Microaiguilles Raman à diffusion de surface améliorée ré-redox pour surveiller les réponses d’acupuncture chez les rats souffrant d’une tolérance au glucose altérée

Résumé

Cette étude exploratoire sur le modèle de rats présente une microaiguille active à diffusion Raman améliorée par surface (SERS) sensible au redox pour une intervention simultanée à l’acupuncture et le suivi ratiométrique des indices SERS liés à la capacité oxydative locale et au potentiel redox chez les rats souffrant d’une tolérance au glucose altérée.

Résumé

Une tolérance au glucose altérée (IGT) est associée à une homéostasie redox perturbée et à une augmentation du stress oxydatif, mais le suivi dynamique in vivo des modifications associées au redox pendant l’intervention d’acupuncture reste techniquement difficile. Cette étude a développé un système de microaiguilles actifs à diffusion Raman améliorée de surface (SERS) sensible à la redox pour une intervention simultanée à l’acupuncture et le suivi ratiométrique relatif des indices SERS liés à la capacité oxydative (CO) et au potentiel redox (RP) chez les rats atteints d’IGT. Des sondes SERS sensibles à l’oxydation et à la redox ont été préparées en fonctionnalisant des nanocoquilles d’or (GNS) avec de la p-phénylénediamine (p-PDA) pour la réactivité aux OC et de l’anthraquinone pour la réactivité RP, respectivement. Les sondes ont été chargées dans deux rainures gravées sur des aiguilles d’acupuncture pour construire des microaiguilles actives au SERS. Des rats mâles de Sprague–Dawley sans pathogènes spécifiques ont été utilisés dans cette étude exploratoire. Trois rats ont servi de témoins normaux, et 20 rats ont été nourris avec un régime riche en graisses et administrés à la streptozotocine (STZ) pour induire l’IGT. Après le dépistage, 18 rats IGT éligibles ont été divisés en groupes à régime riche en graisses et groupes à régime normal, avec 9 rats par groupe de régime. Chaque groupe alimentaire a été ensuite divisé en sous-groupes de torsion de point d’acupuncture, torsion non de site d’acupuncture et insertion directe de point d’acupuncture, avec 3 rats par sous-groupe. Le needling a été effectué deux fois par jour pendant 7 jours consécutifs, et les indices de glucose sanguin à jeun (FPG), de glucose postprandial à 2 heures (2hPG) et d’indices SERS liés à la CO et RP ont été enregistrés. Les résultats ont montré que le needling aux points d’acupuncture avec le twisting était associé à des valeurs plus faibles de FPG et de 2hPG et modifiait les indices SERS liés à OC et RP dans ce modèle de rat IGT. Comme les courbes d’étalonnage externes, les tests biochimiques indépendants de stress oxydo-agressif, les tests de lixiviation par sonde et les tests de biocompatibilité n’ont pas été inclus, les rapports SERS doivent être interprétés comme des indices optiques relatifs associés au redox plutôt que des concentrations biochimiques absolues ou des valeurs absolues du potentiel redox. Ces résultats confirment la faisabilité des microaiguilles actives par SERS comme plateforme préclinique exploratoire pour combiner l’intervention par acupuncture avec le suivi SERS ratiométrique local chez les rats IGT.

Introduction

La tolérance au glucose altérée (IGT), une diminution de la capacité du corps à tolérer le glucose, représente une étape de transition entre la glycémie normale et la glycémie^{diabétique 1}. L’IGT est donc un signal d’alerte précoce clé et une étape réversible dans le développement du diabète^{de type 2.} Les données cliniques montrent qu’environ 30 % de la population atteinte de l’IGT évoluera vers le diabète de type 2 dans 5 à 10 ans³ ; Cependant, avec une intervention rapide, ce pourcentage peut être réduit à moins de 10 ^%4.

L’IGT est un processus dynamique et complexe, et un environnement persistant à haute teneur en glucose est un déclencheur clé des troubles du métabolisme^{oxydatif 5}. Lorsque le corps est en état prolongé d’hyperglycémie, la chaîne respiratoire mitochondriale fonctionne de manière anormale, et le taux de génération d’espèces réactives d’oxygène augmente de 30 à 50 %, augmentant directement le pouvoir oxydatif^{dans le corps 6} ; Simultanément, des niveaux élevés de sucre inhibent l’activité des enzymes clés, telles que la glutathion réductase, empêchant le système antioxydant d’éliminer rapidement l’excès d’espèces réactives de l’oxygène et perturbant davantage l’équilibre oxydation-réduction. De plus, l’IGT s’accompagne de modifications pathologiques, notamment une résistance à l’insuline et une légère altération de la fonction β-cellulaire, entraînant une gamme de réponses biologiques et biochimiques ^7,8. Avec l’évolution de l’état redox, ces changements aggravent encore la perturbation du métabolisme du glucose et augmentent le risque potentiel de complications liées au diabète, notamment la rétinopathie, la néphropathie et les maladies^{cardiovasculaires 9,10}. Par conséquent, la surveillance de la capacité oxydative (CO) et du potentiel redox (RP) chez les individus ou les modèles animaux atteints de TGI devrait améliorer notre compréhension des mécanismes sous-jacents au développement de la TGI et guider la conception de stratégies thérapeutiques ciblées.

L’acupuncture a une histoire de plus de 3 000 ans et a montré une bonne efficacité clinique dans le traitement de nombreuses^{maladies 11}. De plus, de nombreuses études expérimentales chez des animaux ont démontré que l’acupuncture exerce des effets bénéfiques dans la régulation des états de stress oxydatif chez des modèles animaux en améliorant le système enzymatique antioxydant et en réduisant la peroxydation^{lipidique 12}. En tant que pratique médicale traditionnelle chinoise, l’acupuncture a également démontré des bénéfices significatifs dans le traitement du diabète et de l’IGT. Les points d’acupuncture Guanyuan (CV4) et Sanyinjiao (SP6) ont été rapportés activant la voie SIRT1/PGC-1α dans le muscle squelettique, soulageant ainsi la résistance à l’insuline chez les souris obéses^{diabétiques 13}. De plus, les points d’acupuncture de Tianshu (ST25) modulent l’activité des neurones inhibiteurs du glucose situés dans la région hypothalamique latérale et contribuent à la régulation du métabolisme des^{glycolipides 14}. Cependant, la plupart des études sur les mécanismes de l’acupuncture intravasculaire se sont principalement concentrées sur les systèmes neuromodulateur, immunomodulateur et gastro-intestinal, dans lesquels l’acupuncture peut affecter le métabolisme du glucose par la modulation de la fonction autonome ou réguler indirectement les niveaux de glucose sanguin en améliorant l’équilibre de la flore^{intestinale 15,16}. Le mécanisme spécifique de l’effet de l’acupuncture dans le traitement par IGT et ses effets sur le stress oxydatif ont manqué d’investigations approfondies et de données expérimentales.

La diffusion Raman améliorée en surface (SERS) offre une grande sensibilité et spécificité, ce qui permet la détection d’une grande variété d’analytes. Les nano-sondes SERS basées sur les nanofibres^{optiques 17}, les membranes de chitosan¹⁸, et des études antérieures ont démontré que les aiguilles^{d’acupuncture 19} peuvent être utilisées pour détecter des biomarqueurs, des neurotransmetteurs et d’autres aspects de la biochimie cellulaire in vivo. Les aiguilles d’acupuncture, en particulier, représentent des outils prometteurs pour les tests des tissus profonds, permettant un suivi in situ peu invasif suivi d’une analyse ex vivo. L’acupuncture, en tant que méthode thérapeutique bien établie, possède un éventail extrêmement large d’applications cliniques. Des études récentes ont montré que les fibres optiques, pansements et dispositifs à microaiguilles compatibles SERS peuvent soutenir le suivi in situ ou peu invasif des signaux associés au redox dans des contextes biologiquement^{pertinents 20,21}. Parallèlement, les aiguilles d’acupuncture actives pour le SERS et les systèmes de micro-aiguilles associés se sont imposés comme des vecteurs prometteurs pour intégrer la capacité de détection à l’intervention^{tissulaire 19}, aboutissant à des microaiguilles actives par SERS avec une réponse in vivo et des capacités de détection SERS in vitro.

La présente étude s’appuie sur la stratégie de microaiguilles SERS-active précédemment rapportée pour détecter les signaux liés à la capacité oxydative et au potentiel redox dans les modèles de stress induit par le glucose. Cependant, le présent travail diffère de l’étude précédente tant par son contexte biologique que par l’usage expérimental. Plus précisément, cette étude applique la plateforme de microaiguilles active SERS à un modèle de rat présentant une tolérance au glucose altérée et intègre le suivi ratiométrique local SERS avec une intervention par acupuncture. La présente étude compare en outre les points d’acupuncture avec des sites adjacents non acupunctures, évalue différentes manipulations de l’aiguillage et surveille les indices SERS associés au redox pendant une période d’intervention de 7 jours. Comparée aux fibres optiques à base de SERS, pansements de plaies et microaiguilles SERS actives principalement pour la détection biochimique à site ou à fonction unique rapportées, la plateforme actuelle offre deux avancées. Premièrement, les sondes sensibles à la OC et à la RP sont intégrées dans deux rainures gravées indépendantes sur une seule aiguille d’acupuncture, permettant une surveillance simultanée des paramètres redox complémentaires. Deuxièmement, l’aiguille d’acupuncture fonctionne non seulement comme support de sonde SERS, mais aussi comme dispositif thérapeutique, permettant de réaliser une surveillance redox pendant l’intervention d’acupuncture plutôt qu’après le traitement. Comme montré à la Figure 1, après l’insertion des microaiguilles dans les tissus, de minuscules plaies se forment, et les sondes dans les deux sillons réagissent avec les tissus, leur permettant de détecter les niveaux de CO et RP in vivo. L’objectif de l’étude était d’utiliser ces microaiguilles actives par SERS pour examiner les modifications du CO et du RP chez les rats atteints de IGT et déterminer les effets de l’acupuncture associée à des points d’acupuncture chez ces animaux, obtenant ainsi des informations précieuses sur le mécanisme des effets de l’acupuncture dans le traitement de l’IGT et la relation entre les états redox et hyperglycémique anormaux.

Protocole

Animaux et modèles de l’IGT

Toutes les procédures animales ont été approuvées par le Comité d’éthique animale de l’Institut de recherche de l’Université du Sud-Est de Suzhou (n° d’approbation SEU-IACUC-20250318007) et ont été réalisées conformément aux directives institutionnelles pour le soin et l’utilisation des animaux de laboratoire. Les rats ont été recueillis et hébergés dans des conditions sans agents pathogènes spécifiques (SPF) à 25 °C avec un cycle de 12 heures de lumière et 12 heures d’obscurité. Pour les interventions nécessitant une anesthésie, les rats étaient anesthésés à l’aide d’isoflurane délivré en oxygène via une chambre d’induction et maintenus à l’aide d’un cône nasal. L’isoflurane a été utilisé à 3 % pour l’induction et 1 % pour l’entretien, la concentration étant ajustée en fonction du rythme respiratoire et de la réponse procédurale.

Une profondeur anesthésique suffisante a été confirmée avant le piquage ou l’injection par la perte du réflexe de redressement et l’absence de réponse au pincement de l’orteil. Pendant l’anesthésie, le schéma respiratoire, la position corporelle et la récupération étaient surveillés, et les animaux étaient placés sur un coussin chauffant pour maintenir la température corporelle. Les animaux étaient hébergés à 2 par cage avec un accès libre à la nourriture et à l’eau, sauf si le jeûne était nécessaire pour le test de glycémie. Après l’arrivée, les rats étaient acclimatés pendant une semaine avant l’induction du modèle. Le bien-être animal était surveillé quotidiennement, y compris l’activité générale, le toilettage, la prise alimentaire, le poids corporel, l’état du site d’injection et la récupération après anesthésie. À la fin de l’étude, les rats ont été euthanasiés selon le protocole animal approuvé. L’euthanasie a été réalisée par inhalation progressive de CO₂ remplissante, suivie d’une confirmation du décès par la méthode de la luxation cervicale. Les animaux répondant aux critères humains, notamment une perte de poids sévère, une immobilité persistante, une respiration anormale, l’incapacité à manger ou à boire, ou une détresse sévère, ont été euthanasiés immédiatement plutôt que maintenus jusqu’à la fin prévue. Des rats mâles de Sprague–Dawley de qualité spécifique sans pathogène, pesant 200 ± 20 g, ont été utilisés dans cette étude. Après une semaine d’acclimatation, les rats ont été répartis au hasard en deux groupes : les trois rats du groupe normal ont été nourris avec de la nourriture normale, tandis que les 20 rats du groupe modèle ont été nourris avec de la nourriture riche en matières grasses (50 % de base de nourriture + 10 % de saindo + 25 % de saccharose + 15 % de poussière de jaune) pendant 3 semaines. Les animaux du groupe modèle ont reçu une injection intrapéritonéale de 20 mg/kg de solution STZ à 2 % (solubilisée dans 0,1 mol/L, tampon de citrate pH 4,4) pendant 12 heures, après 12 heures de jeûne sans restriction d’eau. Ceux du groupe normal ont reçu une injection intrapéritonéale de la dose correspondante de solution tampon de citrate après avoir été nourris avec de la nourriture normale. Un test de tolérance au glucose intrapéritonéal (IPGTT) a été réalisé une semaine plus tard. Les réactifs et équipements utilisés dans cette étude sont listés dans le tableau des matériaux.

La glycémie à jeun (FPG) a été mesurée par prélèvement sanguin à la pointe de la queue des rats de chaque groupe après 12 heures de jeûne sans restriction hydrique, et 2 h de glucose postprandial (2hPG) a été enregistrée après injection intrapéritonéale de 20 % de dextrose à 20 g/kg. Dans le groupe normal, la plage FPG était de 5,1 à 6,6 mmol/L, et la plage de glucose de 2 hPG était de 7,3 à 9,4 mmol/L, contre un FPG de ≤7,0 mmol/L et une plage de 2 hPG de 10 à 16 mmol/L dans le groupe modèle. Parmi les 20 rats assignés à l’induction du modèle IGT, 18 répondaient aux critères prédéfinis de l’IGT après l’IPGTT et ont été inclus dans l’expérience d’intervention ultérieure. Deux rats ont été exclus car leurs valeurs FPG ou 2hPG dépassaient la plage IGT prédéfinie. Les 18 rats éligibles ont ensuite été répartis au hasard dans un groupe à régime riche en graisses et un groupe à régime normal, avec 9 rats par groupe. Chaque groupe de régime était ensuite divisé en trois sous-groupes : torsion par point d’acupuncture, torsion sans site d’acupuncture et insertion directe par point d’acupuncture, avec trois rats par sous-groupe. Il s’agissait d’une étude exploratoire de développement de méthodes visant à évaluer la faisabilité de combiner une intervention par acupuncture avec le suivi ratiométrique basé sur SERS dans un modèle préclinique de rats IGT. Aucun calcul formel de puissance statistique n’a été effectué. La taille du sous-groupe de trois rats a été sélectionnée en fonction de la faisabilité, des études préliminaires SERS-microaiguilles, et du principe de réduction animale. Les rats étaient assignés au hasard par l’expérimentateur ; Aucune dissimulation formelle d’allocation ni aveuglement n’a été réalisée.

Les protocoles de traitement par acupuncture ont été examinés en se référant aux recommandations de pratique clinique fondées sur des preuves pour la médecine traditionnelle chinoise, et à la faisabilité des expériences animales²². Les points d’acupuncture sélectionnés étaient Zhongwan (RN12/CV12), Shuifen (RN9/CV9), Yinjiao (RN7/CV7), Tianshu bilatéral (ST25), Shuidao bilatéral (ST28) et Zusanli bilatéral (ST36). RN12, RN9 et RN7 étaient situés sur la ligne médiane antérieure et traités comme des points intermédiaires uniques, tandis que ST25, ST28 et ST36 étaient traités bilatéralement. Les appariements de points d’acupuncture étaient basés sur ceux utilisés pour le traitement clinique de l’IGT²³. L’adaptation s’est basée sur la littérature^24,25, en utilisant la méthode dichotomique. Chez les rats, les points d’acupuncture étaient localisés selon des repères anatomiques et une conversion proportionnelle à partir des points d’acupuncture humains standards. Les points abdominaux RN/CV ont été identifiés le long de la ligne médiane antérieure en utilisant le processus xiphoïde, l’ombilic et la symphyse pubienne comme repères anatomiques. ST25 a été marqué bilatéralement au niveau ombilical, et ST28 a été marqué bilatéralement dans la région abdominale inférieure, à la même distance latérale de la ligne médiane antérieure. ST36 a été identifié sur le membre postérieur antérolatéral dans la région antérieure du tibial, latéralement au tubercule tibial. Les sites de comparaison adjacents non liés à l’acupuncture étaient marqués à 5 mm de latéral par rapport aux points d’acupuncture correspondants et en dehors de la ligne méridienne reconnue, tout en évitant les vaisseaux visibles, les cicatrices et les sites de perforation précédents. Avant le piquage, les rats étaient anesthésés avec de l’isoflurane selon le protocole animal approuvé et placés en position couchée sur un coussin chauffant. La peau abdominale et postérieure de chaque site cible a été rasée et désinfectée avec 75 % d’éthanol. Des microaiguilles actives par SERS étaient insérées approximativement perpendiculaires à la peau à une profondeur d’environ 10 mm. Pour les groupes de torsion des points d’acupuncture, des microaiguilles actives par SERS ont été insérées dans les points d’acupuncture sélectionnés et tournées doucement dans les deux directions pendant la période de rétention de 20 minutes. Pour les groupes non centrés sur le site d’acupuncture, la même procédure a été réalisée aux sites de comparaison non acupuncture adjacents de 5 mm. Pour les groupes à insertion directe, des microaiguilles actives par SERS ont été insérées dans les points d’acupuncture et conservées pendant 20 minutes sans torsion. Toutes les procédures de needling étaient effectuées par le même opérateur entraîné afin de minimiser la variation entre opérateurs.

Le needling a été pratiqué deux fois par jour, à 10h00 et 15h00, pendant 7 jours consécutifs. Avant chaque intervention quotidienne, la FPG était mesurée après 8 heures de jeûne sans restriction d’eau. Après chaque intervention de piquage quotidienne, les réponses de la colonne orange et de la RP ont été enregistrées. Le 7e jour, après un traitement d’acupuncture, un IPGTT a été réalisé et des valeurs de 2hPG ont été enregistrées.

Mises en garde

La streptozotocine est dangereuse et doit être manipulée comme un produit chimique toxique. Préparez la solution de streptozotocine dans une hotte chimique ou un cabinet de biosécurité certifié, tout en portant une blouse de laboratoire, des gants en nitrile, des lunettes de protection et un masque. Les seringues, aiguilles, lingettes, literie, cages et déchets animaux contaminés par la streptozotocine doivent être manipulés conformément aux procédures institutionnelles dangereuses pour les déchets biologiques et chimiques. Les aiguilles et seringues usagées doivent être immédiatement jetées dans des récipients à objets tranchants résistants aux perforations sans reboucher.

Fabrication de microaiguilles SERS actives pour la détection de la CO et de la RP

Des aiguilles d’acupuncture ont été préparées^{comme indiqué précédemment 26}. Des microaiguilles actives SERS ont été fabriquées à l’aide du même type d’aiguilles d’acupuncture en acier inoxydable commercial (0,25 mm × 26 mm) tout au long de l’étude. Les aiguilles étaient insérées à peu près perpendiculairement à la peau à une profondeur de 10 mm. Pour les groupes en torsion, une rotation bidirectionnelle manuelle a été appliquée doucement et de manière constante pendant 20 minutes pendant la période de rétention par le même opérateur formé. La manipulation n’était pas contrôlée par un instrument ; par conséquent, la fréquence et l’amplitude exactes de rotation n’ont pas été quantifiées. Cette limitation a été reconnue dans la Discussion.

Au départ, les aiguilles étaient trempées dans une solution PMMA à 20 % (p/v) en MMA, suivies d’un séchage à température ambiante (25 °C) pendant 1 jour. Ensuite, deux creux parallèles de taille uniforme et de forme et profondeur similaires dans la couche protectrice du PMMA (espacés de 5 mm) ont été réalisés à l’aide d’une petite lame de couteau artisanal nettoyée à l’éthanol ; ensuite, les aiguilles étaient immergées dans de l’acide sulfurique de 0,5 M servant d’électrolyte pendant 10 s pour subir une gravure électrochimique à une tension de 12 V, générant ainsi deux rainures presque circulaires aux sites de marquage. Troisièmement, après avoir rincé à trois reprises, les aiguilles ont été immergées à température ambiante pendant 24 heures dans une solution d’éthanol contenant 0,1 mol L⁻¹ MPTES et 0,3 mol ^L−1 APTES, conférant ainsi une fonctionnalité sulfhydryle aux surfaces rainurées. Quatrièmement, le revêtement a été retiré en trempant l’aiguille dans le MMA. Des microaiguilles SERS-sensibles au potentiel redox ont été préparées selon une méthode²⁷ précédemment rapportée. Le substrat SERS a été adsorbé sur l’une des rainures gravées de chaque aiguille d’acupuncture, après quoi les microaiguilles actives SERS résultantes étaient immergées dans une solution aqueuse de p-PDA à une concentration de 1 × ^10-4 mol/L pendant 60 minutes à 37 °C, produisant des microaiguilles SERS sensibles à l’oxydation. Des substrats SERS à base de nanocoquilles d’or ont été synthétisés comme^{décrit précédemment 28}. Dans le présent travail, ces microaiguilles étaient laissées goutter dans l’autre rainure de chaque aiguille d’acupuncture, puis laissées sécher naturellement. Cela a donné des microaiguilles actives par SERS avec une réponse OC et RP.

Évaluation ex vivo de la réponse OC et RP aux microaiguilles actives par SERS

Les réponses des sondes OC et RP ont été évaluées en insérant les microaiguilles actives SERS dans le tissu ex vivo. Pour vérifier la réactivité de la sonde OC aux changements oxydatifs, les spectres SERS de p-PDA ont été enregistrés avant et après l’oxydation. Des spectres des sondes redox SERS ont également été obtenus dans une solution fortement réductrice de_{NaBH 4} et une solution fortement oxydante de HAuCl₄. La sélectivité de la sonde OC a été évaluée à l’aide d’agents réducteurs, incluant 1 × ^10-4 M_{FeSO 4}, 1 × ^10-4 M_{Na 2}SO₄, et 1 × ^10-4 M d’acide ascorbique, ainsi que des agents oxydants, dont 1 × ^10-4 M_{CuSO 4}, 1 × 10-4 M_{H 2O 2}, 1 × ^10-4 M_{FeCl 3}, et 1 × ^10-4 M HAuCl₄. Toutes les solutions ont été préparées dans 20 mM PBS (pH 7,4), et les sondes ont été incubées avec chaque solution pendant 20 minutes à 37 °C. La robustesse des microaiguilles actives par SERS a été évaluée en enregistrant les réponses OC avant et après la réaction avec 1 × ^10-4 mol/L de FeCl₃ à température ambiante. Ces tests ex vivo et basés sur la solution ont été utilisés pour confirmer la réactivité de la sonde dans des conditions contrôlées. Cependant, ils ne reproduisent pas entièrement la complexité du microenvironnement tissulaire in vivo, où la variation locale du pH, l’adsorption des protéines, les composants de la matrice extracellulaire et d’autres substances biologiques peuvent affecter les signaux SERS. Ainsi, les lectures in vivo de l’OC et du RP ont été interprétées comme des indices SERS relatifs associés au redox plutôt que comme des mesures biochimiques indépendantes de la matrice.

Détection de la CO et RP dans les sites d’acupuncture et non acupuncture

Pour évaluer la performance des sondes OC et RP aux points d’acupuncture et non, les microaiguilles actives par SERS ont été insérées dans des rats sains aux points d’acupuncture ST36 et RN12, et à 5 mm adjacents à chacun de ces points, à une profondeur d’environ 10 mm, pendant la même durée.

Effets de la torsion de l’aiguille sur la détection de l’OC et du RP

Pour évaluer la réactivité des sondes OC et RP sous différentes techniques de needling, des microaiguilles actives par SERS ont été insérées dans les points d’acupuncture ST36 et RN12 et 5 mm adjacentes à ces points chez des rats sains, jusqu’à une profondeur d’environ 10 mm. À chaque point d’acupuncture, une aiguille était tordue, tandis que l’aiguille correspondante adjacente à la pointe ne l’était pas, et inversement (une aiguille adjacente au point d’acupuncture était torsadée, alors que sa pendant au point d’acupuncture ne l’était pas). Les signaux SERS des sondes ont été collectés au même moment d’insertion pour chaque aiguille.

Modifications du CO et du RP chez les rats atteints de TGI concernant les points d’acupuncture, la torsion de l’aiguille et les conditions alimentaires

Pour évaluer les effets des points d’acupuncture, de la torsion d’aiguille et des conditions alimentaires sur le CO et le RP des rats porteurs d’IGT, les rats du groupe régime riche en graisses ont été répartis au hasard en trois groupes (A1, A2 et A3 ; trois rats dans chaque groupe), tout comme ceux du groupe alimentaire normal (groupes B1, B2 et B3 ; trois rats dans chaque groupe). Pour les rats des groupes A1 et B1, des microaiguilles actives par SERS étaient insérées dans les points d’acupuncture après sédation et tordues pendant 20 minutes ; la même procédure a été réalisée pour les rats des groupes A2 et B2, sauf que les microaiguilles ont été insérées à 5 mm à côté des points d’acupuncture. Pour les rats en A3 et B3, les microaiguilles actives par SERS étaient insérées dans les points d’acupuncture du rat sans se tordre ; Les aiguilles sont restées en place pendant 20 minutes. Le needling était pratiqué deux fois par jour, à 10h00 et 15h00, pendant 7 jours. Avant chaque intervention, un glucomètre était utilisé pour enregistrer les valeurs de FPG pour chaque groupe de rats (après jeûne mais sans restriction d’eau pendant 8 heures). Après chaque jour de needling, les réponses OC et RP ont été mesurées et enregistrées. Au jour 7, après acupuncture, une IPGTT a été réalisée sur chaque groupe de rats, et des valeurs de 2hPG ont été enregistrées.

Caractérisation et mesure

La morphologie des microaiguilles actives par SERS a été examinée à l’aide de microscopie électronique à balayage (MEB). Les spectres SERS ont été acquis à 25 °C, à l’aide d’un spectromètre Raman configuré avec un objectif de 50× longue distance de travail (NA : 0,5) et un laser de 785 nm. Pour toutes les mesures, le temps d’acquisition était de 10 s, et le système Raman fonctionnait à une puissance laser nominale de 600 μW sous la même configuration optique. La puissance réelle du laser délivrée à la surface tissulaire n’a pas été directement mesurée dans cette étude. Par conséquent, les spectres SERS ont été utilisés pour des comparaisons relatives entre groupes sous des paramètres d’acquisition identiques, et aucune conclusion n’a été tirée concernant la sécurité photothermique absolue des tissus. Les rapports d’intensité de deux sondes SERS ont été calculés selon l’approche suivante : le rapport des valeurs d’intensité à 1450 cm⁻¹ à 1500 cm⁻¹ a été désigné comme indicateur pour la CO (I₁₄₅₀ ^cm−1/I₁₅₀₀ ^cm−1), après soustraction de l’intensité à 1700 cm⁻¹ (en arrière-plan) de chacun des deux pics, respectivement, comme dans les rapports ^{précédents, 17} ; et en utilisant I₁₆₀₆ ^cm−1/I₁₆₆₆ ^cm−1 comme indicateur de RP, l’intensité à 1700 cm⁻¹ (en arrière-plan ) a été soustraite de chacun des deux pics, respectivement. Les valeurs calculées de I₁₄₅₀ cm⁻¹/I₁₅₀₀ ^cm−1 et I₁₆₀₆ cm⁻¹/I₁₆₆₆ cm⁻¹ ont été analysées comme indices relatifs dérivés du SERS des réponses associées à OC et RP, respectivement. Ces rapports ont été utilisés pour comparer les variations entre groupes et points temporels sous des paramètres d’acquisition identiques.

Aucune courbe d’étalonnage externe n’a été établie dans la présente étude pour convertir ces rapports en concentrations absolues d’espèces oxydatives ou en valeurs absolues électrochimiques du potentiel redox. Chaque spectre a été enregistré deux fois à cinq points différents de la sonde SERS dans trois échantillons réplicatifs. Origin était utilisé pour traiter les données et produire des graphiques. Pour minimiser la variabilité liée à l’acquisition, la même longueur d’onde laser, objectif, temps d’acquisition, réglage de puissance laser et flux de travail de traitement spectral ont été appliqués à tous les groupes. Les effets photothermiques ou photochimiques potentiels causés par l’irradiation laser n’ont pas été quantifiés de manière indépendante et sont reconnus comme une limitation. Les données statistiques sont présentées sous forme de moyenne ± d’erreur standard de la moyenne (MEB). La taille de l’échantillon et le test statistique utilisé pour chaque expérience ou panel de figures sont spécifiés dans les légendes correspondantes. Pour les expériences de validation de sonde ex vivo , la sonde SERS ou microaiguille préparée indépendamment était utilisée comme unité d’analyse. Pour les analyses in vivo de la glycémie et de l’indice SERS, le rat a été utilisé comme unité d’analyse biologique. Les spectres collectés à partir de plusieurs points sur la même sonde ont été considérés comme des mesures techniques et moyennés avant analyse au niveau du groupe. Les analyses statistiques ont été réalisées à l’aide du logiciel SPSS. Des comparaisons entre groupes ont été réalisées à l’aide des tests statistiques indiqués dans les figures correspondantes. Les mesures sérieuses de glycémie à jeun et d’indice SERS sur la période d’intervention de 7 jours ont été interprétées comme des tendances longitudinales exploratoires en raison de la petite taille des sous-groupes, et aucun modèle formel à mesures répétées ou à effets mixtes n’a été appliqué. La signification statistique a été définie comme p < 0,05. *p < 0,05, **p < 0,01, ***p < 0,001, ****p < 0,0001.

Résultats

Fabrication de microaiguilles SERS actives pour la détection de la CO et de la RP

Pour identifier les changements dans le CO et la RP, des microaiguilles SERS actives contenant les sondes correspondantes ont été fabriquées. Des images représentatives du MEB ont confirmé la structure à deux rainures des microaiguilles actives par SERS. La figure 2A montre le corps de l’aiguille d’acupuncture avec deux rainures gravées, la figure 2B montre une rainure chargée de GNS, et la figure 2C montre une vue agrandie du GNS distribué à l’intérieur de la rainure. Ces images ont confirmé que les rainures gravées pouvaient servir de sites de chargement localisés pour les sondes SERS sensibles à l’OC et au RP. Le rapport des intensités de pic I₁₄₅₀ cm⁻¹/I₁₅₀₀ ^cm−1 a été utilisé pour représenter le degré d’oxydation du p-PDA. La figure 3A présente les spectres SERS de p-PDA avant et après l’interaction avec 1 × 10⁻⁴ M FeCl₃, tandis que la figure 3B présente les spectres de la sonde redox dans 1 × 10⁻³ M NaBH4 et 1 × 10-4 M HAuCl₄ solutions aqueuses. La réponse de la sonde RP s’exprimait sous forme d’un rapport d’intensité maximale (I₁₆₀₆ ^cm-1/I₁₆₆₆ ^cm-1), qui diminuait avec l’augmentation du RP.

Pour évaluer la sélectivité de la sonde réactive à la capacité oxydative, le rapport I₁₄₅₀ ^cm−1/I₁₅₀₀ ^cm−1 a été mesuré après exposition à différents agents réducteurs et oxydants. Des mesures indépendantes par sonde ont été effectuées avec n = 3 par groupe, et la sonde SERS ou microaiguille préparée indépendamment a été utilisée comme unité d’analyse (Figure 3C). Comparé au groupe CK (test de Kruskal–Wallis suivi du test de comparaison multiple de Dunn), les agents réducteurs_{FeSO 4} et Na₂SO₄ n’ont pas modifié de manière significative le rapport I₁₄₅₀ cm⁻¹/I₁₅₀₀ cm⁻¹ (p > 0,05). L’acide ascorbique (AA, p < 0,001) a également produit un ratio accru dans la condition actuelle du test, bien qu’il ait été inclus comme agent réducteur. Par conséquent, la réponse AA a été interprétée prudemment comme une réponse spectrale spécifique à la sonde dans ce test basé sur la solution plutôt que comme une preuve d’un comportement oxydant. En revanche, les réactifs oxydants ou associés à l’oxydation augmentaient le rapport à des degrés divers. Le rapport a été augmenté après exposition à CuSO₄ (p < 0,0001), H₂O₂ (p < 0,0001), FeCl₃ (p < 0,0001) et HAuCl₄ (p < 0,0001). Pour évaluer la stabilité de la sonde OC à température ambiante, des spectres SERS ont été acquis à intervalles horaires sur une période de 6 heures avant la réaction de la sonde avec 1 × 10⁻⁴ M_{FeCl 3} (Figure 3D), et les rapports I₁₄₅₀ cm⁻¹/I₁₅₀₀ cm⁻¹ correspondants ont été calculés. Après adsorption par sonde, la valeur initiale est restée stable à environ 0,20 ± 0,02, tout comme celle de la réaction avec FeCl₃ à environ 0,9 ± 0,10, sur une période de 6 heures. Ces résultats suggèrent que le p-PDA sur GNS est stable dans l’air.

Réponses OC et RP aux points d’acupuncture et non acupuncture

Des études^{antérieures ont montré} que la sonde OC atteint sa réponse maximale 10 minutes après l’insertion. Les figures 4A et B illustrent la réponse des microaiguilles actives par SERS chez des rats en bonne santé placés aux points d’acupuncture ST36 et RN12, ainsi que chez ceux placés à 5 mm adjacents aux points, pendant 10 minutes. Pour ces expériences, n = 3 rats par groupe, et les spectres collectés à partir de plusieurs points sur la même sonde ont été traités comme des répliques techniques et moyennés avant analyse au niveau du groupe. Les microaiguilles actives pour le SERS ont répondu efficacement aux changements de la CO et de la RP in vivo, sans différence significative de CO et RP dans le groupe des points d’acupuncture par rapport au groupe des points non acrobucheurs (tests t des échantillons indépendants, p > 0,05).

Pour mieux déterminer les effets de la torsion de l’aiguille sur le CO local et le RP in vivo, des microaiguilles actives par SERS ont été insérées dans des rats sains aux points d’acupuncture ST36 et RN12, et 5 mm au-delà, à une profondeur de 10 mm. Lors de la manœuvre de torsion sur chaque point d’acupuncture, l’aiguille adjacente à la pointe était détournée, et inversement, et des changements dans les valeurs de CO et RP au point de la perforation ont été enregistrés (Figures 4C–F). Il n’y a pas eu de changements significatifs dans le CO et le RP selon que la torsion ait été pratiquée à l’un ou l’autre point d’acupuncture ou non chez des rats sains, ni aucun effet de torsion à un point adjacent (p > 0,05).

Modifications de la CO et du RP chez les rats présentant une IGT associées à l’acupuncture, à la torsion de l’aiguille et à des troubles alimentaires

Pour confirmer l’établissement réussi d’un modèle de rat basé sur l’IGT, des valeurs de FPG et de 2hPG ont été enregistrées à l’aide d’un test IPGTT sur des rats modèles et des rats témoins, respectivement. Le groupe témoin comprenait n = 3 rats, et le groupe modèle comprenait n = 18 rats remplissant les critères prédéfinis pour une tolérance au glucose altérée. Les rats modèles ont montré une glycémie à jeun plus élevée que les rats témoins (6,92 mmol/L contre 5,54 mmol/L ; test U de Mann–Whitney, p < 0,01) et une taux de glucose sanguin postprandial plus élevé dans les 2 heures par rapport aux rats témoins (11,52 mmol/L contre 7,92 mmol/L ; Test U de Mann–Whitney, p < 0,001) (Figure 5), indiquant une induction réussie de l’IGT chez les animaux modèles.

Pour vérifier les effets de la combinaison de points d’acupuncture, de torsion d’aiguille et de conditions alimentaires chez les rats IGT, un ensemble typique de paires de points d’acupuncture a été sélectionné. Les 18 rats modèles éligibles ont ensuite été divisés en groupes à régime riche en graisses et groupes à régime normal, avec n = 9 rats par groupe de régime. Chaque groupe alimentaire a été subdivisé en trois sous-groupes d’intervention : torsion par point d’acupuncture, torsion sans site d’acupuncture, et insertion directe par point d’acupuncture, avec n = 3 rats par sous-groupe. Les valeurs de FPG ont été enregistrées avant chaque jour de needling (Figures 6A–C), et des valeurs de 2hPG (Figure 6D) ont été mesurées après 7 jours de needling par test IPGTT dans chaque groupe. Dans cet ensemble de données exploratoire, aucune différence claire de FPG ou de 2hPG n’a été observée entre les groupes modèles à régime riche en graisses et à régime normal après le needling aux points d’acupuncture. Des comparaisons entre le needling au point d’acupuncture et le needling non au site d’acupuncture ont suggéré que la torsion du point d’acupuncture était associée à des valeurs de glucose sanguine plus faibles dans les conditions expérimentales actuelles (tests t d’échantillons indépendants, p < 0,05). Comme la taille du sous-groupe était petite et que le régime alimentaire, la localisation des points d’acupuncture et la manipulation des torsions ne pouvaient pas être totalement séparés statistiquement, ces résultats ont été interprétés comme des observations préliminaires de modèles animaux.

Les changements dans les indices SERS liés à la capacité oxydative et au potentiel redox ont été surveillés pendant une semaine d’intervention d’acupuncture chez les rats IGT. Pour ces analyses, n = 3 rats ont été inclus par sous-groupe, et chaque rat a été traité comme l’unité d’analyse biologique. Chez les rats à régime riche en graisses, l’indice SERS lié à la capacité oxydative a diminué au fil du temps dans les groupes de torsion des points d’acupuncture et d’insertion directe des points, tandis qu’il est resté relativement plus élevé dans le groupe de torsion sans site d’acupuncture (Figure 7A). L’indice SERS lié au potentiel redox a augmenté au fil du temps dans les groupes de torsion du point d’acupuncture et d’insertion directe du point d’acupuncture, tandis que le groupe de torsion sans site d’acupuncture a montré une augmentation relativement plus faible (Figure 7B). Des tendances similaires ont été observées chez les rats IGT à régime normal. L’indice SERS lié à la capacité oxydative a diminué au fil du temps dans les groupes de torsion des points d’acupuncture et d’insertion directe des points d’acupuncture, avec un changement plus faible dans le groupe de torsion non des sites d’acupuncture (Figure 7C). L’indice SERS lié au potentiel redox a augmenté au fil du temps dans les groupes de torsion des points d’acupuncture et d’insertion directe des points d’acupuncture, tandis que le groupe de torsion sans site d’acupuncture est resté relativement plus bas (Figure 7D).

Pour comparer davantage les conditions alimentaires sous la même manipulation d’acupuncture, les sous-groupes de torsion des points d’acupuncture issus des groupes des régimes riches en graisses et des régimes normaux ont été comparés. Dans cette comparaison, l’indice SERS lié à la capacité oxydative a diminué au fil du temps dans les deux conditions alimentaires, avec une diminution plus importante observée dans le sous-groupe des torsions de points d’acupuncture au régime normal au jour 7 (Figure 7E). L’indice SERS lié au potentiel redox a augmenté au fil du temps dans les deux conditions alimentaires, avec une valeur plus élevée au jour 7 dans le sous-groupe de la torsion des points d’acupuncture au régime normal (Figure 7F). Ces résultats suggèrent que la torsion des points d’acupuncture et la normalisation alimentaire étaient associées à des modifications des indices SERS locaux associés au redox chez les rats IGT. Comme chaque sous-groupe ne comprenait que trois rats et qu’aucun test biochimique indépendant sur le stress oxydoatif n’a été réalisé, ces résultats doivent être interprétés comme des observations exploratoires de modèles animaux plutôt que comme des preuves biochimiques définitives d’amélioration du stress oxydatif.

DISPONIBILITÉ DES DONNÉES :

Toutes les données brutes numériques utilisées pour la génération de figures et l’analyse statistique, y compris les mesures de glucose sanguin, les valeurs de rapport dérivées du SERS, et les données sources pour les panels de figures quantitatives, ont été organisées et téléchargées sous forme de Tableau Supplémentaire 1. Pour les expériences de surveillance continue de la sonde générées directement par l’instrument analytique, les valeurs exportées et les résultats représentatifs générés par l’instrument utilisés pour évaluer la performance de la sonde sont inclus dans le Fichier Supplémentaire 1.

Figure 1 : Flux de travail méthodologique pour l’intervention par acupuncture et le suivi SERS ratiométrique local à l’aide d’une microaiguille SERS active à double rainure. Le schéma illustre l’insertion de la microaiguille SERS active à deux rainures dans un point d’acupuncture ou un site adjacent non acupuncture, suivie de l’acquisition spectrale Raman. Les auteurs ont créé cette figure à l’aide du logiciel WPS, et aucune licence de droit d’auteur n’est requise. Abréviations : SERS = diffusion Raman améliorée en surface. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figurine.

Figure 2 : Images représentatives du MEB des microaiguilles actives en SERS. (A) Corps d’aiguille d’acupuncture comportant deux rainures ; barre d’échelle = 200 μm ; grossissement = 77×. (B) Une rainure intégrée au GNS ; barre d’échelle = 20 μm ; grossissement = 1 000×. (C) Une image agrandie de la rainure dans B ; barre d’échelle = 2 μm ; grossissement = 30 000×. Abréviations : SEM = microscopie électronique à balayage ; GNS = nanocoquillages en or. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figurine.

Figure 3 : Caractérisation des sondes SERS OC-responsive et RP-responsive. (A) Spectres normalisés de p-PDA avant et après l’interaction avec FeCl₃. (B) Spectres SERS normalisés des sondes RP dans des solutions de_{NaBH 4} et_{HAuCl 4}, respectivement. (C) I₁₄₅₀ cm⁻¹/I₁₅₀₀ cm⁻¹ rapports pour les sondes OC dans diverses solutions oxydantes et réductrices. n=3 mesures indépendantes par sonde par groupe. Test de Kruskal–Wallis suivi du test de comparaison multiple de Dunn contre le groupe CK. Les données sont présentées comme moyenne ± erreur standard de la moyenne (MEB). (D) Évaluation de la stabilité sur six heures de la sonde sensible au CO avant et après la réaction avec FeCl₃. Abréviations : SERS = diffusion Raman améliorée par la surface ; CK = contrôle ; p-PDA = p-phénylénediamine ; AA = acide ascorbique. p < 0,001, ****p < 0,0001. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figurine.

Figure 4 : Indices SERS liés à la OC et RP mesurés avec différentes méthodes de pointage aux sites d’acupuncture et non acupuncture chez des rats sains. (A) Indice SERS lié à la CO après insertion directe aux points d’acupuncture et aux sites adjacents non acupunctures. (B) Indice SERS lié à la RP après insertion directe aux points d’acupuncture et aux sites adjacents non acupuncture. (C) Indice SERS lié à la CO après insertion directe aux sites non acupunctures et torsion de l’aiguille aux points d’acupuncture. (D) Indice SERS lié à la RP après insertion directe aux sites non acupunctures et torsion de l’aiguille aux points d’acupuncture. (E) Indice SERS lié à l’OC après insertion directe aux points d’acupuncture et torsion de l’aiguille aux sites adjacents non acupunctures. (F) Indice SERS lié à la RP après insertion directe aux points d’acupuncture et torsion de l’aiguille aux sites adjacents non acupunctures. OC a été calculé comme_{I 1450} ^cm-1/I₁₅₀₀ ^cm-1, et RP comme_{I 1606} ^cm-1/I₁₆₆₆ ^cm-1. n=3 par groupe. Les données sont présentées en moyenne ± SEM. Aucune différence significative n’a été observée entre les comparaisons par paires. Abréviations : OC = capacité oxydative ; RP = potentiel redox. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figurine.

Figure 5 : Valeurs FPG et 2hPG selon le test IPGTT chez les rats modèles et témoins (CK). Le FPG et le 2hPG ont été mesurés pour vérifier l’établissement du modèle de rat à tolérance au glucose altérée. n = 3 rats dans le groupe témoin et n = 18 rats dans le groupe modèle. L’analyse statistique a été réalisée par le test U de Mann–Whitney, et les résultats sont présentés sous forme de la moyenne ± SEM. **p < 0,01, ***p < 0,001. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figurine.

Figure 6 : Valeurs de FPG et 2hPG pour les rats IGT lors des interventions d’acupuncture. (A) Valeurs FPG pour le groupe recevant l’acupuncture avec torsion de l’aiguille aux points d’acupuncture et insertion directe de l’aiguille aux points d’acupuncture (n = 3 par groupe). (B) Valeurs FPG pour le groupe recevant des piquages avec torsion aux points d’acupuncture et aux points non acupunctures (n = 3 par groupe). (C) Valeurs de FPG pour les groupes régiments riches en graisses et normaux (n = 3 par groupe). (D) Jour 7 Valeurs de 2hPG chez les rats riche en graisses et au régime normal sous les conditions de torsion des points d’acupuncture, torsion non des sites d’acupuncture et insertion directe des points d’acupuncture. (n = 3 par groupe). Les résultats sont présentés comme la moyenne ± SEM. Les comparaisons par paires prévues des points d’arrivée dans le panel D ont été analysées à l’aide d’un test t de Student à deux branches non apparié. *p < 0,05. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figurine.

Figure 7 : Changements de la CO et du RP des rats dans chaque groupe durant une semaine d’acupuncture. (A) Changements de CO chez les rats IGT riches en graisses. (B) Changements de RP chez les rats IGT à régime riche en graisses. (C) Changements de CO chez les rats IGT à régime normal. (D) Changements de RP chez les rats IGT à régime normal. (E) Comparaison de l’indice SERS lié à la CO entre les conditions d’un régime riche en graisses et celui normal au sein du sous-groupe de torsion du point d’acupuncture ; (F) Comparaison de l’indice SERS lié à RP entre les conditions d’alimentation riche en graisses et normales au sein du sous-groupe de torsion des points d’acupuncture. n = 3 rats par sous-groupe. Les données sont présentées en moyenne ± MEB. Les mesures sérielles ont été interprétées comme des tendances longitudinales exploratoires. Abréviations : OC = capacité oxydative ; RP = potentiel redox. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figurine.

Fichier supplémentaire 1 : Résultats représentatifs générés par l’instrument pour l’évaluation de la sonde-réponse. Ce fichier contient des résultats représentatifs de surveillance continue générés directement par l’instrument analytique et utilisés pour évaluer la performance de la réponse de la sonde. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.

Tableau complémentaire 1 : Tableau de données brut pour les analyses quantitatives. Ce fichier contient les données numériques utilisées pour la génération de figures et l’analyse statistique, y compris les mesures de glycémie, les valeurs de ratio dérivées du SERS, et les données quantitatives du panel de figures. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.

Discussion

Une tolérance au glucose altérée représente une étape de transition réversible avant le diabète de type 2 et est étroitement associée à un déséquilibre métabolique, à la résistance à l’insuline et à la dysrégulation liée au stress oxydatif. L’intervention sur le mode de vie et d’autres stratégies thérapeutiques précoces peuvent réduire le risque de progression d’une tolérance au glucose altérée au diabète, mais les outils pour surveiller dynamiquement les réponses biochimiques locales pendant l’intervention restent^{limités à 30}. L’acupuncture a été rapportée comme affectant le métabolisme du glucose et les voies liées au stress oxydoatif dans des études expérimentales et cliniques. Cependant, la plupart des études mécanistes sur l’acupuncture reposent sur des mesures sanguines ou tissulaires finales, et relativement peu de méthodes permettent un suivi peu invasif des réponses locales associées au redox lors de l’intervention à l’acupuncture. Des essais cliniques antérieurs sur des traitements pour l’IGT ont confirmé que le risque de diabète peut être largement réduit grâce à des interventions liées au mode de vie, notamment des modifications alimentaires, une réduction de la masse corporelle et une augmentation de l’activité^{physique 31}. Il a été démontré que l’acupuncture est efficace pour améliorer les indices métaboliques du glucose et réduire le jeûne et le 2hPG. Ainsi, l’élucidation de la relation entre acupuncture, redox et IGT peut fournir des approches pour inverser l’IGT ou intervenir dans sa progression, réduisant ainsi l’incidence du diabète sucré, tout en fournissant un éclairage sur la pathologie de l’IGT et les mécanismes sous-jacents à son développement.

La présente étude propose une plateforme Raman à microaiguilles actives à diffusion active à double rainure Redox et sensible à la surface, pour combiner l’intervention par acupuncture avec le suivi SERS ratiométrique local dans un modèle de rat avec une tolérance au glucose altérée. Dans ce système, deux rainures gravées sur une seule aiguille d’acupuncture étaient utilisées pour transporter des sondes réactives à la capacité oxydative et rédox-potentiel. Cette conception permettait à l’aiguille d’acupuncture de fonctionner non seulement comme un outil d’intervention, mais aussi comme vecteur de détection pour les lectures optiques locales relatives associées au redox. Les résultats ont montré que le needling aux points d’acupuncture avec le twisting était associé à une baisse de la glycémie à jeun et des valeurs de 2hPG, ainsi qu’à des modifications des indices SERS liés à la capacité oxydative et au potentiel redox chez les rats tolérants au glucose altérés. Ces résultats confirment la faisabilité d’utiliser des microaiguilles actives par SERS pour explorer les réponses locales associées au redox lors de l’intervention par acupuncture. Dans l’ensemble, les résultats suggèrent que le needling aux points d’acupuncture avec le twisting était associé à des valeurs plus faibles de FPG et de 2hPG ainsi qu’à des modifications des indices SERS liés à la CO et RP chez les rats IGT. Ces résultats confirment la faisabilité d’utiliser des microaiguilles actives par SERS pour suivre les réponses optiques locales associées au redox lors de l’intervention par acupuncture. Cependant, comme les tests biochimiques standards de stress oxydoatif et de sollicitude, l’analyse de lixiviation par sonde et les tests de biocompatibilité tissulaire n’ont pas été réalisés, les changements observés de l’indice SERS ne doivent pas être interprétés comme une preuve biochimique définitive d’une amélioration du stress oxydatif.

Plusieurs approches alternatives pourraient être utilisées pour approfondir la même hypothèse. Les tests biochimiques standards de stress oxydatif, incluant des mesures d’espèces réactives d’oxygène, de malondiadéhyde, de superoxyde dismutase, de catalase, de glutathion peroxydase et de rapports glutathione/glutathion disulfure, pourraient être utilisés pour valider si les variations des indices dérivés du SERS correspondent aux biomarqueurs conventionnels de stress^{oxydatif 32,33}. Les sondes redox électrochimiques, les capteurs redox à fluorescence, les tests de chimiluminescence, la microdialyse suivie d’une analyse biochimique, ainsi que la validation immunohistochimique ou histologique tissulaire peuvent également fournir des informations complémentaires. La combinaison de la détection par microaiguille active par SERS avec ces approches indépendantes permettrait de déterminer si les changements optiques observés reflètent des altérations biochimiques redox spécifiques ou des réponses tissulaires locales plus larges au needling et au statut^{métabolique 34}.

Les applications potentielles de cette méthode vont au-delà du modèle actuel de tolérance au glucose altéré. Parce que le déséquilibre redox est impliqué dans les maladies métaboliques, les lésions tissulaires, l’inflammation et la réparation des plaies, les microaiguilles actives par SERS peuvent constituer un outil préclinique utile pour surveiller les réponses locales associées au redox dans des modèles liés au diabète, des études de cicatrisation, des modèles de maladies inflammatoires et d’autres interventions^{mini-invasives 35}. Dans la recherche en acupuncture, la plateforme peut être utile pour comparer les points d’acupuncture, les sites non acupunctures, les différentes manipulations de brodage et différents programmes d’intervention. Cependant, ces applications restent exploratoires et nécessitent une validation technique et biologique supplémentaire.

Plusieurs limitations doivent être notées. Premièrement, les relevés OC et RP ont été calculés comme des indices ratiométriques dérivés du SERS et n’ont pas été calibrés selon les concentrations standard d’espèces oxydatives ou les valeurs de potentiel redox électrochimiques absolus. Par conséquent, les résultats présents doivent être interprétés comme des réponses optiques associées à la redox relative sous des conditions d’acquisition identiques, plutôt que comme des mesures biochimiques absolues. Deuxièmement, le microenvironnement tissulaire biologique peut introduire des sources supplémentaires de variation du signal, notamment des changements locaux de pH, l’adsorption des protéines, des composants de la matrice extracellulaire et d’autres effets matriciels. Ces facteurs n’ont pas été entièrement évalués dans des milieux contenant du sérum ou imitant les tissus. Troisièmement, la puissance réelle du laser délivrée à la surface tissulaire et le changement local de température lors de l’acquisition du Raman n’ont pas été mesurés directement ; par conséquent, les effets photothermiques ou photochimiques potentiels ne peuvent être totalement exclus. Quatrièmement, la reproductibilité au niveau des lots de la géométrie des rainures et de la charge de la sonde n’a pas été évaluée quantitativement par imagerie MEB multi-aiguilles ou analyse d’efficacité de chargement. Enfin, la validation biochimique indépendante, l’analyse par lixiviation par sonde et les tests de biocompatibilité locale n’ont pas été réalisés. Les études futures devraient établir des courbes d’étalonnage dans des matrices biologiquement pertinentes, corréler les indices SERS avec les tests standard de stress oxydatif et redox, quantifier la lixiviation par sonde, évaluer la compatibilité tissulaire locale après insertion répétée, et valider l’appareil dans des cohortes animales plus grandes. Les microaiguilles actives par SERS peuvent constituer une plateforme utile pour combiner l’intervention par acupuncture avec le suivi SERS ratiométrique relatif des indices locaux associés au redox dans un modèle préclinique de rat IGT. Des étalonnages supplémentaires, une validation biochimique, une évaluation de lixiviation par sonde et des études de biocompatibilité sont nécessaires avant qu’une surveillance quantitative absolue ou une application translationnelle puisse être revendiquée.

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
3-Aminopropyltriéthoxysilane (APTES, 98%)	Tianjin Heowns Bio-Chemical Technology Co., Ltd.	A800524
(3-Mércaptpropyl)triméthoxysilane (MPTES, 95%)	Tianjin Heowns Bio-Chemical Technology Co., Ltd.	M742544
Acide ascorbique	Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd.	CFAD310554
Glucomètre	Cofoe Medical Technology Co., Ltd.	Cofoe A03
Bandelettes de test de glucose sanguin	Cofoe Medical Technology Co., Ltd.	Cofoe-A03-C
Sulfate de cuivre (CuSO4)	Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd.	PHR1477
Alcool éthylique (≥99,7%)	Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd.	XW00641752
Sulfate de fer (FeSO4)	Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd.	XW01772078701
Glucose (Glu)	Tianjin Heowns Bio-Chemical Technology Co., Ltd.	D9434
Peroxyde d'hydrogène (H2O2)	Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd.	P-17-0500
Chlore de fer (FeCl3)	Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd.	CP81015228
Méthacrylate de méthyle (MMA)	Shanghai Aladdin Bio-Chem Technology Co., Ltd.	M109626
Spectromètre micro-Raman	Renishaw	InVia Raman Microscope
p-Phénylènediamine (p-PDA)	Shanghai TCI Chemical Industry Development Co., Ltd.	P128784
Polyméthacrylate de méthyle (PMMA)	Tianjin Heowns Bio-Chemical Technology Co., Ltd.	P742581
Microscope électronique à balayage	Zeiss	ULTRA Plus
Borhydrure de sodium (NaBH4)	Shanghai Adamas-beta Reagents Co., Ltd.	S432207
Sulfite de sodium (Na2SO4)	Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd.	S572396
Aiguilles d'acupuncture en acier inoxydable	Suzhou Tianxie Acupuncture Instruments Co., Ltd.	X-20-03
Logiciel d'analyse statistique	International Business Machines Corporation	Version 2021
Stréptozotocine (STZ)	Shanghai Aladdin Bio-Chem Technology Co., Ltd.	S408311
Acide tétrachloroaurique (HAuCl4)	Tianjin Heowns Bio-Chemical Technology Co., Ltd.	A124024
Logiciel SPSS	International Business Machines Corporation, Armonk, New York State, USA	version 26.0
rats	Jiangsu Qinglongshan Biotechnology Co., Ltd.	Specific-pathogen-free male Sprague-Dawley
chow de base	Anuokang Biotech.	SY10001
Suif	MCE	HY-W127601
Saccharose	MCE	HY-B1779
Poudre de jaune d'œuf	MCE	HY-B2235B
Acide citrique monohydraté	Sigma-Aldrich	C1909
Citrate trisodique dihydraté	Sigma-Aldrich	S4641
Tampon citrate	beyotime	P0086
Tampon de phosphate de saure	beyotime	ST448-1L
Isoflurane	Bioss	D54468
Système d'anesthésie à l'isoflurane pour petits animaux	RWD Life Science	R500
Chambre d'induction et cone nasal	RWD Life Science	R500compatible accessoires
Tapis chauffant	Shanghai Yuyan Life Science	Y69020
Éthanol à 75%	Boyu Bio.	YB60401
Chambre d'euthanasie CO2	Lab Animal Tec. Co.	LAT-10-0090
WPS	Beijing Kingsoft Office Software	WPS365