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Détection des antigènes des cellules immunitaires intratumorales dans un modèle de cellules souches de glioblastome immunocompétent utilisant l'immunohistochimie basée sur un substrat

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DOI :

10.3791/72193

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21 août 2026

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1Department of Biology, North Carolina Agricultural and Technical State University, 2Brain Tumor Research Center, Department of Neurosurgery, Massachusetts General Hospital and Harvard Medical School

Dans cet article

Résumé

L'étude décrit un protocole immunohistochimique reproductible, basé sur un substrat, permettant une détection fiable d'antigènes uniques ou doubles dans des coupes de tissu tumoral dérivé de cellules souches de glioblastome, fixées au formol et incluses en paraffine (FFPE). Ce protocole facilite l'identification de divers marqueurs tumoraux et immunitaires tout en surmontant des difficultés techniques, et pourrait être utilisé dans d'autres modèles de tumeurs.

Résumé

Le glioblastome (GBM) est la tumeur cérébrale primitive la plus fréquente et la plus létale, et il manque actuellement de thérapies efficaces. Il se caractérise par un microenvironnement tumoral profondément immunosuppresseur, en partie induit par les cellules souches-like du GBM (GSC) résistantes aux traitements. Nous décrivons ici des protocoles reproductibles d'immunohistochimie (IHC) monoculaire et biculaire basés sur des substrats, permettant la détection d'antigènes de surface et intracellulaires associés aux cellules immunitaires infiltrant la tumeur, sur des sections de tumeurs cérébrales fixées au formol et incluses en paraffine (FFPE). Les tumeurs cérébrales proviennent de GSC murines implantées de manière orthotopique chez des souris immunocompétentes. Le protocole d'IHC monoculaire utilise un système de détection chromogène basé sur la peroxydase de raifort (HRP) pour visualiser individuellement les antigènes des cellules immunitaires, tandis que le protocole d'IHC biculaire emploie une stratégie de coloration séquentielle basée sur la phosphatase alcaline (AP) afin de détecter simultanément deux antigènes de cellules immunitaires dans la même section tissulaire, y compris dans des protocoles utilisant des anticorps primaires d'origine d'hôte identique. Ces méthodes fournissent un cadre pratique et reproductible pour l'analyse chromogène d'antigènes associés aux cellules immunitaires infiltrant la tumeur dans les tissus de GBM, et pourraient être adaptées à d'autres modèles précliniques de tumeurs et potentiellement à des échantillons humains FFPE.

Introduction

Le glioblastome (GBM) est une tumeur cérébrale primitive maligne agressive, hautement invasive et hétérogène, associée à une faible survie des patients malgré les thérapies actuelles considérées comme standard1. Une caractéristique fondamentale du GBM est son microenvironnement tumoral (TME) profondément immunosuppresseur, qui contribue à la résistance aux stratégies d'immunothérapie2,3. Plusieurs mécanismes sont à l'origine de l'immunosuppression dans le GBM, notamment une infiltration réduite des lymphocytes T effecteurs et l'induction d'une dysfonction et d'une exhaustion des lymphocytes T4. De plus, les cellules souches-like du GBM (GSC), une sous-population de cellules de GBM, favorisent davantage l'échappement immunitaire en maintenant un TME immunologiquement « froid », caractérisé par une activité immunitaire cytotoxique limitée5. Ces caractéristiques soulignent l'importance d'une caractérisation précise des populations de cellules immunitaires infiltrant la tumeur ainsi que de leurs états fonctionnels dans le TME du GBM.

L'immunohistochimie (IHC) demeure l'une des méthodes les plus largement utilisées pour évaluer l'infiltration des cellules immunitaires dans les tissus tumoraux, car elle préserve l'architecture tissulaire tout en permettant la visualisation, la localisation et une évaluation semi-quantitative des marqueurs cellulaires in situ6,7,8,9,10,11,12. Des études antérieures d'immunohistochimie et de profilage immunitaire ont considérablement approfondi notre compréhension du paysage immunitaire du GBM et identifié des populations de cellules immunitaires associées à la progression tumorale et à la réponse thérapeutique12,13,14,15,16. L'IHC chromogénique monochromatique est particulièrement utile pour détecter des marqueurs immunitaires individuels dans des sections tissulaires fixées au formol et incluses en paraffine (FFPE)12,13,15,17,18,19,20. En revanche, l'IHC chromogénique bichromatique permet la visualisation simultanée de deux marqueurs dans la même section tissulaire, facilitant ainsi l'évaluation du phénotype cellulaire, de la prolifération ou de l'état d'activation12,19,21.

Malgré ces avancées, les protocoles d'immunohistochimie chromogénique basés sur des substrats pratiques et standardisés, applicables aux modèles de GBM dérivés de CSC immunocompétents, restent limités. De plus, l'immunohistochimie chromogénique est plus difficile à réaliser dans le GBM que dans de nombreuses autres tumeurs solides en raison de l'infiltration immunitaire clairsemée et hétérogène, de l'hétérogénéité intratumorale étendue et du microenvironnement tumoral fortement immunosuppresseur et complexe, ce qui complique la visualisation précise et l'interprétation de plusieurs populations cellulaires au sein d'une même coupe tissulaire2,3,4. L'immunohistochimie chromogénique double présente des défis techniques supplémentaires, notamment lorsque les deux anticorps primaires sont produits chez la même espèce hôte, nécessitant une optimisation minutieuse de la compatibilité des anticorps, une stratégie de coloration séquentielle pour la détection simultanée de deux antigènes dans une même section tissulaire, ainsi que le choix d'un substrat chromogénique permettant une discrimination claire des marqueurs en microscopie optique.

Ici, nous décrivons des protocoles immunohistochimiques reproductibles, basés sur un substrat, en simple et double coloration, permettant de détecter avec succès des antigènes représentatifs associés aux cellules immunitaires infiltrant les tumeurs, situés à la surface cellulaire ou à l'intérieur des cellules, dans un modèle orthotopique de GBM dérivé de cellules souches cancéreuses gliales 005 immunocompétent22,23,24. Ces protocoles immunohistochimiques chromogéniques basés sur un substrat peuvent également être adaptés à d'autres modèles tumoraux précliniques et potentiellement à des échantillons tumoraux humains en inclusion paraffine (FFPE). Les tissus cérébraux de souris prélevés ont été fixés dans du formol tamponné neutre à 10 % pendant une nuit (~12 h) avant un traitement tissulaire de routine et une inclusion dans la paraffine, comme décrit précédemment19. Les blocs FFPE ont été coupés en sections (épaisseur de 5 µm19) sur des lames de microscope en verre chargées positivement et stockés à température ambiante jusqu'à leur utilisation. L'immunohistochimie en simple coloration utilise un système de détection chromogénique basé sur la peroxydase de raifort (HRP) avec le 3,3′-diaminobenzidine (DAB) comme substrat afin de produire un signal brun visible en microscopie optique. Ce protocole convient à la détection d'antigènes associés à la membrane ainsi que d'antigènes intracellulaires dans des coupes de tissus FFPE.

L'IHC double couleur permet la détection simultanée de deux antigènes dans la même coupe de tissu, mais nécessite une optimisation supplémentaire pour garantir la compatibilité des anticorps et une séparation claire des signaux chromogéniques. La coloration IHC double couleur est relativement simple lorsque les anticorps primaires sont produits chez des espèces hôtes différentes, permettant ainsi l'utilisation d'anticorps secondaires spécifiques à chaque espèce. Toutefois, la détection simultanée devient plus délicate sur le plan technique lorsque les deux anticorps primaires proviennent de la même espèce hôte. Pour surmonter cette difficulté, le protocole d'IHC double couleur décrit ici utilise une stratégie de coloration chromogénique séquentielle basée sur la phosphatase alcaline (AP), avec des substrats distincts, afin de permettre une discrimination visuelle claire entre les deux signaux d'antigène en microscopie optique.

Les deux protocoles comprennent des étapes de déparaffinage, de réhydratation, de récupération des antigènes, de blocage, de coloration, de déshydratation, de clarification et de montage. La préparation des réactifs est cruciale pour la qualité et la reproductibilité de la coloration (voir Fichier Supplémentaire 1). De même, des dilutions appropriées des anticorps primaires sont également essentielles pour un protocole de coloration réussi, effectuées immédiatement avant utilisation dans 2,5 % de sérum de cheval ou de chèvre normal, selon l'espèce hôte de l'anticorps secondaire correspondant (voir Tableau 1). Une liste d'anticorps secondaires spécifiques à chaque espèce utilisés pour la coloration simple et double est également présentée dans le Tableau 2. L'IHC en une seule couleur utilise des réactifs de clarification et de montage à base de xylène, tandis que l'IHC en double couleur nécessite des alternatives sans xylène (par exemple, Histo-Clear), car le substrat est partiellement soluble dans le xylène (voir la liste des substrats dans le Tableau 3).

Protocole

Ce protocole a été réalisé conformément à toutes les directives réglementaires et institutionnelles pertinentes, y compris celles du comité institutionnel de soins et d'utilisation des animaux (IACUC) (numéros de protocole IACUC : 2004N000067 et LA24-0045).

REMARQUE : Plusieurs étapes des protocoles d'IHC simple et double coloration impliquent des réactifs inflammables, notamment l'éthanol et les agents de clarification des tissus. En conséquence, les procédures utilisant des produits chimiques inflammables, y compris la déparaffinisation, la réhydratation, la déshydratation, la clarification et le montage, doivent être effectuées dans une hotte chimique certifiée, en respectant les pratiques de sécurité en laboratoire appropriées. Les réactifs inflammables doivent être préparés et stockés dans des récipients en verre à bouchon vissé correctement étiquetés, placés dans des armoires de stockage désignées pour les substances inflammables, conformément aux directives institutionnelles de sécurité. Les matériaux et volumes de réactifs sont configurés pour un traitement par lots allant jusqu'à 48 lames microscopiques (deux supports de coloration, 24 lames par support), bien que le protocole puisse facilement être adapté en fonction des besoins expérimentaux.

1. IHC monocouleur pour coupes de tumeur cérébrale en inclusion formol-paraffine

REMARQUE : Le protocole suivant décrit une IHC monochromatique basée sur un substrat pour la détection d'antigènes membranaires et intracellulaires représentatifs dans des sections de tumeurs cérébrales en inclusion paraffinique (FFPE) provenant du modèle orthotopique de cellules souches cancéreuses 005.

  1. Déparaffinage (20 min) :
    1. Placer les lames dans un porte-lames en polyoxyméthylène (POM) et immerger le porte-lames dans des récipients de coloration, d'abord dans le xylène I, puis dans le xylène II, pendant 10 min chacun dans une hotte chimique. Veiller à ce que les coupes tissulaires restent entièrement immergées dans le xylène pendant le déparaffinage.
      PRÉCAUTION : Effectuer cette étape sous une hotte chimique avec des équipements de protection individuelle (EPI) appropriés, y compris une blouse de laboratoire, des lunettes de protection, un masque facial et des gants. Ne pas laisser les coupes sécher à ce stade ni aux étapes suivantes, car cela pourrait endommager les tissus et entraîner la perte des coupes. Conserver les solutions de xylène dans des récipients en verre hermétiques et les réutiliser si elles apparaissent propres.
  2. Réhydratation progressive (15 min) :
    1. Réhydrater les coupes successivement dans de l'éthanol à 100 %, 90 % et 70 %, pendant 5 min chacun. Pour cela, immerger les lames dans de l'éthanol à 100 % dans le récipient de coloration pendant 5 min (puis remettre l'éthanol à 100 % dans la bouteille en verre pour réutilisation), suivis de l'éthanol à 90 % pendant 5 min (puis remettre dans la bouteille), et enfin de l'éthanol à 70 % pendant 5 min (puis remettre dans la bouteille).
      PRÉCAUTION : Effectuer cette étape sous une hotte chimique et utiliser les EPI comme à l'étape 1.1. Ces solutions d'éthanol peuvent être réutilisées entre différentes expériences si elles sont conservées dans des récipients en verre hermétiques, à condition qu'elles apparaissent propres.
  3. Rinçage à l'eau (5 min) :
    1. Placer les lames dans de l'eau distillée pendant 5 min ; ceci achève le processus de réhydratation.
      REMARQUE : Pendant cette étape, préparer 600 mL (pour 1 porte-lames) à 800 mL (pour 2 porte-lames) de solution tampon de récupération d'antigène 1× (tampon citrate de sodium 10 mM) dans un bécher en verre de 2 L pouvant aller au micro-ondes, selon les instructions indiquées dans le fichier supplémentaire 1.
  4. Récupération d'antigène (~20 min) :
    1. Couvrir le bécher de 2 L contenant la solution fraîchement préparée de tampon de récupération d'antigène au citrate de sodium 10 mM avec un film plastique afin d'éviter une évaporation excessive pendant le préchauffage et le chauffage prolongé au micro-ondes.
    2. Faire quelques trous dans le film plastique pour empêcher le tampon de jaillir en raison de la pression excessive générée lors de l'ébullition des coupes tissulaires.
      REMARQUE : Utiliser les EPI comme à l'étape 1.1.
    3. Préchauffer la solution fraîchement préparée de tampon de récupération d'antigène au citrate de sodium 10 mM pendant 3 min. Placer le porte-lames contenant les coupes tissulaires réhydratées dans la solution de récupération d'antigène préchauffée.
    4. Ensuite, chauffer les coupes tissulaires au micro-ondes pendant 15 min à puissance maximale (par exemple, P10), en surveillant attentivement le bécher pour s'assurer que les coupes restent immergées et ne s'assèchent pas par évaporation.
      REMARQUE : Alternativement, effectuer la récupération d'antigène dans un bac de coloration en plastique placé à l'intérieur d'un cuiseur vapeur pendant environ 15 min, ce qui constitue une méthode de chauffage plus douce nécessitant moins de surveillance. Le tampon au citrate de sodium (10 mM, pH 6,0) a été validé avec succès et utilisé comme tampon de récupération d'antigène pour tous les anticorps primaires listés dans le tableau 1. En fonction de l'anticorps primaire et des recommandations du fabricant, d'autres tampons, tels que l'EDTA ou le Tris-EDTA, peuvent être nécessaires pour les anticorps non évalués dans cette étude. 
  5. Refroidissement (10–20 min) :
    1. Retirer le bécher du micro-ondes, le poser sur le plan de travail et le laisser refroidir à température ambiante pendant 20 min. Pour accélérer le refroidissement, placer le bécher dans de l'eau du robinet glacée pendant ~10 min.
      PRÉCAUTION : Le bécher sera extrêmement chaud ; utiliser des gants résistants à la chaleur ou des pinces à bécher pour le manipuler. Utiliser les EPI comme à l'étape 1.1.
  6. Lavage au tampon salin phosphate de Dulbecco (DPBS) (~10 min) :
    1. Retirer le porte-lames du bécher et immerger les lames dans une solution DPBS 1× dans le récipient de coloration.
    2. Rincer les coupes deux fois dans le DPBS 1× pendant 5 min chacun, en effectuant des lavages doux et statiques pour éviter le détachement des tissus.
  7. Barrière hydrophobe (<1 min/lame) :
    1. Pendant le lavage au DPBS (étape 1.6), retirer chaque lame individuellement, essuyer délicatement autour de la coupe tissulaire avec des lingettes sans peluches (par exemple, Kim Wipes), en évitant tout contact avec le tissu lui-même.
    2. Utiliser une barrière hydrophobe, telle qu'un stylo PAP (peroxydase-anti-peroxydase), pour tracer une barrière répulsive aux liquides autour de chaque coupe tissulaire, puis replacer la lame dans la solution de lavage DPBS dans le récipient de coloration. Répéter ces étapes pour toutes les lames.
      REMARQUE : Une barrière hydrophobe autour du tissu empêche le débordement des réactifs entre les coupes et aide à maintenir les anticorps sur le tissu.
  8. Blocage de la peroxydase endogène (5 min) :
    1. Jeter le DPBS 1× du récipient de coloration, puis ajouter la solution de H₂O₂ à 3 %, en veillant à ce que les lames ou les coupes tissulaires soient complètement immergées pendant 5 min.
      REMARQUE : Une incubation prolongée dans le H₂O₂ à 3 % peut endommager les tissus. Le blocage de l'activité de la peroxydase endogène est une étape cruciale pour éviter un fond causé par la peroxydase endogène lors du développement de la couleur. Utiliser les EPI comme à l'étape 1.1.
  9. Lavage au DPBS (~12 min) :
    1. Jeter la solution de H₂O₂ à 3 %, puis rincer à nouveau les lames dans le DPBS 1× deux fois pendant 5 min chacun.
    2. Après le deuxième lavage, retirer les lames du porte-lames, les placer à plat dans la chambre humide, et ajouter de l'eau distillée aux bords de la chambre humide.
    3. Ne pas laisser les coupes sécher ; passer immédiatement au blocage à l'étape 1.10.
      REMARQUE : Chaque chambre humide listée dans le tableau des matériaux dispose d'un espace pouvant accueillir 30 lames.
  10. Blocage par sérum (~70 min) :
    1. Ajouter 50 µL de solution d'albumine sérique bovine (BSA) à 5 % par coupe et incuber pendant 30 min à température ambiante, tout en gardant le couvercle de la chambre humide fermé pour éviter l'évaporation du tampon de blocage des coupes tissulaires.
    2. Après 30 min, tapoter délicatement les lames sur des lingettes sans peluches placées sur le plan de travail pour éliminer le BSA.
    3. Ensuite, ajouter 2,5 % de sérum normal de cheval ou de chèvre (une goutte par coupe), correspondant à l'espèce d'origine de l'anticorps secondaire, et incuber les coupes pendant 30 min supplémentaires à température ambiante avec le couvercle de la chambre humide en place, puis tapoter les lames sur du papier absorbant ou des lingettes sans peluches pour éliminer le sérum, et passer immédiatement à l'étape 1.11.
      REMARQUE : Ne pas laisser les coupes sécher. Préparer les anticorps primaires dilués dans le tampon de blocage approprié (voir le tableau 1) vers la fin de l'étape de blocage afin qu'ils soient prêts à être utilisés à l'étape 1.11 une fois le blocage terminé.
  11. Incubation avec l'anticorps primaire (~16 h) :
    1. Appliquer environ 50 µL d'anticorps primaires, dilués de façon optimale dans le tampon de blocage approprié (voir le tableau 1), sur les coupes tissulaires et incuber toute la nuit (~16 h) à 4 °C dans une chambre humide.
      REMARQUE : S'assurer que les zones désignées de la chambre humide sont remplies d'eau distillée pour maintenir l'humidité pendant la nuit. De plus, prendre des précautions pour que les zones/chambres désignées pour les lames tissulaires ne soient pas remplies d'eau distillée, car cela pourrait provoquer un débordement sur les coupes tissulaires.
  12. Lavage au DPBS (0,1 % Tween 20) (~18–20 min) :
    1. Placer un porte-lames dans un récipient de coloration et le remplir de tampon de lavage (DPBS 1×, 0,1 % Tween 20).
    2. Après l'incubation nocturne, retirer les lames de la chambre humide, jeter les anticorps primaires en tapotant délicatement les lames sur du papier absorbant, puis placer les lames dans un porte-lames immergé dans le tampon de lavage (DPBS 1×, 0,1 % Tween 20) dans un récipient de coloration, et jeter le tampon de lavage.
    3. Ensuite, laver les coupes trois fois dans le DPBS 1× (0,1 % Tween 20), pendant 5 min chacun, puis retirer les lames du porte-lames, les placer à plat dans la chambre humide, et passer immédiatement à l'étape 1.13.
      REMARQUE : Chaque temps de lavage peut être prolongé à 10–15 min si une coloration de fond élevée est observée après le développement de la couleur à l'étape 1.15. Les lavages doivent être doux et statiques (pas d'agitation ni de balancement) pour éviter le détachement des tissus des lames.
  13. Incubation avec l'anticorps secondaire (~32–35 min) :
    1. Ajouter une goutte par coupe de l'anticorps secondaire conjugué à la peroxydase approprié (anti-lapin ou anti-rat IgG, selon le cas ; voir le tableau 2) et incuber les coupes tissulaires pendant 30 min à température ambiante avec le couvercle de la chambre humide en place.
      REMARQUE : L'anticorps secondaire peut être dilué au 1:1 dans du PBS pour réduire le fond à l'étape 1.15.
  14. Lavage au DPBS (0,1 % Tween 20) (~18–20 min) :
    1. Après l'incubation avec l'anticorps secondaire, retirer les lames de la chambre humide et tapoter délicatement les lames sur du papier absorbant pour éliminer les anticorps secondaires.
    2. Ensuite, placer les lames dans un porte-lames immergé dans le tampon de lavage (DPBS 1× avec 0,1 % Tween 20) à l'intérieur d'un récipient de coloration pour un lavage rapide, puis jeter le tampon de lavage.
    3. Ensuite, laver les coupes tissulaires trois fois avec le DPBS 1× (0,1 % Tween 20) pendant 5 min chacun.
      1. Avant de commencer l'étape de développement du chromogène (c'est-à-dire l'étape 1.15), placer un porte-lames séparé dans un récipient de coloration rempli d'eau distillée, une étape préparatoire pour l'étape 1.16, afin d'arrêter la réaction chromogène.
      2. Pendant le dernier lavage, préparer fraîchement la solution de travail de DAB (1 goutte de chromogène par 1 mL de substrat ; voir le fichier supplémentaire 1).
  15. Développement du chromogène (30 s–5 min) :
    1. Après le troisième lavage à l'étape 1.14, retirer les lames du porte-lames et les poser à plat sur le plan de travail avec un fond blanc.
    2. Appliquer 50 µL de solution de travail de DAB sur chaque coupe et surveiller visuellement l'apparition de la couleur brune sur fond blanc ou au microscope optique.
      REMARQUE : Utiliser les EPI comme à l'étape 1.1. L'utilisation de papier absorbant blanc aide à visualiser le développement de la couleur brune pendant l'étape chromogène au DAB. Le développement de la couleur peut prendre de 20 à 60 s pour certains marqueurs et de 2 à 5 min pour d'autres (voir les détails à l'étape 1.16).
  16. Arrêt de la réaction (1–2 min) :
    1. Dès que le signal de couleur brune souhaité apparaît à l'étape 1.15, arrêter immédiatement la réaction en plongeant la lame dans un récipient d'eau distillée préparé à l'étape 1.14.3.1.
    2. Laisser les lames rincées dans l'eau distillée pendant 1 min. Jeter l'eau distillée, puis passer à l'étape 1.17 (contre-coloration).
      REMARQUE : Les lames peuvent rester dans l'eau distillée jusqu'à 1 h sans affecter la coloration. La durée nécessaire au développement de la couleur détermine le moment de lancer l'étape d'arrêt de la réaction. De plus, s'il y a 2 à 3 marqueurs (tels que CD3, CD4, CD8 ou d'autres) sur la même lame (comme dans cette étude), les temps de réaction peuvent varier ; par exemple, dans le système décrit ici, le développement de la couleur prend généralement environ 30 s pour les cellules CD8+, 1 à 3 min pour les cellules CD3+ ou CD4+, ou plus longtemps (3 à 5 min) pour les cellules Granzyme B+ et Ki67+. En raison des différences dans les temps de développement de la couleur, toute la lame ne peut pas être immergée dans l'eau distillée pour arrêter la réaction. À la place, arrêter chaque réaction individuellement pour chaque coupe en ajoutant directement 200 à 300 µL d'eau distillée sur chaque coupe.
  17. Contre-coloration (<1 min) :
    1. Pour améliorer le contraste avec la coloration brune, ajouter de l'hématoxyline diluée (1:3 dans de l'eau distillée) dans le récipient de coloration, en veillant à ce que les lames restent immergées dans l'hématoxyline diluée pendant ~10–20 s.
      REMARQUE : Si le fond du DAB est intense, prolonger la contre-coloration (jusqu'à 1 min) ou utiliser brièvement de l'hématoxyline non diluée.
  18. Lavage à l'eau du robinet (6 min) :
    1. Jeter l'hématoxyline du récipient de coloration et la remettre dans la bouteille en verre pour réutilisation.
    2. Rincer les lames dans l'eau du robinet pendant 1 min, puis rincer à l'eau du robinet coulant lentement pendant 5 min, en gardant les coupes orientées à l'opposé du flux direct de l'eau. Jeter l'eau du robinet et passer à l'étape 1.19.
      REMARQUE : Les étapes restantes jusqu'au montage sont effectuées sous une hotte chimique.
  19. Déshydratation progressive (15–17 min) :
    1. Immerger les lames dans de l'éthanol à 70 % dans le récipient de coloration pendant 5 min (puis remettre l'éthanol à 70 % dans la bouteille pour réutilisation), suivis de l'éthanol à 90 % pendant 5 min (puis remettre dans la bouteille), et enfin de l'éthanol à 100 % pendant 5 min (puis remettre dans la bouteille).
    2. Passer à l'étape 1.20.
      REMARQUE : Effectuer cette étape sous une hotte chimique. Les mêmes solutions d'éthanol utilisées à l'étape 1.2 sont utilisées pour cette étape de déshydratation et peuvent être réutilisées plusieurs fois si elles apparaissent propres.
  20. Clarification :
    1. Utiliser les mêmes solutions de xylène I et II utilisées pour le déparaffinage (étape 1.1) pour nettoyer les coupes tissulaires/lames.
    2. Immerger d'abord les lames dans la solution de xylène I dans le récipient de coloration pendant 10 min (puis remettre le xylène I dans la bouteille pour réutilisation), puis dans la solution de xylène II pendant 10 min supplémentaires.
    3. Laisser les lames dans le xylène II jusqu'à la fin du montage (c'est-à-dire l'étape 1.21).
      REMARQUE : Ne jamais laisser les coupes sécher pendant cette étape, car elles deviendraient fragiles ; ainsi, si nécessaire, les coupes peuvent rester plus longtemps dans le xylène II pour le montage.
  21. Montage :
    1. Retirer les lames une par une du xylène II et les placer à plat sous une hotte chimique. Placer une goutte de milieu de montage à base de xylène sur une lame à couvrir de taille appropriée, puis poser la lame à couvrir sur la lame, le milieu de montage face aux coupes tissulaires.
    2. Appuyer doucement sur la lame à couvrir avec le pouce pour répartir uniformément le milieu de montage sur les trois coupes et éliminer les bulles d'air.
      REMARQUE : Une lame à couvrir de 24 × 50 mm est nécessaire pour couvrir trois coupes sur une lame ; une lame à couvrir de 24 × 40 mm pour deux coupes ; et une lame à couvrir de 24 × 24 mm pour une coupe. Il est important de terminer le montage en moins de 30 s par lame, car le milieu de montage peut sécher rapidement en raison du flux d'air constant dans la hotte, ce qui fait évaporer rapidement le xylène II de la lame et rend les coupes fragiles.
  22. Séchage à l'air et microscopie optique :
    1. Laisser sécher les lames à l'air libre sous la hotte chimique pendant au moins 2 h avant leur évaluation et leur imagerie au microscope optique. Une fois sèches, conserver les lames montées dans des boîtes à lames à température ambiante pendant des années.

2. IHC double coloration pour des coupes de tumeur cérébrale en inclusion formol-paraffine

REMARQUE : Le protocole suivant décrit un protocole immunohistochimique (IHC) chromogénique à double coloration basé sur un substrat, permettant la détection simultanée de deux antigènes dans la même section de tumeur cérébrale en inclusion paraffinée (FFPE). Comparé à l'IHC monochromatique, le protocole à double coloration est plus long, car il nécessite des cycles de coloration séquentiels avec des incubations indépendantes aux anticorps primaires, incluant des étapes d'incubation nocturne pour chaque cycle de coloration. Toutefois, ce protocole prolongé permet une détection fiable des deux antigènes simultanément dans la même section tissulaire, tout en préservant la morphologie tissulaire et en assurant une séparation claire des signaux chromogéniques en microscopie optique.

  1. Déparaffinage (20 min) :
    1. Suivre le même processus de déparaffinage que celui décrit ci-dessus pour l’IHC monochromatique à l’étape 1.1 dans une hotte chimique, mais utiliser des agents de clarification sans xylène (par exemple, Histo-Clear I et Histo-Clear II au lieu du xylène).
      ATTENTION : Utiliser les EPI comme à l’étape 1.1 et effectuer cette étape sous une hotte chimique. L’utilisation d’Histo-Clear est recommandée car le chromogène est partiellement soluble dans le xylène, et un traitement sans xylène permet de préserver l’intensité de la coloration lors de l’IHC double coloration. Ne pas laisser sécher les coupes. Ces solutions de clarification peuvent être réutilisées si elles sont conservées dans des récipients en verre hermétiques et restent propres.
  2. Réhydratation progressive (15 min) :
    1. Identique à l’IHC monochromatique comme décrit à l’étape 1.2. Réhydrater les coupes successivement avec une diminution progressive de la concentration en éthanol (100 %, 90 % et 70 %) pendant 5 min à chaque étape.
      ​REMARQUE : Un jeu distinct d’éthanol progressif sans xylène est utilisé ici, car l’éthanol progressif utilisé pour l’IHC monochromatique à l’étape 1.2 est probablement contaminé par le Xylène II.
  3. Rinçage à l’eau (5 min) :
    1. Identique à l’IHC monochromatique à l’étape 1.3 ; placer les lames dans de l’eau distillée pendant 5 min pour terminer le processus de réhydratation.
      ​REMARQUE : Identique à l’étape 1.3 ; préparer la solution de récupération d’antigène pendant cette période de 5 min.
  4. Récupération d’antigène (~20 min) : Suivre la même procédure de récupération d’antigène que celle décrite pour l’IHC monochromatique à l’étape 1.4.
  5. Refroidissement (10–20 min) : Suivre le même processus de refroidissement que celui décrit pour l’IHC monochromatique à l’étape 1.5.
  6. Lavage au DPBS (10 min) : Suivre le processus de rinçage de la solution de récupération d’antigène comme décrit pour l’IHC monochromatique à l’étape 1.6.
  7. Barrière hydrophobe (<1 min/lame) :
    1. Pendant le lavage au DPBS à l’étape 2.6, créer une barrière hydrophobe autour des sections tissulaires en suivant le même processus/protocole qu’à l’étape 1.7.
    2. Utiliser un stylo à barrière hydrophobe pour tracer une barrière répulsive aux liquides autour de chaque section tissulaire, puis replacer la lame dans la solution de lavage au DPBS dans le récipient de coloration. Répéter ces étapes pour toutes les lames.
  8. Blocage de la phosphatase alcaline (5 min) :
    1. Après avoir terminé les barrières hydrophobes sur toutes les sections tissulaires, retirer les lames du récipient de coloration, les placer à plat dans la chambre humidifiée, ajouter une goutte de solution de blocage de la phosphatase alcaline endogène (par exemple, BLOXALL) par section, et incuber les sections pendant 5 min. Passer immédiatement à l’étape 2.9.
      ​REMARQUE : Étant donné que des anticorps secondaires conjugués à la phosphatase alcaline (AP) sont utilisés dans le protocole d’IHC double coloration, il est essentiel de bloquer l’activité de la phosphatase alcaline endogène afin de réduire le signal de fond lors du développement de la couleur rouge ou bleue. La solution de blocage BLOXALL est utilisée ici pour inhiber la phosphatase alcaline endogène. Elle inhibe également la peroxydase endogène, donc cette solution de blocage peut également être utilisée dans le protocole d’IHC monochromatique pour bloquer l’activité de la peroxydase endogène, à la place de la solution de H₂O₂ à 3 %.
  9. Lavage au DPBS (10 min) :
    1. Rincer les lames deux fois dans une solution de DPBS 1× dans le récipient de coloration, pendant 5 min chacune.
    2. Après le deuxième lavage, retirer les lames du récipient de coloration, les placer à plat dans la chambre humidifiée, et ajouter de l’eau distillée aux bords de la chambre humidifiée.
      REMARQUE : Ne pas laisser sécher les sections ; passer immédiatement au blocage de la liaison antigène-anticorps non spécifique à l’étape 2.10.
  10. Blocage par sérum (~70 min) :
    1. Suivre le même processus de blocage par sérum que dans le protocole d’IHC monochromatique décrit à l’étape 1.10.
      1. Commencer par bloquer avec le tampon de blocage universel (5 % de BSA ; 50 µL/section) pendant 30 min à température ambiante, puis avec le sérum de cheval normal à 2,5 % (une goutte/section), correspondant à l’espèce hôte de l’anticorps secondaire anti-IgG de lapin conjugué à l’AP, pendant 30 min supplémentaires à température ambiante, couvercle de la chambre humidifiée en place.
      2. À la fin de cette période, tapoter doucement les lames sur du papier absorbant pour éliminer le sérum, puis passer à l’étape 2.11.
        REMARQUE : Préparer l’anticorps primaire I (voir Tableau 1) durant la dernière minute de l’étape de blocage, comme décrit à l’étape 1.10.
  11. Incubation avec l’anticorps primaire I (~16 h) :
    1. Suivre le même processus d’incubation avec l’anticorps primaire qu’à l’étape 1.11. Par exemple, ajouter environ 50 µL d’anticorps anti-CD3 de lapin, dilué 1:100 dans du sérum de cheval normal à 2,5 % (voir Tableau 1), à chaque section tissulaire.
    2. Incuber toute la nuit (~16 h) à 4 °C dans une chambre humidifiée.
  12. Lavage au DPBS (0,1 % Tween 20) (~18–20 min) :
    1. Suivre la même procédure de lavage (3 étapes, 5 min chacune) que celle décrite pour le protocole d’IHC monochromatique à l’étape 1.12.
    2. Après le troisième lavage, placer les lames à plat à l’intérieur de la chambre humidifiée. Passer immédiatement à l’étape 2.13.
      REMARQUE : Mêmes remarques qu’à l’étape 1.12, par exemple, chaque temps de lavage peut être prolongé à 10–15 min, et le lavage doit être doux et statique. Ne pas laisser sécher les sections.
  13. Incubation avec l’anticorps secondaire I (~32–35 min) :
    1. Ajouter une goutte par section d’anticorps secondaire anti-IgG de lapin conjugué à l’AP (voir Tableau 2) et incuber les sections tissulaires pendant 30 min à température ambiante, couvercle de la chambre humidifiée en place.
      REMARQUE : L’anticorps secondaire peut être dilué 1:1 dans du PBS pour réduire le signal de fond à l’étape 2.15.
  14. Lavage au DPBS (0,1 % Tween 20) (~18–20 min) :
    1. Suivre la même procédure de lavage avec du DPBS 1×/0,1 % Tween 20, comme à l’étape 1.14.
    2. REMARQUE : Pendant la dernière étape de lavage, préparer fraîchement la solution de travail du substrat (5 mL, comme recommandé ; voir Tableau 3) selon les instructions du fabricant (voir la préparation des réactifs dans le Fichier Supplémentaire 1).
  15. Développement de la couleur rouge (12–15 min) :
    1. Après avoir terminé l’étape 2.14, placer les lames à plat sur le plan de travail avec un fond blanc, comme du papier absorbant blanc, comme décrit à l’étape 1.15.
    2. Mélanger soigneusement la solution de travail du substrat rouge fraîchement préparée, puis ajouter 50 µL à chaque section tissulaire (éliminer toute solution restante).
    3. Incuber les sections tissulaires à température ambiante jusqu’à l’apparition de la couleur rouge, en vérifiant périodiquement toutes les 2–3 min sur un fond blanc ou au microscope optique.
      REMARQUE : Le temps nécessaire au développement de la couleur rouge varie selon les marqueurs et peut prendre 20–30 min. Toutefois, pour la coloration des cellules CD3+ dans des sections de tumeur cérébrale 005 avec le système de détection AP, le développement de la couleur rouge se produit généralement en 12–15 min.
  16. Rinçage au tampon (5 min) :
    1. Dès que le signal de couleur rouge souhaité apparaît à l’étape 2.15, rincer les sections dans du DPBS 1×/0,1 % Tween 20 pendant 5 min dans un récipient de coloration.
    2. Pendant ce temps de lavage, préparer fraîchement l’anticorps primaire II dans un tampon de blocage approprié (par exemple, anticorps anti-Ki67 de lapin dilué 1:100 dans du sérum de cheval normal à 2,5 % ; voir Tableau 1).
      REMARQUE : Contrairement au rinçage à l’eau distillée utilisé en IHC monochromatique (étape 1.16), le DPBS/0,1 % Tween 20 est utilisé ici non seulement pour arrêter la réaction, mais aussi pour éliminer rigoureusement l’excès de chromogène et préparer le second cycle de coloration.
  17. Incubation avec l’anticorps primaire II (~16 h) :
    1. Placer les lames dans une chambre humidifiée et ajouter environ 50 µL d’anticorps anti-Ki67 de lapin fraîchement préparé à chaque section tissulaire. Incuber toute la nuit (~16 h) à 4 °C.
  18. Lavage au DPBS (0,1 % Tween 20) (~18–20 min) :
    1. Suivre la même procédure qu’à l’étape 1.12.
    2. Après le troisième lavage, retirer les lames du récipient de coloration et les placer à plat dans la chambre humidifiée. Passer immédiatement à l’étape 2.19.
  19. Incubation avec l’anticorps secondaire II (~32–35 min) :
    1. Suivre la même procédure qu’à l’étape 2.13. Ajouter une goutte par section d’anticorps anti-IgG de lapin conjugué à l’AP (voir Tableau 2) et incuber les sections tissulaires pendant 30 min à température ambiante, couvercle de la chambre humidifiée en place.
  20. Lavage au DPBS (0,1 % Tween 20) (~18–20 min) :
    1. Suivre la même procédure de lavage avec du DPBS 1×/0,1 % Tween 20, comme à l’étape 1.14.
      REMARQUE : Pendant la dernière étape de lavage, préparer fraîchement la solution de travail du substrat (5 mL, comme recommandé ; voir Tableau 3) selon les instructions du fabricant (voir la préparation des réactifs dans le Fichier Supplémentaire 1).
  21. Développement de la couleur bleue (10–12 min) :
    1. Après avoir terminé l’étape 2.20, placer les lames à plat sur le plan de travail avec un fond blanc.
    2. Mélanger soigneusement la solution de travail du substrat bleu fraîchement préparée, puis ajouter 50 µL à chaque section tissulaire (éliminer toute solution restante).
    3. Incuber les sections tissulaires à température ambiante jusqu’à l’apparition de la couleur bleue, en vérifiant périodiquement toutes les 2–3 min sur un fond blanc ou au microscope optique.
      REMARQUE : Comme pour le développement de la couleur rouge à l’étape 2.15, le temps nécessaire au développement de la couleur bleue peut prendre 20–30 min. Toutefois, pour la coloration des cellules Ki67+ dans des sections de tumeur cérébrale 005 avec le système de détection AP, la couleur bleue se développe en 10–12 min.
  22. Lavage au tampon (5 min) :
    1. Dès que le signal de couleur bleue souhaité apparaît à l’étape 2.21, immerger les sections dans du DPBS 1×/0,1 % Tween 20 pendant 5 min dans un récipient de coloration. Éliminer la solution de lavage.
  23. Rinçage à l’eau (1 min) : Rincer les sections dans de l’eau distillée pendant 1 min. Éliminer l’eau distillée après rinçage.
  24. Déshydratation progressive (15–17 min) :
    1. Immerger les lames dans de l’éthanol à 70 % dans le récipient de coloration pendant 5 min (puis remettre l’éthanol à 70 % dans la bouteille en verre pour réutilisation), suivis d’éthanol à 90 % pendant 5 min (puis remettre dans la bouteille), et enfin d’éthanol à 100 % pendant 5 min (puis remettre dans la bouteille).
    2. Répéter chaque étape dans une hotte. Passer à l’étape 2.25.
      REMARQUE : Les mêmes solutions d’éthanol (sans xylène) de l’étape 2.2 sont utilisées dans cette étape de déshydratation et peuvent être réutilisées plusieurs fois si elles restent propres.
  25. Clarification sans xylène :
    1. Utiliser les mêmes solutions sans xylène (c’est-à-dire Histo-Clear) utilisées à l’étape 2.1 pour nettoyer les sections tissulaires/lames.
      1. Immerger d’abord les lames dans la solution sans xylène I dans le récipient de coloration pendant 10 min (puis remettre la solution sans xylène I dans la bouteille en verre pour réutilisation), puis dans la solution sans xylène II pendant 10 min supplémentaires.
      2. Garder les lames dans la solution sans xylène II jusqu’à la fin du montage (c’est-à-dire l’étape 2.26).
        REMARQUE : Les sections peuvent rester plus longtemps dans la solution sans xylène II, si nécessaire, pour le montage.
        ATTENTION : Utiliser les EPI comme à l’étape 1.1 et effectuer cette étape sous une hotte chimique.
  26. Montage sans xylène :
    1. Retirer les lames une par une de la solution sans xylène II et les placer à plat dans une hotte. Placer une goutte de milieu de montage sans xylène sur une lame de couverture de taille appropriée, puis poser la lame de couverture sur la lame, le milieu de montage face aux sections tissulaires.
    2. Appuyer doucement sur la lame de couverture avec le pouce pour répartir uniformément le milieu de montage sur les trois sections et éliminer les bulles d’air.
      REMARQUE : Terminer le montage en moins de 30 s par lame, car le milieu de montage peut sécher rapidement. Utiliser les EPI comme à l’étape 1.1 et effectuer cette étape sous une hotte chimique.
  27. Séchage à l’air et microscopie optique : Laisser sécher les lames à l’air dans la hotte pendant au moins 2 h avant l’évaluation et l’imagerie au microscope optique. Une fois sèches, les lames montées peuvent être conservées dans des boîtes à lames à température ambiante pendant des années.

Résultats

L’IHC en une seule couleur utilisant le système de détection chromogénique basé sur la peroxydase du raifort (HRP) a produit une coloration nette et reproductible sur des sections de tumeur cérébrale 005 en inclusion paraffine (FFPE). Des images représentatives de la coloration des antigènes de surface sont présentées dans la Figure 1, illustrant la détection réussie des marqueurs des lymphocytes T (CD3, CD4, CD8), des marqueurs des macrophages associés aux tumeurs (TAM) (CD68, F4/80) et de la molécule du point de contrôle immunitaire ligand de mort programmée 1 (PD-L1). Dans tous les cas, la coloration positive apparaissait sous forme d’un signal chromogénique brun distinct, la 3,3'-diaminobenzidine (DAB) étant utilisée comme chromogène, avec une morphologie tissulaire préservée et une coloration de fond minimale, indiquant que le protocole d’IHC en une seule couleur est compatible avec une grande diversité d’antigènes membranaires.

L'applicabilité du protocole d'immunohistochimie monochromatique pour la détection d'antigènes intracellulaires est illustrée dans la Figure 2. Des images représentatives de coloration montrent une détection réussie de marqueurs intracellulaires transcriptionnels, de signalisation, prolifératifs, cytotoxiques et apoptotiques, notamment T-bet, FoxP3, STAT1 phosphorylé (pSTAT1), Ki67, la granzyme B et la caspase-3 clivée. De façon similaire à la coloration des antigènes de surface, la détection des marqueurs intracellulaires a produit des signaux chromogènes bruns nets tout en préservant l'architecture tissulaire, avec un fond non spécifique minimal (Figure 2), ce qui démontre que le protocole convient à la détection des antigènes de surface comme des antigènes intracellulaires.

Le protocole d'immunohistochimie double coloration a été utilisé avec succès pour détecter simultanément deux antigènes dans la même section tissulaire, en employant une stratégie de détection chromogénique séquentielle basée sur la phosphatase alcaline (AP). Comme illustré dans Figure 3, double marquage de CD3(rouge)/Ki67(bleu) et de pSTAT1(rouge)/CD68(bleu), indiquant respectivement les lymphocytes T proliférants et les macrophages de type M119, ont produit des signaux chromogéniques clairement distinguables en microscopie optique, démontrant une détection simultanée efficace de deux antigènes avec une séparation nette des couleurs par le protocole de marquage séquentiel. Afin de montrer davantage la polyvalence de cette approche de coloration double, le même protocole a été appliqué avec succès à la détection concomitante d'un marqueur neuronal (NeuN en rouge) et de la protéine fluorescente verte (GFP en bleu) sur des sections de tumeur cérébrale provenant de tumeurs GSC 005 exprimant la GFP (Figure 4). La colocalisation de GFP et de NeuN indique probablement que les CSG 005 se différencient en phénotypes matures exprimant le marqueur neuronal NeuN21.

Les images de la Figure 1, de la Figure 2 et de la Figure 3 sont représentatives de quatre tumeurs indépendantes, avec une section par tumeur pour tous les antigènes cellulaires immunitaires marqués, à l'exception de l'image F4/80, qui représente deux tumeurs indépendantes, et de l'image PD-L1, qui représente trois tumeurs indépendantes, avec deux sections à la fois pour F4/80 et PD-L1. L'image de la Figure 4 représente une seule section tumorale. Étant donné que le protocole d'immunohistochimie double a été utilisé pour marquer de façon séquentielle deux antigènes (par exemple, CD3+ et Ki67+, ou CD68+ et pSTAT1+) sur la même section de tissu à partir de deux à quatre tumeurs indépendantes, et a été davantage validé par la co-marquage des cellules GFP+ et NeuN+, ces résultats soutiennent l'application reproductible du protocole d'immunohistochimie double. De même, le protocole d'immunohistochimie simple a été appliqué avec succès à 12 antigènes cellulaires immunitaires indépendants, démontrant ainsi son applicabilité étendue dans les conditions de marquage décrites ici.

Ensemble, ces résultats représentatifs démontrent que les protocoles d'immunohistochimie basés sur un substrat, en simple et en double coloration, décrits ici fournissent des méthodes pratiques et reproductibles pour la détection d'un large éventail d'antigènes intracellulaires et d'antigènes de surface dans les tissus de GBM en inclusion paraffinée (FFPE).

Immunohistochimie des marqueurs immunitaires CD3, CD4, CD8, CD68, F4/80, PD-L1, images au microscope.
Figure 1: Immunohistochimie (IHC) monocouleur pour les antigènes de surface. Coloration IHC monochromatique (brune) basée sur un substrat pour les antigènes de surface des lymphocytes T infiltrant la tumeur (CD3)+, CD4+, et CD8+), macrophages associées aux tumeurs (CD68+ et F4/80+) et la molécule de point de contrôle immunitaire ligand 1 de la mort programmée (PD-L1+) en utilisant le système de détection basé sur la peroxydase de raifort (HRP) sur des sections de glioblastome murin dérivées de cellules souches-like de glioblastome (GSC) (voir détails dans la section 1 du protocole). Des images représentatives d'ICH sont présentées (grossissement 10× pour CD3, CD4 et CD8 ; grossissement 20× pour CD68, F4/80 et PD-L1). Les cellules positives sont colorées en brun. Échelles = 100 μμm. Veuillez cliquer ici pour visualiser une version agrandie de cette figure.

Marqueurs d'immunohistochimie T-bet, FoxP3, p-STAT1, Ki67, GranB, CC3 sur des coupes de tissu.
Figure 2: Immunohistochimie (IHC) monocouleur pour les antigènes intracellulaires. Coloration IHC monochromatique (brune) basée sur le substrat de la transcription intracellulaire (T-bet)+ et FoxP3+), signalisation (pSTAT1+), proliférative (Ki67+), cytotoxique (granzyme B+, GranB) et apoptotique (caspase-3 clivée)+, marqueurs CC3) sur des coupes de tumeurs cérébrales à l'aide d'un système de détection basé sur la peroxydase de raifort (HRP) sur des sections de glioblastome murin dérivées de cellules souches-like de glioblastome (GSC) (voir détails dans la section 1 du protocole). Des images représentatives d'ICH sont présentées (grossissement 10× pour FoxP3, GranB et CC3 ; grossissement 20× pour T-bet, pSTAT1 et Ki67). Les cellules positives sont colorées en brun. Échelles = 100 μμm. Veuillez cliquer ici pour visualiser une version agrandie de cette figure.

Analyse histologique, marqueurs CD3/Ki67 et pSTAT1/CD68, image microscopique, étude de la prolifération cellulaire.
Figure 3: Immunohistochimie double coloration pour les lymphocytes infiltrant les tumeurs prolifératifs (LIT) et les macrophages associés aux tumeurs de type M1 (MAT) Coloration IHC double (rouge/bleu) basée sur un substrat de CD3+(rouge)/Ki67+(bleus) lymphocytes T prolifératives infiltrant la tumeur et pSTAT1+(rouge)/CD68+(macrophages de type M1 en bleu) à l'aide du système de détection basé sur la phosphatase alcaline (AP) sur des sections de glioblastome (GBM) chez la souris, dérivées de cellules souches-like de glioblastome (GSC) (voir les détails dans la section 2 du protocole). Des images représentatives d'immunohistochimie sont présentées (grossissement 20×). Dans l'image supérieure, la CD3+ les cellules sont colorées en rouge, Ki67+ les cellules sont colorées en bleu, et quelques-unes des cellules colocalisées sont indiquées par des flèches noires. De même, dans l'image du bas, pSTAT1+ les cellules sont colorées en rouge, CD68+ les cellules sont colorées en bleu, et quelques cellules co-localisées sont indiquées par des flèches noires. Échelles = 100 μμm. Veuillez cliquer ici pour visualiser une version agrandie de cette figure.

Tissu coloré NeuN/GFP, tumeur contre non-tumeur, image microscopique, analyse de la différenciation cellulaire.
Figure 4: Immunohistochimie double coloration (IHC) pour les cellules neuronales et la protéine fluorescente verte-positive (GFP)+) des cellules souches-like du glioblastome (GSCs). Coloration IHC double (rouge/bleu) basée sur un substrat de NeuN+(rouge)/GFP+(bleu) en utilisant le système de détection basé sur la phosphatase alcaline (PA) sur des sections de glioblastome murin dérivées de cellules souches-like du glioblastome (GSC) (voir détails dans la section 2 du protocole). Image représentative d'immunohistochimie (amplification 20×). NeuN+ (a neuronal marker) cellules colorées en rouge, GFP+ (les cellules exprimant les GSCs 005) sont colorées en bleu, et quelques cellules colocalisées sont indiquées par des flèches noires. Échelle = 100 μμm. Veuillez cliquer ici pour visualiser une version agrandie de cette figure.

Anticorps primaire contreNuméro de catalogueFournisseurDilution utiliséeBuffer de dilution**Espèce de l'hôteSecondaire approprié
CD3eab5690Abcam1:100Sérum de chevalLapinAnti-IgG de lapin
CD414-9766-80eBioscience1:200Sérum de chèvreRatAnti-IgG de rat
CD68ab125212Abcam1:100Sérum de chevalLapinAnti-IgG de lapin
CD8a14-0808-80eBioscience1:100Sérum de chèvreRatAnti-IgG de rat
Caspase-3 clivée9661CST1:100Sérum de chevalLapinAnti-IgG de lapin
F4/80ab111101Abcam1:100Sérum de chevalLapinAnti-IgG de lapin
FoxP3ab54501*Abcam1:450Sérum de chevalLapinAnti-IgG de lapin
GFPab183734Abcam1:200Sérum de chevalLapinAnti-IgG de lapin
Granzyme Bab4059Abcam1:150Sérum de chevalLapinAnti-IgG de lapin
Ki67ab16667Abcam1:100Sérum de chevalLapinAnti-IgG de lapin
NeuN24307CST1:400Sérum de chevalLapinAnti-IgG de lapin
PD-L1ab205921Abcam1:400Sérum de chevalLapinAnti-IgG de lapin
pSTAT19167CST1:100Sérum de chevalLapinAnti-IgG de lapin
T-betab91109Abcam1:100Sérum de chevalSourisAnti-IgG de souris

Tableau 1 : Liste des anticorps primaires. Anticorps primaires utilisés dans cette étude, accompagnés de leurs sources, dilutions de travail optimisées, tampons de dilution recommandés, espèces d'origine et anticorps secondaires appropriés pour la coloration immunohistochimique en une ou deux couleurs.

Anticorps secondaire conjuguéNuméro de catalogueEspèce d'origineGoutte/sectionFournisseur
HRP anti-IgG de ratMP-7444-15ChèvreUne goutte (non diluée)Vector Laboratories
HRP anti-IgG de lapinMP-7401Cheval
HRP anti-IgG de sourisMP-7402-15Cheval
AP anti-IgG de ratMP-5404-15Chèvre
AP anti-IgG de lapinMP-5401Cheval

Tableau 2 : Liste des anticorps secondaires. Réactifs de détection secondaires optimisés pour les protocoles d'IHC en une ou deux couleurs, incluant les conjugués enzymatiques (HRP ou AP), les espèces hôtes, le volume d'application recommandé et les informations sur le fournisseur.

SubstratEnzyme de détectionComposition du tamponFormulation du réactifDurée d'incubationRemarques
Vector BluePhosphatase alcaline100 mM Tris-HCl, pH 8,2–8,5, 0,1 % Tween 202 gouttes (80 µL) du réactif 1 + 2 gouttes (80 µL) du réactif 2 + 2 gouttes (45 µL) du réactif 320–30 minPour coloration bleue en IHC double ; partiellement soluble dans le xylène ; l'utilisation de réactifs et de milieux de montage sans xylène est recommandée
Vector RedPhosphatase alcaline100 mM Tris-HCl, pH 8,2–8,5, 0,1 % Tween 202 gouttes (80 µL) du réactif 1 + 2 gouttes (80 µL) du réactif 2 + 2 gouttes (80 µL) du réactif 320–30 minPour coloration rouge en IHC double
DABProtéine peroxydase de raifortTampon de substrat fourni par le fabricant1 goutte de chromogène ajoutée à 1 mL de substrat DABVariable (voir étape 2.16)Produit une coloration brune ; cancérogène, manipuler conformément aux consignes de sécurité

Tableau 3 : Liste des substrats chromogènes. Ce tableau récapitule les substrats chromogènes utilisés pour l'IHC en simple et double coloration, incluant les enzymes de détection compatibles, la préparation et la formulation, les durées d'incubation, ainsi que les recommandations essentielles de manipulation pour un développement optimal du signal chromogène.

Fichier supplémentaire 1 : Préparation des réactifs, des tampons et des substrats. Ce fichier résume la préparation, le stockage et les précautions essentielles concernant la manipulation de tous les réactifs, tampons, solutions de blocage et substrats chromogéniques utilisés dans les protocoles d'immunohistochimie en simple et double coloration.Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.

Discussion

Cette étude décrit un protocole immunohistochimique chromogénique basé sur un substrat détaillé et reproductible pour la détection simple et double couleur d'antigènes de surface et intracellulaires dans des tissus tumoraux cérébraux en inclusion paraffinée (FFPE) provenant d'un modèle orthotopique de cellules souches gliomateuses (GSC). L'objectif principal de cette étude était méthodologique, visant à établir un protocole pratique, étape par étape, pour une détection fiable d'antigènes par méthode chromogénique dans des tissus de glioblastome multiforme (GBM) immunocompétents.

L'immunohistochimie chromogène reste une méthode largement utilisée pour évaluer les marqueurs cellulaires dans les tissus inclus en paraffine (FFPE), car elle préserve l'architecture tissulaire tout en permettant la localisation spatiale des antigènes au sein du microenvironnement tumoral (TME)15,16. Une coloration chromogène reproductible nécessite une optimisation minutieuse de plusieurs paramètres techniques, notamment la récupération des antigènes, les conditions de blocage, la concentration des anticorps, le temps de développement du chromogène, ainsi que la manipulation des tissus pendant la coloration et le montage. De légères variations dans ces étapes peuvent entraîner une perte tissulaire, une intensité de signal faible, une coloration de fond excessive ou une mauvaise préservation de la morphologie. Ce protocole aborde les difficultés techniques courantes en fournissant des instructions détaillées afin d'améliorer la cohérence et la reproductibilité de la coloration.

À l'aide du protocole d'IHC monocouleur, une coloration représentative a permis la détection réussie d'une large gamme d'antigènes associés à la membrane et d'antigènes intracellulaires, notamment des marqueurs des lymphocytes T, des marqueurs associés aux macrophages, des molécules de point de contrôle immunitaire, des protéines de signalisation, des marqueurs de prolifération et des antigènes associés à l'apoptose. Ces résultats représentatifs démontrent l'applicabilité du protocole pour la détection de diverses classes d'antigènes dans des tissus de GBM en inclusion paraffine (FFPE) à l'aide d'un système de détection chromogénique standard basé sur la peroxydase (HRP).

Un défi technique courant en IHC chromogénique double est la détection simultanée de deux antigènes lorsque les deux anticorps primaires sont produits chez la même espèce hôte, ce qui peut compliquer la compatibilité des anticorps et la discrimination des signaux. Pour remédier à cela, nous avons mis en place un protocole de coloration double en séquence basé sur la phosphatase alcaline (AP), utilisant des substrats chromogéniques distincts qui permettent une séparation visuelle claire des signaux antigéniques en microscopie optique.

La coloration double représentative de CD3/Ki67 et de pSTAT1/CD68 a démontré une détection simultanée réussie des antigènes au sein de la même section tissulaire. L'application supplémentaire de ce protocole à la double coloration NeuN/GFP soutient davantage la polyvalence du protocole séquentiel en double coloration au-delà de l'analyse des marqueurs immunitaires. La coloration immunohistochimique en double coloration peut être quantifiée par un score manuel ou par analyse d'image numérique. Les métriques courantes incluent le nombre ou le pourcentage de cellules simples et doubles positives, ainsi que leur répartition au sein de la tumeur. Lorsqu'une analyse numérique est utilisée, il est recommandé d'appliquer des seuils cohérents et un choix rigoureux des régions afin d'assurer des résultats reproductibles.

Pour obtenir des résultats de coloration fiables avec le protocole d'immunohistochimie monochromatique, un contrôle négatif omettant l'anticorps primaire doit être inclus. Ce contrôle ne doit produire aucun signal chromogène lors du développement du substrat (étape 1.15), confirmant ainsi la spécificité de la procédure de coloration. Pour le protocole d'immunohistochimie double coloration, des contrôles négatifs supplémentaires sont recommandés en omettant l'anticorps primaire I (étape 2.11), l'anticorps primaire II (étape 2.17), ou les deux anticorps primaires. Étant donné que les deux anticorps primaires proviennent de la même espèce hôte, ces contrôles permettent de vérifier que le second anticorps secondaire anti-lapin (étape 2.19) ne détecte pas l'anticorps primaire résiduel du premier cycle de coloration et aident à exclure tout transfert croisé ou signal chromogène non spécifique.

Bien que les images représentatives présentées dans ce protocole illustrent des résultats de coloration optimaux, les utilisateurs peuvent parfois observer des résultats sous-optimaux, tels qu'un signal chromogène faible ou absent, une coloration de fond excessive, une coloration irrégulière sur la section tissulaire ou un faible rapport signal/bruit. Ces problèmes sont généralement liés à une récupération insuffisante des antigènes, à une concentration d'anticorps sous-optimale, à un blocage insuffisant, à une sur-développement du substrat chromogène ou au dessèchement du tissu pendant la procédure de coloration. Ces problèmes peuvent généralement être identifiés par comparaison avec des contrôles positifs et négatifs appropriés, et corrigés en optimisant les conditions de récupération des antigènes, la dilution des anticorps, les étapes de blocage, les procédures de lavage et les durées d'incubation avec le chromogène, comme indiqué tout au long du protocole.

Une limitation de cette étude est que l'applicabilité de l'IHC en simple ou double couleur a été démontrée à l'aide de sections tissulaires représentatives provenant du même modèle tumoral, plutôt que d'être appliquée systématiquement à plusieurs modèles tumoraux ou stades de progression tumorale. Toutefois, cette limitation n'affecte pas l'objectif principal de cette étude, qui consistait à établir et documenter un protocole méthodologique reproductible pour l'IHC chromogénique en simple et double couleur basée sur un substrat. Comparée à l'immunofluorescence, l'IHC chromogénique est compatible avec la microscopie optique classique, préserve mieux la morphologie tissulaire et est moins affectée par l'autofluorescence du tissu. Bien qu'optimisée ici pour un modèle orthotopique immunocompétent de GBM dérivé de CSG, cette méthode pourrait être adaptée à d'autres modèles tumoraux précliniques et, après une optimisation spécifique aux marqueurs, à des échantillons tumoraux humains en inclusion paraffine (FFPE). L'intégration à des plateformes de pathologie numérique et d'analyse d'image pourrait encore étendre son utilité pour des analyses tissulaires semi-quantitatives.

Déclarations de divulgation

S.D.R. est co-inventeur de brevets relatifs aux virus herpétiques oncolytiques, détenus et gérés par l'Université de Georgetown et le Massachusetts General Hospital, qui ont perçu des redevances de la part d'Amgen et d'Acti\Vec Inc., et a agi en tant que consultant tout en percevant des émoluments de Replimune, Cellinta et Greenfire Bio, ainsi que des émoluments et des actions d'EG 427. Les autres auteurs déclarent que ce manuscrit a été rédigé en l'absence de toute relation commerciale ou financière pouvant être interprétée comme un conflit d'intérêts potentiel.

Remerciements

D.S. a été soutenu en partie par un financement du College of Science and Technology de l'Université d'État agricole et technique de Caroline du Nord (NCA&T), par une bourse de recherche pour professeurs (GRADS-4C) de la NCA&T, ainsi que par une subvention des NIH (1R16NS147983-01). De même, S.D.R. a bénéficié en partie du poste Thomas A. Pappas en neurosciences, tandis que R.H.N. a été soutenu en partie par une subvention des NIH (1R35GM153737). Nous remercions le Dr Inder Verma et le Dr Yasushi Soda pour les 005 GSC.

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
Bouteilles en verre de 2 L CorningCORN1395-2LUtilisées pour la préparation et le stockage du DPBS 10×, du DPBS 1×, de l’eau distillée et du tampon de citrate de sodium
Bécher en verre Pyrex de 2 L Corning1000-2LUtilisé pour la récupération d’antigène assistée par micro-ondes dans un tampon de citrate de sodium (volume de travail de 600–800 mL)
Sérum normal de cheval à 2,5 % ou sérum normal de chèvreFournis prêts à l’emploi avec les anticorps secondaires de Vector Laboratories. Utilisés pour le blocage spécifique à l’espèce et la dilution des anticorps selon l’espèce hôte de l’anticorps secondaire (IgG anti-lapin ou anti-rat) afin de minimiser la liaison non spécifique et la coloration de fond
Peroxyde d’hydrogène (H2O2) à 30 %Fisher ScientificBP2633500
Bouteilles en verre de 500 mLVWR InternationalVWRU10754-818Utilisées pour la préparation et le stockage des réactifs inflammables pour l’IHC monochromatique et des réactifs sans xylène pour l’IHC bichromatique
Papier absorbant de paillasse avec KimwipesUtilisé pendant les procédures de coloration pour éliminer l’excès d’anticorps ou de solution de lavage des coupes de tissus avant les incubations suivantes, minimisant ainsi le transfert de réactifs et la contamination croisée
Anti-CD3eAbcamab5690
Anti-CD4 eBioscience14-9766-80
Anti-CD68Abcamab125212
Anti-CD8a eBioscience14-0808-80
Anti-caspase-3 clivéeCST9661
Anti-F4/80Abcamab111101
Anti-FoxP3Abcamab54501
Anti-GFPAbcamab183734
Anti-granzyme BAbcamab4059
Anti-Ki67Abcamab16667
Anti-NeuNCST24307
Anti-PD-L1Abcamab205921
Anti-pSTAT1CST9167
Anti-T-betAbcamab91109
AP anti-IgG de lapinVector LaboratoriesMP-5401
AP anti-IgG de ratVector LaboratoriesMP-5404-15
Solution de blocage BLOXALLVector LaboratoriesSP-6000-100Utilisée principalement en IHC bichromatique pour inhiber l’activité de la peroxydase endogène et de la phosphatase alcaline
Albumine sérique bovine (BSA)Bioworld22070007-2Utilisée pour préparer un tampon de blocage universel à 5 % afin de réduire la liaison non spécifique
Milieu de montage définitif Cytoseal 60 Electron Microscopy Sciences18006Milieu de montage compatible avec le xylène, utilisé pour l’IHC monochromatique
Substrat et chromogène DABDAKOK346811-2Utilisés pour la détection chromogénique monochromatique basée sur la HRP. Préparer immédiatement avant utilisation en ajoutant une goutte de chromogène à 1 mL de substrat DAB selon les instructions du fabricant’s. La solution travail inutilisée doit être éliminée après préparation. Le DAB est un cancérogène potentiel et doit être manipulé conformément aux directives institutionnelles de biosécurité et de sécurité chimique
Eau distilléeUtilisée pour la préparation des réactifs, les lavages et la préparation des tampons. De l’eau ultrapure ou Milli-Q peut également être utilisée
DPBS (solution saline tamponnée au phosphate de Dulbecco’s) Corning55-031-PC
Éthanol, 200 preuves Decon Labs2701
Lames microscopiques Fisherbrand Superfrost PlusFisher Scientific12-550-15Lames en verre microscopiques chargées positivement pour les coupes de tissus
Coverslips en verreCorning ou Milipore SigmaDes tailles appropriées doivent être choisies en fonction du nombre de coupes de tissus par lame. Les tailles courantes incluent : 24 mm × 24 mm (une coupe de tissu), 24 mm × 40 mm (deux coupes de tissus), 24 mm × 50 mm (trois coupes de tissus)
HématoxylineFisher Scientific220-102
Histo-Clear (1 L)Electron Microscopy Sciences64111-01Agent de clarification sans xylène utilisé pour l’IHC bichromatique. Préparer deux bouteilles de 500 mL étiquetées Histo-Clear I et Histo-Clear II
HRP anti-IgG de sourisVector LaboratoriesMP-7402-15
HRP anti-IgG de lapinVector LaboratoriesMP-7401
HRP anti-IgG de ratVector LaboratoriesMP-7444-15
Chambres humidifiées Stellar ScientificHS-120879Pour l’incubation des coupes de tissus avec les anticorps primaires et secondaires
Stylo à barrière hydrophobe (stylo PAP)Vector LaboratoriesH-4000Utilisé pour créer une barrière hydrophobe autour des coupes de tissus afin de retenir les anticorps et les réactifs pendant l’incubation et d’éviter la contamination croisée entre plusieurs coupes de tissus sur la même lame
KimwipesKimtech Science34155Utilisés pour l’élimination douce des réactifs résiduels et du tampon de lavage des coupes de tissus
Agitateur magnétique IKAI-10001529Pour la préparation des solutions mères de citrate de sodium et de DPBS
Four à micro-ondesPanasonic (Modèle : NN-L931BF)SN : 6H61050036Capacité de 2,2 pieds cubes. Nécessaire pour la récupération d’antigène assistée par la chaleur à l’aide d’un bécher en verre de 2 L
Microscope à lumière Nikon NikonSN : 707798Nikon Eclipse Ci-L sn : 707798, Sola light engine 5M5-LCR-VA sn : 11787, Logiciel : NIS Elements BR 4.60.00 & NIS Elements BR Analysis 4.60.00, Caméras : Nikon DS-Fi3 sn : 110865 (couleur) & Photometrics CoolSNAP DYNO snA17A608015 (N/B)
Compteur de pH VWR International77619-152Pour ajuster le pH du tampon de récupération d’antigène
Plastique transparentFisher Scientific01810Utilisé pour couvrir légèrement le tampon de récupération d’antigène pendant le chauffage au micro-ondes afin de minimiser l’évaporation et d’empêcher le dessèchement des tissus
Porte-lames en polyoxyméthylène (POM) MopecSP234Compatible avec les récipients de coloration ci-dessus ; chaque porte-lames peut contenir jusqu’à 24 lames microscopiques
Balances de précision Mettler Toledo30697420Pour peser le citrate de sodium et la poudre de DPBS
RéfrigérateurThermo ScientificTSG3005CAPour le stockage des réactifs et des anticorps sensibles à la température
Boîtes de stockage pour lamesFisher Scientific22-267294
Récipients ou boîtes de coloration MopecSP233Chaque récipient accueille un porte-lames de 24 lames
Barreaux d’agitation Fisher Scientific14-512-128Pour la préparation des solutions mères de citrate de sodium et de DPBS
Dihydrate de citrate de trisodium Thermo Scientific ChemicalsAA3643936
Tween 20 Thermo ScientificAAJ20605AP
Milieu de montage définitif VectaMount PT Vector LaboratoriesH-5600-60Milieu de montage définitif sans xylène utilisé pour l’IHC bichromatique
Kit de substrat de phosphatase alcaline Vector Blue Vector LaboratoriesSK-5300Utilisé pour le développement du signal chromogénique bleu lors de l’IHC bichromatique basée sur la phosphatase alcaline. Comme Vector Blue est partiellement soluble dans le xylène, des agents de clarification et des milieux de montage sans xylène doivent être utilisés pour les protocoles de coloration bichromatique
Kit de substrat de phosphatase alcaline Vector RedVector LaboratoriesSK-5100Utilisé pour le développement du signal chromogénique rouge lors de l’IHC bichromatique basée sur la phosphatase alcaline
Xylène (1 L) StatLab8400-1Utilisé comme agent de déparaffinage et de clarification pour l’IHC monochromatique. Préparer deux bouteilles de 500 mL étiquetées Xylène I et Xylène II

Références

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