Un modèle de lacération hépatique murine simplifiant la quantification de la coagulopathie hémorragique, de l'inflammation et de la survie induites par un traumatisme

Bilgimol Chumappumkal Joseph; Mia Lora Cacho; Ryan Mathew; Annette von Drygalski

doi:10.3791/72215

Article de méthode

Un modèle de lacération hépatique murine simplifiant la quantification de la coagulopathie hémorragique, de l'inflammation et de la survie induites par un traumatisme

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DOI :

10.3791/72215

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25 septembre 2026

Bilgimol Chumappumkal Joseph¹ , Mia Lora Cacho¹ , Ryan Mathew¹ , Annette von Drygalski¹

¹Division of Hematology and Cellular Therapy, Department of Medicine, University of California San Diego

Dans cet article

Résumé

Nous présentons un modèle reproductible de lacération hépatique chez la souris, associé à une hémorragie sévère, intégrant la perte sanguine, la coagulopathie induite par le traumatisme et les résultats en termes de survie. Ce modèle permet d'évaluer des interventions hémostatiques, notamment le facteur VIIa recombinant et l'acide tranexamique, ainsi que des paramètres de coagulation, de fibrinolyse et de mortalité, offrant ainsi une plateforme rentable et évolutible pour la recherche mécanistique et translationnelle sur l'hémorragie.

Résumé

Les hémorragies incontrôlées restent une cause majeure de décès évitable chez les patients traumatisés, et la coagulopathie induite par le traumatisme (TIC) est un facteur déterminant majeur de la mortalité précoce. Des modèles expérimentaux capables de reproduire de manière fiable l'hémorragie et les réponses coagulopathiques associées sont essentiels pour les études mécanistiques et l'évaluation d'interventions ciblées. Nous décrivons ici un modèle murin standardisé d'hémorragie profonde utilisant une lacération hépatique (LL) reproductible provoquant une hémorragie, qui peut être quantifiée avec précision, tout en permettant simultanément le suivi de la coagulopathie systémique, des marqueurs inflammatoires et de la mortalité.

Les souris subissent une laparotomie médiane standardisée suivie d'une LL, et la perte sanguine est quantifiée à l'aide de compresses imprégnées de sang. Les marqueurs systémiques de la coagulation, de la fibrinolyse et des marqueurs inflammatoires sont recueillis par prélèvement sanguin rétro-orbitaire avant et à des intervalles sériels prédéfinis après l'intervention. La LL accompagnée de perte sanguine produit de manière fiable un TIC (caractérisé par un allongement du temps de céphaline activé (aPTT), une augmentation du complexe thrombine-antithrombine (TAT), une diminution sélective des facteurs de coagulation (F) V et VIII et une activation de la fibrinolyse). Parallèlement, l'activation inflammatoire se manifeste par une augmentation de l'interleukine-6 (IL-6). De plus, ce modèle permet également des analyses de survie après la réparation de l'incision médiane.

En tant qu'application translationnelle, le rhFVIIa et l'acide tranexamique (TXA) sont utilisés pour démontrer que le modèle est sensible à la correction des saignements grâce à une modulation pharmacologique des paramètres de la coagulation et de la fibrinolyse. Par rapport aux modèles chez les grands animaux, ce système murin offre une opportunité économique, polyvalente et facilement échelonnée pour étudier des interventions innovantes et ciblées dans les hémorragies traumatiques.

Introduction

Le traumatisme est une cause majeure de décès et d'invalidité chez les jeunes adultes (âge < 45 ans)¹^,², les hémorragies incontrôlées étant responsables d'une grande partie de la mortalité précoce³. Un facteur critique de mauvais pronostic chez les patients gravement blessés est le développement d'une coagulopathie induite par le traumatisme (TIC)⁴^,⁵. La TIC est une dysrégulation complexe et multifactorielle de l'hémostase, caractérisée par l'épuisement des facteurs de coagulation V et VIII⁶^,⁷, une fibrinolyse dysrégulée⁷^,⁸^,⁹ et une activation inflammatoire systémique¹⁰. La TIC contribue à la persistance des saignements et est associée à des besoins accrus de transfusion¹¹, à un risque accru d'insuffisance d'organes⁵ et à une mortalité élevée, malgré les progrès réalisés dans la réanimation de contrôle des lésions et les interventions thérapeutiques⁵.

Des modèles expérimentaux capables de reproduire de manière fiable le choc hémorragique avec les modifications coagulopathiques associées sont donc essentiels pour l'investigation mécanistique et l'évaluation d'interventions hémostatiques ciblées. Les modèles d'hémorragie contrôlée utilisent un prélèvement sanguin standardisé, qui peut ne pas induire de lésion tissulaire, contrairement à ce qui contribue à la réponse coagulopathique systémique observée dans les traumatismes cliniques¹². Par conséquent, les modèles d'hémorragie intégrant une lésion d'organe solide devraient offrir une pertinence clinique accrue, à condition que les saignements prolongés et les réponses systémiques puissent être évalués de manière quantitative¹³^,¹⁴^,¹⁵^,¹⁶. Des modèles plus complexes du TIC intègrent des combinaisons de traumatisme crânio-cérébral, de fractures des os longs ou des membres, de lésions des tissus mous, de laparotomie et de choc hémorragique contrôlé afin de reproduire plusieurs composantes du traumatisme grave¹⁷^,¹⁸. Bien que ces approches offrent une représentation plus complète du polytraumatisme, leurs multiples procédures de lésion et manipulations physiologiques peuvent augmenter la complexité technique et la variabilité expérimentale.

Malgré des décennies de recherches, les modèles expérimentaux cliniquement pertinents et reproductibles du CID restent limités et hétérogènes. Les revues de littérature ont souligné le besoin de modèles robustes capables de reproduire plus fidèlement la séquence clinique de lésion tissulaire et de choc hémorragique, et permettant d'évaluer des interventions thérapeutiques¹⁷^,¹⁹. Des modèles complexes nécessitant une instrumentation étendue, notamment une cathétérisation cardiaque et une surveillance hémodynamique continue, peuvent fournir des informations physiologiques détaillées, mais requièrent également des équipements spécialisés et des manipulations procédurales supplémentaires. Afin de réduire les obstacles à la recherche en traumatologie, il paraît essentiel de simplifier l'approche expérimentale tout en conservant les caractéristiques clés du CID. Nous décrivons ici un modèle murin standardisé induisant un choc hémorragique non contrôlé¹⁴ à l'aide d'une lésion hépatique (LL) reproductible provoquant une hémorragie sévère et reproduisant les caractéristiques principales du CID. Ce modèle permet d'évaluer les réponses de coagulation et inflammatoires, notamment des mesures générales de la coagulation (TCA et génération de thrombine), une diminution sélective de facteurs de coagulation (FV et FVIII) en tant que signature du CID, des marqueurs de la fibrinolyse, ainsi qu'un profilage des cytokines. Afin de démontrer la sensibilité et la pertinence de ce modèle par rapport au traumatisme humain, nous évaluons les effets du rhFVIIa (agent pro-hémostatique) et de l'ACX (agent anti-fibrinolytique), utilisés lors de la réanimation des traumatismes, sur la gravité de l'hémorragie, l'évolution du trouble de la coagulation et les résultats en termes de survie.

Le modèle permet également des prélèvements sanguins sériels et terminaux, permettant une évaluation longitudinale des trajectoires de coagulation et d'inflammation en lien avec la gravité des lésions et les interventions thérapeutiques. Pris ensemble, ces éléments offrent un système murin reproductible et évolutif pour l'étude du TIC dans le contexte d'une hémorragie sévère, ainsi que pour l'évaluation d'interventions hémostatiques et de traitements pharmacologiques ciblés, en utilisant des critères d'évaluation cliniquement pertinents, notamment la perte sanguine, la coagulopathie, la fibrinolyse, l'inflammation et la survie.

Par rapport aux modèles murins de lacération hépatique publiés précédemment, notamment le protocole décrit par Dyer et al.¹³, cette méthode introduit plusieurs avancées méthodologiques majeures. Celles-ci incluent une mesure gravimétrique quantitative des pertes sanguines, une standardisation de la gravité de la lésion par normalisation de la masse hépatique lacérée par rapport au poids corporel, ainsi qu’un profilage complet du CID, de la fibrinolyse et de l’inflammation. En outre, le modèle permet des prélèvements sériés, une modulation pharmacologique et des analyses de survie détaillant les techniques de fermeture abdominale, favorisant ainsi une récupération physique plutôt qu’une euthanasie. Toutes les procédures peuvent être réalisées dans le cadre d'une seule approche expérimentale, offrant une plateforme reproductible et translationnelle pour l'étude des hémorragies et des interventions hémostatiques ciblées.

Protocole

Le Comité institutionnel de soins et d'utilisation des animaux de l'Université de Californie à San Diego (UCSD) a approuvé tous les protocoles relatifs aux animaux. Les souris C57BL/6J ont été élevées et maintenues au sein de l'installation interne d'élevage de l'UCSD. Des souris mâles et femelles âgées de 8 à 10 semaines ont été utilisées dans les expériences. Une vue d'ensemble schématique du déroulement et du calendrier expérimental est fournie dans la figure supplémentaire 1.

REMARQUE : Les tailles d'échantillons ont été déterminées à partir d'expériences préliminaires, de la variabilité attendue pour chaque critère d'évaluation et de l'expérience antérieure avec le modèle de lacération hépatique chez la souris. Les tailles finales d'échantillons pour chaque critère d'évaluation et chaque groupe expérimental sont indiquées dans les légendes des figures correspondantes. Pour les mesures du poids hépatique, les données provenant de plusieurs expériences indépendantes ont été regroupées afin d'évaluer la cohérence entre les cohortes expérimentales. Pour les tests de coagulation réalisés lors de séries expérimentales distinctes, des échantillons précédemment analysés ont été inclus dans plusieurs séries afin de surveiller la cohérence et la reproductibilité entre les tests.

1. Préparation préexpérimentale

Prélèvement des échantillons de référence (jour -1)
1. Prélevez environ 200 µL de sang par accès rétro-orbitaire chez chaque souris (âgée de 8 à 10 semaines) 24 heures avant l'expérience afin d'établir les paramètres de base.
2. Administrez environ 200 µL de solution saline stérile pour injection par voie sous-cutanée après le prélèvement sanguin.
3. Placez les souris dans des cages propres, en conditions standard de laboratoire, avec une température contrôlée de 20 à 24 °C, une humidité relative de 30 % à 70 %, et un cycle lumière/obscurité de 12 heures/12 heures, avec un accès libre à la nourriture et à l'eau jusqu'au jour de l'expérience.
Préparation de la cage (jour 0)
1. Transférez la souris dans une cage propre doublée de serviettes en papier neuves le jour de l'expérience.
2. Retirez la nourriture et l'eau 15 minutes avant l'expérience et maintenez cette privation jusqu'à ce que les éponges d'absorption soient retirées après la chirurgie.

2. Préparation de l'instrument et du champ chirurgical

Stérilisation de l'instrumentation
1. Stériliser les instruments chirurgicaux, le coton, les applicateurs et les papiers filtres par autoclavage.
2. Désinfecter la surface chirurgicale à l'aide d'éthanol à 70 %.
Installation de la table chirurgicale
1. Disposer les instruments stériles sur un champ stérile.
2. Préparer un récipient en acier inoxydable contenant de l'éthanol à 70 % et du coton stérile pour le nettoyage intermédiaire des instruments.
3. Activer un stérilisateur à microbilles et le laisser atteindre 150 °C pour la stérilisation entre les animaux.

3. Préparation du maintien de la température

Préparation du tapis chauffant isotherme
1. Activer le tapis chauffant isotherme immédiatement avant la chirurgie conformément aux instructions du fabricant.
2. Régler le tapis chauffant isotherme de manière à maintenir la température corporelle de la souris dans une plage cible de 36–37 °C pendant toute la durée de l'anesthésie et de la chirurgie.
3. Vérifier une répartition uniforme de la chaleur sur toute la surface du tapis.
4. Placer le tapis sur la plateforme chirurgicale et le recouvrir d'un champ stérile.
5. Relier la planche chirurgicale au système d'anesthésie à l'isoflurane.

4. Anesthésie et procédures préopératoires

Induction de l'anesthésie
1. Induire l'anesthésie en plaçant la souris dans une chambre d'induction contenant 2 % d'isoflurane dans un débit d'oxygène de 2 L/min.
2. Confirmer une anesthésie adéquate par le réflexe de pincement des orteils.
3. Enregistrer le poids corporel avant la chirurgie.
Administration d'analgésie et de traitement
1. Administrer de la buprénorphine (3,25 mg/kg, par voie sous-cutanée) comme analgésique.
2. Préparer les agents hémostatiques selon les besoins.
3. Pour les groupes traités, administrer du facteur VII activé humain recombinant (rhFVIIa ; 3 mg/kg) ou de l'acide tranexamique (10 mg/kg) par injection intraveineuse rétro-orbitaire 5 min avant la lésion.
4. Administrer un volume équivalent (~100 µL) de solution saline stérile pour injection aux animaux témoins.

5. Préparation chirurgicale

Préparation du site chirurgical
1. Transférer la souris anesthésiée sur la planche chirurgicale placée sur le tapis isotherme.
2. Entretenir l'anesthésie au moyen d'un embout nasal utilisant 1,5 % à 2 % d'isoflurane dans 2 L/min d'oxygène tout au long de l'intervention chirurgicale.
3. Placer la souris en position dorsale et fixer les quatre membres avec du ruban adhésif.
4. Raser la région abdominale.
5. Effectuer une préparation aseptique en utilisant alternativement de la povidone-iodée et de l'éthanol à 70 % (trois cycles).

6. Procédure de lacération hépatique

Pré-pesée des matériaux
1. Pré-pesez deux tubes de 1,5 mL, dont un tube contenant 0,5 mL de solution saline et un tube vide.
2. Pré-pesez trois triangles d'absorption primaires et deux triangles d'absorption secondaires pour chaque animal, puis enregistrez leur masse combinée.
3. Pré-pesez un bateau de pesée pour chaque animal afin de peser ultérieurement le tissu hépatique excisé.
Induction d'une lésion hépatique
1. Réalisez une laparotomie médiane d’environ 0,5 pouce (12,7 mm) de longueur pour exposer le foie.
2. Placez deux triangles d'absorption le long des parois abdominales droite et gauche, en évitant tout contact avec le foie.
3. Exteriorisez le lobe hépatique gauche et identifiez les marges du lobe afin de standardiser l'étendue de l'ablation tissulaire. Évitez toute lésion tissulaire involontaire.
4. À l’aide de ciseaux tranchants, lacérez environ 75 % du lobe d’un seul mouvement contrôlé afin d’assurer la cohérence entre les animaux.
5. Transférez le tissu lacéré excisé dans le tube vide préalablement pesé, pour une quantification ultérieure de la gravité de la lésion.
6. Insérez un troisième triangle d'absorption dans la cavité abdominale afin de faciliter une collecte uniforme du sang pendant la phase d'hémorragie.
Fermeture abdominale rapide pour maintenir l'hémorragie interne (étape critique)
1. Fermez immédiatement la paroi abdominale en ~10–15 s à l’aide de deux agrafes chirurgicales.
2. Assurez un alignement précis des bords de l’incision afin d’obtenir une fermeture complète sans espace. Une fermeture incomplète peut entraîner une fuite sanguine externe et une sous-estimation de la perte sanguine.
3. Appliquez une tension constante mais douce pendant la fermeture, en évitant de comprimer le contenu abdominal, ce qui pourrait modifier la dynamique du saignement.
4. Renforcez la fermeture avec un adhésif tissulaire (2 à 3 gouttes) afin de garantir un compartiment abdominal parfaitement étanche.
Surveillance après la lésion
1. Pesez le tissu hépatique excisé et normalisez la mesure par rapport au poids corporel afin de quantifier et de confirmer l’étendue de la lésion hépatique.
2. Replaquez la souris dans sa cage, posée sur un tapis isotherme.
3. Laissez l’hémorragie se poursuivre pendant 60 min pour le groupe d’analyse finale et le groupe de survie.

7. Prélèvement sanguin et quantification de la perte sanguine

Prélèvement et traitement des échantillons sanguins
1. Pour le groupe terminal, réanesthésier la souris avec de l'isoflurane à 60 min après la lacération hépatique.
2. Pour le groupe de survie, réanesthésier la souris avec de l'isoflurane à 6 h et à 7 jours après la lacération hépatique afin de prélever du sang.
3. Prélever le sang par ponction rétro-orbitaire dans des tubes contenant une solution de citrate de sodium (rapport sang-anticoagulant : 9:1) pour la préparation du plasma.
4. Centrifuger les échantillons à 2 000 × g pendant 10 min, suivie d'une seconde centrifugation à 12 000 × g pendant 5 min, afin d'obtenir un plasma pauvre en plaquettes destiné aux tests de coagulation et de fibrinolyse ultérieurs.
Mesure des pertes sanguines
1. Réouvrir l'abdomen à 60 min après la lacération hépatique, pour les deux groupes (terminal et de survie), et retirer les éponges absorbantes contenant du sang.
2. Transférer toutes les éponges imprégnées de sang dans un tube préalablement pesé contenant du sérum physiologique stérile.
3. Utiliser des éponges absorbantes supplémentaires préalablement pesées pour recueillir le sang résiduel présent dans la cavité abdominale.
4. Peser le tube de collecte après le prélèvement sanguin afin d'obtenir le poids final du tube.
5. Calculer la perte sanguine à l’aide de l’équation gravimétrique suivante :
  Perte sanguine (µL/g) = [(poids final du tube − poids initial du tube – poids de l’éponge absorbante) / poids corporel de la souris] × 1000.
  NOTE : Tous les poids sont exprimés en grammes. Le facteur 1 000 permet de convertir les grammes de sang en microlitres, en supposant une densité sanguine d’environ 1 g/mL.
Groupe de survie et suivi longitudinal
1. Après la mesure de la perte sanguine à 60 min, fermer immédiatement l’incision à l’aide de agrafes chirurgicales et d’un adhésif tissulaire afin d’assurer une fermeture complète du compartiment abdominal.
2. Administrer 400 µL de sérum physiologique stérile par voie sous-cutanée avant la récupération.
3. Replacer la souris en condition d’élevage standard et la surveiller en continu pendant son réveil de l’anesthésie, puis l’évaluer à 2 h, 6 h et 24 h après la chirurgie, suivie d’une surveillance quotidienne jusqu’au jour 7.

8. Soins postopératoires

Surveillance postopératoire
1. Surveiller continuellement les animaux pendant la phase initiale de récupération de l'anesthésie pour détecter des signes de détresse ou de morbidité.
2. Enregistrer le statut de survie et les observations cliniques à chaque évaluation prévue.
Soins de support
1. Administrer 400 µL de solution saline stérile par voie sous-cutanée quotidiennement pendant 3 jours.
2. Administrer une analgésie (buprénorphine, 3,25 mg/kg, par voie sous-cutanée) toutes les 72 heures conformément au protocole approuvé de soins aux animaux.
3. Garder les souris en conditions d'élevage standard avec un accès libre à la nourriture et à l'eau.
Critères d'euthanasie
1. Surveiller les animaux pour détecter les critères d'euthanasie prédéfinis, notamment une léthargie sévère ou persistante, l'incapacité à se déplacer ou à atteindre la nourriture ou l'eau, une détresse respiratoire sévère, une absence de réaction ou d'autres signes de détresse grave spécifiés dans le protocole institutionnel approuvé de soins aux animaux.
2. Euthanasier les animaux qui atteignent les critères d'euthanasie prédéfinis conformément aux directives institutionnelles.
3. Poursuivre la surveillance de la survie jusqu'au jour 7 ou jusqu'à l'atteinte d'un critère d'euthanasie.

9. Procédures terminales et prélèvement de tissus

Aux points terminaux expérimentaux prédéfinis, anesthésier les souris et prélever le sang par ponction rétro-orbitaire.
Procéder à l'euthanasie par inhalation de CO₂ conformément aux directives institutionnelles.
Prélever les organes et préparer les tissus pour l'analyse histologique selon les procédures en aval spécifiées.

10. Dosages de la coagulation, de la fibrinolyse et des cytokines

REMARQUE : Les réactifs, les kits de dosage et l'équipement utilisés pour ces procédures sont énumérés dans le Tableau des matériaux.

Mesure du TCA
1. Enregistrer tous les temps de coagulation à l’aide du coagulomètre indiqué dans le Tableau des matériaux.
2. Mélanger 25 µL de plasma de souris avec 25 µL de réactif TCA et incuber pendant 3 min à 37 °C. Initier la coagulation en ajoutant 25 µL de CaCl₂ (25 mM) préparé dans du HBS (20 mM HEPES, 147 mM NaCl, 3 mM KCl, pH 7,4), puis enregistrer le temps de coagulation.
Mesure de l’activité du FV, du FII et du FX
1. Mélanger 5 µL de plasma de souris avec 20 µL de plasma déficient en facteur correspondant et 25 µL de HBS contenant 0,5 % d’albumine de sérum bovin.
2. Incuber pendant 1 min à 37 °C, puis initier la coagulation en ajoutant le réactif Innovin indiqué dans le Tableau des matériaux.
3. Déterminer l’activité du facteur par rapport au système d’étalonnage ou de référence correspondant.
Mesure du facteur VIII
1. Dosage du facteur VIII à l’aide d’un test chromogénique pour le FVIII, selon les instructions du fabricant.
Mesure du fibrinogène
1. Déterminer la concentration en fibrinogène selon la méthode de Clauss. Ajouter 10 µL de plasma de souris à 40 µL de solution saline tamponnée au HEPES contenant 0,01 % d’albumine de sérum bovin et incuber pendant 3 min à 37 °C.
2. Initier la formation du caillot en ajoutant 25 µL de thrombine (25 U/mL), puis déterminer la concentration en fibrinogène à l’aide de l’étalonnage du test.
Mesure des biomarqueurs plasmatiques
1. Mesurer les complexes TAT, les complexes PAP et le D-dimère dans le plasma à l’aide des kits de dosage commerciaux indiqués dans le Tableau des matériaux. Réaliser chaque dosage selon les instructions du fabricant.
2. Utiliser les étalons, calibrateurs et contrôles spécifiques au dosage conformément aux indications des fabricants, et calculer les concentrations des analytes à partir des courbes d’étalonnage correspondantes.
Mesure de l’IL-6 plasmatique
1. Mesurer les concentrations plasmatiques d’IL-6 au moment du prélèvement de base ainsi qu’à 60 min et 6 h après une lacération hépatique, à l’aide du test multiplex de cytokines indiqué dans le Tableau des matériaux.
2. Réaliser le dosage selon les instructions du fabricant et analyser les données à l’aide du logiciel Q-View du fabricant.

Résultats

Le modèle LL entraîne une gravité de blessure reproductible et standardisée chez les souris. Figure 1A illustre la constance du poids du foie lacéré lorsqu'il est normalisé par rapport au poids corporel (%PC), avec une lésion médiane de 1,4 % PC à travers les groupes expérimentaux. Cette constance confirme une induction chirurgicale fiable et permet la reproductibilité entre les animaux et dans différentes conditions expérimentales. La capacité à standardiser la gravité de la lésion est essentielle pour évaluer les réponses physiologiques ultérieures indépendamment de la variabilité des dommages tissulaires.

La validation de la réponse hémorragique et de la modulation thérapeutique dans le modèle est illustrée dans la Figure 1B. Les souris ont été prétraitées avec du sérum physiologique, l'agent préhémostatique rhFVIIa ou l'agent antifibrinolytique TXA, et la perte sanguine a été quantifiée et normalisée par rapport au poids corporel (µL/g). Les souris traitées au sérum physiologique ont présenté une hémorragie importante après la LL, tandis que celles traitées au rhFVIIa ou à la TXA ont montré une réduction de la perte sanguine. Ces résultats démontrent la capacité de ce modèle à détecter la modulation pharmacologique de l'hémorragie et à évaluer des interventions hémostatiques dans des conditions de saignement incontrôlé.

Le modèle reproduit également des caractéristiques clés de la coagulopathie induite par un traumatisme. Comme illustré dans la Figure 1C, le LL a entraîné un allongement du TCA, indiquant une altération de la coagulation après la lésion. Un traitement par rhFVIIa ou par l’ACX a atténué cet allongement, suggérant une restauration de la fonction de coagulation. De même, la génération de thrombine, évaluée par les complexes TAT, était augmentée après le LL et diminuée avec le traitement par l’ACX, tandis que le rhFVIIa ne réduit pas les taux de TAT (Figure 1D), ce qui suggère une modulation de l’activation de la coagulation.

Une caractérisation plus poussée de la coagulopathie est présentée dans la Figure 2. Le LL a entraîné une diminution sélective des facteurs de coagulation V et VIII, en accord avec une coagulopathie induite par le traumatisme (TIC), et ces modifications ont été corrigées par le traitement au rhFVIIa ou à l'acide tranexamique (TXA) (Figure 2A,B). En revanche, les facteurs II et X n'ont pas été significativement modifiés (Figure 2C,D), indiquant que ces changements s'inscrivent dans un contexte de préservation des facteurs II et X, ce qui soutient un phénotype prédominant de TIC plutôt qu'un profil similaire à la coagulation intravasculaire disséminée (DIC).

Le développement de la fibrinolyse après une LL est illustré dans la Figure 3. Les taux de fibrinogène ont diminué après la lésion, indiquant une consommation, et n'ont pas été entièrement rétablis par le rhFVIIa ou l'ACD (Figure 3A). En revanche, les marqueurs fibrinolytiques, notamment les complexes plasmine-antiplasmine (PAP) et le D-dimère, étaient élevés après la LL. Le rhFVIIa a réduit les taux de complexes PAP, mais n'a pas significativement modifié les taux de D-dimère. L'ACD a réduit les taux de complexes PAP et de D-dimère après la LL (Figure 3B,C).

Enfin, la réponse inflammatoire systémique et les résultats en matière de survie sont évalués dans la Figure 4. Les taux plasmatiques d'interleukine-6 (IL-6) sont mesurés à 60 min et à 6 h après le LL dans tous les groupes de traitement. Les taux d'IL-6 sont élevés aux premiers moments dans tous les groupes (Figure 4A). La survie sur une période de 7 jours est évaluée à l'aide d'une analyse de Kaplan-Meier. La survie à 7 jours est de 75 % dans le groupe saline, de 55 % dans le groupe rhFVIIa et de 80 % dans le groupe traité par TXA. Aucune différence significative n'est observée entre les groupes saline et TXA, tandis que la survie est significativement réduite dans le groupe rhFVIIa par rapport aux groupes saline et TXA (Figure 4B).

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Figure 1 : Validation du modèle de lacération hépatique (LL) : reproductibilité de la gravité de la lésion, perte sanguine quantitative et induction d'une coagulopathie. Une hémorragie interne sévère est induite par une laparotomie médiane suivie d'une LL standardisée. Les souris reçoivent un traitement préalable au sérum physiologique (~100 µL) ou au facteur VII activé humain recombinant (rhFVIIa ; 3 mg/kg), ou à l'acide tranexamique (TXA ; 10 mg/kg) avant la lésion, afin d'évaluer la modulation pharmacologique des saignements et de la coagulopathie. (A) La gravité de la lésion est quantifiée comme le poids du foie lacéré normalisé par rapport au poids corporel (%BW), démontrant une induction reproductible d'une lésion standardisée chez les animaux. (B) La perte sanguine est quantifiée par une méthode gravimétrique et normalisée par rapport au poids corporel (µL/g), mettant en évidence une hémorragie mesurable réduite par le traitement au TXA. (C) Le temps de thromboplastine partielle activée (aPTT) et (D) les complexes thrombine–antithrombine (TAT) montrent une induction reproductible de coagulopathie après LL, avec une modulation observée après traitement par rhFVIIa ou TXA. Les données sont présentées sous forme de valeurs individuelles avec médiane et intervalle interquartile ; les comparaisons ont été effectuées à l'aide d'un test non paramétrique de Mann-Whitney U (n = 5–21). ****P ≤ 0,0001. Adapté avec autorisation de Joseph et al.¹⁶. Veuillez cliquer ici pour visualiser une version agrandie de cette figure.

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Figure 2 : Validation de la coagulopathie induite par un traumatisme (TIC) après une lacération hépatique (LL) : épuisement sélectif des facteurs de coagulation. Une hémorragie interne sévère est induite par une laparotomie médiane suivie d'une LL standardisée. Les souris reçoivent préalablement du sérum physiologique (~100 µL), du facteur VII activé humain recombinant (rhFVIIa ; 3 mg/kg) ou de l'acide tranexamique (TXA ; 10 mg/kg) avant la lésion, afin d'évaluer la modulation pharmacologique de la coagulopathie. Les paramètres de coagulation sont mesurés 60 minutes après la LL. (A) Les taux du facteur V et (B) du facteur VIII montrent un épuisement reproductible après la LL, en accord avec la TIC. (C) Le facteur II et (D) le facteur X restent relativement préservés, indiquant un épuisement sélectif des facteurs de coagulation plutôt qu'une consommation globale. Les données sont présentées sous forme de valeurs individuelles avec médiane et intervalle interquartile (n = 7–10). Les comparaisons statistiques ont été réalisées à l'aide d'un test de Mann-Whitney U non paramétrique. ***P ≤ 0,001 ; ****P ≤ 0,0001. Adapté avec autorisation de Joseph et al.¹⁶. Veuillez cliquer ici pour visualiser une version agrandie de cette figure.

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Figure 3 : Validation de l'activation fibrinolytique après une lacération hépatique (LL). Une hémorragie interne sévère est induite par une laparotomie médiane suivie d'une LL standardisée. Les souris reçoivent un traitement préalable au sérum physiologique (~100 µL), au facteur VII activé humain recombinant (rhFVIIa ; 3 mg/kg) ou à l'acide tranexamique (TXA ; 10 mg/kg) avant la lésion, afin d'évaluer la modulation pharmacologique de la fibrinolyse. Les paramètres fibrinolytiques sont mesurés 60 minutes après la LL. (A) Les taux de fibrinogène montrent une consommation après la lésion, en accord avec l'activation de la fibrinolyse et l'épuisement des facteurs de coagulation. (B) Les complexes plasmine–antiplasmine (PAP) et (C) les taux de D-dimères sont augmentés après la LL, indiquant une dégradation active du fibrine et une activation fibrinolytique systémique. Les données sont présentées sous forme de valeurs individuelles avec médiane et intervalle interquartile (n = 8–13). Les comparaisons statistiques ont été réalisées à l'aide d'un test de Mann-Whitney U non paramétrique. **P ≤ 0,01 ; ***P ≤ 0,001 ; ****P ≤ 0,0001. Adapté avec autorisation de Joseph et al.¹⁶. Veuillez cliquer ici pour visualiser une version agrandie de cette figure.

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Figure 4 : Validation de la réponse inflammatoire systémique et évaluation de la survie après une lacération hépatique (LL). Une hémorragie interne sévère est induite par une laparotomie médiane suivie d'une LL standardisée. Les souris reçoivent un traitement préalable au sérum physiologique (100 µL), au facteur VII activé humain recombinant (rhFVIIa ; 3 mg/kg) ou à l'acide tranexamique (TXA ; 10 mg/kg) avant la lésion. Après la lésion, l'incision abdominale est fermée à l'aide de clips chirurgicaux et d'un adhésif tissulaire, puis les animaux sont replacés dans leurs cages d'origine. Les soins de support comprennent l'administration sous-cutanée quotidienne de sérum physiologique (400 µL) pendant les trois premiers jours suivant la lésion. Des échantillons de plasma sont prélevés à 60 min et à 6 h après la LL afin d'évaluer l'activation inflammatoire systémique. (A) Les taux d'interleukine-6 (IL-6) montrent une réponse inflammatoire systémique prolongée après la lésion. Les données sont présentées sous forme de valeurs individuelles avec médiane et intervalle interquartile. Les comparaisons statistiques ont été réalisées à l'aide d'un test non paramétrique de Mann-Whitney U (n = 9–13). (B) La survie sur sept jours est évaluée par analyse de Kaplan-Meier, démontrant la capacité du modèle à prendre en compte des critères d'évaluation longitudinaux basés sur les résultats (n = 20). ****P ≤ 0,0001. Adapté avec autorisation de Joseph et al.¹⁶. Veuillez cliquer ici pour visualiser une version agrandie de cette figure.

Figure supplémentaire 1 : Aperçu schématique du modèle de lacération hépatique et chronologie expérimentale. Cette figure résume le déroulement expérimental du modèle murin standardisé de lacération hépatique (LL) induisant une hémorragie non contrôlée. Les souris subissent une laparotomie médiane suivie d'une lacération hépatique reproductible d'environ 75 % du lobe hépatique gauche. Avant la lésion, les souris reçoivent soit du sérum physiologique (~100 µL, contrôle véhicule), soit du facteur VII activé humain recombinant (rhFVIIa ; 3 mg/kg), soit de l'acide tranexamique (TXA ; 10 mg/kg), administrés par voie intraveineuse par injection rétro-orbitaire 5 min avant la lacération hépatique. La quantification des pertes sanguines est réalisée à l'aide de compresses abdominales préalablement pesées, placées dans la cavité abdominale au moment de la lésion, récupérées 60 min après la lacération hépatique, puis pesées afin de déterminer le volume total d'hémorragie. L'abdomen est ensuite fermé à l'aide de clips chirurgicaux et d'un adhésif tissulaire. Des prélèvements sanguins sont effectués par voie rétro-orbitaire à 60 min chez le groupe d'analyse terminale, et à 6 h et 7 jours chez le groupe de survie. Le plasma est analysé pour différents paramètres de coagulation, notamment le temps de céphaline activé (aPTT), l'activité des facteurs de coagulation, les complexes thrombine-antithrombine (TAT), les complexes plasmine-α2-antiplasmine (PAP) et le D-dimère à 60 min. Un profilage des cytokines est réalisé à 60 min et à 6 h. La survie est surveillée sur une période de 7 jours. Adapté avec autorisation de Joseph et al.¹⁶. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.

Discussion

Dans cette étude, nous présentons un modèle murin reproductible d'hémorragie sévère utilisant une lésion hépatique standardisée (LL) qui intègre, dans une seule expérience, l'évaluation quantitative de la perte sanguine, la caractérisation du trouble de la coagulation induit par le traumatisme (TIC) et de l'inflammation, ainsi que l'analyse de la survie. Le modèle produit une gravité de lésion constante, comme en témoigne le poids du foie lacéré normalisé par rapport au poids corporel, tout en permettant une évaluation reproductible de l'hémorragie et des réponses hémostatiques systémiques entre les différents groupes expérimentaux. L'utilisation d'un modèle de petit rongeur avec une lésion standardisée et des mesures quantitatives des résultats permet une évaluation efficace de plusieurs critères expérimentaux dans un cadre unique, facilitant ainsi une investigation reproductible et évolutible du TIC, sans nécessiter de procédures techniquement complexes.

Il est important de noter que ce modèle reproduit des caractéristiques clés du trouble hémorragique traumatique (TIC), notamment l'allongement des paramètres généraux de la coagulation (TCA), une augmentation de la génération de thrombine, reflétée par les complexes TAT, une diminution sélective des facteurs de coagulation V et VIII, ainsi qu'une activation de la fibrinolyse, attestée par une élévation des complexes PAP et la formation de D-dimères. Ces modifications surviennent dans un contexte de préservation des facteurs II et X, ce qui soutient un phénotype dominé par le TIC plutôt qu'une coagulation intravasculaire disséminée. La possibilité de quantifier simultanément ces paramètres offre un cadre translationnel pertinent pour évaluer la dysrégulation hémostatique après un traumatisme.

Un atout majeur de ce modèle réside dans l'intégration de la survie comme critère de jugement dans le contexte d'un saignement traumatique. Afin d'évaluer des stratégies de sauvetage cliniquement pertinentes, nous avons testé le rhFVIIa et l'acide tranexamique (TXA), deux agents utilisés ou étudiés lors de la réanimation des traumatismes chez l'humain. Le TXA a démontré des effets constants pour réduire la perte sanguine, normaliser la coagulopathie et l'activation fibrinolytique, se traduisant par un sauvetage en termes de survie. En revanche, le rhFVIIa a entraîné une mortalité notable associée à une surcorrection des paramètres hémostatiques et à un contrôle incomplet de la fibrinolyse¹⁶.

Ces résultats mettent en évidence un aspect important du modèle : la survie dépend d'une interaction complexe entre la gravité de l'hémorragie, la coagulopathie et la réponse systémique, plutôt que de la correction isolée de voies hémostatiques spécifiques. Il semble que ce modèle d'hémorragie soit sensible à l'intégration des paramètres biochimiques hémostatiques avec la survie, cette dernière étant un déterminant critique du résultat en pratique clinique. Bien que l'hémorragie traumatique sévère constitue la lésion principale modélisée dans ce système, une atteinte organique secondaire peut également contribuer au résultat. Dans notre étude précédente utilisant ce modèle, des microthrombi pulmonaires et un dépôt de fibrine ont été observés chez des souris traitées par le rhFVIIa et étaient associés à une mortalité accrue, suggérant une contribution potentielle d'une lésion organique thrombo-inflammatoire au résultat¹⁶.

Bien qu'un groupe témoin soumis à une opération factice simultanée n'ait pas été inclus dans la présente étude, nous avons précédemment démontré qu'une laparotomie sans LL n'entraînait pas de CIT, ce qui montre la nécessité d'une perte sanguine rapide supplémentaire (choc) pour provoquer les anomalies de la coagulation caractéristiques observées avec le CIT¹⁴.

Plusieurs considérations techniques sont importantes pour la reproductibilité de ce modèle. L'importance et l'emplacement de la lésion hépatique (LL) doivent être standardisés, car les variations quantitatives de tissu hépatique retiré peuvent fortement influencer la gravité des saignements et la réponse coagulopathique qui en résulte. Dans notre protocole, environ 75 % du lobe hépatique gauche est retiré, la masse du foie lacéré étant normalisée par rapport à la masse corporelle, ce qui fournit une mesure objective de la constance des lésions. La fermeture rapide et étanche de l'abdomen est également essentielle pour prévenir les pertes sanguines externes et maintenir un environnement d'hémorragie intra-abdominale contenue durant la période d'observation. Pour une mesure précise de la perte sanguine, les compresses préalablement pesées doivent être systématiquement récupérées, en utilisant la même procédure et le même calendrier de collecte pour tous les groupes expérimentaux. Ces étapes minimisent les variations dépendant de l'opérateur et sont particulièrement importantes, car des différences dans la perte sanguine initiale peuvent influencer la coagulopathie ultérieure et la survie. Si des saignements excessifs surviennent avant la fermeture ou si du sang est perdu à l'extérieur, l'animal doit être exclu.

Une limite de ce modèle est qu'il se concentre sur les lésions organiques, ce qui ne reflète pas l'hétérogénéité du polytraumatisme, qui peut inclure des fractures des os longs, des traumatismes par écrasement des tissus mous et d'autres états complexes de choc. Toutefois, cette lésion ciblée constitue également une caractéristique intentionnelle du modèle, permettant d'étudier les effets d'une hémorragie profonde et du CID sans la complexité procédurale et la variabilité supplémentaires introduites par plusieurs types de lésions. En conclusion, ce modèle murin de lésion lésionnelle (LL) offre une approche rentable (par rapport aux études sur grands animaux), robuste et évolutible pour étudier l'hémorragie traumatique, le CID et la mortalité. En combinant une plateforme expérimentale simple utilisant de petits rongeurs, une lésion standardisée, une mesure quantitative de la perte sanguine, un profilage hémostatique complet et une évaluation de la survie, ce modèle constitue une alternative pratique aux modèles de traumatisme plus largement instrumentés. Il permet une évaluation intégrée de la perte de volume sanguin, de la coagulation (TCA, FII, FV, FVIII, FX, TAT), de la fibrinolyse (fibrinogène, PAP, D-dimères) et des critères de jugement liés à la survie dans un contexte cliniquement pertinent, particulièrement adapté à l'évaluation d'interventions antifibrinolytiques et d'interventions hémostatiques ciblées.

Déclarations de divulgation

A.v.D. a reçu des émoluments pour sa participation à des comités consultatifs scientifiques, des missions de consultation et des interventions orales pour BioMarin, Regeneron, Pfizer, Bioverativ/Sanofi, CSL Behring, Novo Nordisk, Spark Therapeutics, Genentech et uniQure. A.v.D. est cofondateur de Hematherix LLC, une société biotechnologique qui développe une thérapie par ^superFVa pour les complications hémorragiques. B.C.J., M.L.C. et R.M. n'ont rien à divulguer.

Remerciements

Nous remercions Laurent Mosnier, PhD, pour ses conseils techniques.

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
Nom	Entreprise	Numéro de catalogue
Aiguille 25 G	BD Diagnostics	305124
Aiguille 30 G	BD Diagnostics	305106
Système d'anesthésie	Patterson Scientific	78915712
Réactif TCA - STA-C.K. Prest. 5	Stago	597
Autoclip	Fine Science Tools	12022-19
Applicateur d'Autoclip	Fine Science Tools	12020-09
Extracteur d'Autoclip	Fine Science Tools	12023-00
Albumine sérique bovine	Sigma Aldrich	10735078001
Chlorure de calcium	Fisher scientific	C79-500
Tube capillaire – simple	Fisher Scientific	22-260943
Applicateur en coton	Medique	19-090-701
Boules de coton	Fisher Scientific	22-456-103
Kit ELISA D-dimère	Invitrogen	EEL094
Alèse isotherme Delta Phase	Braintree Scientific	50-195-4663
Éthanol	Fisher scientific	BP28184
Ethiqa	Fidelis	SKU 072117
Plasma déficient en facteur II	Affinity Biologicals	FII-DP
Plasma déficient en facteur V	Affinity Biologicals	FV-DP
Plasma déficient en facteur VIII	Affinity Biologicals	FVIII-DP
Plasma déficient en facteur X	Affinity Biologicals	FX-DP
Papier filtre, extra-épais, 7 cm × 8,4 cm	Fisher Scientific	PI88605
Forceps de Graefe	Fine Science Tools	11049-10
Chambre d'induction	Patterson Scientific	78933385
Sérum physiologique injectable	Hospira	0409-4888-02
Innovin	Siemens Healthineers	23-044-778
Isoflurane	Med Vet International	50-304-2993
K824086 Chromogenix Coatest SP Facteur VIII	Diapharma	K822585
Adhésif tissulaire rapide Liqui Vet	World Precision Instrument	50-253-9340
Stérilisateur à microbilles	Fisher scientific	14-955-342
Tubes microcentrifugeuses – 1,5 mL	Fisher Scientific	AM12400
Kit multiplex cytokines souris	Quansys Biosciences	111049MS-13P
Kit d'analyse du complexe PAP	Biotechne	NBP3-06903
Povidone-iode	Med Vet International	50-283-2277
Facteur VII activé humain recombinant	Novo Nordisk	0169-7001
Citrate de sodium	Fisher Scientific	S279-500
Champ opératoire chirurgical	Stoelting	10-000-695
Plateforme chirurgicale, collecteur d'anesthésie pour souris 5 voies Equaflow	Patterson Scientific	78919268
Ciseaux chirurgicaux	Fine Science Tools	91405-11
Bandes adhésives	Fisher scientific	15-901-5R
Kit d'analyse du complexe TAT	Siemens Healthineers	23-044-704
Thrombine	Invitrogen	PIRP43100
Acide tranexamique	Auromedics	55150-0188-10
Tondeuse	Stoelting	10-000-792
Système de filtration au charbon actif WAG	Patterson Scientific	78909457
Boîte de pesée	Fisher Scientific	01-549-752

Références

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