Stabilisation des protéines et des protéines — ARN condensés dans les hydrogels d’agarose à faible fusion pour des mesures biophysiques quantitatives

Résumé

Ici, nous présentons une méthode robuste pour immobiliser physiquement les condensats séparés en phase liquide-liquide au sein d’une matrice d’hydrogel agarose poreuse à faible fusion sans perturber leur dynamique interne des liquides. Cette approche minimise la sédimentation des goutteles, la coalescence et les artefacts de mouillage de surface, permettant l’imagerie reproductible et l’analyse biophysique quantitative sur plusieurs heures.

Résumé

Les condensats biomoléculaires formés par séparation en phase liquide-liquide sont de plus en plus reconnus comme des unités organisationnelles fondamentales de la cellule, avec des rôles allant du traitement de l’ARN à l’assemblage des granules de contrainte. La reconstitution in vitro de tels condensats à l’aide de protéines et d’ARN purifiés fournit des systèmes modèles, mais les gouttelettes liquides grossissent, sédimentent et se dispersent sur les surfaces au fil du temps, introduisant une variabilité significative dans les mesures quantitatives sur des périodes expérimentales. L’intégration de ces condensats dans un hydrogel clairsemé, optiquement transparent et chimiquement inerte — ici préparé à partir d’agarose à faible fusion (LMA) à 0,3–1,0 % en p/v — stabilise les gouttelettes en trois dimensions, permettant l’utilisation de méthodologies avec des temps de mesure plus longs ou des montages expérimentaux avec des mesures répétées. Cet article présente un protocole détaillé, étape par étape, pour la préparation des stocks LMA, la formation et l’incorporation, et fournit des exemples de relevés biophysiques spécifiques en aval. Nous montrons également que des propriétés spécifiques des goutteles, telles que la diffusion moléculaire, sont préservées après l’intégration de la LMA dans les systèmes représentatifs testés. Puisque la méthode est compatible avec la microscopie confocale, large champ ou super-résolution, la récupération de fluorescence après photoblanchiment, ou la spectroscopie par résonance magnétique nucléaire, entre autres, elle peut permettre la caractérisation quantitative de condensats biomoléculaires pertinents en santé et maladie.

Introduction

La séparation en phase liquide-liquide (LLPS) favorise la formation d’organites sans membrane et de condensats biomoléculaires dans les cellules, notamment les granules de contrainte, les corps P et le^nucléol 1,2,3,4,5. Ces condensats concentrent des protéines spécifiques et des acides nucléiques tout en maintenant un échange rapide avec le cytoplasme ou nucléoplasme environnant – une caractéristique d’un comportement ^liquide 1,2,3,4,5. La dysrégulation de la LLPS a été liée à diverses maladies, telles que les troubles^{neurodégénératifs 3,6,7}, et est également impliquée dans la réplication de plusieurs virus, comme le SARS-CoV-2 ^8,9,10,11,12.

La reconstitution in vitro des condensats à l’aide de protéines purifiées et d’ARN sous des conditions tampons définies est devenue une approche fondamentale pour étudier les mécanismes LLPS ^3,4. Cependant, les gouttelettes dans un tube à essai ou sur une surface vitrée sont sensibles à trois artefacts majeurs : (i) la sédimentation gravitationnelle, provoquant l’accumulation de gouttelettes au fond ; (ii) la coalescence, où les gouttelettes fusionnent au fil du temps en moins de structures plus grandes ; et (iii) mouillage de surface, où les gouttelettes se dispersent et s’adsorbent partiellement sur la gaine. Ces phénomènes réduisent la reproductibilité des mesures quantitatives et rendent difficile le suivi des gouttelettes individuelles dans leurs dimensions physiologiquement^{pertinentes 13}. Ces phénomènes limitent encore l’utilisation de méthodes nécessitant des temps de mesure prolongés de minutes à heures (par exemple, la spectroscopie par résonance magnétique nucléaire [RMN] ou les techniques de microscopie à super-résolution telles que STORM) et interdisent des mesures répétées sur des échelles de temps étendues.

L’immobilisation physique au sein d’un réseau hydrogel traite simultanément les trois artefacts. L’agarose forme un gel physiquement réticulé à des températures inférieures à 34–38 °C. À des concentrations de 0,3–1,0 % en p/v, la taille du maillage de l’agarose est suffisamment grande pour encapsuler des gouttelettes intactes à l’échelle du micromètre tout en restant suffisamment poreuse pour ne pas entraver la dynamique moléculaire^{intra-gouttelette 13}. De plus, la porosité de la matrice agarose permet la diffusion des macromolécules et des petites molécules à l’intérieur et à l’extérieur des gouttelettes incrustées. Pour les systèmes particulièrement sensibles à la température impliquant des protéines à domaines repliés ou suivant une séparation de phase de type UCST/LCST (température critique supérieure/inférieure), on peut utiliser à la place de l’agarose à faible fusion (LMA) avec un point de gélification de 26–30 °C. D’autres approches anti-mouillage, telles que la passivation de surface, peuvent réduire l’adhésion du condensat et donc le mouillage, mais nécessitent souvent une préparation spécialisée et ne préviennent pas la sédimentation des gouttelettes ni la coalescence. En revanche, l’encastrement d’agarose offre une méthode simple et largement accessible pour immobiliser spatialement les condensats. Il est important de noter que l’agarose a été validée pour ne pas perturber l’état conformationnel de la fusion dans le sarcome (FUS) et d’autres protéines liant l’ARN lors de la formation de gouttelettes jusqu’à des concentrations d’agarose de 1,0 % w/^{v 13}. Ce protocole standardise l’approche d’embedding d’agarose pour un usage général avec de nombreux systèmes protéine séparant de phase ou protéine-ARN d’intérêt, fournissant des conseils étape par étape pour la préparation des réactifs et de l’échantillon.

Protocole

1. Préparation du stock d’agarose

IMPORTANT : Préparez la crosse d’agarose dans le même tampon utilisé pour fabriquer les échantillons séparés par phase (ci-après appelés « tampon de gouttelettes ») pour éviter le décalage du^{tampon 14}. Exemple : L’échantillon de nucléocapside est préparé dans le tampon A (25 mM HEPES, 50 mM NaCl, pH 7,2), qui doit également être utilisé pour préparer le stock d’agarose.
REMARQUE : Les conditions expérimentales finales, incluant mais sans s’y limiter la composition tampon, la concentration des protéines, l’utilisation d’additifs et les volumes finaux d’échantillons, dépendent fortement du système biologique spécifique étudié et de l’application spécifique en aval. De même, les paramètres d’acquisition, la configuration de l’instrument et l’analyse des données dépendent fortement de l’échantillon et de l’expérience spécifique. Par exemple, la préparation du nucléocapside SARS-CoV-2 avec poly(A) est décrite à la Figure 1A (microscopie à fluorescence confocale).

1. Pèser la quantité appropriée de LMA ou d’agarose ordinaire dans un tube de 1,5 mL contenant un tampon de gouttelettes. Exemple : pour une bouillie à 2 % en mousse/v, dissoudre 20 mg d’agarose dans 1 mL de tampon A.
   REMARQUE : La concentration finale d’agarose doit être de 1 à 2 % en v/v, selon la concentration finale souhaitée dans l’échantillon. Dépasser 2 % de poids par v n’est pas recommandé car il devient de plus en plus difficile de pipeter. Coupez l’extrémité étroite de la pointe de la pipette pour faciliter la pipette, surtout à des pourcentages élevés d’agarose. Consultez la section discussion pour déterminer si la LMA ou l’agarose classique est requise pour les échantillons.
2. Chauffez l’agarose à 80–90 °C dans un bloc chauffant ou un bain-marie et dissoudrez complètement l’agarose par vortex (environ 10 minutes).
   ATTENTION : L’agarose en fusion est chaude. Manipulez avec précaution.
3. Équilibrez le stock d’agarose à 37 °C (LMA) ou 55 °C (agarose classique) dans le bloc chauffant ou le bain-marie. Vérifiez que la solution reste claire et liquide à cette température. Vérifiez la température de la crosse d’agarose avec un thermomètre si nécessaire.
   POINT DE PAUSE : Les stocks d’agarose en fusion peuvent être maintenus au chaud pendant 30 à 60 minutes.
   Il est fortement recommandé de chauffer l’agarose dans un bain-marie pour assurer un chauffage plus homogène et maintenir la température cible avec une précision suffisante. Cela est particulièrement important lorsqu’on travaille avec la LMA, car de petites variations de température peuvent provoquer une gélification prématurée.
4. Après la préparation de l’échantillon (section 2), conservez les stocks d’agarose restants à +4 °C. Suivez les étapes 1.2 et 1.3 ci-dessus pour refondre et rééquilibrer le stock d’agarose avant utilisation.
   REMARQUE : Nous recommandons de conserver le stock d’agarose pendant un maximum de 2 semaines à +4 °C et de ne pas le soumettre à plus de 2 à 3 cycles de solidification/fusion. Adoptez de bonnes pratiques de fabrication pour prévenir la contamination. Jetez les stocks plus tôt s’ils ne refondent pas ou ne se solidifient pas, ou si une contamination visible survient.

2. Préparation de l’échantillon

1. Préchauffez tous les matériaux en contact direct avec l’agarose (par exemple, pointes de pipette, tubes, lames de microscopie) à environ 37 °C en les plaçant sur le bloc chauffant ou dans un incubateur pendant 2 à 3 minutes.
2. Préparez le stock d’agarose comme indiqué dans la Section 1.
3. Préparez le tampon de gouttelettes, les composants de séparation de phase (par exemple, stocks de protéines ou d’ARN), et tout autre additif (par exemple, agents de foulement, colorants) pour les échantillons selon le protocole standard. Équilibrez à température ambiante (RT). Exemple : tampon A (25 mM HEPES, 50 mM NaCl, pH 7,2), stock de protéines de nucléocapsides (60 μM, dans le tampon A), stock poly(A) (30 μM, dans le tampon A).
   REMARQUE : Pour la récupération de fluorescence après photoblanchiment (FRAP), la microscopie à fluorescence confocale ou la microscopie de reconstruction optique stochastique (STORM), ajoutez une petite fraction de protéine ou d’ARN marqués fluorescentement aux stocks de protéines ou d’ARN, respectivement (recommandé : fraction marquée <5 %).
4. Calculez les volumes de tampon de gouttisses, de stock d’agarose, les composants de séparation de phase (par exemple, protéine ou ARN d’intérêt), ainsi que tout additif supplémentaire (par exemple, agents de regroupement) nécessaires à l’échantillon. Exemple : 6 μL de tampon A, 5 μL de stock d’agarose à 2 % (0,5 % final), 5 μL de protéine nucléocapside (15 μM finaux), 4 μL de poly(A) (6 μM finaux). Volume final 20 μL.
   REMARQUE : Bien que cela dépende fortement de la plaque, du tube, de la plaque ou de l’autre récipient utilisé pour l’expérience, les volumes couramment utilisés sont de 150 μL pour un tube RMN de 3 mm, 20 μL pour la microscopie ou les expériences FRAP sur une lame de microscopie à 6 canaux, et 20 à 30 μL pour les expériences STORM sur des lames de microscopie à 18 puits (voir le tableau des matériaux).
   1. Comme valeurs de départ, utilisez l’agarose finale de 0,3 à 0,5 % en po/v pour les tests biophysiques standards, et 0,8 à 1,0 % en po/v pour la stabilisation à long terme (par exemple, les expériences de vieillissement).
      REMARQUE : Pour la stabilisation et le stockage à long terme des échantillons, des mesures doivent être prises pour éviter la déshydratation de l’échantillon (par exemple, sceller le contenant de l’échantillon, stocker dans une chambre humidifiée et ajouter une barrière d’évaporation) et garantir que la composition tampon et le pH restent stables lors des incubations prolongées.
   2. Pour les échantillons RMN, ajoutez le 5 % final de D2O v/v à l’échantillon pour le verrouillage.
      REMARQUE : La concentration de tous les autres composants et le volume total de l’échantillon dépendent fortement de l’application spécifique et de la configuration expérimentale.
5. Ajoutez les volumes correspondants de tampon, de composants de séparation de phase, de crosse d’agarose et d’additifs dans un tube préchauffé de 1,5 mL.
   REMARQUE : Nous recommandons d’ajouter d’abord le tampon et l’agarose, puis les additifs supplémentaires. Nous recommandons également d’ajouter les composants de séparation de phase en dernier pour déclencher la formation de condensat. Cependant, l’ordre optimal de mélange dépend du système et doit être déterminé à l’avance. Cela est particulièrement pertinent pour les systèmes où la stœchiométrie et l’ordre d’addition peuvent fortement influencer la taille des gouttelettes ou la compartimentation. Exemple : L’ordre de mélange pour l’échantillon de nucléocapside est d’abord Buffer A, second stock d’agarose, troisième protéine de nucléocapside, et dernier poly(A), en utilisant les volumes indiqués à l’étape 2.4. Dans cet exemple, LLPS est déclenché par l’ajout de poly(A). Pour les systèmes dans lesquels les LLPS produisent une turbidité visible, la turbidité peut servir d’indicateur qualitatif de la QC ; cependant, le temps d’apparition et la visibilité dépendent du système, et l’absence de turbidité immédiate ne signifie pas en soi une défaillance du protocole.
   1. Gardez le tube dans le bloc chauffant ou le bain-marie tout en faisant des pipets plusieurs fois. Évitez d’introduire des bulles d’air.
      REMARQUE : Tant que l’agarose est encore liquide, les gouttelettes peuvent fusionner. Ainsi, varier le temps de pré-incubation sur le bloc chauffant ou dans un bain-marie avant d’initier la gélification peut être un outil utile pour étudier les gouttelettes de différentes tailles. Caractériser la cinétique de croissance des gouttelettes en l’absence d’agarose avant de sélectionner l’intervalle de temps pré-incubation permet aux chercheurs de cibler de manière reproductible une plage spécifique de taille de gouttelettes.
6. Pour les échantillons de microscopie / FRAP :
   1. Utilisez une pipette normale pour transférer rapidement l’échantillon dans/sur la lame de microscopie de votre choix (par exemple, lame de microscopie à canal avec fond de couvre-topo).
   2. Laissez la gélification à la RT pendant 5 à 10 minutes (voir la note dans la section discussion).
      REMARQUE : Ne bougez pas la lame de microscopie pendant cette période. Protégez les échantillons fluorescents de la lumière.
   3. Mesurez l’échantillon selon le protocole standard. Exemple : microscope confocal à disque tournant, objectif 100x 1,45 plan apo oil, longueur d’onde d’excitation 561 nm pour le colorant Cy3, acquisition de 100 ms à 30 % de puissance laser (Cy3) et 50 ms à 6 % d’intensité lumineuse (champ clair). Pour le FRAP : région de javel de 1/10^de diamètre de gouttelette placée au centre de la gouttette, 25 images de préblanchiment (acquisition sans délai), 60 images post-blanchiment (prises à intervalles de 1 seconde), impulsion laser pour blanchissage de 15 ms à 70 % de puissance laser. Analyser la récupération FRAP par normalisation à grande échelle dans un logiciel en libre accès ; Signalez les paramètres d’ajustement cinétique uniquement si l’ajustement est effectué.
7. Pour les exemples STORM :
   1. Utilisez une pipette normale pour transférer rapidement l’échantillon dans la lame STORM de votre choix (par exemple, lame à chambre à 18 puits avec fond à couvercle). Distribuez l’échantillon sous forme de goutte.
   2. Laissez la gélification à la RT pendant 5 à 10 minutes (voir la note dans la section discussion).
      REMARQUE : Ne bougez pas la lame de microscopie pendant cette période. Protégez les échantillons fluorescents de la lumière.
   3. Remplissez tout le puits avec le tampon STORM. Scellez le puits selon le protocole standard.
   4. Équilibrez l’échantillon pendant au moins 1 à 2 heures avant la mesure afin de permettre au tampon STORM de diffuser dans l’hydrogel agarose.
      REMARQUE : La diffusion réussie du tampon STORM dans l’échantillon peut être facilement vérifiée si les colorants fluorescents clignotent lors de l’acquisition de STORM. Selon les spécifications de l’échantillon, des temps d’équilibrage plus longs peuvent être nécessaires.
   5. Mesurez l’échantillon selon le protocole standard utilisé. Exemple : microscope inversé Ti2, objet d’huile SR apochromat TIRF 100x 1,49, éclairage très incliné et mince. Acquisition de 20 000 images par échantillon, champ de vision de 64 x 64 pixels, temps d’exposition de 10 ms avec un laser 647 nm de 125 mW pour la teinture Cy5, et utilisation d’un laser de 20 mW 405 nm pour faciliter la transition de l’état sombre à longue durée de vie vers l’état fondamental. Les images ont été traitées en utilisant une estimation de la vraisemblance maximale avec un ajustement multiémetteur. La correction de dérive a été appliquée, et seuls des points de données avec une précision de localisation de 25 nm ou supérieure ont été inclus dans la visualisation finale. Les images finales sont produites en utilisant la méthode des histogrammes décalés moyens à un grossissement de 20x (1 pixel = 8 nm dans l’image finale).
8. Pour les échantillons RMN :
   1. Utilisez une longue pipette en verre fine (préchauffée) pour transférer rapidement l’échantillon dans le tube RMN. Distribuez l’échantillon au fond du tube.
   2. Laissez la gélification à la RT pendant 5 à 10 minutes (voir la note dans la section discussion).
      REMARQUE : Ne secouez pas le tube RMN pendant cette période.
   3. Mesurez l’échantillon selon le protocole standard utilisé. Exemple : intensité de champ de la RMN 750 MHz avec sonde PATXI à température ambiante, tube de 3 mm, acquisition à 25 °C, séquence d’impulsions standard (stebpgp1s19) pour expériences de diffusion (DOSY), paramètres : 4 096 points avec 32 balayages, intensité de gradient 2–95 %, temps de diffusion 0,08 s, impulsion de gradient 12 ms, délai de relaxation (d1) 5 s.

Résultats

Le protocole a été appliqué aux condensats formés par le domaine terminal FUS N-terminal (FUS NTD) ou par la protéine nucléocapside (N) du SARS-CoV-2 avec des ARN poly(A) ou s2m comme exemples représentatifs de gouttelettes protéique uniquement et protéine-ARN. Pour évaluer si l’agarose affecte de manière détectable la formation de condensats dans les conditions testées, nous avons formé des gouttelettes avec la protéine N et le poly(A) en présence et en absence d’un LMA de 0,5 % en v/v. Comme la LMA se solidifie après environ 5 minutes à la RT, nous avons enregistré des images de microscopie à fluorescence à ce moment et observé que les gouttelettes avaient à peu près la même taille dans les deux cas (Figure 1A,B). Pour démontrer l’effet préventif de l’agarose sur le mouillage et la fusion des goutteles, nous avons enregistré un autre ensemble d’images 60 minutes après la préparation de l’échantillon. Bien que les gouttelettes incrustées dans l’agarose n’aient pas changé de taille, les condensats en l’absence de LMA ont montré une augmentation drastique de taille due à la fusion et au mouillage de surface (Figure 1A,B). Bien que nous ayons intégré les gouttelettes relativement tôt après la nucléation, des gouttelettes de tailles différentes peuvent être intégrées en variant le temps d’incubation avant l’implantation. Malgré l’inclusion des gouttelettes dans l’hydrogel d’agarose, la dynamique mesurée du condensat n’a pas été détectée de manière détectable. La récupération FRAP et, par conséquent, la diffusion apparente des gouttelettes étaient très similaires avec et sans LMA dans l’échantillon (Figure 1C). De plus, des expériences antérieures de spectroscopie RMN ordonnée par diffusion (DOSY) avec des condensats FUS NTD ont montré que les taux de diffusion n’étaient pas détectablement influencés par la concentration d’agarose, du moins dans la fourchette de 0,25–1 % en v/v (Figure 1D) (adapté d’Emmanouilidis et ^al.13). Ces résultats démontrent qu’un hydrogel d’agarose convient à piéger des condensats séparés de phase dans l’espace et le temps, permettant des mesures répétées sur de longues périodes.

Bien que les mesures par microscopie et FRAP soient assez rapides à enregistrer (de secondes à quelques minutes), certaines expériences nécessitent plusieurs minutes (par exemple, STORM, RMN ^{1D 1}H) voire des heures (par exemple, RMN 2D [¹⁵N ¹H] NMR HSQC) pour être obtenues. Pour de telles expériences, il est crucial que les gouttelettes restent immobiles tout au long de l’acquisition et ne se sédimentent pas avec le temps. Ici, nous montrons que nous avons stabilisé les gouttelettes d’ARN N + s2m en LMA suffisamment longtemps pour acquérir des images STORM (Figure 1E). De plus, les spectres RMN des gouttelettes de DTN de FUS en présence et en absence d’agarose présentaient des largeurs de raie comparables, suggérant qu’aucune interaction détectable entre les hydrogels d’agarose et la protéine dans ces conditions ne sont pas détectées (Figure 1F) (adapté d’Emmanouilidis et ^al.13). En revanche, les spectres de condensats incorporés dans l’agarose ont montré une intensité de signal plus élevée, probablement parce que des gouttelettes non stabilisées se sont sédimentées dans le tube RMN lors de l’acquisition et n’étaient donc plus disponibles pour la mesure (Figure 1F) (adaptée d’Emmanouilidis et ^al.13). En conclusion, la stabilisation des condensats dans les hydrogels d’agarose permet non seulement des expériences sur le cours du temps, mais aussi l’utilisation de méthodologies avec des temps d’acquisition étendus, tout en préservant les propriétés mesurées des gouttelettes dans les systèmes représentatifs testés.

Figure 1 : Stabilisation du condensat par plongement en agarose sans perturber de manière détectable les propriétés des gouttelettes mesurées. (A) Microscopie à fluorescence de la protéine nucléocapside de 15 μM avec 6 μM Cy3-poly(A) (5 % marqué) dans le tampon A (25 mM HEPES, 50 mM NaCl, pH 7,2) en présence (+ agarose) ou absence (sans agarose) de 0,5 % en poids et en valeur de la LMA. Les images ont été prises 5 ou 60 minutes après le mixage / l’intégration de l’agarose. Les images représentent 7 images acquises lors de n = 2 expériences indépendantes. Barres d’échelle = 5 μm. (B) Quantification des rayons des gouttelettes des condensats indiqués dans (A). Les données sont affichées sous forme de boîtes graphiques (boîte = plage interquartile, ligne centrale = médiane, moustaches = plage des données restantes, point = valeurs aberrantes). Le rayon moyen ± l’écart-type (SD) et le nombre de gouttelettes analysées dans chaque condition sont affichés directement sur le graphique. Les données suivent une distribution normale. Les gouttelettes individuelles n’ont pas été traitées comme des répliques biologiques indépendantes pour l’inférence statistique. Aucun test statistique n’a été effectué ; les distributions sont représentées de manière descriptive. (C) FRAP des gouttelettes indiquées en (A) au moment 5 min. Le photoblanchiment a été réalisé avec le laser à 561 nm (Cy3). Les données montrent l’intensité normalisée (moyenne ± sd de n = 3 réplications indépendantes par condition), qui est obtenue en normalisant le signal blanchi aux valeurs pré-blanchiment, à une zone non blanchie du même échantillon, et à la fluorescence de fond. (D) Signal DOSY non atténué de la protéine fus NTD de 200 μM dans le tampon B (30 mM HEPES, 200 mM KCl, 600 mM urée, pH 7,3) en présence de 0,25, 0,5 ou 1,0 % d’agarose régulière en po/v. N = 1. (E) Microscopie à fluorescence confocale et images STORM de la protéine Cy5-nucléocapside de 15 μM (marquée à 5 %) avec 6 μM d’ARN viral S2M dans le tampon A contenant 0,5 % de PML en po/v. Représentatif de n = 3 expériences indépendantes. Barre d’échelle = 1 μm dans les deux images. (F) spectres RMN ^{1D 1}H (à gauche) et spectres RMN 2D [¹⁵N ¹H] (à droite) de 200 μM FUS NTD dans le tampon B en présence ou absence de 0,5 % d’agarose régulière w/v. N = 1. Les panneaux (D) et (F) sont reproduits à partir d’Emmanouilidis et ^al.13. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Discussion

Le succès de l’enracinement de condensats biomoléculaires par agarose dépend de plusieurs facteurs. Premièrement, l’agarose doit être maintenue à des températures suffisamment élevées pour éviter une gélification prématurée, et en même temps suffisamment basses pour ne pas perturber les structures ou interactions biomoléculaires. L’agarose à faible fusion a un point de gelification de 26 à 30 °C et un point de fusion de 60 à 65 °C, tandis que l’agarose ordinaire a un point de gélification de 34 à 38 °C et un point de fusion de 90 à 95 °C. Deuxièmement, un mélange rapide et un transfert dans le récipient de réaction final (par exemple, le tube RMN) sont critiques, car de petites déviations de temps ou de température peuvent entraîner un plongement inégal et donc une reproductibilité compromise.

Malgré ces points critiques, la méthode peut être facilement adaptée à différents besoins expérimentaux. Pour les systèmes de séparation de phase avec des protéines intrinsèquement désordonnées ou les systèmes peu sujets à la dénaturation thermique, l’agarose classique peut être utilisée à la place de la LMA pour économiser des coûts. Lors de la préparation d’échantillons contenant des protéines à domaines repliés ou toute autre (bio-)molécule sensible à la température sujette à la dénaturation thermique, il faut utiliser la LMA pour prévenir la dénaturation. Un échantillon témoin uniquement à la chaleur ou sans agarose peut être préparé pour séparer les effets de l’inclusion de l’agarose de ceux du réchauffement transitoire de l’échantillon. Pour réduire le risque de ces effets de dénaturation dépendants de la température, l’agarose à faible fusion est particulièrement adaptée aux échantillons sensibles à la température, tandis que la concentration d’agarose peut être ajustée pour moduler la taille du maillage et le degré de confinement mécanique. Pour les mesures de diffusion très sensibles, telles que la méthode RMN récemment développée appelée LLPS REDIFINE^15,16, la concentration d’agarose la plus faible empêchant la sédimentation est généralement préférable, typiquement 0,3–0,5 % en va-et-vient. Pour les expériences de maturation nécessitant des semaines à des mois de stabilité, 0,8 à 1 % en w/v est préférable. Ces paramètres doivent être optimisés pour assurer une stabilisation efficace sans modifier de manière détectable la morphologie ou la dynamique du condensat et doivent toujours être adaptés au système spécifique. Cette validation nécessite la comparaison d’échantillons avec ou sans inclusion d’agarose (et dans des conditions identiques) ou la comparaison de différentes concentrations d’agarose (pour exclure les effets de maillage dépendants de la concentration), par exemple l’utilisation de la microscopie pour évaluer la morphologie des gouttelettes, le FRAP pour évaluer la diffusion, ou toute autre méthode adaptée pour évaluer les propriétés des gouttelettes importantes pour l’investigateur.

Le temps de gélification est un autre facteur important. Le temps nécessaire pour solidifier l’agarose dépend de plusieurs facteurs, tels que le type de tampon, le pH, la concentration finale d’agarose, la température de départ, et l’utilisation d’agarose à faible fusion ou normale. En général, l’agarose se solidifie en 5 à 10 minutes. La gélification du fond d’agarose peut servir d’indication pour la gélification de l’échantillon. De même, la variation des temps de pré-incubation avant l’inclusion de l’agarose permet de caractériser de manière reproductible différentes tailles de gouttelettes. Le choix du tampon est aussi crucial^{à 14}. Il est essentiel que le stock d’agarose soit préparé dans le même tampon utilisé pour préparer les échantillons afin d’éviter un désaccord de tampon. Le tampon doit être celui dans lequel le système est connu pour se séparer en phase.

La sensibilité à la température doit être prise en compte pour chaque système. De nombreux systèmes de séparation de phase présentent un comportement de phase thermo-réversible, connu sous le nom de LLPS de type UCST/LCST. Par conséquent, une exposition brève à des températures légèrement élevées lors du mélange de l’agarose doit être validée afin de s’assurer qu’elle ne perturbe pas le comportement de phase ni les propriétés des gouttelettes mesurées. Si des problèmes surviennent, ils peuvent généralement être résolus en affinant les conditions de température, en minimisant le temps de manipulation ou en ajustant la concentration d’agarose. Par exemple, bien que le stock LMA soit idéalement chauffé à 37 °C, les stocks LMA resteront liquides à 33–35 °C.

Le dépannage est important car différents modes de défaillance peuvent survenir selon l’échantillon et la configuration expérimentale. Si les gouttelettes se dissolvent en mélangeant avec de l’agarose, cela peut être dû à une LMA trop chaude ou à un désaccord de tampon. Dans ce cas, le stock LMA doit être maintenu exactement à ou quelques degrés en dessous de la température cible, et préparé dans un tampon identique à la protéine/ARN d’intérêt. Si une gélification prématurée survient dans la pointe de la pipette, cela peut être dû à un LMA trop froid ou à un manque de préchauffage des extrémités. Pour éviter cela, les embouts et tubes doivent être préchauffés à 37 °C, l’opérateur doit travailler rapidement, et le bloc chauffant doit être maintenu à la température ciblée. Si l’humidification, la coalescence ou la sédimentation surviennent au fil du temps, cela peut être dû à un gel trop clairsemé ou à une gélification inégale. Dans ce cas, la concentration de LMA peut être augmentée, et même une gélification à température ambiante doit être assurée. Si la solution d’agarose contient des particules visibles, cela peut être dû à une dissolution d’agarose incomplète. Dans ce cas, l’agarose doit être chauffée jusqu’à ce qu’elle soit complètement transparente et bien mélangée avant utilisation (par exemple, en vortex). Si des bulles d’air sont introduites lors du mélange ou du pipettage, elles peuvent interférer avec l’imagerie et entraîner une distribution inégale du condensat. Pour minimiser la formation de bulles, les solutions doivent être délicatement mélangées en pipettant lentement de haut en bas. Si une gélification hétérogène ou une distribution inégale du condensat est observée, cela peut être dû à un mélange insuffisant ou à des gradients locaux de température pendant la gélification. Dans ce cas, les échantillons doivent être conservés sur le bloc chauffant (ou le bain-marie) jusqu’à ce que tous les composants soient ajoutés, mélangés immédiatement mais doucement, puis laissés solidifier dans des conditions de température uniformes. Les gradients de température abrupts doivent être évités ; La solidification à température ambiante est recommandée (et la solidification au réfrigérateur doit être évitée). Dans des expériences à long terme, l’évaporation de l’échantillon peut modifier les concentrations de soluté et les propriétés du condensat. Pour minimiser l’évaporation, les échantillons doivent être scellés correctement et maintenus dans un environnement à contrôle humide autant que possible.

Contrairement à des méthodes telles que la fixation par paraformaldéhyde, l’inclusion en agarose ne fixe pas chimiquement les échantillons. Par conséquent, les condensats restent dynamiques, ce qui est avantageux pour les études fonctionnelles mais limite le stockage à long terme. Pour des périodes expérimentales prolongées, des précautions doivent être prises pour éviter l’évaporation et les changements de tampon, tels que les changements de pH. De plus, bien que l’agarose soit généralement peu interactif dans ces tests, des effets indirects potentiels sur la diffusion ou l’environnement local doivent être envisagés. Si l’on soupçonne des interactions agarose–biomolécule, telles qu’une liaison non spécifique de la protéine à l’agarose, des matrices hydrogel alternatives telles que le polyéthylène glycol diacrylate photo-réticulé (PEG-DA), avec une taille de maille et une porosité correspondantes, peuvent être envisagées. L’absence d’interactions doit être validée en mesurant la FRAP dans la présence et l’absence de la matrice.

En plus de la fixation chimique, des stratégies de passivation de surface telles que les surfaces recouvertes de BSA, PEG ou surfactant, ainsi que les bicouches lipidiques soutenues, sont couramment utilisées pour réduire l’adhésion et l’humidification des condensats. Bien que ces approches minimisent efficacement les interactions de surface, elles n’empêchent pas le déplacement du condensat, la sédimentation ou la fusion. L’incorporation d’agarose complète donc ces méthodes en assurant une immobilisation physique tout en maintenant la dynamique du condensat, ce qui la rend particulièrement utile pour des expériences prolongées, l’imagerie tridimensionnelle et les mesures quantitatives nécessitant un positionnement stable de l’échantillon. Le choix de la méthode doit donc être guidé par l’objectif expérimental.

Dans l’ensemble, les hydrogels d’agarose offrent un moyen simple mais efficace de stabiliser les condensés en trois dimensions. Cela empêche le mouillage des gouttelettes et la fusion sans perturber de manière détectable les propriétés intrinsèques mesurées dans les systèmes représentatifs testés, permettant ainsi des expériences et techniques temporelles nécessitant de longs temps d’acquisition, comme la spectroscopie^{RMN 15}. Bien que cette méthode ne soit pas adaptée à tous les systèmes de séparation de phase pour plusieurs raisons, la méthode présentée ici est applicable à l’étude de plusieurs condensats biomoléculaires et peut être particulièrement utile pour étudier les processus de maturation pertinents aux mécanismes des maladies^{neurodégénératives 17}.

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
1.5 mL tubes	toute marque convient	N/A
chambres de lames à 18 puits	ibidi	81816	pour STORM
agarose, basse température de gélification	Sigma-Aldrich	A9414	qualité biologie moléculaire
agarose ultra pure	Invitrogen	16500500
lames à canal	ibidi	80606	pour microscopie
microscope confocal	Nikon	N/A
Cy5-dye, chimie NHS	Jena Biosciences	FP-201-CY5	pour marquage protéine
D2O (oxyde de deutérium)	Sigma-Aldrich	151882
easyFRAP	Koulouras et al. 2018	N/A	https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/29901776/
tampon Everspark 2.0 dSTORM	idylle	KMO|ETE+
protéine FUS NTD	N/A	N/A	exprimée recombinante dans notre laboratoire, comme décrit dans la référence 13 (Emmanouilidis et al. Nat Chem Biol 2021)
bloc chauffant ou bain-marie	toute marque convient	N/A	toute marque ou modèle convient
HEPES	Sigma-Aldrich	H3375
logiciel d'analyse d'image	Fiji	N/A	https://fiji.sc/
KCl	Sigma-Aldrich	P5405
NaCl	Sigma-Aldrich	S9888
spectromètre RMN	Bruker	N/A	750 MHz, sonde PATXI à température ambiante, voir référence 13 pour plus de détails (Emmanouilodis et al. Nat Chem Biol 2021)
tube RMN	Bruker	N/A	3 mm, en verre
pipettes P10, P20, P200 et P1000	toute marque convient	N/A
pCp-Cy3-dye	Jena Biosciences	NU-1706-CY3	pour le marquage de l'ARN
ARN poly(A)	N/A	N/A	transcrit in vitro dans notre laboratoire, longueur environ 50 nucléotides, comme décrit dans Kathe et al. Mol Biol Cell 2024
ARN s2m	N/A	N/A	transcrit in vitro dans notre laboratoire, longueur 45 nucléotides, séquence : 5'-GGUUCACCGAGGCCACGCGGAGU ACGAUCGAGUGUACAGUGAACC-3', comme décrit dans Kathe et al. Mol Biol Cell 2024
protéine du nucléocapside du SARS-CoV-2	N/A	N/A	exprimée recombinante dans notre laboratoire, comme décrit dans Kathe et al. Mol Biol Cell 2024
logiciel de tracé (par exemple R)	R-Project	Version 4.2.1	https://www.r-project.org/
microscope STORM	Nikon N-STORM	N/A
plugin ThunderSTORM	Ovesny et al. 2014	N/A	https://pmc.ncbi.nlm.nih.gov/articles/PMC4207427/
embouts pour les pipettes utilisées	toute marque convient	N/A
TopSpin	Bruker	Version 3.2 et 4.1
urée	Sigma-Aldrich	U5128