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Article de méthode

Transplantation intracérébrale néonatale pour le remplacement de la microglie et l’analyse de la lignée in vivo

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DOI :

10.3791/72119

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28 juillet 2026

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1Department of Human Genetics, University of Utah School of Medicine, 2Department of Pathology & Laboratory Medicine, Abramson Family Cancer Research Institute, Perelman School of Medicine, University of Pennsylvania

Dans cet article

Résumé

Ce protocole permet une transplantation intracérébrale néonatale efficace de populations définies de microglies, soutenant un engretiam robuste à long terme et une analyse de la lignée de la microglie ainsi que l’intégration in vivo à travers plusieurs sources de donneurs et modèles de receveurs.

Résumé

Le remplacement de la microglie par transplantation de cellules myéloïdes s’est imposé comme une approche expérimentale prometteuse pour étudier les processus neurologiques et les maladies. Cependant, les stratégies de transplantation existantes sont souvent limitées par une inefficacité de l’engrafte, une dépendance au conditionnement basé sur l’irradiation ou une flexibilité restreinte entre les systèmes donneur et receveur. Ici, nous décrivons un protocole de transplantation intracérébrale néonatale pour introduire des populations de microglies purifiées (microglies Hoxb8 et non Hoxb8 ) dans le cerveau de la souris en développement. Cette méthode permet un engretiam et une intégration efficaces des cellules donneuses dans le parenchyme cérébral dans des conditions physiologiquement permissives. Il est important de noter que le protocole est compatible avec plusieurs sources de donneurs, y compris les progéniteurs hématopoïétiques embryonnaires et les microglies cérébrales dérivées du cerveau postnatal, et peut être appliqué à différents modèles de receveurs présentant une microglie endogène réduite ou absente, y compris des souris conditionnellement déficientes en Csf1r et des souris Csf1rΔFIRE . Les cellules donneuses sont purifiées par tri cellulaire activé par fluorescence et délivrées bilatéralement dans le cerveau de souris néonatales à l’aide de micropipettes en verre pour un accouchement efficace et peu invasif. Les souris receveuses sont vieillies pour permettre aux cellules donneuses de s’étendre et de peupler la niche de la microglie, et les résultats sont évalués par analyse histologique de la distribution des cellules donneuses et de l’expression des marqueurs. Cette approche offre une plateforme robuste et évolutive pour étudier l’ontogenèse de la microglie et l’intégration in vivo à travers divers contextes expérimentaux.

Introduction

Le remplacement de la microglie par transplantation de cellules myéloïdes s’est imposé comme une stratégie puissante pour sonder la biologie de la microglie et comme un paradigme thérapeutique potentiel pour les maladies neurologiques. Au cours des dernières années, le domaine a évolué vers des stratégies capables de remplacer largement la microglie dans le système nerveuxcentral 1. Des études récentes ont démontré que les macrophages et progéniteurs dérivés du donneur peuvent greffer le cerveau, adopter des programmes transcriptionnels similaires à ceux des microglies et, dans certains cas, améliorer les phénotypes associésà la maladie 2,3,4,5,6,7,8. Ces résultats soutiennent l’idée que le remplacement des macrophages cérébraux peut être utilisé pour étudier et potentiellement modifier les processus neurologiques de la maladie.

Un défi central dans la transplantation de microglie est d’obtenir un engraftement robuste tout en minimisant les confondus expérimentaux. De nombreuses stratégies de remplacement établies reposent sur l’irradiation, la chimiothérapie ou les paradigmes d’appauvrissement de la microglie pour générer une nicheengreftable 6,9,10,11,12,13. Malgré leur efficacité, ces approches peuvent induire la sénescence de la microglie, perturber la barrière hémato-encéphalique et modifier la signalisation inflammatoire, ce qui peut compliquer l’interprétation du comportement des cellulesdonneuses 9,14. Des travaux plus récents ont commencé à explorer des approches indépendantes du conditionnement ou à toxicité réduite pour le remplacement de lamicroglie 5,8,15.

Le moment du développement est un facteur important pour le succès de la transplantation. Le cerveau néonatal offre un environnement permissif qui favorise l’expansion des cellules donneuses et l’intégration à long terme, probablement en raison de la réduction des barrières structurelles et de l’établissement continu de la niche endogène de la microglie. Des études récentes de transplantation utilisant un accouchement postnatal précoce (P0–P5) démontrent un engressement parenchymateux robuste et l’acquisition d’une identité similaire à celle des microglies, renforçant l’importance du contexte développemental pour un remplacement efficace 7,8,16,17.

La microglie Hoxb8 fournit un système particulièrement informatif pour étudier les contributions spécifiques à la biologie de la microglie selon la lignée. Ces cellules proviennent de progéniteurs hématopoïétiques embryonnaires et représentent un sous-ensemble défini de la microglie parenchymatoreuse, avec des conséquences comportementales lorsqu’elles sontdysfonctionnelles 17,18,19,20,21. Des travaux récents utilisant des progéniteurs primaires Hoxb8 ainsi que des systèmes progéniteurs des microglies et des récepteurs des œstrogènes (ER)-Hoxb8 démontrent que ces cellules peuvent être développées, génétiquement manipulées et greffées avec succès dans le cerveau, où elles adoptent des profils transcriptionnels similaires à ceux des microglies et des caractéristiques fonctionnelles 7,8,17. Ces avancées mettent en lumière l’utilité des approches de transplantation pour disséquer la lignée et l’hétérogénéité de la microglie.

Ici, nous décrivons une plateforme de transplantation intracérébrale néonatale optimisée pour la polyvalence entre les systèmes donneurs et receveurs. Contrairement aux approches reposant sur l’irradiation ou le conditionnement systémique, cette méthode utilise une livraison intracérébrale bilatérale directe chez des souris nouveau-nées, permettant le placement de cellules donneuses dans un environnement cérébral permissif au développement tout en minimisant les perturbations systémiques. La technique est compatible avec plusieurs sources de donneurs, y compris les progéniteurs hématopoïétiques embryonnaires et les microglies cérébrales dérivées du cerveau postnatal, et peut être appliquée sur des modèles distincts de receveurs présentant des microglies endogènes réduites ou absentes. Un avantage pratique majeur est que le crâne néonatal fin permet une injection manuelle rapide avec des micropipettes en verre, éliminant ainsi le besoin de forage ou de fixation stéréotaxique tout en obtenant une large implantation parenchymateuse.

Ensemble, cette approche fournit un système robuste, flexible et évolutif pour étudier l’ontogenèse de la microglie, l’hétérogénéité et l’intégration in vivo à travers divers contextes expérimentaux. Cela positionne la transplantation intracérébrale néonatale comme une alternative complémentaire et expérimentalement contrôlée aux stratégies de remplacement systémique de la microglie.

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Protocole

Toutes les méthodes et expériences de cette étude ont été réalisées sur des souris. Les procédures expérimentales ont été approuvées par le Comité de soins et d’utilisation des animaux institutionnels (IACUC) de l’Université de l’Utah, Public Health Service Assurance #D16-00018 (A3031-01).

1. Préparation des couples reproducteurs pour les portées donneuses et recevrices

  1. Placez les couples reproducteurs dans la même cage le soir pour initier les accouplements chronométrés.
  2. Inspectez chaque matin les femelles pour détecter la présence d’un plug vaginal afin de confirmer la réussite de l’accouplement.
  3. Retirez les femelles bouchées des mâles et hébergez-les individuellement jusqu’à la mise à part, qui prend environ 18 à 20 jours.
  4. Manipulez doucement les mères enceintes pendant 5 minutes par jour pendant 7 à 10 jours avant la naissance pour réduire le stress lié à la manipulation néonatale.
  5. Exposez les mères à un coton-tige contenant une odeur de bétadine lors des séances quotidiennes de manipulation afin de réduire le stress maternel lorsque les chiots sont ramenés après l’opération.
  6. Préparez des cages propres avec du matériel de nidification pour les femelles enceintes avant l’accouchement prévu.

2. Prélèvement et traitement des cerveaux néonatals

  1. Euthanasiez les souris donneuses néonatales (P0–P4) par surdose d’isoflurane à l’aide d’un clochet en pot ou d’une chambre fermée similaire équipée d’un faux plancher pour éviter le contact direct avec l’anesthésie.
  2. Une fois la respiration cessée et l’absence de réflexes confirmée, décapitez immédiatement.
  3. Prélève tout le cerveau, y compris le cervelet et les bulbes olfactifs. Placez les cerveaux dans 3 mL de solution de sel équilibrée 1× Hanks (HBSS) froide dans une boîte de Petri en plastique sur glace.
  4. À l’aide de scalpels et de pinces stériles, réduisez le cerveau en morceaux d’environ 1 à 2mm 3 .
  5. Transférez le tissu cérébral haché (1 tube de dissociation cérébral par tissu) dans des tubes de dissociation tissulaire contenant des réactifs digestifs enzymatiques fournis par le système de dissociation des tissus neuraux selon le protocole recommandé par le fabricant.
  6. Placez les tubes dans un dispositif de dissociation mécanique capable de chauffer et incubez à 37 °C pendant 30 minutes selon le programme de dissociation des tissus neuronaux recommandé par le fabricant.
  7. Pré-tremper des filtres à cellules de 70 μm avec 400 μL de 1× HBSS.
  8. Faites passer le tissu dissocié à travers les passoires pré-trempées placées sur un tube conique de 50 mL sur de la glace.
  9. Lavez les tubes avec 10 mL de 1× HBSS et passez à travers les filtres pour assurer une récupération maximale des cellules.
  10. Éliminez les filtres et centrifugez les cellules à 300 × g pendant 10 minutes à température ambiante. Aspirez le surnageant.
  11. Resuspendez les cellules dans 1 mL de tampon de lyse des globules rouges dans de l’eau ultrapure stérile par échantillon et incubez pendant 10 minutes à 4 °C.
  12. Éteindre la réaction de lyse avec 10 mL de 1× HBSS/1 % de BSA/5 % de FBS.
  13. Éliminez les filtres et faites tourner les cellules à 300 × g pendant 10 minutes à 4 °C. Aspirez le surnageant.
  14. Déterminez le nombre de cellules à l’aide d’un hémocytomètre. La plage typique de rendement des cellules est de 3,2 à 4,0 × 106 avant le tri.
  15. Resuspendre les cellules en 5 % de FBS dans 1× HBSS à la concentration souhaitée pour la coloration en aval des anticorps.

3. Coloration des anticorps cellulaires pour le tri FACS des populations de microglie

  1. Resuspendre les cellules dans 1 mL de tampon de coloration (5 % FBS dans le 1× HBSS) contenant un anticorps bloqueur du récepteur Fc (CD16/32 purifié, 1:2000) et incuber les cellules pendant 10 minutes à 4 °C.
  2. Centrifugez les cellules à 240 × g pendant 3 minutes à 4 °C. Aspirez le surnageant.
  3. Incuber les cellules avec des anticorps conjugués fluorescentement (CD45 APC, 1:160 ; CD11b Alex Fluor 700, 1:160) dans 1 mL de tampon de coloration pendant 30 minutes sur glace dans le noir.
  4. Centrifugez les cellules à 240 × g pendant 3 minutes à 4 °C. Aspirez le surnageant.
  5. Ajouter un colorant de viabilité (par exemple, 3 μM DAPI en 1× HBSS) pour exclure les cellules mortes.
  6. Effectuer le tri FACS à l’aide d’un trieur de cellules haute vitesse équipé de lasers appropriés pour la détection DAPI, GFP, tdTomato, CD45-APC et CD11b-Alexa Fluor 700.
  7. Utilisez une buse de 100 μm avec une faible pression de gaine lorsque possible pour maximiser la viabilité de la cellule. Gardez les tubes de collecte d’échantillons et les cellules triées sur la glace tout au long de la procédure.
  8. Utilisez des cellules non colorées, des contrôles de compensation couleur unique et des contrôles fluorescent moins un lorsque nécessaire pour régler les tensions, la compensation et les grilles.
  9. Premièrement, les cellules de grille par aire de diffusion avant versus zone de dispersion latérale pour exclure les débris.
  10. Les singlets de porte utilisent la hauteur de diffusion latérale versus la largeur de diffusion latérale.
  11. Excluez les cellules mortes en faisant un contrôle sur les cellules DAPI⁻.
  12. Des pource-maillots en direct, porte sur CD45basse CD11b⁺ microglie.
  13. Dans la microgliebasse CD45 CD11b⁺, utiliser GFP et fluorescence tdTomato pour séparer les populations microgliales des donneurs (microglies Hoxb8 : DAPI⁻ CD45bas CD11b⁺ tdTomato⁺ GFP⁺, microglies non-Hoxb8 : DAPI⁻ CD45bas CD11b⁺ tdTomato⁻ GFP⁺).
  14. Triez chaque population dans des tubes stériles contenant du HBSS froid 1x.
  15. Après le tri, réanalysez une petite aliquote de cellules triées pour confirmer la pureté et la viabilité avant la transplantation.
  16. Collectez les cellules triées en HBSS stériles 1× et maintenez-les sur la glace dans le noir jusqu’à la transplantation.
    REMARQUE : Les rendements typiques pour la microglie Hoxb8 varient de 3,70 à 4,60 x10 cellules et pour la microglie non-Hoxb8 de 1,10 à 1,14 x 10cellules 5 par cerveau néonatal (P0–P4), bien que les rendements puissent varier selon l’âge, le génotype et l’efficacité du traitement des tissus. Transplantez les cellules vivantes purifiées dès que possible, idéalement dans les 60 minutes suivant le tri des cellules.

4. Prélèvement et traitement des progéniteurs hématopoïétiques du foie fœtal

  1. Euthanasiez les mères enceintes en utilisant de l’isoflurane à 5 % délivré en oxygène via un vaporisateur de précision jusqu’à ce que la respiration cesse et que l’absence de réflexes soit confirmée.
  2. Après un surdosage d’isoflurane, effectuer une méthode physique secondaire par luxation cervicale afin d’assurer la mort, conformément aux directives institutionnelles de soins et d’utilisation animale.
  3. Retirez les cornes utérines des souris enceintes et placez-les dans des boîtes froides de 3 mL de 1× HBSS dans des boîtes de Petri en plastique (60 mm × 15 mm).
  4. Disséquez les embryons E12,5 de l’utérus et placez-les dans des boîtes de Petri en plastique froid 3 mL de 1× HBSS.
  5. Disséquez le foie fœtal à l’aide de pinces fines et placez-les dans 3 mL frais de HBSS froid 1× contenant 5 % de FBS dans des boîtes de Petri.
  6. Dissociez mécaniquement le tissu hépatique fœtal regroupé à l’aide d’une aiguille de 26 G et d’une seringue de 3 mL.
  7. Centrifugez les cellules à 240 × g pendant 5 minutes à 4 °C. Aspirez le surnageant.
  8. Laver les cellules avec 1× HBSS.
  9. Faites passer la suspension à cellules à travers un filtre de 80 μm.
  10. Incuber les cellules dans 20 μL de tampon de lyse des globules rouges (0,15 M chlorure d’ammonium, 1 mM de KHCO3) pendant 5 minutes, puis ajouter 13 mL de 1× HBSS pour la trempe.
  11. Poursuivre l’incubation pendant 5 minutes pour lyser les globules rouges.
  12. Faites tourner les cellules à 200 × g pendant 5 minutes à 4 °C.

5. Coloration par anticorps cellulaires pour le tri FACS des cellules progénitrices hématopoïétiques

  1. Incuber les cellules hépatiques fœtales avec des anticorps conjugués fluorescentement (Ter119 PerCP-Cy5.5, 1:50 ; Kit PE-Cy7, 1:100) en 5 % FBS/1 % BSA en 1× HBSS pendant 30 minutes sur glace dans le noir.
  2. Lavez les cellules avec 1× HBSS et centrifugez à 240 × g pendant 5 minutes à 4 °C.
  3. Ajouter un colorant de viabilité (par exemple, 3 μM DAPI en 1× HBSS) pour exclure les cellules mortes.
  4. Effectuer le tri FACS à l’aide d’un trieur de cellules à haute vitesse équipé de lasers et filtres appropriés pour la détection DAPI, Ter119 PerCP-Cy5.5, Kit PE-Cy7, tdTomato et GFP.
  5. Utilisez une buse de 100 μm avec une faible pression de gaine lorsque possible pour maximiser la viabilité de la cellule. Gardez les tubes de collecte d’échantillons et les cellules triées sur la glace tout au long de la procédure.
  6. Utilisez des cellules non colorées, des contrôles de compensation couleur unique et des contrôles fluorescent moins un lorsque nécessaire pour régler les tensions, la compensation et les grilles.
  7. Première cellule de grille utilisant la zone de diffusion avant versus la zone de dispersion latérale pour exclure les débris.
  8. Les singlets de porte utilisent la hauteur de diffusion avant versus la largeur de diffusion avant, suivie de la hauteur de diffusion latérale versus la largeur de diffusion latérale.
  9. Excluez les cellules mortes en faisant un contrôle sur les cellules DAPI⁻.
  10. Des singlets vivants, excluez les cellules de la lignée érythroïde en faisant un passage par porte sur les cellules Ter119⁻.
  11. Au sein de la population Ter119⁻, la porte sur les cellules hématopoïétiquesprogénitrices de Kit est élevée .
  12. Au sein de lapopulation élevée DAPI⁻ Ter119⁻ Kit, isolez les progéniteurs positifs à la lignée Hoxb8 en faisant un gating sur les cellules tdTomato⁺.
  13. Si la lignée donneuse contient également le rapporteur Cx3cr1-GFP, utilisez la fluorescence GFP pour confirmer que la population de progéniteurs du foie fœtal triée est GFP⁻ ouGFP faible à ce stade, distinguant ainsi les cellules progénitrices des cellules myéloïdes différenciées exprimant Cx3cr1.
  14. Triez la population finale DAPI⁻ Ter119⁻ Kithigh tdTomato⁺ GFP dans des tubes de collecte stériles contenant du froid 1× HBSS.
  15. Après le tri, réanalysez une petite aliquote de cellules triées pour confirmer la pureté et la viabilité avant la transplantation.
  16. Collectez les cellules triées en HBSS stériles 1× et maintenez-les sur la glace dans le noir jusqu’à la transplantation.
    REMARQUE : Les rendements typiques varient d’environ 5,0 à 7,0 × 10 progéniteurs hématopoïétiquesde 4 Hoxb8 par préparation hépatique fœtale E12,5, selon la taille de l’embryon et l’efficacité du tri. Transplantez les cellules vivantes purifiées dès que possible, idéalement dans les 60 minutes suivant le tri.

6. Préparation des aiguilles d’injection

  1. Chargez des capillaires en verre borosilicaté (1,0 mm de diamètre extérieur, 0,58 mm de diamètre intérieur, avec filament) dans un extracteur de micropipette.
  2. Tirez les capillaires à l’aide d’un programme de traction à deux lignes optimisé pour générer de longues aiguilles effilées adaptées à la transplantation intracérébrale néonatale.
    1. Les réglages typiques incluent : Chaleur = 645, Traction = 30, Vitesse = 120, Délai = ÉTEINT et Pression = 200. Optimisez les réglages finaux pour le type de verre spécifique, les conditions environnementales et la calibration du tireur. Ensuite, on taillade les aiguilles obtenues et on les biseau pour obtenir un diamètre final de la pointe extérieure d’environ 30 μm.
  3. Placez les aiguilles tirées sur deux bandes de mastic à l’intérieur d’une grande boîte de Petri en plastique pour protéger les pointes des dommages avant de tailler et de biseauter.
  4. Placez l’aiguille tirée sous un microscope stéréoscopique disséquant à un grossissement d’environ 10× à 20× et soutenez-la avec une attelle souple.
    REMARQUE : Un grossissement plus élevé (20×–40×) peut être utilisé lors de l’inspection des pointes pour vérifier la formation correcte du conique et identifier d’éventuels défauts avant le coupage et le biseautage.
  5. Utilisez une lame de rasoir stérile pour tailler la pointe de l’aiguille afin d’obtenir un diamètre extérieur d’environ 30 μm.
  6. Fixez l’aiguille coupée dans un porte-micromeuleuse.
  7. Ajustez l’angle de biseau à 30°–35°.
  8. Allumez le moulin et l’éclairage.
  9. Laissez l’eau distillée couler sur la meule à un rythme régulier d’environ une goutte toutes les 4 à 5 secondes.
  10. Placez doucement la pointe de l’aiguille en contact avec la pierre à meuler en rotation jusqu’à ce qu’un bord biseauté soit formé.
  11. Mesurez le diamètre extérieur de la pointe biseautée à l’aide d’un appareil de mesure de pointe lorsque disponible.
  12. Sélectionnez des aiguilles d’un diamètre extérieur proche de 30 μm pour la transplantation.
  13. Remplissez l’aiguille avec un tampon stérile et expulsez doucement le liquide pour vérifier que la pointe est ouverte et dégagée.

7. Préparation de l’appareil d’injection

  1. Assemblez une pipette manuelle à commande buccale composée d’un tube flexible, d’un embout buccal, d’un filtre en ligne et d’un support capillaire.
    REMARQUE : Un filtre en ligne est intégré à l’appareil de pipetage contrôlé par la bouche pour éviter toute contamination.
  2. Marquez l’aiguille tous les 2 mm (jusqu’à 2 marques par aiguille). Tous les 2 mm correspondent à ~2 μL.
  3. Insérez l’aiguille d’injection en verre préparée à ~1,5 cm dans le support capillaire et vérifiez que l’ensemble est sécurisé et hermétique.
  4. Appliquez une succion douce à travers l’embout buccal pour vérifier un flux d’air dégagé et une résistance adéquate.
  5. Vérifiez que le système permet un contrôle fluide de l’aspiration et de l’injection avant de charger les cellules donneuses.
  6. Remplissez l’aiguille d’injection en verre avec la suspension à cellules donneuses préparée (4,5 μL au total) à l’aide d’une pointe fine de pipette.
    REMARQUE : Veillez à ce qu’aucune bulle d’air ne reste dans l’aiguille avant de commencer la transplantation. Utilisez une aiguille par souris.

8. Anesthésiation des récepteurs néonatals et préparation du champ chirurgical

  1. Placez la souris néonatale dans l’orientation couchée sur la table chirurgicale et induisez une anesthésie en utilisant de l’isoflurane à 2,0 % à 5,0 % délivré en oxygène via un vaporisateur de précision.
  2. Placez le nez de la souris dans un cône nasal pour maintenir une délivrance continue d’isoflurane et d’oxygène tout au long de la procédure.
  3. Prévoyez environ 1 minute pour l’induction de l’anesthésie tout en surveillant la respiration.
  4. Touchez doucement les membres et confirmez l’absence de réflexe de sevrage pour vérifier une anesthésie adéquate.
  5. Une fois un plan anesthésique approprié atteint, réduire la concentration d’isoflurane à 0,5 % à 2,0 % pour le maintien et poursuivre l’anesthésie jusqu’à 10 minutes pendant la greffe.
  6. Maintenez la souris néonatale à environ 38 °C à l’aide d’un coussin chauffant placé sous la table chirurgicale.
  7. Nettoyez la zone du site d’injection sur la tête en alternant la bétadine et l’éthanol à 70 % avec des cotons-tigeons stériles.
  8. Appliquez une dernière couche de bétadine et laissez la peau sécher avant l’injection.
    ATTENTION : L’isoflurane est un agent anesthésiant dangereux. Utilisez des systèmes de récupération anesthésique appropriés et assurez-vous d’une ventilation adéquate des pièces, conformément aux consignes de sécurité institutionnelles.

9. Réalisation d’une transplantation intracérébrale néonatale

  1. Stabilisez doucement la tête avec des doigts gantés ou un support doux pour minimiser les mouvements lors de l’injection.
    REMARQUE : Les souris receveuses sont transplantées entre P1 et P4.
  2. Identifier les sites d’injection bilatérale dans le télencéphale dorsal antérieur (future région du cortex frontal), environ 1 à 2 mm latéraux à la ligne médiane sagittale et immédiatement caudaux aux bulbes olfactifs. Positionnez les sites d’injection de façon symétrique dans chaque hémisphère tout en évitant les vaisseaux sanguins visibles à la surface.
    REMARQUE : En raison de la mince taille du crâne et de la petite taille des souris néonatales, les injections sont effectuées à l’aide de repères anatomiques visuels plutôt que de coordonnées stéréotaxiques.
  3. Inspectez visuellement le crâne et évitez d’insérer l’aiguille près des vaisseaux sanguins visibles.
  4. Faites avancer la micropipette en verre biseauté doucement à travers la peau et le crâne en développement.
  5. Guidez l’aiguille environ 1 à 2 mm sous la surface du crâne dans l’hémisphère frontal.
  6. Administrez les cellules donneuses en utilisant une pression manuelle contrôlée via l’appareil de pipette à commande buccale.
    REMARQUE : Lors de la greffe de progéniteurs hématopoïétiques purifiés ou de microglies néonatales, injectez 2 à 3 μL par hémisphère, correspondant à environ 2,5 × 10cellules 4 par injection. Cela fournit environ 5 × 104 cellules par cerveau de souris.
  7. Retirez lentement la micropipette du cerveau pour minimiser le reflux des cellules injectées et réduire les lésions tissulaires.
  8. Effectuer une injection controlatérale.
    REMARQUE : Utilisez une aiguille par souris pour éviter la contamination croisée entre souris.

10. Récupération de nouveau-nés transplantés

  1. Placez chaque chiot sur un coussin chauffant immédiatement après l’intervention.
  2. Surveillez les chiots jusqu’à ce que la couleur corporelle normale, les mouvements spontanés et l’activité globale reviennent.
    REMARQUE : Le temps de récupération varie de 5 à 10 minutes.
  3. Ramenez les chiots au barrage.
  4. Frottez soigneusement chaque chiot avec la literie de la cage et le matériau de nidification.
  5. Remettez les chiots dans la cage avec la mère.
  6. Confirmez que la mère récupère et accepte les petits revenus.

11. Surveillance de la santé postopératoire

  1. Observez les chiots chaque jour pendant 10 minutes pendant les 3 premiers jours suivant la transplantation.
  2. Évaluez les chiots pour leur activité normale, leur comportement de tétete et leurs interactions avec la mère.
    REMARQUE : Ne dérangez pas les cages à souris pendant cette période. Cela peut augmenter la pression sur le barrage.
  3. Continuez à surveiller les chiots un jour sur deux jusqu’au sevrage après la période initiale de 3 jours.
  4. Évaluer le développement normal, le comportement alimentaire, le niveau d’activité et les soins maternels des chiots.
  5. Mesurez et enregistrez le poids corporel quotidiennement pendant la période postopératoire précoce.
  6. Évaluez les chiots pour détecter des signes de détresse, une posture anormale, de la léthargie ou une alimentation altérée.
  7. Effectuer une euthanasie humaine lorsque cela est nécessaire selon les directives institutionnelles de soins aux animaux.
    1. Pour les souris nouveau-nées, euthanasiez par surdose d’isoflurane à l’aide d’un clochet en bocal ou d’une chambre fermée similaire équipée d’un faux plancher pour éviter le contact direct avec l’anesthésie. Une fois la respiration cessée et l’absence de réflexes confirmée, décapitez immédiatement.
    2. Pour les souris adultes, l’euthanasie avec de l’isoflurane à 5 % délivré en oxygène via un vaporisateur de précision jusqu’à ce que la respiration cesse et que l’absence de réflexes soit confirmée, suivie d’une luxation cervicale comme méthode physique secondaire pour assurer la mort.
      REMARQUE : Les animaux présentant une mortalité postopératoire ou l’absence d’engraftement détectable de cellules donneuses au point de départ expérimental ont été exclus de l’analyse. L’analgésie postopératoire n’a pas été administrée car la transplantation intracérébrale néonatale était considérée comme minimalement invasive.

12. Collecte des tissus cérébraux pour la cryosection et la coloration par immunofluorescence

  1. Retirez soigneusement le cerveau et préparez-le pour une analyse en sections congelées.
  2. Traiter le tissu cérébral postnatal pour la cryosection et découper les sections coronales à l’aide d’un cryostat selon les procédures décrites précédemment.
    REMARQUE : Pour chaque souris, 9 à 12 sections coronales couvrant le cortex somatosensoriel sont analysées.
  3. Montez des sections sur des lames de microscope et conservez-les à -20 °C jusqu’à ce qu’elles soient teintées.
  4. Incubez brièvement des sections dans un tampon de perméabilisation contenant 0,2 % de Triton X-100 et 1 % de désoxycholate de sodium.
  5. Préparez les anticorps primaires (anti-GFP poulet, 1:500 ; Anticorps anti-td de la tomate pour cochon d’Inde, 1:250 ; lapin anti-Iba1 ; 1:500) dilué dans un tampon de dilution d’anticorps approprié.
  6. Incubez des sections de tissu avec des anticorps primaires toute la nuit à 4 °C.
  7. Lavez les sections avec du sérum physiologique tamponné phosphate pour éliminer les anticorps primaires non liés.
  8. Incuber des sections avec des anticorps secondaires conjugués au fluorophore (anti-lapin de chèvre Alexa Fluor 647, 1:500 ; anti-cochon d’Inde de chèvre Alexa Fluor 555, 1:500 ; anti-poulet de chèvre Alexa Fluor 488, 1:500) pendant 2 heures à température ambiante dans le noir.
  9. Contre-coloration avec DAPI pour visualiser les noyaux cellulaires.
  10. Montez les sections avec un support antifade et appliquez un cache-verre-vâtre.

13. Acquisition d’images par microscopie confocale

  1. Acquérir des images de fluorescence à l’aide d’un microscope confocal équipé d’objectifs de 10× ou 20 ×.
  2. Acquérir des images à 512 × 512 ou 1024 × 1024 pixels en utilisant des vitesses de balayage de 200 à 400 Hz.
  3. Collectez des sections optiques avec des intervalles de pas z de 2 à 5 μm à travers le tissu.

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Résultats

La transplantation intracérébrale néonatale de populations de microglies purifiées entraîne une survie à long terme et une implantation généralisée de cellules issues du donneur dans le parenchyme cérébral du receveur. Les populations de microglies de donneurs purifiées ont été isolées par tri cellulaire activé par fluorescence à l’aide de rapporteurs de lignées fluorescentes (Hoxb8 microglies : tdTomato⁺ GFP⁺ ; microglies non-Hoxb8 : tdTomato⁻ GFP⁺) avant la transplant...

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Discussion

La transplantation intracérébrale néonatale de progéniteurs microgliales purifiés ou de sous-populations microgliales définies offre une approche robuste pour reconstruire le compartiment microglial in vivo et examiner les propriétés spécifiques à la lignée des macrophages cérébraux. Cette méthode permet la reconstitution sélective à l’aide de cellules donneuses définies génétiquement, permettant une évaluation directe de l’engressement et de la maturation des cellules donneuses...

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Déclarations de divulgation

Les auteurs ne déclarent aucun intérêt financier concurrent.

Remerciements

Ce travail a été soutenu par les National Institutes of Health (R01 MH093595) (M.R.C.), la Dauten Family Foundation et le centre de cytométrie en flux de l’Université de l’Utah. Des souris Csf1rΔFIRE ont été générées par le Dr Ben Xu à l’Université de l’Utah.

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
Bell jarVariousN/AUtilisé pour l'euthanasie
Capillaires en verre borosilicaté avec
filament		Sutter InstrumentBF100-78-15Utilisé pour les aiguilles d'injection
Albumine sérique bovine (BSA)Sigma AldrichA8806Utilisé pour préparer le tampon PB. Diverses marques sont disponibles. Celui répertorié ici n'est qu'un exemple.
CD11b Alexa Fluor 700BioLegend101222Cellules myéloïdes
CD45 APCBioLegend103112Cellules hématopoïétiques
Filtres cellulaires (70 µm)Falcon352350Utilisé pour générer des suspensions de
cellules uniques. Diverses marques sont disponibles. Celui répertorié ici n'est qu'un exemple.
Anticorps anti-GFP de pouletAves LabsGFP-1020Coloration immunofluorescence
Anticorps c-Kit PE-Cy7BioLegend105814Progeniture hématopoïétique
Microscope confocalLeicaTCS SP5Utilisé pour l'imagerie par
fluorescence
Tubes coniques (15 mL/ 50 mL)Eppendorfhttps://www.eppendorf.com/us-en/Products/Lab-Consumables/Lab-Tubes/Eppendorf-Tubes-BioBased-p-PF-4440301Traitement des tissus/cellules. Diverses marques sont disponibles. Celui répertorié ici n'est qu'un exemple.
Machine cryostateLeicahttps://www.leicabiosystems.com/en-de/histology-equipment/cryostats/Génère des sections de tissus
congelés. Diverses marques sont disponibles. Celui répertorié ici n'est qu'un exemple.
Coloration nucléaire DAPIThermo Fisher ScientificD1306Utilisé pour la viabilité et
la coloration nucléaire
Microscope de dissectionLeicahttps://www.leica-microsystems.com/products/light-microscopes/stereo-microscopes/Utilisé pour tailler et préparer les
aiguilles d'injection. Diverses marques sont disponibles. Celui répertorié ici n'est qu'un exemple.
Trieur de cytométrie en flux FACSAriaBD BioscienceFACSAria Purification des cellules
Fc block (CD16/32 purifié)Biolegend101302Bloque la liaison d'anticorps indésirables aux cellules de souris exprimant des récepteurs Fc
Sérum bovin foetal (FBS)ThermoFisher Scientifichttps://www.thermofisher.com/in/en/home/life-science/cell-culture/mammalian-cell-culture/fbs.htmlUtilisé dans les tampons de
préparation cellulaire. Diverses marques sont disponibles. Celui répertorié ici n'est qu'un exemple.
Tuyaux flexibles pour pipette buccaleVariousN/AComposant de l'appareil d'injection
manuel
Logiciel d'analyse de cytométrie en fluxFlowJov10.8.1Utilisé pour l'analyse de données FACS
Trieur de cellules de cytométrie en fluxBD BiosciencesFACSAriaUtilisé pour la purification des cellules
Dissociateur Octo avec
chauffage gentleMACS		Miltenyi Biotec130-096-427Utilisé pour la dissociation des tissus
cérébraux
Anticorps secondaire Alexa Fluor 488
anti-poulet de chèvre		Thermo Fisher ScientificA-11039Anticorps secondaire
Anticorps secondaire Alexa Fluor
555 anti-cochon d'Inde de chèvre		Thermo Fisher ScientificA-21428Anticorps secondaire
Anticorps secondaire Alexa Fluor 647
anti-lapin de chèvre		Thermo Fisher ScientificA-21245Anticorps secondaire
Anticorps secondaire Alexa Fluor 647
anti-rat de chèvre		Thermo Fisher ScientificA-48265Anticorps secondaire
Anticorps anti-tdTomato de cochon d'IndeFrontier InstituteAB_2631185Coloration immunofluorescence
Solution de sels équilibrée de Hanks
(HBSS)		Gibco14175-079Utilisé pendant la
préparation cellulaire
HémocytomètreVariousN/AComptage des cellules
Filtre en ligne pour pipette buccaleVariousN/AEmpêche la contamination
MicrogrinderNarishigeEG-400Utilisé pour biseauter les aiguilles d'injection
en verre
Tireur de micropipetteSutter InstrumentP-1000Utilisé pour générer des aiguilles d'injection
fines
Embout buccal de pipetteVariousN/AUtilisé pour le contrôle manuel de
l'injection
Kit de dissociation des tissus nerveux (P)Miltenyi Biotec130-092-628Utilisé pour la dissociation enzymatique des tissus cérébraux
Petites boîtes de PétriThermo Fisher Scientifichttps://www.thermofisher.com/search/browse/category/us/en/90111022Utilisé pour stocker les aiguilles tirées ou la récolte de tissus. Diverses marques sont disponibles. Celui répertorié ici n'est qu'un exemple.
Anticorps anti-Iba1 de lapinWako019-19741Marqueur de microglie
Anticorps anti-TMEM119 de lapinAbcam209064Marqueur spécifique à la microglie
Anticorps anti-CD206 de ratBioLegend141712Utilisé pour identifier les populations de macrophages
Anticorps anti-P2RY12 de ratBioLegend848002Marqueur de microglie
Lames de rasoir/scalpelsVariousN/AUtilisé pour tailler les extrémités des aiguilles ou
la récolte de tissus
Tampon de lysat de globules rougesChemCruzsc-296258Utilisé pour l'élimination des globules
rouges
Appareil stéréotaxiqueKopf Instrumentshttps://kopfinstruments.com/Utilisé pour l'implantation
chirurgicale. Diverses marques sont disponibles. Celui répertorié ici n'est qu'un exemple.
Anticorps Ter119 PerCP-Cy5.5BioLegend116228Cellules de la lignée érythroïde

Références

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