décrit ici permet une analyse intégrée de l’organisation de la MEC pulmonaire avec un accent particulier sur l’architecture des fibres élastiques. En plus des approches établies pour la caractérisation de la^{MCE 4,5}, ce flux de travail intègre la coloration Elastica et un pipeline d’analyse^{de 10} images basé sur TWOMBLI, optimisé pour l’architecture des tissus pulmonaires. En combinant la coloration Elastica avec l’analyse quantitative des réseaux, ce flux de travail dépasse l’évaluation histologique conventionnelle et permet une caractérisation détaillée de l’abondance des fibres, de la fragmentation, de l’organisation spatiale et de la complexité structurelle. Le protocole est particulièrement adapté aux études portant sur la fibrose, l’emphysème, le remodelage pulmonaire associé à l’obésité, les maladies pulmonaires inflammatoires, le vieillissement et d’autres affections caractérisées par le remodelage extracellulaire de la matrice pulmonaire.

Protocole

Toutes les expériences sur la souris décrites ici ont été réalisées conformément à l’approbation du Comité d’éthique animale de l’État de Rhénanie-du-Nord-Westphalie, Allemagne (AZ : 81-02.04.2021.A221).

REMARQUE : Portez un équipement de protection individuelle approprié (blouse de laboratoire, gants, protection oculaire) tout au long de la procédure.

1. Prélèvement et préparation du tissu pulmonaire murin

REMARQUE : Les souris ont été euthanasiées par overdose d’isoflurane selon les directives institutionnelles et gouvernementales avant la collecte des tissus.

1. Ouvrez délicatement la cavité thoracique avec une incision médiane, puis coupez le diaphragme le long de son attache, et exposez délicatement les poumons.
2. Retirez tout le poumon en excisant ensemble les lobes droit et gauche, en veillant à garder tous les lobes intacts.
3. Placez les lobes pulmonaires individuellement dans un tube de 5 mL contenant 2 mL de formol tamponné neutre à 10 % et incubez pendant 15 à 20 heures à 4 °C.
   REMARQUE : La fixation préserve l’architecture tissulaire pour les analyses histologiques et élastiques ultérieures. Comme l’objectif principal de ce flux de travail était la visualisation et l’évaluation quantitative de l’organisation des fibres élastiques plutôt que des analyses morphométriques alvéolaires, les poumons n’étaient pas fixés par l’inflation avant le traitement des tissus.
   ATTENTION : Le formol neutre tamponné contient du formaldéhyde, qui est toxique, cancérigène et peut provoquer des irritations de la peau, des yeux et des voies respiratoires. Manipulez du formol dans une hotte chimique certifiée tout en portant un équipement de protection individuelle approprié, y compris des gants, une blouse de laboratoire et des lunettes de sécurité.
4. Insérez le tissu pulmonaire fixe dans la paraffine selon le protocole d’immersion histologique^{standard 11}.
   REMARQUE : Assurez-vous d’une déshydratation complète et d’une infiltration de paraffine afin de maintenir la morphologie tissulaire en vue d’une coloration ultérieure. Pour minimiser la variabilité entre les échantillons et garantir la compatibilité entre les conditions expérimentales, utilisez toujours les mêmes lobes pulmonaires pour chaque analyse. Il est recommandé d’utiliser le lobe gauche pour l’histologie.
5. Découpez le tissu pulmonaire FFPE en sections de 5 à 7 μm d’épaisseur à l’aide d’un microtome et montez-les sur des lames en verre standard. Faites cuire les lames à 60 °C pendant 1 h avant de procéder aux applications en aval. Les lames peuvent être stockées à RT dans un environnement sans poussière pendant plusieurs semaines ou à 4 °C pour un stockage à long terme.
   REMARQUE : Évitez l’exposition à l’humidité pendant le stockage, car l’humidité peut provoquer l’oxydation de la paraffine et compromettre la qualité des taches. Conservez les lames dans une boîte plastique scellée avec un dessiccant si un stockage à long terme est nécessaire.
   Point de pause : Conserver les lames à RT ou 4 °C jusqu’à la teinture.

2. Coloration des fibres élastiques

1. Effectuer la coloration Elastica (ressorcine-fuchsin) sur des sections de tissu pulmonaire incrustées en paraffine de 5 à 7 μm afin de visualiser les fibres élastiques dans les structures alvéolaires et vasculaires.
   REMARQUE : Colorez uniquement autant de lames que possible en même temps afin d’assurer une intensité de coloration et une reproductibilité constantes entre les échantillons.
   1. Le déparaffinate immerge les lames dans le xylène (isomères mixtes) deux fois pendant 5 minutes chacune.
      ATTENTION : Le xylène est toxique et inflammable. Manipulez une hotte chimique et portez un équipement de protection approprié.
   2. Réhydratez les lames en série descendante d’éthanol jusqu’à 80 % d’éthanol.
      1. Incubez la lame pendant 3 minutes à la répression dans une chambre de coloration remplie à 100 % d’éthanol.
      2. Transférez la lame dans de l’éthanol frais à 100 % et incubez 3 minutes à la rétention réinitiale.
      3. Transférez la lame à 95 % d’éthanol et incubez pendant 3 minutes à la rétention thérapeutique.
      4. Transférez la lame à 80 % d’éthanol et incubez pendant 3 minutes en RT.
   3. Transférez la lame dans une nouvelle chambre de coloration contenant une solution de Resorcine-Fuchsine et incubez pendant 20 à 30 minutes à la RT.
      REMARQUE : La solution de coloration à la ressorcine-fuchsine peut être utilisée plusieurs fois et est stable en RT.
      ATTENTION : La solution colorante Resorcin-fuchsine contient des produits chimiques potentiellement dangereux, notamment des acides concentrés et des colorants, qui peuvent provoquer des irritations de la peau et des yeux. Manipulez la solution dans un espace bien ventilé ou une hotte à fumée et portez un équipement de protection individuelle approprié conformément aux consignes de sécurité institutionnelles.
   4. Placez la lame dans une chambre de coloration sous de l’eau distillée courante et lavez pendant 1 minute.
   5. Différenciez à 95–96 % d’éthanol : 15–60 s, surveillez au microscope.
      REMARQUE : Arrêtez lorsque les fibres élastiques restent d’un violet violet profond et que le fond est suffisamment dégagé. Les fibres élastiques teintées apparaissent d’un violet foncé. Les fibres de collagène restent intactes et paraissent généralement pâles. Une surtache peut augmenter le fond ; Ajustez le temps d’incubation en fonction de l’épaisseur et de la fixation des tissus.
   6. Arrêtez la différenciation en transférant immédiatement la lame dans de l’eau bidistillée et en rinçant pendant 30 secondes. Optionnel : Une contre-coloration peut être réalisée si nécessaire pour une évaluation pulmonaire supplémentaire, mais cela peut réduire l’efficacité de segmentation des fibres. Nous recommandons de réaliser une coloration H&E pour évaluer le poumon sur les coupures adjacentes.
   7. Déshydratez les lames séquentiellement dans de l’éthanol à 95 % pendant 1 à 2 minutes, puis à 100 % d’éthanol deux fois pendant 1 à 2 minutes pour éliminer l’eau résiduelle.
   8. Éliminez les sections en xylène deux fois pendant 3 minutes jusqu’à ce que le tissu paraisse optiquement transparent.
   9. Montez les barbons de couverture avec une résine synthétique permanente compatible xylène et laissez les lamelles sécher à plat à la RT.
      REMARQUE : Une déshydratation complète et un dégagement sont essentiels pour éviter la nébulosité et assurer la préservation à long terme des zones tachées.
      Point de pause : Stockez les lames montées sur des taches à RT jusqu’à l’imagerie.

3. Imagerie des fibres élastiques et analyse de réseau

1. Acquisition d’images
   1. Acquérir des images en champ clair haute résolution des sections de tissu pulmonaire à l’aide d’un scanner de diapositives avec un objectif de 40×. Assurez-vous de réglages cohérents d’exposition et de balance des blancs sur tous les échantillons.
      REMARQUE : Les images ont été acquises en utilisant les mêmes réglages du scanner tout au long de l’étude, y compris le grossissement, la résolution spatiale (0,25 μm/pixel), l’éclairage et l’exposition.
   2. Dessinez une région d’intérêt (ROI) couvrant toute la section du tissu pulmonaire afin d’assurer une couverture complète lors de l’examen.
   3. Définir une zone de référence de fond sans tissu pour mesurer et soustraire l’intensité du fond lors de l’analyse de l’image.
   4. Utilisez la détection automatique de la mise au point du scanner pour attribuer un nombre optimal de points focaux sur le tissu, garantissant une netteté et une qualité d’image uniformes.
   5. Acquérez l’image en utilisant un éclairage et des réglages d’exposition uniformes.
      REMARQUE : Si la mise au point automatique échoue dans les régions denses ou inégales, utilisez un réglage manuel de mise au point fine pour s’assurer que toutes les structures tissulaires, y compris les zones alvéolaires et vasculaires, sont bien capturées.
2. Déconvolution d’image : estimation du vecteur de coloration dans QuPath¹². Les vecteurs de coloration représentent les valeurs spécifiques d’absorbance RVB de chaque colorant histologique, permettant la séparation des colorations qui se chevauchent lors de la déconvolution des couleurs.
   REMARQUE : Dans ce protocole, les vecteurs de coloration étaient définis dans QuPath, car les vecteurs de coloration prédéfinis pour la ressorcine-fuchsine ne sont pas disponibles aux Fidji.
   1. Ouvrez l’image dans QuPath et sélectionnez le type d’image en champ clair.
      REMARQUE : Pour minimiser les biais, calculez les vecteurs de coloration à l’aide d’images représentatives du jeu de données et appliquez les mêmes valeurs à toutes les images.
   2. Dessinez une région d’intérêt (ROI) contenant principalement des fibres élastiques pour définir la première composante de coloration.
   3. Dans l’onglet Image, naviguez jusqu’aux sections vecteurs de coloration.
   4. Cliquez sur la teinte 1, puis définissez le vecteur de coloration à partir du ROI pour définir le vecteur couleur des fibres élastiques (généralement violet-violet).
   5. Sélectionnez un ROI contenant un tissu non élastique (par exemple, fond ou collagène) et cliquez sur la teinture 2, puis définissez le vecteur de coloration à partir du ROI pour définir la composante de couleur secondaire.
   6. QuPath calcule automatiquement la Teinte 3, correspondant à l’arrière-plan.
   7. Un exemple de vecteurs calculés et appliqués aux Fidji : Resorcin-Fuchsin R : 0,6201225, G : 0,6541292, B : 0,43308553 ; Signal non spécifique R :0.31585205 ; G : 0,815618 ; B : 0,48477295 ; Contexte : R :-0,105005614, G :-0,4780256, B :0,87204665.
      REMARQUE : Ces valeurs ont été colorées uniquement pour des images colorées uniquement par la ressorcine-fuchsin. Si une contre-coloration est présente, de nouveaux vecteurs de coloration doivent être calculés.
   8. Sauvegardez ces éléments comme vecteurs de teinture personnalisés et appliquez-les pour une déconvolution des couleurs cohérente sur tous les échantillons.
      REMARQUE : Définir des vecteurs de coloration personnalisés à partir de régions représentatives améliore la précision de la déconvolution des couleurs, en particulier pour la coloration ressorcine-fuchsine, où les teintes d’élastine et de fond peuvent varier selon les lots.
3. Déconvolution des couleurs d’image dans^{Fiji 13,14}.
   1. Ouvrez Fiji (ImageJ) et chargez l’image en champ clair de la section de tissu coloré.
   2. Optionnel : Transformer l’image en format RVB (Type → → Couleur RVB) uniquement si l’image n’est pas déjà en RVB (par exemple, des images 8 bits). Cette étape ouvre une nouvelle fenêtre d’image ; Sauvegardez-les pour préserver les données brutes originales.
   3. Effectuez la déconvolution des couleurs en sélectionnant Image > Color > Color Deconvolution > User Values.
   4. Voici le vecteur de coloration personnalisé précédemment obtenu depuis QuPath.
   5. Exécutez le plugin pour générer trois images en niveaux de gris distinctes correspondant aux fibres élastiques, aux tissus excluant les fibres élastiques, et au fond.
   6. Utilisez directement les images pour TWOMBLI sans prétraitement supplémentaire. TWOMBLI nécessite des images nettes avec une résolution suffisante ; le lissage (par exemple, le flou gaussien) doit être évité afin de préserver les détails structurels.
      REMARQUE : Assurez-vous que les régions sélectionnées dans QuPath pour l’estimation vectorielle sont représentatives de la coloration typique, car ces vecteurs personnalisés seront appliqués uniformément sur toutes les images pour une comparaison cohérente.
   7. Sauvegardez le canal de fibre élastique comme fichier TIFF pour la quantification et l’analyse en aval.
4. Sélection du ROI pour l’analyse de la fibre
   1. Pour chaque section pulmonaire, sélectionnez cinq ROI carrés non biaisés dans la région alvéolaire et cinq ROI dans la région péribronchiolaire (100 μm x 100 μm chacun).
   2. Dupliquez chaque ROI sur l’image brute (image > duplique) pour préserver les données originales.
   3. Dupliquez les mêmes ROI sur l’analyse des fibres élastiques décomposées.
   4. Sauvegardez tous les ROI dupliqués sous forme de fichiers TIFF individuels pour une analyse en aval.
      REMARQUE : Les régions contenant des plis tissulaires, des artefacts de coupe, des déchirures, de grands vaisseaux sanguins ou une architecture alvéolaire mal conservée ont été exclues de l’analyse. Seuls les ROI de fibres élastiques déconvoluées étaient utilisés comme entrée pour l’analyse TWOMBLI, tandis que les doublons bruts correspondants étaient conservés comme fichiers de référence pour le contrôle qualité et l’inspection visuelle. Les régions d’intérêt (ROI) doivent être sélectionnées par échantillonnage aléatoire systématique afin d’assurer une représentation impartiale du tissu. Pour minimiser davantage le biais de l’opérateur, un script automatisé de sélection de ROI compatible avec QuPath est fourni dans le Fichier Supplémentaire 1 et le Fichier Supplémentaire 2, et son implémentation est décrite à la Section 3.5.
5. Application de la sélection automatisée du ROI dans QuPath à l’aide d’un script automatisé de sélection du ROI.
   1. Ouvrez l’image dans QuPath et définissez le type d’image sur Brightfield.
   2. Dans le menu Outils , sélectionnez l’outil d’annotation souhaité pour créer les premières annotations. Des annotations carrées sont recommandées.
   3. Dessinez des annotations carrées dans le tissu pulmonaire. Chaque annotation ne doit englober qu’une seule région d’intérêt (ROI) pour l’analyse, soit une région alvéolaire, soit une zone péribronchiale.
   4. Une fois les annotations créées, allez dans Annotations et sélectionnez Annotations verrouillées pour éviter tout mouvement ou modification accidentelle.
   5. Ajoutez les classes « alvéoles » et « zone péribronchiale » à la liste des classes en cliquant sur le bouton « + » à côté de liste des classes dans le panneau d’annotage.
   6. Attribuez chaque annotation à la classe appropriée. Sélectionnez une annotation, choisissez la classe correspondante, puis cliquez sur Séparer sélectionné. La couleur de l’annotation changera, et la classe assignée (« alvéoles » ou « zone péribronchiale ») sera affichée dans le panneau des propriétés d’annotage.
   7. Ouvre le script correspondant et exécute-le. Une fois terminé, un message indiquera que le ROI a été généré avec succès. Les ROI nouvellement créés apparaîtront dans la hiérarchie des annotations sous forme d’annotations enfants de l’annotation définissant la classe originale.
   8. Pour exporter les ROI, sélectionnez-les et naviguez dans Fichier → Exporter les images → les Pixels originaux. Enregistrez les ROI exportés sous forme de fichiers TIFF.
      REMARQUE : Les ordonnances sont conçues pour ne reconnaître que les noms de classes « alvéoles » et « zone péribronchiale ». Ces noms doivent être saisis exactement comme spécifié. Par défaut, les scripts génèrent aléatoirement cinq ROI carrés non chevauchants, mesurant 100 μm × 100 μm au sein de chaque annotation. Les ROI des candidats ne sont acceptés que si leurs coins et leur centre sont entièrement intégrés dans les limites des annotagions, assurant ainsi une inclusion complète dans la région sélectionnée. Le nombre et les dimensions des ROI peuvent être modifiés dans le script pour répondre à des besoins expérimentaux spécifiques. Au moins trois répliques biologiques et un minimum de cinq ROI/échantillon sont recommandés pour les analyses.
6. Analyse de TWOMBLI
   1. Sauvegardez toutes les images de ROI des fibres élastiques dans un dossier dédié pour analyse.
   2. Créez deux sous-dossiers dans le répertoire de travail : a. Folder de masques – pour les masques binaires générés par TWOMBLI. b. Dossier HDM – pour les images à matrice de haute densité (HDM) générées par TWOMBLI.
   3. Exécutez le plugin TWOMBLI : Open Fiji et lancez TWOMBLI (Plugins -> Macros -> Run).
   4. Sélectionnez le fichier de paramètres d’analyse approprié. Les paramètres TWOMBLI suivants ont été utilisés pour l’analyse des fibres élastiques, listés dans le tableau 1.
      REMARQUE : Ces paramètres peuvent varier selon l’intensité de coloration. Les paramètres ont été optimisés empiriquement à partir de multiples images représentatives provenant de sections de tissu pulmonaire colorées dans des conditions standardisées. L’optimisation a été réalisée en comparant les masques générés avec le motif de coloration original et en sélectionnant les réglages offrant le meilleur chevauchement entre le masque segmenté et le réseau élastique sous-jacent. Une fois établis, les mêmes paramètres étaient appliqués à toutes les images du jeu de données.
   5. Choisissez l’option « fibres foncées sur fond clair ».
   6. Générez et enregistrez des masques binaires dans le dossier Masque.
   7. Générez et enregistrez des images binaires dans le dossier HDM.
   8. Extraire des paramètres quantitatifs du réseau tels que la longueur de la fibre, les points de branchement, la courbure, la densité et l’alignement.
      REMARQUE : L’analyse TWOMBLI nécessite des images nettes et haute résolution (>1 pixel/μm). Une mauvaise déconvolution des couleurs, des zones floues ou une compression d’image peuvent compromettre la précision de la quantification du réseau fibre.
7. Quantification et analyse statistique
   1. Exportez les paramètres réseau TWOMBLI sous forme de fichier CSV.
   2. Importez les données CSV brutes dans GraphPad Prism pour une analyse statistique et une visualisation.
      REMARQUE : Le paramètre suivant est recommandé : Masquer la longueur totale, qui reflète la quantité totale de fibres élastiques dans le ROI, permettant de quantifier l’abondance et la perte de fibres. Les extrémités de la fibre indiquent le degré de fragmentation de la fibre ; un nombre accru de points d’extrémité suggère des fibres perturbées ou cassées. Les Points de Ramification de la fibre mesurent l’interconnexion des fibres, reflétant la complexité structurelle et l’intégrité du réseau ECM. Un nombre plus élevé de points de branchement indique un réseau plus complexe et imbriqué. La lacunarité quantifie l’homogénéité de la distribution des fibres à travers le ROI. Une faible lacunarité indique un réseau uniforme avec des lacunarités de taille similaire, tandis qu’une lacunarité élevée reflète un réseau hétérogène avec des tailles variables décrivant une structure plus complexe. Le comptage de boîtes-Dimension fractale capture la complexité de l’architecture fibre. Des valeurs plus élevées de dimension fractale indiquent des réseaux plus complexes et détaillés, tandis que des valeurs plus basses reflètent des structures plus simples ou perturbées.
   3. Générez des graphiques colonnes montrant la moyenne ± SEM pour chaque paramètre du réseau quantifié (par exemple, longueur de fibre, branchement, courbure et densité).
   4. Normalité des données de test en utilisant le test de Shapiro-Wilk. Pour les données paramétriques, appliquez un test t de Student non apparié à deux queues. Pour les données non paramétriques, appliquez un test Mann-Whitney U. Pour les comparaisons impliquant plus de deux groupes expérimentaux, une analyse unidirectionnelle de la variance (ANOVA) suivie d’un test de comparaison multiple post-hoc approprié, ou un test de Kruskal–Wallis pour les données non paramétriques, doit être appliquée.
      REMARQUE : Conservez tous les fichiers CSV bruts intacts afin d’assurer la reproductibilité et la traçabilité des données. Indiquez dans les légendes des figures, le nombre de ROI et de répliques biologiques analysés pour chaque condition dans les figures.

Résultats

Ce protocole fournit des paramètres quantitatifs du réseau de fibres élastiques à travers différentes régions pulmonaires et conditions expérimentales. L’analyse TWOMBLI, comme décrite précédemment, fournit des paramètres tels que la longueur de la fibre, la densité de branchement, la lacunarité et la dimension fractale pour l’évaluation de la matrice^{extracellulaire 10}. S’appuyant sur ce cadre, notre approche permet une caractérisation complète de l’organisation des fibres élastiques, permettant d’évaluer les changements d’abondance des fibres, de connectivité, d’uniformité et de complexité structurelle tant dans les tissus pulmonaires physiologiques que pathologiques.

Dans les tissus pulmonaires sains, les fibres élastiques forment de longs réseaux continus, bien alignés le long des septa alvéolaires et des structures péribronchiales. En revanche, les poumons pathologiques ou métaboliquement modifiés, comme ceux des souris obèses, présentent souvent une branchement accrue et une complexité de réseau accrue, reflétant des altérations de l’organisation des fibres^{élastiques 3}. Les résultats représentatifs, y compris les masques binaires et les paramètres quantitatifs, sont représentés à la Figure 1A, B. Ces résultats peuvent être intégrés avec des analyses histologiques et moléculaires pour évaluer l’intégrité de la MCE et l’ampleur du^{remodelage 3}. La lacunarité et le remplissage des espaces sont illustrés dans les tissus pulmonaires sains afin de visualiser les différences dans l’organisation de la ME (Figure 1C). Combinés à d’autres métriques quantitatives, ces paramètres capturent la complexité du réseau et révèlent des changements dans l’architecture tissulaire provoqués par la réorganisation de la MCE, fournissant des éclairages sur des schémas distincts de remodelage structurel au sein du réseau à fibres élastiques.

L’interprétation précise de ces résultats quantitatifs dépend de manière critique d’une acquisition et d’un traitement d’image de haute qualité. Des conditions d’imagerie ou de traitement sous-optimales, incluant une mauvaise mise au point, un éclairage incohérent ou une estimation imprécise du vecteur de coloration, peuvent entraîner des masques fragmentés ou bruyants et, par conséquent, des résultats quantitatifs peu fiables (Figure 1D). Par conséquent, une inspection visuelle attentive des images brutes et des résultats de segmentation est essentielle pour garantir la qualité des données avant l’interprétation. Les masques sous-optimaux peuvent généralement être reconnus par une fragmentation excessive des fibres continues, une segmentation discontinue ou incomplète, l’incorporation de bruit de fond sous forme de structures fibreuses, ou un mauvais chevauchement entre le motif de coloration original et le masque généré, indiquant que l’acquisition d’image, l’estimation du vecteur de coloration ou les paramètres de segmentation doivent être réévalués. Pour illustrer ces caractéristiques, des sections avec contre-coloration ont été intentionnellement analysées, ce qui interfère avec l’identification des fibres élastiques et entraîne une segmentation sous-optimale. Un exemple de masque de cette qualité de faible qualité est montré à la Figure 1E. Pour évaluer davantage la robustesse et la reproductibilité du flux de travail, des ensembles de données d’images ont été analysés indépendamment par deux chercheurs en utilisant les mêmes paramètres d’analyse optimisés (Figure 2A). De plus, des échantillons dérivés d’animaux indépendants ont été inclus pour évaluer la variabilité biologique (Figure 2B). Des résultats quantitatifs comparables ont été obtenus entre opérateurs et réplicés biologiques, soutenant la reproductibilité et l’indépendance de l’utilisateur du pipeline d’analyse d’images proposé. Ensemble, ces analyses démontrent que le flux de travail permet une évaluation robuste de l’organisation des fibres élastiques et facilite la comparaison entre les conditions physiologiques et pathologiques.

Figure 1. Flux de travail d’analyse de coloration Elastica. (A) Image brute représentative, signal de fibre élastique isolée obtenu par déconvolution d’image, masque binaire généré avec TWOMBLI, et superposition des fibres élastiques originales avec le masque correspondant, démontrant une segmentation précise. (B) Paramètres quantitatifs représentatifs générés par l’analyse de TWOMBLI. (C) Exemples d’analyses de lacunarité et de remplissage de lacunaires dans des tissus pulmonaires murins sains pour illustrer les différences dans l’organisation de la matrice extracellulaire. (D) Illustration de masques fragmentés et bruyants résultant d’une acquisition ou d’un traitement d’image sous-optimal. (E) Coupe tissulaire contre-colorée à l’hématoxyline et à l’éoine, démontrant une identification élastique altérée et une génération de masques sous-optimale. Les zones présentant une mauvaise correspondance entre le motif de coloration original et le masque généré sont indiquées. Barre d’échelle A, D = 100 μm, E = 50 μm. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 2. Reproductibilité et robustesse du flux de travail d’analyse des fibres élastiques. (A) Les ensembles de données d’images ont été analysés indépendamment par deux chercheurs en utilisant les paramètres d’analyse TWOMBLI pour évaluer la reproductibilité entre opérateurs. Des métriques quantitatives dérivées de TWOMBLI sont présentées. A et B indiquent les deux opérateurs indépendants. (B) Des échantillons dérivés d’animaux indépendants ont été analysés pour évaluer la variabilité biologique. Des métriques quantitatives dérivées de TWOMBLI sont présentées, démontrant des résultats comparables entre réplications biologiques et soutenant la robustesse de la chaîne d’analyses. M1, M2 et M3 indiquent des animaux individuels en bonne santé. n = 3, L’analyse statistique a été réalisée à l’aide d’ANOVA unidirectionnelle suivie du test de comparaison multiple de Dunnett. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figurine.

Paramètres	Valeurs
Saturation du contraste	0.75
Largeur minimale de ligne	5
Largeur maximale de ligne	10
Fenêtre de courbure minimale	20
Fenêtre de courbure maximale	80
Longueur minimale des branches	10
Affichage Maximun HDM	175
Diamètre minimal de l’écart	0

Tableau 1 : Résumé des paramètres quantitatifs dérivés de TWOMBLI. Aperçu des paramètres générés par TWOMBLI et de leur interprétation pour l’évaluation de l’architecture des fibres élastiques dans le tissu pulmonaire. Les indicateurs incluent des mesures d’abondance de fibres, de ramification, d’alignement, de connectivité et d’organisation du réseau.

Fichier supplémentaire 1 : Alvéoles ROI impartiales Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.

Fichier supplémentaire 2 : ROI imparcial de la zone péribronchique Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.

Discussion

Ce protocole offre un flux de travail robuste et reproductible pour étudier l’architecture de la matrice extracellulaire pulmonaire (ECM) murine, avec un accent particulier sur le remodelage des fibres élastiques entraînées par les fibroblastes. Les fibres élastiques sont essentielles pour maintenir la complaisance pulmonaire et le recul, et leur perturbation est une caractéristique de multiples maladies pulmonaires, notamment la fibrose, les lésions pulmonaires, le vieillissement et les troubles^{métaboliques 2}. Malgré leur rôle fonctionnel central, l’évaluation quantitative de l’organisation et de l’assemblage des fibres élastiques est restée limitée. Le flux de travail comble cette lacune en permettant une caractérisation systématique et quantitative de l’architecture des réseaux à fibres élastiques.

Une force majeure de cette méthode réside dans l’intégration d’un flux de travail d’imagerie quantitative avec l’analyse histologique structurale. Bien que les approches conventionnelles évaluent souvent séparément la composition ou les caractéristiques histologiques de la MEC, ce protocole permet une quantification objective de l’organisation élastique des fibres, incluant la longueur des fibres, les branches et la complexité du réseau. Cela permet une comparaison directe entre les affections physiologiques et pathologiques et fournit des éclairages sur le remodelage de la ME médiée par les^{fibroblastes 3}.

Cependant, plusieurs aspects techniques sont essentiels pour garantir la cohérence expérimentale et la qualité des données. La coloration resorcine-fuchsine est sensible à des variables telles que le temps de fixation, l’épaisseur de la section et la consistance des réactifs, rendant la standardisation essentielle à la reproductibilité. Les résultats quantitatifs de TWOMBLI dépendent de la qualité de l’image, de la résolution et d’une sélection cohérente de la région d’intérêt, et doivent donc être interprétés parallèlement à une évaluation histologique et validés sur plusieurs échantillons. De plus, la densité et la morphologie des fibres diffèrent entre les régions alvéolaires et péribronches, nécessitant une optimisation spécifique à chaque région. Cette approche capture l’organisation globale du réseau de fibres élastiques en deux dimensions et ne résout pas les caractéristiques ultrastructurales, qui nécessitent des techniques de résolution plus élevée telles que la microscopie électronique. Les modalités d’imagerie tridimensionnelle, y compris la microscopie confocale ou multiphotonique, peuvent encore améliorer l’analyse de la géométrie et de la connectivité des fibres.

Plusieurs étapes du flux de travail sont particulièrement cruciales pour garantir des résultats fiables et reproductibles. La fixation des tissus, la qualité de la coupe et la coloration constante entre la resorcine et la fuchsine influencent considérablement la visualisation des fibres élastiques et doivent donc être soigneusement standardisées.  Une faible intensité de coloration, une coloration inégale ou un fond élevé peuvent résulter d’une qualité variable des réactifs, de conditions de coloration incohérentes ou d’une préservation inadéquate des tissus. De plus, l’inclusion de tissus pulmonaires sains et malades, de contrôles techniques de coloration et d’échantillons de référence traités entre lots expérimentaux est recommandée afin de surveiller la cohérence des colorations et la robustesse analytique. Les tissus riches en fibres élastiques peuvent également servir de contrôles positifs pour valider les procédures d’acquisition et de segmentation d’images. Une estimation précise du vecteur de coloration lors de la déconvolution de l’image est une autre étape essentielle, car une sélection vectorielle inappropriée peut entraîner une extraction incomplète de fibres et des masques fragmentés. Selon la question expérimentale, le flux de travail peut être modifié en ajustant la taille et le nombre de ROI, en adaptant les paramètres de traitement d’image ou en intégrant des approches d’imagerie tridimensionnelle pour approfondir l’organisation des fibres élastiques.

Dans l’ensemble, cette méthode représente une plateforme polyvalente pour étudier le remodelage de la MCE dans des contextes physiologiques et pathologiques. Comme l’intégrité des fibres élastiques est directement liée à la compliance pulmonaire et à la fonction mécanique, cette approche est particulièrement importante pour comprendre comment les changements structurels dans la MEE se traduisent par des altérations de la fonction pulmonaire. Il est particulièrement adapté à l’étude des changements structurels causés par les fibroblastes et offre de nouvelles opportunités pour mieux comprendre le remodelage de la ME et sa contribution à la progression de la maladie et à la fonction tissulaire. L’approche peut également être étendue à d’autres tissus, notamment les tissus cardiovasculaires, la peau, l’utérus, les troubles du tissu conjonctif, les organes fibrotiques et les échantillons humains, ou combinée à des techniques avancées d’imagerie spatiale et haute résolution afin d’en élargir davantage l’applicabilité.

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Axio CS2 Slide Scanner	Carl Zeiss
Coplin Glass Staining jar	Sigma-Aldrich	S6016
DPX Mountant	Sigma-Aldrich	6522
Ethanol (100%) for histology	Carl Roth	9065.4
Fiji		https://imagej.net/software/fiji/	version 1.54t
Formalin solution, neutral buffered 10%	Sigma	HT501128
HISTOSETTE I Tissue Processing/Embedding Cassettes	Sigma-Aldrich	H0542
microtome	Thermo Fischer Scietific	HM355S
Micrsocope Slides	VWR	631-0108
Mouse: C57BL/6J	The Jackson Laboratory	RRID: IMSR_JAX:000664	Strain #:000664
paraffin embedding system	Epredia HistoStar embedding module
Prism		https://www.graphpad.com	version 11
Qupath		https://qupath.github.io	version 0.7.0
Resorcin-Fuchsin	Waldeck	2.00E-30
TWOMBLI plugin		https://github.com/wershofe/TWOMBLI
Xylene	Applichem GmBH	14020172