Article de méthode

Ciblage de Cas9 pour effectuer des expériences de sauvetage dans des cellules HEK293 knockout transduites de manière stable

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DOI :

10.3791/72172

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28 août 2026

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1Department of Biological and Environmental Sciences, Le Moyne College, 2Department of Immunology and Microbial Disease, Albany Medical College

Dans cet article

Résumé

Ce protocole élimine la protéine Cas9 après l'édition du génome afin de faciliter des expériences de complémentation robustes dans des lignées cellulaires invalidées de manière stable.

Résumé

La technologie d'édition génique CRISPR-Cas9 a révolutionné la biologie moléculaire. Cette technologie est souvent utilisée pour supprimer un gène codant une protéine d'intérêt. Le phénotype obtenu fournit des informations précieuses sur la fonction de la protéine. L'importance fonctionnelle de la protéine ciblée peut être confirmée en réintroduisant la protéine afin de restaurer la fonction perdue (récupération). Cela est généralement réalisé en introduisant le gène complémentaire (ADNc) codant la protéine en trans à l'aide d'un vecteur d'expression. Toutefois, dans des lignées cellulaires invalidées génétiquement qui expriment de manière stable le système CRISPR-Cas9, le nouveau plasmide d'expression introduit pourrait également être clivé par Cas9. Le protocole présenté ici propose une stratégie permettant de contourner cet obstacle potentiel aux expériences de récupération. Cette approche est illustrée à l'aide de cellules HEK293 dans lesquelles le gène codant la protéine CUL4B, un échafaudage de ligase d'ubiquitine E3, a été interrompu par CRISPR-Cas9. La transduction de ces cellules avec un ARN guide (gRNA) ciblant le transgène Cas9 intégré a entraîné la disparition de la protéine Cas9 détectable. L'ablation de Cas9 a permis la restauration de l'expression et de la fonction de CUL4B après l'introduction d'un plasmide d'expression de CUL4B. Ces résultats démontrent la faisabilité d'une approche largement applicable pour l'étude de la fonction protéique par des expériences de récupération.

Introduction

CRISPR-Cas9 est un puissant outil d'édition du génome dérivé d'un système immunitaire adaptatif naturellement présent chez les procaryotes, utilisé pour se défendre contre l'infection par des bactériophages. Grâce à son faible coût, son taux de réussite élevé et sa facilité d'utilisation, la technologie CRISPR-Cas9 a surpassé d'autres outils d'édition du génome, tels que les nucléases à doigts de zinc (ZFN) et les nucléases effectrices activateurs de transcription de type TALE (TALEN), pour la modification génétique précise, notamment en culture cellulaire. Ce système à deux composants comprend une nucléase Cas9 et un ARN guide (gRNA). Par appariement de bases selon le modèle de Watson-Crick, le gRNA dirige Cas9 vers une cible génomique adjacente à un motif appelé séquence adjacente au proto-espaceur (PAM). La séquence PAM sert de site de reconnaissance essentiel qui autorise l'activité de la nucléase. À cet endroit, Cas9 induit une cassure double brin (DSB). En l'absence d'un modèle de réparation homologue, la cellule répare la DSB par jonction non homologue des extrémités (NHEJ). Ce mécanisme de réparation peut introduire des insertions ou des délétions (indels), entraînant des mutations par décalage du cadre de lecture et une inactivation fonctionnelle du gène cible. L'interruption du gène cible est donc obtenue en introduisant Cas9 conjointement avec un gRNA conçu spécifiquement. La séquence de 20 nucléotides du gRNA est complémentaire d'un site génomique situé immédiatement à côté du PAM. La perte fonctionnelle résultante du gène cible met en évidence le rôle spécifique de ce gène dans les processus cellulaires1.

Une expérience de sauvetage, ou test de complémentation, consiste à rétablir la protéine manquante afin de démontrer l'inversion du phénotype observé. Cette approche constitue un contrôle rigoureux permettant d'exclure des effets expérimentaux non voulus, tels que ceux résultant de suppressions « hors cible » par CRISPR-Cas9. La méthode la plus courante pour réintroduire une protéine d'intérêt passe par la transfection ou la transduction d'un vecteur d'expression exogène. Toutefois, cet ADN introduit est sensible à la même ciblage CRISPR-Cas9 que le locus endogène. Ce risque est particulièrement élevé dans les lignées cellulaires transduites de manière stable, où l'expression constitutive de Cas9 est associée à une sélection par antibiotique afin d'assurer une population de knock-out homogène et constante ; une stratégie souvent nécessaire dans les lignées cellulaires difficiles à transfecter ou à transduire, comme celles dérivées de lignées immunitaires, hématopoïétiques ou neuronales.

Une méthode pour contourner le ciblage vectoriel consiste à introduire un ARNm exogène codant pour la protéine d'intérêt, évitant ainsi le clivage médié par Cas9 et la nécessité d'une transcription nucléaire. Toutefois, par rapport à l'ADN plasmidique, l'ARNm synthétique est plus coûteux à produire, intrinsèquement moins stable et donne une expression hautement transitoire. De plus, il nécessite des modifications chimiques spécifiques afin d'éviter l'activation des réponses immunitaires innées cytosoliques2.

Pour éviter le ciblage des plasmides d'expression par le complexe Cas9/ARNg, on peut recourir à une ingénierie des bases variables de la séquence codante. En exploitant la dégénérescence du code génétique, des mutations synonymes peuvent être introduites afin d'éliminer la séquence PAM requise et/ou de perturber la complémentarité avec l'ARNg, sans modifier la séquence en acides aminés de la protéine codée. Toutefois, l'utilisation de mutations synonymes n'est pas sans risque. Ces modifications peuvent entraîner une utilisation sous-optimale des codons, ce qui pourrait perturber la cinétique de traduction et conduire à un mauvais repliement des protéines, à une stabilité réduite des ARNm ou à des changements délétères de la structure secondaire de l'ARN3,4. Bien que moins fréquents, d'autres effets indésirables possibles incluent l'introduction de signaux de polyadénylation cryptiques, la perturbation de motifs régulateurs post-transcriptionnels et une densité accrue de sites CpG5,6. En outre, les séquences modifiées pourraient involontairement déclencher des réponses cellulaires au stress si la structure de l'ARNm interfère avec la progression du ribosome7,8.

Outre les défis liés à l'utilisation d'ARNm synthétiques ou à l'ingénierie des bases flottantes, l'expression constitutive de Cas9 après l'édition introduit plusieurs variables perturbatrices dans les analyses ultérieures. Étant donné que la spécificité de Cas9 peut être imparfaite, une expression persistante augmente la probabilité de coupures hors cible, conduisant à l'accumulation progressive de mutations non intentionnelles au fil du temps9,10,11. De plus, une surveillance génomique chronique et des cassures double-brin répétées peuvent déclencher une réponse persistante au dommage de l'ADN, poussant finalement les cellules vers un arrêt du cycle cellulaire, une sénescence ou une apoptose12,13. Cette production constitutive impose également une charge métabolique, favorisant ainsi la dérive clonale, au cours de laquelle les cellules faiblement exprimantes surpassent les cellules fortement exprimantes, entraînant des niveaux inconstants de transgène au fil des passages successifs. Enfin, en tant que grande protéine procaryote, Cas9 peut induire un stress via la signalisation immunitaire innée ou saturer le système d'homéostasie protéique de l'hôte, provoquant ainsi la réponse au désassemblage des protéines14,15,16.

Pour atténuer ces complications, plusieurs stratégies d'inhibition transitoire de Cas9 ont été développées, notamment des protéines anti-CRISPR d'origine phagique (Acrs)17,18, des inhibiteurs de petite molécule ou des systèmes fusionnés à un dégron comme les PROTACs19,20, ainsi que des mécanismes de contrôle optogénétique19,21. Toutefois, ces approches présentent des obstacles pratiques qui limitent leur utilité dans les tests de sauvetage. Les Acrs agissent par mimétisme moléculaire et nécessitent donc une optimisation stœchiométrique pour atteindre une précision adéquate. Les Acrs peuvent également aggraver les mêmes stress protéostatiques et immunogéniques associés à la surexpression de Cas9. La modulation chimique introduit des complexités pharmacocinétiques, un risque de cytotoxicité et des « effets crochet » liés aux PROTAC, où des concentrations excessives de ligand empêchent de manière paradoxale la formation d'un complexe ternaire productif22. Les plateformes optogénétiques sont limitées par la phototoxicité cellulaire et la nécessité d'un matériel spécialisé pour assurer un apport lumineux constant19,21. De manière importante, comme ces méthodes n'assurent qu'une inhibition temporaire ou réversible, elles sont souvent insuffisantes pour des applications où Cas9 est exprimé de façon constitutive.

En revanche, les systèmes CRISPR s'auto-inactivant offrent une solution définitive en perturbant de manière autonome et permanente le transgène Cas9 immédiatement après une édition réussie du gène cible. En éliminant l'activité nucléasique résiduelle, cette approche protège de façon permanente les vecteurs de secours ultérieurs contre le clivage, tout en réduisant simultanément le stress protéostatique à long terme et la dérive génomique hors cible. Bien que les ARN guides auto-dirigés puissent être délivrés par des transfections transitoires de ribonucléoprotéines ou par des lipides23,24, ces méthodes sont sujettes à la dilution et aux variations stochastiques, conduisant à une population « mosaïque » dans laquelle certaines cellules échappent à l'inactivation25,26,27.

Pour surmonter ces limitations, le protocole décrit ici exploite un système de livraison lentiviral pour l'inactivation spontanée de Cas9, offrant des avantages pratiques distincts pour la modification de lignées cellulaires stables. La livraison lentivirale assure l'héritage lié du transgène Cas9 et de son régulateur auto-ciblant, empêchant efficacement l'« échappement par dilution » typique des populations se divisant rapidement. De plus, la capacité de charge élargie des vecteurs lentiviraux permet la co-expression de marqueurs de sélection afin d'assurer une population homogène dépourvue de Cas9, tandis que leur large tropisme, conféré par la pseudotypage VSV-G, facilite une livraison à haute efficacité dans des types cellulaires difficiles à transfecter25,28,29.

À titre de démonstration de principe de cette méthode, ce protocole décrit l'inactivation spontanée de Cas9 afin de faciliter la récupération phénotypique de la protéine échafaudage de l'ubiquitine ligase E3, CUL4B, dans des cellules HEK293 invalidées pour CUL4B30.

Protocole

Cette étude a utilisé des lignées cellulaires humaines immortalisées établies (HEK293 et HEK293FT) et n'a pas impliqué de participants humains, de tissus humains primaires ou d'expériences animales. Par conséquent, une approbation éthique institutionnelle n'était pas requise.

1. Génération de Cas9-construct lentiviral d'ARNg spécifique

  1. Insérez la séquence d'ARNg spécifique de Cas9 (Tableau 1) dans le vecteur lentiviral pLentiGuide-Puro.
  2. Remplacez le gène de résistance aux antibiotiques par un gène différent de celui utilisé comme marqueur de sélection pour la lignée cellulaire CRISPR-Cas9 transduite de façon stable.
  3. Vérifiez l'insertion réussie et la fidélité de la séquence de l'ARNg spécifique de Cas9 ainsi que celle du gène de résistance aux antibiotiques de remplacement par séquençage de Sanger en utilisant des amorces spécifiques du vecteur.
    REMARQUE : Dans ce protocole, le gène de résistance à la puromycine (PuroR) a été remplacé par le gène de résistance à l'hygromycine B (HygroR) afin de générer le vecteur Cas9 gRNA1_pLentiGuide-Hygro. D'autres gènes de résistance aux antibiotiques possibles incluent la blasticidine S (BlastR), la G418/généticine (NeoR) et la zéocine (ZeoR).

2. Production du lentivirus codant pour l'ARNg spécifique de Cas9

  1. Ensemencer 2,5 × 106  cellules HEK293FT dans une boîte de culture tissulaire de 10 cm.
    NOTE : Maintenir les cellules dans un milieu de type Dulbecco (DMEM ; glucose élevé) complété avec 10 % de sérum bovin fœtal (SBF) (désormais appelé cDMEM) et les incuber à 37 °C dans une étuve humide contenant 5 % de CO2. Les cellules HEK293FT sont utilisées car elles produisent des titres de lentivirus plus élevés que d'autres lignées cellulaires dérivées de HEK29331.
  2. Incuber les cellules pendant 12 h jusqu'à ce qu'elles atteignent au moins 60 % de confluence avant la transfection.
    ATTENTION : Réaliser toutes les manipulations impliquant des vecteurs lentiviraux de troisième génération en conditions de niveau de biosécurité 2 (BSL-2), en utilisant des équipements de protection individuelle (EPI) appropriés et des procédures de décontamination approuvées (par exemple, une cabine de sécurité biologique de classe II, un confinement secondaire et de l'éthanol à 70 %), comme décrit par Pauwels et al.32
  3. Préparer un mélange de transfection standard au phosphate de calcium (CaPhos). Diluer 20 µg d'ADN plasmidique total dans de l'eau stérile de qualité biologie moléculaire jusqu'à un volume final de 450 µL. Ajouter 50 µL de CaCl2 à 2,5 M, puis 500 µL de solution saline tamponnée au HEPES (HBS ; pH 7,05) 2×, afin d'obtenir un volume final de 1 mL dans un tube microcentrifuge de 1,5 mL.
    NOTE : Utiliser de l'ADN plasmidique vérifié par séquençage, principalement en forme superenroulée, répondant aux critères de qualité suivants : A260/A280 = 1,8–2,0, A260/A230 = 2,0–2,2 et endotoxines <0,1 UE/µg. Préparer le mélange de transfection en utilisant un ratio équimolaire approximatif composé de 5 µg de Cas9 gRNA1_pLentiGuide-Hygro, 5,6 µg de pLP1 (Gag/Pol), 3,8 µg de pLP2 (Rev) et 5,6 µg de pLP/VSVG (glycoprotéine du virus de la stomatite vésiculaire).
  4. Mélanger soigneusement la solution de transfection au phosphate de calcium par pipetage doux.
  5. Ajouter goutte à goutte 1 mL du mélange de transfection au phosphate de calcium à la culture de cellules HEK293FT.
  6. Balancer doucement la boîte de culture afin de répartir uniformément les complexes de transfection.
  7. Incuber les cellules pendant 12 h.
    NOTE : La transfection au phosphate de calcium est généralement insensible aux antibiotiques de maintenance standards33. Toutefois, un milieu sans antibiotique est recommandé pour des méthodes de transfection plus sensibles, telles que la lipofection, car les antibiotiques polyanioniques peuvent interférer avec la formation des complexes ADN-lipide34.
  8. Aspirer et jeter le milieu de culture.
  9. Laver les cellules une fois avec 10 mL de solution saline tamponnée au phosphate (PBS) 1× stérile à température ambiante.
  10. Aspirer et jeter le PBS.
  11. Ajouter 10 mL de cDMEM frais à température ambiante.
  12. Replacer les cellules dans l'étuve et laisser les particules lentivirales s'accumuler dans le milieu de culture pendant 36 h.
    NOTE : Dans ces conditions, on estime que le surnageant lentiviral non concentré produit environ 1,0 × 106 unités transduisantes (TU)/mL après 48 h, bien que le titre réel doive être déterminé expérimentalement comme décrit par Kutner et al.35 ou Barde et al.36. Conserver le surnageant lentiviral à −80 °C jusqu'à 2 ans. Éviter les cycles répétés de congélation-décongélation, car ils peuvent réduire le titre viral d'environ 55 %37,38,39,40.

3. Récupération du lentivirus codant pour l'ARNg spécifique de Cas9 et transduction des cellules cibles

  1. Ensemencer 1,0 × 106 cellules cibles adhérentes dans une boîte de culture tissulaire de 10 cm.
  2. Incuber les cellules cibles pendant 12 h avant la transduction lentivirale.
    NOTE : Les cellules cibles sont des cellules HEK293 exprimant de façon stable la Cas9 de Streptococcus pyogenes, un ARN guide ciblant CUL4B (Tableau 1) et un gène de résistance à la puromycine (PuroR). Maintenir les cellules dans du cDMEM contenant 10 µg/mL de puromycine et vérifier l'invalidation de CUL4B par analyse de western blot avant l'auto-inactivation de Cas9. Réaliser toutes les expériences ultérieures avec des cellules HEK293ΔCUL4B de bas passage.
  3. Récupérer le milieu contenant le lentivirus en transférant soigneusement le surnageant des cellules productrices HEK293FT dans un tube conique stérile de 15 mL, en prenant soin de ne pas perturber la monocouche cellulaire.
    NOTE : Jeter les cellules productrices HEK293FT conformément aux directives de biosécurité établies32.
  4. Centrifuger le surnageant recueilli à 1 000 × g pendant 10 min à température ambiante (TA) afin de former un culot avec les cellules productrices résiduelles HEK293FT.
  5. Aspirer et éliminer le milieu de culture des cellules HEK293ΔCUL4B précédemment ensemencées.
  6. Transférer 7 mL du surnageant lentiviral clarifié dans la boîte de 10 cm contenant les cellules HEK293ΔCUL4B. Éviter de perturber le culot au fond du tube de centrifugation et laisser au moins 1 mL de surnageant résiduel pour minimiser le transfert de cellules productrices.
    NOTE : Si désiré, filtrer le surnageant à travers un filtre de 0,45 µm pour éliminer davantage les cellules productrices résiduelles. Jeter le surnageant restant conformément aux directives de biosécurité32. Avec un titre estimé à 1,0 × 106 U.T./mL, un inoculum de 7 mL devrait produire une multiplicité d'infection (MOI) comprise entre 3,5 et 5,541.
  7. Incuber les cellules HEK293ΔCUL4B transduites pendant 24 h pour permettre une transduction et une intégration lentivirales complètes.
  8. Aspirer et éliminer le surnageant viral.
  9. Laver les cellules une fois avec 10 mL de PBS 1× stérile à température ambiante.
  10. Aspirer et éliminer le PBS.
  11. Ajouter 10 mL de cDMEM frais à température ambiante.
  12. Replacer les cellules dans l'incubateur et les cultiver pendant quatre jours pour permettre l'expression du transgène et l'invalidation de Cas9.
    NOTE : Si le vecteur lentiviral d'ARN guide Cas9 ne code pas pour un marqueur fluorescent, transduire une culture sentinelle parallèle avec un vecteur lentiviral similaire exprimant un marqueur fluorescent. Utiliser la culture sentinelle pour estimer l'efficacité de transduction et le moment de l'appauvrissement du gène cible par microscopie à fluorescence qualitative ou cytométrie en flux quantitative. Dans cette étude, l'expression de la GFP a été facilement détectée par microscopie à fluorescence quatre jours après la transduction.

4. Sélection par antibiotique des transductants contenant un ARN guide spécifique de Cas9

REMARQUE : Quatre jours après la transduction, les cellules cibles doivent être confluentes ou presque confluentes et doivent être transférées dans un flacon de culture plus grand. Effectuez le transfert des cellules simultanément avec l'initiation de la sélection par antibiotique.

  1. Aspirez et jetez le milieu de culture des cellules HEK293ΔCUL4B .
  2. Lavez les cellules une fois avec 10 mL de solution saline tamponnée au phosphate stérile (PBS) 1× à température ambiante.
  3. Aspirez et jetez le PBS.
  4. Ajoutez 2 mL de solution stérile de trypsine-EDTA à température ambiante dans la boîte de culture.
  5. Incubez les cellules pendant 5 min pour favoriser leur détachement.
  6. Ajoutez 8 mL de DMEM complété (cDMEM) à température ambiante pour neutraliser la trypsine.
  7. Transférez la suspension cellulaire dans un tube conique stérile de 15 mL.
  8. Effectuez 15 à 20 aspirations et expulsions pour dissocier complètement les agrégats cellulaires.
  9. Centrifugez les cellules à 200 × g pendant 10 min à température ambiante.
  10. Pendant la centrifugation, préparez un flacon de culture tissulaire T150 contenant 20 mL de cDMEM supplémenté avec 250 µg/mL d'hygromycine B.
    NOTE : La concentration d'hygromycine B nécessaire pour la sélection peut varier selon les types cellulaires. Réalisez une courbe de mort en utilisant une gamme de 50 à 500 µg/mL d'hygromycine B afin de déterminer la concentration minimale nécessaire pour éliminer toutes les cellules non transduites en 7 à 10 jours. Si un marqueur de résistance à un autre antibiotique est utilisé dans le vecteur d'ARNg Cas9, effectuez une courbe de mort avec 2 à 10 µg/mL de blasticidine S, 400 à 800 µg/mL de G418/Geneticin ou 50 à 400 µg/mL de zéocine.
  11. Aspirez et jetez le surnageant sans perturber le culot cellulaire.
  12. Resuspendez le culot cellulaire dans 10 mL de cDMEM supplémenté avec 250 µg/mL d'hygromycine B.
  13. Transférez la suspension cellulaire de 10 mL dans le flacon T150 préparé contenant 20 mL de milieu de sélection.
  14. Balayez doucement le flacon pour répartir les cellules uniformément.
  15. Incubez les cellules sous sélection pendant trois jours.
  16. Au jour 3 de la sélection, aspirez le milieu de sélection et remplacez-le par 30 mL de cDMEM frais supplémenté avec 250 µg/mL d'hygromycine B.
    NOTE : Le remplacement du milieu de sélection permet d'éliminer les cellules mortes non adhérentes, de renouveler les nutriments et de maintenir l'activité de l'antibiotique.
  17. Poursuivez l'incubation jusqu'à ce que la monocouche de cellules survivantes atteigne environ 90 % de confluence, généralement après quatre jours supplémentaires.

5. Validation de l'élimination de Cas9 et de la récupération de CUL4B in trans

REMARQUE : Une fois que les cellules atteignent environ 90 % de confluence, confirmez l'ablation de Cas9 dans les expériences initiales, puis cryopréservez immédiatement la population cellulaire restante42. Cette approche minimise le développement de mécanismes compensatoires secondaires.

  1. Séparer les HEK293 à un stade précoce de passageΔCUL4B cellules exprimant de manière stable une gRNA ciblant Cas9 (désormais appelées HEK293ΔCUL4BΔcas9) dans quatre puits d'une plaque de culture de tissus traitée à 6 puits à une densité de 2,5 × 105 cellules par puits
  2. Séminer des HEK293ΔCUL4B des cellules dans quatre puits d'une plaque 6 puits distincte. Ensemencer des cellules HEK293 parentales dans au moins un puits supplémentaire afin de servir de témoin.
    REMARQUE : Utilisez les HEK293ΔCUL4B et des cultures parentales HEK293 comme témoins pour l'expression de Cas9 et de CUL4B, respectivement.
  3. Incuber toutes les cultures pendant 12 h afin de permettre une adhésion cellulaire complète et une prolifération active.
  4. Préparer des mélanges de transfection au phosphate de calcium (CaPhos) contenant 0, 0,5, 1,0 ou 2.0 µg de pCMV-FLAG-CUL4B. Ajuster chaque mélange à un total constant de 10 µg ADN plasmidique en ajoutant un vecteur pCMV vide.
  5. Diluer chaque mélange d'ADN dans de l'eau stérile de qualité biologie moléculaire jusqu'à un volume final de 180 µL, ajouter 20 µL de CaCl₂ 2,5 M2, puis ajouter 200 µL de 2× solution saline tamponnée à l'HEPES (HBS ; pH 7,05) pour obtenir un volume final de 400 µL dans un tube microcentrifuge de 1,5 mL.
    REMARQUE : Lorsque vous utilisez des plasmides d'expression sous la dépendance de promoteurs forts (par exemple, CMV), effectuez une titration de l'ADN afin d'obtenir des niveaux d'expression protéique comparables à ceux de l'expression endogène. Utilisez de l'ADN plasmidique vérifié par séquençage, principalement en forme superenroulée, avec des rapports A260/A280 compris entre 1,8 et 2,0, des rapports A260/A230 compris entre 2,0 et 2,2, et un taux d'endotoxines inférieur à <0,1 UE/µg.
  6. Mélanger chaque solution de transfection CaPhos soigneusement par pipetage doux.
  7. Ajouter 200 µL de chaque mélange de transfection, goutte à goutte, dans le puits désigné contenant des HEK293ΔCUL4BΔcas9 cellules. Changer les embouts de pipette entre chaque échantillon afin d'éviter toute contamination croisée.
  8. Ajouter le reste 200 µL de chaque mélange de transfection correspondant, goutte à goutte, dans le puits désigné contenant des HEK293ΔCUL4B cellules
  9. Incuber les cultures transfectées pendant 12 h.
  10. Aspirez le milieu de culture de chaque puits.
  11. Laver les cellules une fois avec 1 mL de solution stérile à température ambiante de 1× PBS
  12. Aspirez et jetez le PBS.
  13. Ajouter 2 mL de cDMEM frais à température ambiante dans chaque puits.
  14. Incuber les cultures pendant 24 heures supplémentaires afin de permettre l'expression de CUL4B et les réponses fonctionnelles en aval.
  15. Récolter les cellules en utilisant des procédures standards de trypsination.
  16. Transférer chaque suspension cellulaire dans un tube microcentrifuge individuel de 1,5 mL.
  17. Laver chaque suspension cellulaire une fois avec 1× PBS.
  18. Pulser brièvement les échantillons à 14 000 × g à température ambiante pour former un culot cellulaire.
  19. Aspirez et jetez le surnageant de PBS.
    ATTENTION : βLe 2-mercaptoéthanol est un irritant volatil de la peau et des voies respiratoires, doté d'une forte odeur. Manipulez les solutions mères dans une hotte chimique certifiée tout en portant des équipements de protection individuelle adaptés, notamment des gants résistants aux produits chimiques, une blouse de laboratoire et des lunettes de sécurité. Éliminez les pointes, tubes et déchets contaminés conformément aux directives institutionnelles relatives aux déchets dangereux.
  20. Lysez chaque culot cellulaire directement dans 200 µL Tampon d'échantillonnage de Laemmli supplémenté avec 5 % (v/v) β-mercaptoéthanol
  21. Dénaturer les protéines en chauffant les échantillons à 95 °C pendant 15 min.
  22. Résoudre 20–40 µg de protéines totales par puits par électrophorèse standard sur gel de polyacrylamide en présence de dodécylsulfate de sodium (SDS-PAGE).
  23. Transférez les protéines résolues sur une membrane de fluorure de polyvinylidène (PVDF).
  24. Bloquer la membrane pendant 30 min à température ambiante à l'aide du tampon de blocage.
    REMARQUE : Préparer le tampon de blocage en utilisant soit 5 % (p/v) de lait écrémé en poudre, soit 5 % (p/v) d'albumine sérique bovine (BSA) dissous dans du tampon de lavage standard (0,1 % de Tween 20 dans l'un ou l'autre)× Solution saline tamponnée au Tris ou 1× PBS).
  25. Laver la membrane trois fois pendant 10 min chacune en utilisant le tampon de lavage standard.
  26. Incuber la membrane avec des anticorps primaires dirigés contre CUL4B, Cas9, WDR5, CDC6, ou α-TUBULINE pendant 12 h à 4 °C avec agitation douce
    REMARQUE : Diluez les anticorps primaires au 1:1 000 dans le tampon de lavage standard.
  27. Retirer la solution d'anticorps primaire et laver la membrane trois fois pendant 10 min chacun en utilisant un tampon de lavage standard.
  28. Incuber la membrane avec l'anticorps secondaire anti-souris ou anti-lapin IgG conjugué à la peroxydase de raifort (HRP) approprié pendant 12 h à 4 °C avec agitation douce
    REMARQUE : Diluez les anticorps secondaires au 1/3 000 dans le tampon de blocage.
  29. Retirer la solution d'anticorps secondaire et laver la membrane trois fois pendant 10 min chacun en utilisant le tampon de lavage standard.
  30. Appliquer uniformément le substrat chimiluminescent amélioré (ECL) sur la membrane et incuber pendant 1 min.
  31. Capturer les signaux chimiluminescents à l'aide d'un système d'imagerie numérique.
    REMARQUE : Si désiré, confirmer l'invalidation génique réussie par séquençage de Sanger de la région génomique ciblée après amplification par PCR de l'ADN génomique isolé43.

Résultats

Pour générer des lignées d'extinction avec Cas9 inactivée destinées à la reconstitution expérimentale, un lentivirus codant pour un ARN guide ciblant Cas9 (Cas9 gRNA1_pLentiGuide-Hygro) a été produit dans des cellules HEK293FT à l'aide de plasmides d'emballage standards (pLP1, pLP2 et pLP/VSVG). Le surnageant viral obtenu a été récupéré et utilisé pour transduire les cellules cibles. La survie lors de la sélection par l'hygromycine B a confirmé une transduction lentivirale réussie, et une analyse par immunoblot ultérieure a vérifié l'ablation de Cas9 (Figure 1).

La protéine CUL4B était facilement détectable dans les cellules HEK293 parentales, mais absente des cellules HEK293 transfectées avec un vecteur vide.ΔCUL4B et HEK293ΔCUL4BΔCas9 cellules. Conformément à la perte de CUL4B, WDR5 et CDC6 ont présenté respectivement des augmentations et des diminutions attendues de leur expression à l'état d'équilibre, confirmant ainsi la perturbation de la fonction de CUL4B. La protéine Cas9 a été détectée dans les cellules HEK293ΔCUL4B des cellules, mais était indétectable dans les cellules HEK293 parentales et HEK293ΔCUL4BΔcas9 cellules, confirmant une ablacion réussie de Cas9. Comme prévu, la transfection du plasmide d'expression de CUL4B dans des HEK293ΔCUL4B les cellules ont entraîné une restauration minimale de l'expression de la protéine CUL4B. En revanche, une expression forte de CUL4B a été observée après transfection des cellules HEK293ΔCUL4BΔCas9 des cellules, accompagnée de la restauration de l'expression protéique en aval, comme en témoignent une réduction des niveaux de WDR5 et une augmentation de ceux de CDC6. Ensemble, ces résultats démontrent que l'ablacion de Cas9 permet une restauration efficace de l'expression et de la fonction de CUL4B en empêchant le clivage du plasmide de secours par Cas9 (Figure 2).

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Figure 1 : Flux expérimental pour l'ablation ciblée de Cas9 et la validation de la récupération par CUL4B. Ce flux expérimental décrit la génération de cellules CRISPR invalidées pour Cas9 par co-transfection de cellules productrices HEK293FT avec les vecteurs pLP1, pLP2, pLP/VSVG et un construct Cas9 gRNA1_pLentiGuide-Hygro par transfection au phosphate de calcium. Le surnageant lentiviral obtenu est récupéré, centrifugé pour éliminer les cellules productrices résiduelles, puis utilisé pour transduire les cellules cibles. Après sélection, l'ablation réussie de Cas9 est confirmée par analyse en immunotransfert (western blot) afin d'obtenir une lignée cellulaire invalide pure, prête pour la reconstitution expérimentale de CUL4B. Veuillez cliquer ici pour visualiser une version agrandie de cette figure.

figure-results-2
Figure 2 : Récupération de l'expression et de la fonction de CUL4B dans des cellules HEK293 modifiées par CRISPR-Cas9. (A) Schéma expérimental du protocole de transfection. Des cellules HEK293ΔCUL4B   et HEK293ΔCUL4BΔcas9 ont été transfectées soit avec un vecteur vide, soit avec des quantités croissantes de pCMV-FLAG-CUL4B. Les cellules ont été récoltées 36 h après la transfection, et les protéines des lysats ont été séparées par électrophorèse sur gel de SDS-PAGE. (B) Analyse par immunotransfert de l'efficacité de récupération et des contrôles fonctionnels en aval. Les protéines indiquées ont été visualisées par immunotransfert. WDR5 et CDC6 ont servi de contrôles de la fonction de CUL4B. α-TUBULIN a servi de contrôle de chargement. Des cellules HEK293 parentales ont servi de contrôle pour l'expression de base. Les immunotransferts sont représentatifs d'expériences répétées (n = 2). Veuillez cliquer ici pour visualiser une version agrandie de cette figure.

Gène cibleSéquence d'ARNg (5′→3′)PAM (5′→3′)Position de la cibleDescription de la cible
CUL4BATCAAACCCTACAAACTCCAAGGXq24 Exon 3Région N-terminale du cadre ouvert de lecture (ORF) humain CUL4B pour un knockout par décalage du cadre de lecture
cas9CGTGATCACCGACGAGTACAAGGORF (hSpCas9)Région interne conservée du transgène cas9 pour induire des indels auto-inactivateurs

Tableau 1 : Séquences d'ARN guide CRISPR-Cas9 et spécifications des cibles génomiques.

Discussion

Ce protocole a permis une restauration robuste de l'expression et de la fonction de la protéine cible dans des lignées cellulaires invalidées par édition CRISPR-Cas9, dans lesquelles Cas9 avait été éliminée après l'édition. Une observation marquante de cette étude est le degré important avec lequel l'expression constitutive de Cas9 supprime l'expression du transgène dirigée par un plasmide. La force de ce protocole réside dans sa capacité à restaurer à la fois la protéine perdue et le phénotype associé. Cette méthode établit également un cadre pour l'exploration phénotypique d'une grande variété de modifications protéiques. Par exemple, l'introduction d'une variante mimant la phosphorylation (par exemple, la substitution d'une sérine par un acide aspartique) peut fournir des informations précieuses sur le rôle de cette modification post-traductionnelle, sans l'interférence du fond génétique de la protéine native.

Par conséquent, ce protocole est largement applicable aux lignées cellulaires adhérentes standard (par exemple, HeLa, A549) et en suspension (par exemple, Jurkat, THP-1). Toutefois, ce cadre de sélection séquentielle pourrait s'avérer peu pratique pour les cellules primaires ou non divisantes (par exemple, neurones primaires ou macrophages). Dans ces systèmes sensibles, l'élimination rapide des cellules témoins non transduites libère des débris cytotoxiques et des signaux de stress pro-apoptotiques dans le microenvironnement partagé, induisant une toxicité indirecte46,47. Il pourrait également échouer dans les lignées cancéreuses hautement adaptables et aneuploïdes (par exemple, glioblastome U87 ou mélanome A375) qui ont tendance à échapper aux phénotypes médiés par CRISPR par des réarrangements chromosomiques rapides ou par la sélection rapide de clones résistants préexistants48,49. En définitive, l'adéquation dépend de la capacité d'une lignée cellulaire à tolérer la charge métabolique d'une expression par double vecteur, à résister à ces pressions de sélection indirectes et à maintenir des cinétiques de croissance stables tout au long du protocole s'étalant sur plusieurs semaines.

Bien que cette approche constitue une preuve de concept polyvalente pour la plupart des lignées cellulaires, sa mise en œuvre nécessite un équilibre minutieux entre efficacité de délivrance et intégrité génomique. Comme indiqué, l'utilisation d'une délivrance lentivirale pour un ARN guide dirigé contre le « soi » permet d'obtenir une population homogène de cellules dépourvues de Cas9, notamment dans les cellules difficiles à transfecter. Toutefois, le risque de mutagenèse par insertion lié à l'intégration semi-aléatoire reste une préoccupation. Ces risques peuvent être maîtrisés en optimisant le MOI. Dans des lignées perméables comme les HEK293, un MOI compris entre 1 et 5 permet d'atteindre une forte saturation tout en minimisant la mutagenèse induite par intégration et la cytotoxicité41. En revanche, les cellules immunitaires ou neuronales réfractaires nécessitent généralement des MOI compris entre 10 et 50, ce qui implique souvent l'utilisation d'agents facilitateurs tels que la polybrene et/ou la spinoculation pour atteindre des efficacités comparables50,51,52,53,54,55.

Ce compromis technique s'étend au choix entre des populations polyclonales et monoclonales. Les cellules HEK293ΔCUL4BΔcas9 générées ici sont polyclonales, un choix qui accélère les délais expérimentaux en évitant la phase d'expansion, longue de plusieurs semaines, nécessaire au sous-clonage à partir d'une cellule unique. De plus, un pool polyclonal reflète le phénotype moyen de la culture, atténuant efficacement les artefacts clonaux ou les problèmes liés à l'intégration spécifique à un site donné. Bien que les lignées monoclonales soient plus susceptibles de fournir des résultats reproductibles grâce à leur homogénéité génétique, les résultats présentés ici suggèrent que la sélection polyclonale constitue une alternative viable, et souvent préférable, lorsque la rapidité et la représentativité de la population sont prioritaires.

La stabilité temporelle du phénotype obtenu peut également constituer une variable critique. Dans le système présenté ici, l'impact régulateur de CUL4B sur WDR5 et CDC6 a diminué au cours des passages successifs des lignées cellulaires invalidées, ce qui correspond à une régulation compensatoire à la hausse du paralogue CUL4A (données non montrées). Ce résultat reflète les observations de Nakagawa et al., qui ont montré que CUL4A peut partiellement restaurer la fonction de CUL4B dans des cellules appauvries en CUL4B44. Une telle compensation homéostatique est fréquente en biologie cellulaire, en particulier lorsqu'on cible une protéine présentant une forte homologie structurale et une redondance fonctionnelle avec d'autres protéines cellulaires.

Pour contourner ces mécanismes compensatoires secondaires, deux approches stratégiques distinctes peuvent être employées, selon les objectifs expérimentaux et la lignée cellulaire utilisée. Pour les chercheurs privilégiant l'efficacité ou travaillant avec des lignées cellulaires très adaptatives, un calendrier expérimental condensé est essentiel. Cette stratégie implique une validation immédiate de la perte de la protéine cible, idéalement dès que la culture atteint une confluence de 90 % après sélection, suivie rapidement d'une cible Cas9 auto-inactivante et de tests fonctionnels. En adoptant ce protocole accéléré, on a plus de chances de capturer les conséquences biologiques primaires du knockout avant que les mécanismes d'homéostasie cellulaire n'aient suffisamment de temps pour surexprimer des paralogues redondants ou autrement biaiser le phénotype observé.

Alternativement, pour les études nécessitant une stabilité à long terme ou des expériences de complémentation haute précision, notamment dans les modèles réfractaires à la transfection tels que les cellules immunitaires et neuronales, un système contrôlé par la tétracycline (Tet-On/Off) offre une solution viable56,57. Bien que la mise en œuvre de ce cadre inductible nécessite des cycles supplémentaires de transduction lentivirale et l'utilisation de marqueurs de résistance antibiotique distincts, il permet une restauration prolongée de la protéine cible afin de stabiliser l'environnement cellulaire avant de déclencher des événements transitoires de « perte et complémentation » médiés par la doxycycline57.

Déclarations de divulgation

Les auteurs ont utilisé Google Gemini pour aider à affiner la terminologie technique et à réviser le manuscrit. L'IA a été utilisée comme un outil d'amélioration linguistique et n'a pas contribué à la synthèse originale des données, à la conception de l'étude ou à la rédaction initiale du texte. Les auteurs ont examiné et modifié les sorties et assument l'entière responsabilité du contenu du manuscrit final. Les auteurs déclarent ne pas avoir de conflit d'intérêts.

Remerciements

Ce travail a été soutenu par des fonds de démarrage fournis par le Le Moyne College, le Comité de recherche et de développement du Le Moyne College, le Comité de recherche étudiante du Le Moyne College, le Fonds du Walter L. '66 et MaryAnne Poland Jesuit Center for Research and Teaching Innovation, ainsi que par le Département des sciences biologiques et environnementales du Le Moyne College. Les auteurs reconnaissent l'utilisation de BioRender.com pour la préparation des illustrations graphiques. La figure 1 a été créée dans BioRender (Sharifi, J., 2026 ; https://BioRender.com/72u0wl3), et le panneau supérieur de la figure 2 a été créé dans BioRender (Sharifi, J., 2026 ; https://BioRender.com/lc6o2lu).

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
anticorps anti-Cas9Cell Signaling65832Cet anticorps monoclonal de souris permet une détection spécifique de Cas9 de S. pyogenes dans des lysats humains, ce qui le rend idéal pour vérifier l'élimination de Cas9 médiée par ARN guide auto-ciblant.
anticorps anti-CDC6Cell Signaling3387Cet anticorps monoclonal de lapin permet une détection spécifique de CDC6 humain, ce qui le rend idéal pour surveiller les effets fonctionnels en aval de CUL4B.
anticorps anti-CUL4BSigma-AldrichC9995Cet anticorps polyclonal de lapin purifié par affinité permet une détection spécifique de CUL4B humain sans réaction croisée avec son paralogue étroitement apparenté CUL4A.
anticorps secondaire anti-IgG de souris conjugué à la peroxydase de raifort (HRP)Cell Signaling7076Cet anticorps IgG de souris anti-souris est conjugué à la peroxydase de raifort (HRP) et optimisé pour la détection chimiluminescente d'anticorps primaires monoclonaux de souris.
anticorps secondaire anti-IgG de lapin conjugué à la peroxydase de raifort (HRP)Cell Signaling7074Cet anticorps IgG de chèvre anti-lapin est conjugué à la peroxydase de raifort (HRP) et optimisé pour la détection chimiluminescente d'anticorps primaires polyclonaux et monoclonaux de lapin.
anticorps anti-WDR5Cell Signaling13105Cet anticorps monoclonal de lapin permet une détection spécifique de WDR5 humain, ce qui le rend idéal pour surveiller les effets fonctionnels en aval de CUL4B.
anticorps anti-α-TUBULINECell Signaling3873Cet anticorps monoclonal de souris cible la tubuline alpha humaine et est idéal comme contrôle de chargement uniforme pour la normalisation en analyse Western blot.
Kits de transfection au phosphate de calciumThermoFisher ScientificK278001Ce kit fournit des réactifs de transfection transitoire efficaces, optimisés pour la production échelonnée et rentable de vecteurs lentiviraux dans des cellules productrices adhérentes HEK293FT.
Cas9 gRNA1_pLentiGuide-HygroGenScript Biotech Corporation synthèse sur mesureséquence d'ARN guide Cas9 : CGTGATCACCGACGAGTACA, séquence PAM : AGG
Cas9 gRNA1_pLentiGuide-PuroGenScript Biotech Corporation synthèse sur mesureséquence d'ARN guide Cas9 : CGTGATCACCGACGAGTACA, séquence PAM : AGG
Milieu de culture de Dulbecco modifié (DMEM) GibcoD5796Ce milieu riche en glucose, supplémenté en L-glutamine et en pyruvate de sodium, est optimisé pour maintenir la croissance, la viabilité et la stabilité métabolique des lignées cellulaires mammales à prolifération rapide (par exemple, HEK293FT).
Sérum de veau fœtal, qualité premium (inactivé par la chaleur)Corning35-016-CVCe sérum de qualité premium, inactivé par la chaleur, fournit des facteurs de croissance et des hormones essentiels tout en minimisant la cytotoxicité médiée par le complément pour les lignées cellulaires mammales.
HEK293American Type Culture CollectionCRL-1573Cette lignée cellulaire bien caractérisée de rein embryonnaire humain est hautement transfectable et sert de modèle robuste et standard pour étudier les phénotypes de knock-out génique et les cadres de sauvetage protéique.
Cellules HEK293FT ThermoFisher ScientificR70007Cette variante à croissance rapide et hautement transfectable de la lignée de rein embryonnaire humain exprime de façon stable l'antigène T majeur du SV40, ce qui la rend optimale pour maximiser les titres viraux lors de la production de vecteurs lentiviraux.
Hygromycine BsigmaaldrichH7772Cet antibiotique aminonucléoside est utilisé comme agent de sélection en culture cellulaire mammaire pour isoler des transductants stables exprimant le marqueur de résistance à l'hygromycine.
plasmide pCLIP-All-hCMV-Puro (gRNA CUL4B)Skyang Bio LLCsgRNA3:1019408_bséquence d'ARN guide CUL4B : ATCAAACCCTACAAACTCCA, séquence PAM : AGG
pCMV-FLAGCUL4BN/AN/ACe plasmide d'expression mammalienne utilise un promoteur du cytomégalovirus (CMV) pour induire l'expression constitutive d'une protéine Culline 4B (CUL4B) marquée par un tag FLAG, et est un don de Jianping Jin.
Vecteur d'expression mammalienne pCMV-M1Addgene23007Vecteur de contrôle vide (don de Linda Wordeman)
pLentiGuide-PuroAddgene52963Ce vecteur de transfert lentiviral permet l'expression, sous le promoteur U6 humain, d'un ARN guide personnalisable, ainsi que l'expression, sous le promoteur EF-alpha, d'un marqueur de résistance à la puromycine, pour le ciblage CRISPR dans des cellules exprimant Cas9, et est un don de Feng Zhang.
pLX302 EGFP-V5Addgene141348 Vecteur lentiviral codant pour la GFP, utilisé pour évaluer l'efficacité de transduction (don de Kevin Janes)
PuromycineSigma-AldrichP8833Cet antibiotique aminonucléoside est utilisé comme agent de sélection en culture cellulaire mammaire pour isoler des transductants stables exprimant le marqueur de résistance à la puromycine.
Solution tampon saline phosphate stérile (PBS)Corning21-040-CVCette solution saline équilibrée standard est utilisée pour laver les monocouches cellulaires afin d'éliminer efficacement les traces de milieu de culture, de protéines sériques ou d'enzymes, sans perturber la pression osmotique ni la viabilité cellulaire.
Trypsine EDTA 1XCorning25-051-CICette solution enzymatique de dissociation standard est utilisée pour détacher les cellules mammales adhérentes des récipients de culture en clivant les liaisons peptidiques, tandis que l'EDTA chélate les cations divalents pour perturber l'adhésion intercellulaire.
Mélange d'emballage lentiviral ViraPowerThermoFisher ScientificK497500Ce mélange optimisé de plasmides d'emballage (pLP1, pLP2 et pLP/VSVG) est utilisé pour la co-transfection dans des cellules productrices afin de faciliter l'assemblage à haut titre et la production de vecteurs d'expression lentiviraux non réplicatifs.

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