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Article de méthode

Protocole d'isolement de l'ARN de tardigrades multi-espèces

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DOI :

10.3791/72120

⸱

1 septembre 2026

 ,  , 
1Biology Department, The University of North Carolina Asheville, 2Department of Biological Sciences, Florida International University, 3Biology Department, The University of North Carolina at Chapel Hill

Dans cet article

Résumé

Ce protocole décrit les procédures d'isolement d'ARN à partir de diverses espèces de tardigrades en utilisant un kit d'isolement d'ARN basé sur des colonnes, conçu pour isoler l'ARN à partir de faibles quantités de tissu et produire des quantités suffisantes d'ARN de haute qualité pour des applications en aval telles que le séquençage de l'ARN et la synthèse d'ADN complémentaire.

Résumé

Les tardigrades sont des animaux microscopiques connus pour leur tolérance exceptionnelle au stress environnemental. Ces animaux peuvent survivre à la dessiccation, à des pressions extrêmes, à de basses températures et à des niveaux élevés de rayonnement ionisant. Toutefois, les mécanismes moléculaires à la base de ces capacités d'extrémotolérance restent incomplètement compris. Les approches moléculaires utilisées pour étudier ces mécanismes, notamment le séquençage de l'ARN, l'interférence par ARN (ARNi) et l'expression hétérologue de gènes de tardigrades dans des systèmes tels que les bactéries, nécessitent l'isolement d'ARN messager (ARNm) de qualité élevée à partir de matériel biologique limité. Dans cette étude, nous décrivons un protocole reproductible d'isolement d'ARN total à partir de tardigrades qui est (1) efficace sur plusieurs espèces, y compris une espèce d'hétérotardigrade, (2) nécessite seulement 25 à 200 animaux, selon la taille du corps, et (3) fournit un ARN de quantité et de qualité suffisantes pour des applications en aval. Le protocole actuel permet une récupération efficace d'ARN à partir d'un nombre raisonnable de tardigrades et soutient les investigations moléculaires de la tolérance au stress chez diverses espèces de tardigrades.

Introduction

Les tardigrades sont bien connus pour leur capacité à survivre à des stress extrêmes auxquels d'autres animaux ne résisteraient pas, notamment la dessiccation, des pressions extrêmes, des températures extrêmes, et des agents endommageant l'ADN tels que les médicaments chimiothérapeutiques et les radiations ionisantes1,2,3,4,5,6,7,8. Ces dernières années, les scientifiques ont étudié les mécanismes à la base de la résilience extrême des tardigrades en utilisant des approches moléculaires telles que le séquençage de l'ARN, l'interférence par ARN (ARNi) et l'expression hétérologue de gènes de tardigrades dans d'autres systèmes, y compris les cellules humaines et les bactéries8,9,10,11,12,13,14,15,16,17,18,19,20. Appliquées, ces approches se sont révélées des outils puissants pour comprendre précisément comment les tardigrades parviennent à résister à de tels stress extrêmes8,9,10,11,12,13,14,15,16,17,18,19,20,21,22. Cependant, toutes ces approches moléculaires visant à comprendre la tolérance au stress chez les tardigrades dépendent de la capacité à isoler de l'ARN à partir de ces minuscules animaux en quantité suffisante et de qualité adéquate pour être utilisée dans des procédés en aval.

Une méthode antérieure d'isolement d'ARN à partir de tardigrades s'est révélée efficace pour les chercheurs travaillant avec Hypsibius exemplaris23. Toutefois, lors de tentatives de reproduction de ce protocole avec H. exemplaris, nous avons constaté qu'il produisait des concentrations et qualités d'ARN irrégulières (données non publiées). Une méthode alternative d'isolement d'ARN basée sur le phénol s'est révélée fonctionnelle pour H. exemplaris, Ramazzottius varieornatus et une espèce d'hétérotardigrade13,21,22,24,25,26. Ce protocole permet d'obtenir de l'ARN de qualité et de quantité suffisantes pour des applications ultérieures, à partir d'un seul animal ou de groupes d'animaux (~50). Toutefois, ce protocole exige que l'utilisateur manipule des réactifs contenant du phénol. Le phénol est une substance chimique dangereuse nécessitant une manipulation prudente, et une exécution incorrecte de ce protocole peut entraîner une contamination résiduelle par le phénol, nuisible à la pureté de l'ARN et aux applications en aval. Un autre protocole publié précédemment pour l'isolement d'ARN à partir de tardigrades met l'accent sur la capacité d'isoler l'ARN à partir d'un seul animal27. Bien que ce protocole soit utile pour des applications telles que la PCR quantitative (qPCR)27, il est moins adapté à des applications ultérieures comme le séquençage de l'ARN, où l'objectif est d'obtenir une vision plus globale de la manière dont les animaux réagissent à un facteur de stress ou à une condition donnée.

Ces limites des protocoles disponibles d'isolement d'ARN ont conduit à l'exploration de méthodes alternatives pour isoler l'ARN à partir de tardigrades. Le kit d'isolement d'ARN basé sur des colonnes utilisé dans ce protocole est conçu pour isoler l'ARN à partir de faibles quantités de tissu. Ce kit a déjà été utilisé précédemment pour isoler l'ARN de tissus d'insectes en vue d'une analyse en séquençage de l'ARN en aval, ce qui suggère qu'il pourrait être adapté à l'isolement d'autres petits animaux porteurs d'une cuticule, comme les tardigrades28. Cette étude décrit étape par étape l'utilisation de ce kit d'isolement d'ARN basé sur des colonnes avec les tardigrades, en incluant des explications sur les précautions spécifiques à prendre lors de l'exécution de ce protocole avec ces organismes. Cet article rapporte la réussite de ce protocole chez six espèces de tardigrades (H. exemplaris, Milnesium sp., Paramacrobiotus experimentalis, Paramacrobiotus fairbanksi, Paramacrobiotus gadabouti et l'hétérotardigrade Viridiscus celatus). L'étude a validé que de l'ARN de qualité et de quantité suffisantes peut être obtenu à partir d'au moins 25 individus. Des exemples de données de concentration et de qualité de l'ARN obtenu sont également fournis, et sont adaptés à des applications en aval telles que le séquençage de l'ARN (avec un biais minimal et une amplification exponentielle de la bibliothèque) et la synthèse d'ADN complémentaire (ADNc). Ce protocole d'isolement d'ARN s'est déjà révélé utile pour découvrir les mécanismes de tolérance aux radiations chez H. exemplaris8. La réussite de ce protocole sur diverses espèces de tardigrades suggère qu'il pourrait être appliqué plus largement à l'étude des mécanismes de tolérance au stress, des mécanismes de développement et des processus évolutifs.

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Protocole

Le protocole suivant ne nécessite pas l'approbation éthique institutionnelle pour l'utilisation d'animaux, car les animaux invertébrés sont exemptés de cette exigence. Les réactifs et l'équipement utilisés sont listés dans le Tableau des matériaux.

1. Préparation du matériel et de la zone pour l'isolement de l'ARN

  1. Activer un bloc chauffant ou un bain d'eau à 42 °C en prévision de l'extraction d'ARN.
  2. Préparer une rack pour microtubes, des pipettes (2 µL, 20 µL, 200 µL et 1000 µL) et des embouts filtrants de taille appropriée.
  3. Nettoyer la surface de travail, la rack, les pipettes et les boîtes d'embouts avec RNase Away, une solution de javel diluée (10 %) ou de l'éthanol à 70 % afin de dénaturer toute RNase résiduelle.
    REMARQUE : Une contamination excessive par les RNases sur le matériel ou dans la zone d'isolement de l'ARN peut entraîner une qualité insuffisante de l'ARN après l'isolement, en raison de sa dégradation. Réduire ce risque en laissant suffisamment de temps aux produits dénaturants les RNases pour agir, et en attendant que la zone et le matériel soient complètement secs avant de poursuivre.
  4. Porter des gants pendant toutes les étapes de ce protocole et les traiter fréquemment avec une solution dénaturante les RNases tout au long du protocole afin d'éviter la dégradation de l'ARN par les RNases.

2. Collecte d'animaux pour l'isolement d'ARN

  1. À l’aide d’une poire à pipeter fixée à une chambre d’aspiration équipée d’une capillaire en verre (Figure 1A), d’une boucle d’Irwin ou d’une micropipette, transférez 25 à 200 animaux (selon la taille de l’espèce) depuis leurs boîtes de culture vers une boîte contenant de l’eau de source propre afin de réduire la quantité de matériel non constitué de tardigrades (algues ou autres sources alimentaires telles que des nématodes ou des rotifères, selon l’espèce).
  2. Prélevez un tube de 1,5 mL exempt de RNase et un piston.
  3. À l’aide d’une poire à pipeter fixée à une chambre d’aspiration équipée d’une capillaire en verre ou d’une boucle d’Irwin, transférez les animaux au fond du tube de 1,5 mL exempt de RNase, en prenant soin particulièrement de transférer le moins d’eau possible avec les animaux.
  4. Effectuez une centrifugation à 4 500 g pendant 3 min afin de regrouper les tardigrades au fond du tube microcentrifuge.
  5. Tout en observant le tube contenant les tardigrades sous un microscope stéréoscopique, utilisez une pipette de 20 µL ou une poire à pipeter fixée à une chambre d’aspiration équipée d’une capillaire en verre dont l’ouverture est plus petite que les tardigrades dont vous isolez l’ARN, pour retirer soigneusement le plus d’eau possible sans perturber le culot de tardigrades. Consultez la Figure 1B pour voir une illustration de la quantité acceptable d’eau résiduelle.
    REMARQUE : Veillez à laisser une fine couche d’eau afin que les animaux ne se dessèchent pas durant le court intervalle entre le retrait de l’eau et l’ajout du tampon d’extraction (XB). Si les animaux se dessèchent, cela pourrait entraîner une mauvaise qualité de l’ARN après l’isolement.
  6. Ajoutez 100 µL de tampon d’extraction (XB) dans le tube contenant les tardigrades.

3. Disruption mécanique des tardigrades et extraction de l'ARN

  1. À l’aide du pilon sans RNase, briser les tardigrades en appuyant doucement mais fermement le pilon au fond du tube pendant environ 30 s. Un total de 20 à 30 mouvements de broyage devrait suffire pour lyser les tardigrades.
  2. Retirer le pilon du tube avec précaution, en veillant à ce que le maximum de liquide reste au fond du tube.
  3. Examiner le contenu du tube microcentrifugé au microscope stéréo pour s’assurer qu’aucun animal intact n’est visible.
  4. Incuber le mélange à 42 °C pendant 30 min sur un bloc chauffant agité avec agitation douce (300 tr/min).
    REMARQUE : Le tampon d’extraction (XB) stabilise l’ARN afin d’empêcher sa dégradation à cette température.

4. Conditionnement de la colonne d'isolement de l'ARN

  1. Pendant les 10 dernières minutes de l'incubation d'extraction, montez la colonne destinée à la collecte et à la purification de l'ARN. Placez une colonne de purification dans un tube de collecte et étiquetez-la correctement.
  2. Ajoutez 250 µL de tampon de conditionnement (CB) directement sur la colonne.
  3. Incubez 5 min à température ambiante.
  4. Centrifugez à 16,000 × g pendant 1 min, puis jetez le flux traversant. La colonne est désormais prête à recevoir le surnageant d'ARN de l'étape suivante.
  5. Sortez le tampon de réaction 10x DNase I et l'eau sans nucléase du congélateur afin qu'ils décongèlent complètement en prévision de l'étape 6 ci-dessous.

5. Liaison de l'ARN à la colonne

  1. Après l'incubation d'extraction, centrifuger le tube contenant les tardigrades disruptés mécaniquement et le tampon d'extraction (XB) à 3 000 × g pendant 2 min.
  2. Prendre un nouveau tube sans RNase et l'étiqueter en conséquence.
  3. À l’aide d’une pipette de 200 µL équipée d’une pointe filtrante, prélever soigneusement le surnageant à partir des cuticules de tardigrades en pellet. Veiller à ne pas perturber le pellet de cuticules et à ne prélever que le surnageant.
    NOTE : Le transfert de cuticules dans les étapes suivantes entraînera une efficacité réduite du rendement en ARN sur colonne en raison d’un colmatage physique de la colonne. Pour éviter cette erreur potentielle, il est possible d’observer la pointe de pipette contenant le surnageant au microscope afin de s’assurer de l’absence de cuticules. Si des cuticules sont présentes, remettre le surnageant dans le tube et répéter l’étape de centrifugation.
  4. Transférer le surnageant dans le nouveau tube étiqueté, sans RNase.
  5. Pipeter 100 µL d’éthanol à 70 % dans le tube contenant votre ARN et mélanger soigneusement en aspirant et en rejetant plusieurs fois. À cette étape, on devrait observer des filaments visqueux clairs après l’ajout de l’éthanol. C’est un bon indicateur de la présence d’ARN dans votre surnageant.
  6. Pipeter la totalité du mélange (200 µL) sur la colonne préparée à l’étape 4.
    NOTE : Lors de la pipetage de solutions sur la colonne pour cette étape et les suivantes, veiller à déposer le liquide au centre de la colonne et à ne pas toucher physiquement la colonne avec la pointe de pipette. Une perforation mécanique de la colonne entraînerait des problèmes ultérieurs concernant la qualité et la quantité d’ARN.
  7. Pour lier l’ARN à la colonne, centrifuger pendant 2 min à 100 × g, puis centrifuger à 16 000 × g pendant 30 s afin d’éliminer le flux traversant.

6. Préparation de la solution de DNase I

  1. Laisser complètement décongeler le tampon de réaction 10x de l'ADNase I et l'eau sans nucléase avant de préparer la solution.
  2. Pour chaque isolement d'ARN, préparer une solution de 40 µL dans un tube microcentrifuge de 1,5 mL séparé, composée de 32 µL d'eau sans nucléase, 4 µL de tampon de réaction 10x de l'ADNase I et 4 µL d'enzyme ADNase I. Conserver la solution sur de la glace jusqu'au moment de l'appliquer sur la colonne à l'étape 7.3.

7. Lavage de l'ARN et traitement par l'ADNase I

  1. Introduire 100 µL de tampon de lavage 1 (W1) directement sur la colonne de purification contenant l'ARN lié (provenant de l'étape 5.7).
  2. Centrifuger pendant 1 min à 8 000 × g et éliminer l'écoulement.
  3. Introduire 40 µL de solution d'ADNase I de l'étape 6 directement sur la colonne de purification et incuber à température ambiante pendant 15 min pour éliminer la contamination par l'ADN.
  4. Introduire 40 µL de tampon de lavage 1 (W1) sur la colonne de purification et centrifuger à 8 000 × g pendant 30 s.
  5. Introduire 100 µL de tampon de lavage 2 (W2) sur la colonne de purification et centrifuger à 8 000 × g pendant 1 min.
  6. Introduire à nouveau 100 µL de tampon de lavage 2 (W2) sur la colonne de purification et centrifuger à 16 000 × g pendant 2 min. Jeter l'écoulement.
  7. Centrifuger la colonne à 16 000 × g pendant 1 min afin de sécher la colonne.

8. Élution de l'ARN

  1. Prendre un tube de 0,5 mL (fourni dans le kit) pour chaque isolement d'ARN et le marquer de façon appropriée. Ce tube contiendra l'ARN après l'isolement.
  2. Transférer la colonne avec l'ARN fixé et lavé dans le tube de 0,5 mL marqué. La colonne doit s'emboîter fermement dans ce tube.
  3. En observant le tube de côté, positionner la pointe de pipette directement au-dessus de la membrane de la colonne, expulser 11 µL de tampon d'élution (EB) sur la colonne, puis incuber 1 min à température ambiante.
    REMARQUE : Le fait de ne pas disperser le tampon d'élution (EB) directement sur la colonne entraînera une réduction du rendement en ARN. Si des gouttelettes de liquide sont observées autour du pourtour de la colonne, cela indique une dispersion inadéquate du tampon d'élution (EB) sur la colonne. Dans ce cas, il est recommandé de répéter cette étape avec le flux passant de l'étape 8.5, en veillant à expulser le tampon d'élution (EB) directement au centre de la colonne.
  4. Placer le tube de 0,5 mL contenant la colonne dans le tube de collecte fourni avec le kit afin d'assurer un ajustement correct pendant la centrifugation (Figure 2).
  5. Centrifuger la colonne à 1 000 × g pendant 1 min pour répartir le tampon d'élution (EB), puis centrifuger à 16 000 × g pendant 1 min pour éluer l'ARN.
  6. Placer immédiatement le tube de 0,5 mL contenant l'ARN sur de la glace.

9. Validation de la quantité et de la qualité de l'ARN à l'aide d'un spectrophotomètre à microvolume

REMARQUE : D'autres méthodes peuvent être utilisées pour évaluer la quantité et la qualité de l'ARN. Ici, une méthode utilisant un spectrophotomètre à microvolume est employée. Un fluorimètre ou un outil d'électrophorèse sur gel en microfluidique peut également être utilisé29.

  1. Essuyez le socle du spectrophotomètre à microvolume avec un chiffon sans peluches afin de vous assurer qu’il est exempt d’autres liquides.
  2. Sélectionnez le mode ARN sur le spectrophotomètre pour l’analyse.
  3. Effectuez le blanc sur le spectrophotomètre à l’aide de 1 µL du tampon d’élution (EB) utilisé à l’étape 8.3.
  4. Après le réglage du blanc, essuyez le tampon d’élution (EB) du socle avec un chiffon sans peluches.
  5. En gardant le tube de 0,5 mL contenant l’ARN sur de la glace, pipetez 1 µL d’ARN sur le socle du spectrophotomètre. Abaissez le bras du spectrophotomètre pour mesurer l’absorbance de l’échantillon afin de quantifier et d’évaluer la qualité de l’ARN isolé.
    NOTE : Veuillez consulter la section « Résultats » ci-dessous pour obtenir des détails sur la qualité et la quantité acceptables pour les applications en aval.

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Résultats

Une étape cruciale de ce protocole, comme mentionné ci-dessus, consiste à retirer une quantité appropriée d'eau des tardigrades collectés avant d'ajouter le tampon d'extraction (XB) pour l'extraction de l'ARN. Laisser trop d'eau entraînera une dilution du tampon d'extraction (XB) et une extraction d'ARN médiocre (c'est-à-dire un RIN < 7, un rapport 260/280 < 1,8, un rapport 260/230 < 1,8 et/ou une concentration < 5 ng/µL) à partir des animaux, ce qui se traduira par une concentration et une qualité réduites d...

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Discussion

L'objectif de ce protocole est de faciliter l'isolement d'ARN à partir de tardigrades, avec une quantité et une qualité suffisantes pour des applications ultérieures permettant d'étudier la tolérance au stress chez les tardigrades. Ce protocole a mis en évidence les étapes où les utilisateurs pourraient rencontrer des difficultés, notamment l'élimination suffisante d'eau avant l'ajout du tampon d'extraction (XB) (Étape 2.5), la lyse des corps de tardigrades (Étapes 3.1 à 3.3), le transfert du surnageant sur la colonne de...

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Déclarations de divulgation

Les auteurs n'ont rien à divulguer.

Remerciements

Ce travail a été soutenu par des fonds de démarrage de l'UNC Asheville (à CCH) et par une subvention NSF 2225683 attribuée à Jason Pienaar (directeur postdoctoral de PK). Nous remercions la UNC High Throughput Sequencing Facility pour leur assistance technique.

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
Tubes microcentrifugeuses de 1,5 mLUSA Scientific1615-5500Tubes microcentrifugeuses gradués Seal-Rite de 1,5 mL, naturels, en polypropylène, 500 par sac
Éthanol à 70 %VWR71001-654Pour le nettoyage des surfaces de travail et des équipements
Kit Arcturis PicoPure d'isolement de l'ARNFisherKIT0204Kit contenant les composants nécessaires au protocole d'isolement décrit dans cet article
CentrifugeuseEppendorf5405000441Centrifugeuse 5425, à boutons rotatifs, non réfrigérée, avec rotor FA-24x2, 120 V/50-60 Hz (États-Unis)
Eau minérale de Deer ParkTout magasin d'alimentationN/ACe liquide sert de milieu de culture pour les tardigrades et est utilisé pour rincer les tardigrades avant l'isolement de l'ARN
Microscope stéréoscopiqueZeissN/AZeiss Stemi 305, rapport de zoom 5:1 et grossissement total de 8x à 40x, avec unité d'éclairage transmissible M LED
DNase IFisherFEREN0521Thermo Scientific DNase I, sans RNase (1 U/µL)
Pointes de pipette filtrées de 10 µLVWR76322-528Toute pointe de pipette filtrée convient
Pointes de pipette filtrées de 1000 µLVWR76322-154Toute pointe de pipette filtrée convient
Pointes de pipette filtrées de 20 µLVWR76322-134Toute pointe de pipette filtrée convient
Pointes de pipette filtrées de 200 µLVWR76322-150Toute pointe de pipette filtrée convient
Capillaires en verreFisher50-821-811Capillaires en verre standard de World Precision Instrument - 1B120-6 (6 pouces, diamètre extérieur 1,2 mm, sans filament). Ces capillaires sont étirés en deux capillaires à extrémités effilées au-dessus d'une flamme, puis cassés à un diamètre approprié pour pipeter à la bouche l'espèce de tardigrade choisie.
Bain-marie chauffantEppendorf5382000023Eppendorf ThermoMixer C, appareil de base sans bloc thermique, 100-130 V/50-60 Hz (États-Unis/Japon/Amérique du Sud/Taïwan)
Échelle High Sensitivity RNA Screen TapeAgilent5067-5581Échelle pour l'analyse haute sensibilité de l'ARN total sur les systèmes TapeStation
Bandes High Sensitivity RNA ScreenTapeAgilent5067-5579Pour l'analyse haute sensibilité de l'ARN total sur les systèmes TapeStation
tampon d'échantillon High Sensitivity RNA ScreenTapeAgilent5067-5580Tampon pour l'analyse haute sensibilité de l'ARN total sur les systèmes TapeStation
Électrophorèse capillaire microfluidiqueAgilentG2991BASystème Agilent 4200 TapeStation
Spectrophotomètre microvolumeFisher13400607Thermo Scientific NanoDrop UltraC FL, type de détecteur : capteur d'image linéaire CMOS à 2048 éléments, affichage : écran couleur haute définition de 10 pouces, langues : chinois, anglais, français, japonais, allemand, source lumineuse : flash au xénon, largeur spectrale : inférieure ou égale à 1,8 nm (FWHM à Hg 254 nm), tension : 12 VCC
Pipette buccaleMillipore SigmaA5177Ensembles de tubes aspirateurs pour pipettes microcapillaires étalonnées
Eau sans nucléaseFisherFERR0581Eau Thermo Scientific, sans nucléase
Pipettes (2,5 µL, 20 µL, 200 µL et 1000 µL)Eppendorf2231300004Eppendorf Research plus, lot de 4
RNase AwayFisher21-402-178Désinfectant de surface Thermo Scientific RNase AWAY
Tubes et pilons sans RNaseFisher12-141-368Tubes et pilons sans RNase pour l'isolement de l'ARN

Références

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