Un protocole optimisé pour le modèle de sténose valvulaire aortique induite par fil-guide chez la souris

Résumé

Ce protocole décrit un modèle optimisé de sténose valvulaire aortique induite par fil-guide chez des souris C57BL/6. Une plateforme de soutien vasculaire personnalisée imprimée en 3D permet un contrôle précis de l'hémorragie, offrant un taux de survie de 95 % à 24 heures (19/20) et un taux de réussite global du modèle de 90 % à 4 semaines (18/20).

Résumé

La sténose valvulaire aortique (SVA) est une maladie cardiovasculaire majeure dont la prévalence augmente dans les populations vieillissantes, mais la rareté des tissus valvulaires malades limite fortement les études mécanistiques et le développement de traitements. Ce protocole établit et optimise un modèle murin reproductible de SVA en améliorant la méthode d’endommagement valvulaire induit par fil guide de Honda grâce à une gestion contrôlée de l’hémorragie. Des souris C57BL/6 mâles et femelles subissent une lésion valvulaire aortique induite par fil guide ; la procédure est affinée à l’aide d’une plateforme de soutien vasculaire personnalisée imprimée en 3D, permettant un contrôle précis de l’hémorragie lors de l’insertion et du retrait du fil guide. Les critères d’évaluation comprennent la survie à 24 heures, l’évaluation échocardiographique à 4 semaines et la validation histopathologique. Le protocole optimisé atteint un taux de survie à 24 heures de 95 % (19 animaux sur 20) ; parmi les survivants, 94,7 % (18 sur 19) répondent au critère prédéfini de succès hémodynamique à 4 semaines, ce qui donne un taux global de succès du modèle de 90 % (18 sur 20 animaux), confirmé par échocardiographie et analyse histologique. Ce modèle standardisé fournit une plateforme fiable et reproductible pour étudier les mécanismes de dégénérescence valvulaire et évaluer des interventions thérapeutiques candidates.

Introduction

Les maladies valvulaires cardiaques restent une charge médicale importante tant dans les pays développés que dans les pays en développement, leur prévalence augmentant parallèlement au vieillissement de la population¹. Bien que le remplacement valvulaire aortique percutané (TAVI) ait transformé le traitement du rétrécissement aortique sévère^2,3, les mécanismes cellulaires et moléculaires responsables de la dégénérescence valvulaire ne sont encore que partiellement compris, et aucun traitement pharmacologique approuvé n'existe pour ralentir ou inverser la progression de la maladie^4,5. Un obstacle majeur dans la recherche sur les maladies valvulaires est la disponibilité limitée de tissus pathologiques pour l'investigation^6,7. Les prélèvements de valves aortiques humaines sont difficiles à obtenir en quantité suffisante, et les modèles animaux reproduisant fidèlement les modifications valvulaires pathologiques ont été tout aussi rares⁸. Ce manque a stimulé des efforts soutenus pour développer des modèles animaux capables de reproduire les caractéristiques hémodynamiques et histologiques du rétrécissement valvulaire aortique (AVS).

Les approches alimentaires classiques, telles qu'une alimentation prolongée riche en lipides chez des souris ApoE⁻/⁻, nécessitent 20 à 24 semaines et offrent des taux de réussite faibles, seules quelques rares animaux développant un phénotype sténosant définitif^9,10,11,12. Le modèle de lésion valvulaire induite par un fil-guide, décrit par Honda et al., a permis de surmonter bon nombre de ces limites en endommageant mécaniquement les feuillets valvulaires par accès artériel carotidien¹³. La technique initiale implique une dissection de l'artère carotide, le passage rétrograde du fil-guide jusqu'à la valve aortique, des grattages répétés des feuillets et une rotation du fil, entraînant des modifications hémodynamiques rapides en quelques jours et un phénotype sténosant stable au bout de 4 semaines^13,14,15,16. En raison de sa rapidité relative et de sa simplicité, la méthode de Honda a été largement adoptée dans les recherches récentes sur les valves. Toutefois, plusieurs lacunes importantes persistent. Les détails complets de la procédure n'ont pas été entièrement documentés dans la littérature, l'absence de standardisation entre laboratoires est notable, et le rôle du contrôle de l'hémorragie — un facteur majeur de morbidité périopératoire dans ce modèle — n'a jamais été abordé de manière systématique. Ces incohérences réduisent la reproductibilité et limitent la transposition clinique.

On a émis l'hypothèse qu'une optimisation systématique du contrôle de l'hémorragie pourrait améliorer de manière significative la survie périopératoire et la fiabilité du modèle. Ce protocole présente une approche améliorée et standardisée qui s'appuie sur la méthode de Honda en introduisant une plateforme de soutien vasculaire personnalisée, fabriquée par impression 3D. Le dispositif permet d'appliquer une tension longitudinale réglable sur l'artère carotide, assurant une hémostase temporaire complète pendant l'insertion et le retrait du fil-guide, sans écraser le vaisseau. Grâce à cette approche, le protocole optimisé atteint un taux de survie à 24 heures de 95 % (19 animaux sur 20) ; parmi les survivants, 94,7 % (18 sur 19) satisfont au critère prédéfini de succès hémodynamique à 4 semaines, ce qui donne un taux global de succès du modèle de 90 % (18 animaux sur 20). Une documentation détaillée étape par étape est fournie afin de faciliter la reproductibilité entre différents laboratoires.

Protocole

REMARQUE : Toutes les procédures animales décrites dans ce protocole ont été réalisées conformément au Guide pour le soin et l'utilisation des animaux de laboratoire et ont été approuvées par le Comité institutionnel de soins aux animaux et d'utilisation (IACUC) de l'Hôpital de l'Ouest de Chine (Protocole n° 20240311055). Des souris mâles C57BL/6 (8 à 10 semaines ; environ 22 à 25 g) et des souris femelles C57BL/6 (8 à 10 semaines ; environ 18 à 20 g) ont été utilisées tout au long de l'étude. Tous les matériaux, réactifs, instruments, logiciels et dispositifs personnalisés utilisés dans ce protocole, y compris la plateforme de soutien vasculaire personnalisée imprimée en 3D, sont répertoriés dans le Tableau des matériaux.

1. Préparation préopératoire et incision chirurgicale

1. Anesthésier la souris à l'aide d'isoflurane (3 % pour l'induction, 1,5–2 % pour le maintien) vaporisé dans de l'oxygène pur. Confirmer une profondeur anesthésique adéquate en vérifiant l'absence de réflexe de retrait podal (pincement des orteils).
   PRÉCAUTION : L'isoflurane est un anesthésique volatil. L'utiliser avec un système de captage actif ou dans un endroit bien ventilé, porter des EPI appropriés et suivre les procédures de sécurité institutionnelles.
2. Appliquer un onguent ophtalmique sur les deux yeux. Placer la souris en position supine sur une plateforme chirurgicale régulée en température, maintenue à 37 °C.
3. Préparer le champ opératoire en éliminant les poils de la région cervicale antérieure à l'aide d'une crème dépilatoire chimique.
4. Désinfecter la peau selon trois cycles alternés de povidone-iodée (ou de chlorhexidine) et d'alcool à 70 % (ou de sérum physiologique stérile tiède), en terminant par l'antiseptique.
5. Infiltrer 0,5 % de lidocaïne par voie sous-cutanée le long de la ligne d'incision prévue, afin d'assurer une analgésie locale préventive.
6. Puis pratiquer une incision cutanée longitudinale médiane (environ 1,0–1,5 cm) au niveau du cou antérieur, légèrement décalée vers la droite par rapport à la ligne médiane trachéale, à l'aide de microscissors.
   PRÉCAUTION : Les microscissors, aiguilles, fils guide et autres objets tranchants peuvent provoquer des blessures. Les manipuler avec précaution et jeter les objets tranchants usagés dans des conteneurs homologués.

2. Isolement du vaisseau et pose du point de suture

1. Sous un stéréomicroscope chirurgical, exposer l'artère carotide commune droite (RCCA) par une dissection émoussée à travers les couches fasciales et musculaires superficielles. Séparer soigneusement la RCCA du nerf vague adjacent et des tissus conjonctifs environnants, en prenant garde d'éviter toute irritation mécanique du nerf vague.
   REMARQUE : Garder les glandes salivaires et les tissus exposés humidifiés avec une solution saline stérile tiède tout au long de l'intervention afin d'éviter la dessiccation.
2. Ligaturer de façon permanente l'extrémité distale de la RCCA à l'aide d'un fil de soie 6-0 noué en un nœud solide et non glissant.
3. Placer un nœud coulant lâche en fil de soie 6-0 autour du segment proximal de la RCCA, en le laissant desserré pour une utilisation ultérieure lors de l'insertion du fil-guide.

3. Application de la plateforme et artériotomie

REMARQUE : Avant la chirurgie, stériliser la plateforme imprimée en 3D à l'aide d'un gaz d'oxyde d'éthylène (EtO), puis assurer une aération adéquate, et stériliser tous les instruments chirurgicaux en métal par autoclavage.

ATTENTION : L'oxyde d'éthylène est toxique, inflammable et cancérigène. Utiliser la stérilisation à l'EtO uniquement dans des installations agréées, assurer une aération adéquate et suivre les procédures institutionnelles de gestion des déchets.

1. Insérez soigneusement la plateforme de soutien vasculaire imprimée en 3D sous le segment isolé de l'artère carotide céphalique droite (RCCA), en positionnant l'apex en forme de V inversé directement sous le vaisseau.
2. Ajustez lentement la plateforme pour augmenter la tension longitudinale sur la RCCA en engageant les fils pré-placés dans des encoches latérales de plus en plus hautes.
   NOTE : L'apex en forme de V inversé est conçu avec un angle de 120° afin de s'adapter à la courbure du vaisseau sans écraser la paroi. Cessez d'augmenter la tension au moment précis où le pouls artériel n'est plus perceptible visuellement. Ce critère visuel critique assure une hémostase temporaire sans lésion excessive du vaisseau.
3. Pratiquez une petite artériotomie transversale (environ la moitié de la circonférence du vaisseau) sur le segment de RCCA stabilisé à l'aide de ciseaux microchirurgicaux. Une saignée minimale, voire inexistante, devrait survenir si la tension a été correctement réglée.

4. Insertion du guide-fil et lésion de la valve

1. Sous visualisation microscopique, insérer le fil-guide (diamètre de 0,014 pouce / 0,36 mm) dans la lumière artérielle par l'artériotomie transversale, en direction rétrograde vers la racine aortique.
   NOTE : Ce calibre est standard dans les modèles publiés d'endommagement par fil-guide et correspond approximativement au diamètre luminal de l'ACCI murin (~0,4–0,5 mm), ce qui donne un rapport fil-guide/vaisseau d'environ 0,7–0,9.
   ATTENTION : Le fil-guide peut perforer les vaisseaux ou les tissus environnants. L'avancer lentement sous visualisation et jeter les fils-guides usagés comme déchets tranchants ou déchets chirurgicaux contaminés.
2. Serrer le nœud coulant proximal préalablement mis en place autour du vaisseau et du fil-guide afin d'obtenir une hémostase complète au site d'insertion. Une fois le nœud coulant fixé, retirer soigneusement la plateforme imprimée en 3D située sous le vaisseau.
   NOTE : En cas de saignement inattendu pendant l'insertion, ou si le diamètre du fil-guide crée une friction excessive, repositionner temporairement la plateforme pour faciliter l'hémostase, ou réduire légèrement la tension de la plateforme afin de permettre l'expansion de la lumière du vaisseau avant de réitérer l'insertion.
3. Avancer soigneusement le fil-guide en direction rétrograde à travers l'ACCI, au-delà de l'arc aortique, et vers la valve aortique. Sous guidage échocardiographique en temps réel, confirmer que l'extrémité du fil-guide a franchi la valve aortique et pénétré dans le ventricule gauche.
4. Avec le nœud coulant proximal complètement serré pour maintenir l'hémostase, réaliser l'endommagement mécanique de la valve en effectuant 100 mouvements de va-et-vient (poussée-traction) à travers la valve aortique, suivis de 100 mouvements rotatifs du fil-guide contre les feuillets valvulaires.
   NOTE : Les 100 mouvements de va-et-vient et les 100 mouvements rotatifs ont été établis par une optimisation interne approfondie comme les valeurs offrant le meilleur compromis entre durée de la procédure et induction fiable d'une sténose hémodynamiquement significative.

5. Retrait du fil guide et fermeture de la plaie

1. Une fois l'endommagement de la valve terminé, retirer lentement le fil-guide du vaisseau.
2. Transformer immédiatement le nœud coulissant proximal en un nœud permanent non glissant afin de ligaturer l'artère carotide commune proximale (RCCA) et prévenir tout saignement postopératoire.
3. Fermer l'incision cutanée par des points séparés en soie nylon 5-0 ou par des agrafes chirurgicales.
4. Ne pas administrer d'anti-inflammatoires non stéroïdiens (AINS) postopératoires. Ne pas administrer d'antibiotiques périopératoires, car la procédure est réalisée en conditions aseptiques.
5. Transférer l'animal dans une cage de récupération propre et chauffée, et le surveiller en continu jusqu'à ce que la marche complète soit rétablie.

6. Évaluation échocardiographique de l'hémodynamique transvalvulaire

1. Effectuer une évaluation échocardiographique sur toutes les souris survivantes à 4 semaines post-opératoire afin d'évaluer la gravité de la sténose valvulaire aortique.
2. Induire l'anesthésie en plaçant l'animal dans une chambre d'induction contenant 3 % d'isoflurane dans de l'oxygène pur. Confirmer la profondeur d'anesthésie en vérifiant l'absence de réflexe de retrait plantaire. Épiler la paroi thoracique antérieure à l'aide d'une crème dépilatoire chimique. Appliquer une pommade ophtalmique sur les deux yeux afin de prévenir la dessiccation cornéenne.
3. Transférer la souris anesthésiée sur une plateforme d'imagerie régulée en température, en position dorsale.
4. Fixer les pattes aux électrodes électrocardiographiques (ECG) de surface afin d'assurer une surveillance continue de la fréquence cardiaque. Ajuster la concentration d'isoflurane (généralement entre 1,0 et 1,5 %) pour maintenir une fréquence cardiaque physiologique stable comprise entre 450 et 550 battements par minute.
5. Nettoyer la paroi thoracique antérieure et appliquer une couche généreuse de gel de couplage acoustique préalablement réchauffé.
6. Acquisition d'images en mode B
   1. À l'aide d'un système d'échographie Vevo 3100 équipé d'un transducteur MX550D (40 MHz), appuyer sur le bouton Mode B pour commencer l'imagerie en deux dimensions en temps réel.
   2. Positionner le transducteur en position paraesternale gauche afin d'obtenir une vue long-axe paraesternale du ventricule gauche, de la valve aortique et de l'aorte ascendante. Optimiser la profondeur, la largeur et le gain en mode 2D.
7. Acquisition en mode M et mesure du ventricule gauche
   1. À partir de la vue long-axe paraesternale, appuyer sur le bouton Mode M. Positionner la ligne d'échantillonnage à travers le ventricule gauche au niveau des muscles papillaires.
   2. Appuyer sur Démarrer pour commencer l'acquisition. Une fois qu'un tracé stable couvrant au moins trois cycles cardiaques est obtenu, appuyer sur Enregistrer.
   3. Dans Vevo LAB, utiliser l'outil Traçage VG pour tracer l'endocarde en fin de diastole et en fin de systole, puis enregistrer les dimensions internes du ventricule gauche, ainsi que les épaisseurs des parois antérieure et postérieure (LVAWd, LVPWd) et la masse du ventricule gauche.
8. Repositionner et orienter le transducteur afin d'obtenir une vue dédiée de l'arc aortique.
   ​REMARQUE : L'obtention de cette vue spécifique de l'arc aortique est essentielle pour des mesures précises de la vitesse transvalvulaire, car elle permet un alignement optimal du faisceau ultrasonore avec la direction du flux sanguin à travers la valve aortique.
9. Évaluation par Doppler couleur
   1. À partir de la vue de l'arc aortique, appuyer sur le bouton Couleur. Positionner la zone colorée sur la valve aortique et la portion proximale de l'aorte ascendante.
   2. Régler l'échelle de couleur et le gain de manière à visualiser clairement le jet systolique sans phénomène d'aliasing. Appuyer sur Démarrer, puis sur Enregistrer.
10. Mesure de la vitesse Doppler en onde pulsée
    1. Appuyer sur le bouton Doppler en onde pulsée (PW). Placer la zone d'échantillonnage au niveau du point le plus étroit du jet (vena contracta) et appliquer une correction d'angle (<60°).
    2. Appuyer sur Démarrer pour lancer l'enregistrement spectral ; une fois que trois cycles cardiaques au moins sont enregistrés, appuyer sur Enregistrer. Dans Vevo LAB, mesurer la vitesse transvalvulaire maximale à l'aide de l'outil Vitesse maximale, en moyennant au moins trois cycles.

7. Traitement histologique et coloration de la racine aortique

1. Après l'évaluation échocardiographique, confirmez une anesthésie profonde en vérifiant l'absence totale du réflexe de retrait plantaire. Réalisez une dislocation cervicale comme méthode secondaire d'euthanasie, conformément aux lignes directrices de l'AVMA pour l'euthanasie des animaux (édition 2020) et aux protocoles approuvés par l'établissement.
   ATTENTION : Les cadavres d'animaux, les tissus excisés et les matériaux contaminés par le sang constituent des déchets biologiques/animales. Éliminez-les conformément aux réglementations institutionnelles de biosécurité et des installations animales.
2. Réalisez une thoracotomie à l’aide de microciseaux chirurgicaux afin d’exposer le cœur.
3. Insérez une aiguille de perfusion dans l’apex du ventricule gauche et rincez la circulation systémique avec du tampon salin phosphate stérile (PBS) froid. Une perfusion réussie se manifeste par un blanchissement du foie et des poumons.
4. Excisez le cœur intact et immergez-le dans du paraformaldéhyde (PFA) à 4 % à température ambiante pendant au moins 24 heures afin d’assurer une fixation complète.
   ATTENTION : Le paraformaldéhyde est toxique et irritant. Manipulez le PFA à 4 % sous une hotte chimique en portant des équipements de protection individuelle (EPI) appropriés, et éliminez les déchets de PFA comme déchets chimiques dangereux.
5. Transférez le tissu fixé vers un processeur automatique de tissus pour une déshydratation séquentielle à l’aide d’une série d’éthanol à concentration croissante, suivie d’un éclaircissement au xylène et d’une infiltration de paraffine à 65 °C.
   ATTENTION : Le xylène est inflammable et toxique, et la paraffine chaude peut provoquer des brûlures. Manipulez le xylène sous une hotte ou dans un processeur homologué, et éliminez les déchets contenant du xylène comme déchets chimiques dangereux.
6. Incluez les cœurs traités dans des blocs de paraffine.
   REMARQUE : L’orientation correcte du cœur lors de l’inclusion est essentielle. Positionnez le cœur de manière à permettre des coupes transversales au niveau de la racine aortique, passant par les trois feuillets valvulaires.
7. À l’aide d’un microtome rotatif, réalisez des coupes transversales en série d’une épaisseur de 4 à 5 µm au niveau du plan de la valve aortique, en veillant à inclure les trois feuillets. Montez les coupes sur des lames de verre et conservez-les à température ambiante.
8. Réalisez une coloration à l’hématoxyline et à l’éosine (H&E) sur des lames sélectionnées afin d’évaluer la morphologie tissulaire, le remodelage structural et l’épaisseur des feuillets valvulaires.
9. Réalisez une coloration de Von Kossa sur des coupes en série adjacentes afin de détecter et de quantifier la calcification dystrophique, identifiable sous forme de dépôts minéraux brun foncé à noirs au sein des feuillets valvulaires.

8. Procédure chirurgicale factice

REMARQUE : Cette section décrit la procédure de contrôle Sham. Les souris Sham subissent la même anesthésie, préparation cutanée, exposition du vaisseau, artériotomie et insertion rétrograde du guide-fil que le groupe soumis à la lésion aortique par fil (AWI) ; le guide-fil est avancé jusqu'au niveau sus-valvulaire, mais n'est pas passé au-delà de la valve aortique, et aucune lésion valvulaire mécanique n'est réalisée.

1. Anesthésier la souris et préparer le champ opératoire comme décrit aux étapes 1.1 à 1.5.
2. Sous visualisation au microscope stéréoscopique, exposer l'ACCI par dissection émoussée comme décrit à l'étape 2.1.
3. Ligaturer de façon permanente l'extrémité distale de l'ACCI avec un fil de soie 6-0 et placer un nœud coulant lâche proximal (comme aux étapes 2.2–2.3).
4. Réaliser l'artériotomie transversale et insérer le fil-guide comme décrit aux étapes 3.1–4.2.
5. Avancer le fil-guide en direction rétrograde jusqu'au niveau sus-valvulaire de l'aorte ascendante sous guidage échocardiographique, en confirmant que l'extrémité du fil-guide ne traverse PAS la valve aortique.
   REMARQUE : Ne PAS effectuer les mouvements de lésion valvulaire par poussée-traction ou rotation décrits à l'étape 4.4. Retirer le fil-guide et ligaturer immédiatement l'ACCI proximal comme décrit aux étapes 5.1–5.2.
6. Fermer l'incision cutanée par des points séparés en fil de nylon 5-0 ou des agrafes cutanées.
   REMARQUE : Comme pour le groupe AWI, une analgésie peropératoire est assurée par une infiltration locale de lidocaïne (étape 1.5). Transférer l'animal dans une cage de récupération chauffée et le surveiller jusqu'à ce qu'il soit complètement ambulatoire.
7. Soumettre les souris Sham à une surveillance postopératoire identique, à une évaluation échocardiographique à 4 semaines et à un traitement histologique identique à celui du groupe AWI.

9. Analyse statistique et conception de l'étude

1. Au cours de l'étude, 20 souris (10 mâles, 10 femelles) ont subi la procédure AWI, et 6 souris C57BL/6 (3 mâles, 3 femelles) ont subi la procédure Sham.
2. Mesurer la vitesse maximale transvalvulaire (critère définissant la réussite du modèle) chez tous les animaux survivants (19 AWI, 6 Sham).
3. Analyser les indices échocardiographiques et histologiques détaillés dans un sous-groupe prédéfini de 6 souris AWI équilibré par sexe (3 mâles, 3 femelles).
4. S'assurer que toutes les mesures échocardiographiques et histologiques sont effectuées par des investigateurs aveugles à l'affectation des groupes.
5. Évaluer la normalité des données à l'aide du test de Shapiro-Wilk avant tout test paramétrique. Comparer deux groupes indépendants (AWI contre Sham) à l'aide d'un test t de Student non apparié bilatéral.
6. Analyser et représenter les données de survie à l'aide de la méthode de Kaplan-Meier.
7. Effectuer toutes les analyses avec GraphPad Prism. Présenter les données sous la forme moyenne ± ESM, une valeur de p < 0,05 étant considérée comme statistiquement significative.

Résultats

Développement d'une plateforme imprimée en 3D pour le contrôle de l'hémorragie

Pour remédier aux hémorragies périopératoires—la principale source de morbidité et de mortalité dans le modèle conventionnel d'AVS induite par fil-guide—une plateforme de soutien vasculaire imprimée en 3D a été conçue (Figure 1). La plateforme a été fabriquée par impression en stéréolithographie (SLA) à partir d'une résine photosensible biocompatible (conforme aux normes USP Classe VI / ISO 10993), avec une épaisseur structurelle de 1,07 mm. Après impression, les pièces ont été rincées à l'alcool isopropylique afin d'éliminer la résine non polymérisée, puis post-polymérisées sous lumière ultraviolette. Le fichier de conception complet (.stp) est fourni afin que la plateforme puisse être reproduite sur des systèmes SLA standards. La plateforme présente une surface apicale en forme de V inversé, avec un angle au sommet de 120° (Figure 1A–B), qui épouse la courbure de l'artère carotide commune droite isolée sans induire une compression excessive de la paroi. Plusieurs encoches latérales en pas de ciseau (Figure 1C–D) permettre à l'opérateur d'accrocher les fils de suture préalablement placés et d'appliquer une tension longitudinale ajustable sur le vaisseau. La tension est augmentée progressivement jusqu'à ce que le pouls artériel ne soit plus visible — un critère visuel indiquant un hémostase temporaire adéquat. Cette approche assure un champ opératoire stable pour la réalisation de l'artériotomie et l'insertion du fil-guide, tout en évitant des lésions par écrasement excessif de la paroi vasculaire.

Confirmation peropératoire du positionnement du fil-guide

Le bon positionnement du fil-guide a été vérifié en deux étapes au cours de l'intervention. Premièrement, sous visualisation directe au stéréomicroscope, on a observé le fil-guide pénétrer dans la lumière de l'ACCD par l'artériotomie transversale en direction rétrograde (Figure 2A). Deuxièmement, l'imagerie échocardiographique en temps réel a confirmé que l'extrémité du fil-guide avait franchi la valve aortique et pénétré dans le ventricule gauche. L'imagerie en mode B a identifié le fil-guide comme un artefact linéaire hyperéchogène traversant le plan de la valve aortique. (Figure 2B). L'imagerie Doppler couleur a mis en évidence un flux turbulent localisé au niveau de la valve aortique, confirmant de manière supplémentaire le positionnement du guide à travers les feuillets valvulaires (Figure 2C; Vidéo supplémentaire 1).

Survie périopératoire et taux de réussite du modèle

L'intégration de la plateforme à tension ajustable dans le flux opératoire a permis un taux de survie précoce élevé. L'analyse de Kaplan-Meier a montré un taux de survie de 95 % à 24 heures postopératoires (19 souris sur 20 ; Figure 3A). L'examen post-mortem du seul décès n'a révélé aucune preuve d'hémorragie majeure, de lésion structurelle ou d'ischémie cardiaque, suggérant que le décès était dû à des complications liées à l'anesthésie plutôt qu'au traumatisme chirurgical. La réussite du modèle à 4 semaines a été évaluée selon un critère prédéfini : une vitesse maximale d'écoulement transvalvulaire supérieure à 2 000 mm/s, associée à des résultats histologiques confirmatoires. Parmi les 19 animaux survivants, 18 (94,7 %) ont atteint ce seuil, ce qui donne un taux global de réussite du modèle de 90 % dans l'ensemble de la cohorte (18 souris sur 20 ; Figure 3B). Les résultats étaient comparables entre les sexes : la survie à 24 heures était de 9 sur 10 chez les mâles et de 10 sur 10 chez les femelles, et le taux de réussite du modèle à 4 semaines était de 9 sur 10 (90 %) pour les deux sexes ; le seul décès périopératoire concernait un mâle (lié à l'anesthésie), et l'unique échec du modèle concernait une femelle survivante.

Confirmation échocardiographique d'une sténose aortique

L'échocardiographie transthoracique réalisée 4 semaines après la chirurgie a confirmé des modifications hémodynamiques compatibles avec une sténose aortique sévère dans le groupe AWI. Les valeurs échocardiographiques quantitatives sont exprimées en moyenne ± erreur standard de la moyenne (ESM) ; les paramètres fonctionnels et de remodelage du ventricule gauche ont été analysés chez 6 souris Sham et 6 souris AWI, tandis que la vélocité maximale transvalvulaire a été mesurée chez toutes les souris AWI survivantes et les témoins Sham (n = 19 AWI, n = 6 Sham). La fraction d'éjection du ventricule gauche était légèrement inférieure dans le groupe AWI par rapport aux témoins Sham à 4 semaines (56,21 ± 1,15 % contre 61,57 ± 2,12 % ; p = 0,0503 ; Figure 3C), une différence qui n'atteignait pas la significativité statistique. Les enregistrements Doppler en onde impulsionnelle ont montré une augmentation marquée de la vélocité du jet transvalvulaire dans le groupe AWI, atteignant 2740,89 ± 104,10 mm/s, comparée à 988,00 ± 126,24 mm/s dans le groupe témoin Sham (Figure 3D). L'analyse quantitative a confirmé une élévation très significative de la vélocité maximale du jet transvalvulaire dans le groupe AWI par rapport aux témoins Sham (p < 0,0001 ; Figure 3E). Conformément à une phase précoce d'adaptation à une surcharge de pression, le groupe AWI présentait un remodelage concentrique du ventricule gauche : l'épaisseur en diastole de la paroi antérieure était significativement augmentée (LVAWd 1,14 ± 0,02 contre 0,96 ± 0,03 mm ; p = 0,0016 ; Figure 3F), tandis que l'épaisseur en diastole de la paroi postérieure et la masse du ventricule gauche étaient plus élevées mais n'atteignaient pas la significativité statistique (LVPWd 1,01 ± 0,12 contre 0,76 ± 0,02 mm, p = 0,0650, Figure 3G ; masse du VG 124,51 ± 10,63 contre 104,47 ± 2,45 mg, p = 0,0961, Figure 3H).

Validation histopathologique du remodelage valvulaire et de la calcification

L'examen histologique des racines aortiques a confirmé les résultats de l'échocardiographie. Les valeurs histologiques quantitatives sont exprimées en moyenne ± erreur type de la moyenne (ETM) et ont été analysées chez 6 souris Sham et 6 souris AWI. La coloration H&E dans le groupe AWI a révélé un épaississement prononcé des feuillets valvulaires ainsi qu'une désorganisation structurelle, des caractéristiques absentes chez les témoins Sham (Figure 3I). La morphométrie quantitative a confirmé une augmentation significative de l'épaisseur moyenne des feuillets valvulaires dans le groupe AWI par rapport au groupe Sham (p < 0,0001 ; Figure 3J). La coloration de Von Kossa a mis en évidence une calcification dystrophique étendue au sein des feuillets valvulaires épaissis du groupe AWI, identifiée sous forme de dépôts minéraux brun foncé à noirs. Les témoins Sham présentaient des dépôts minéraux négligeables (Figure 3K). Une analyse quantitative des images a révélé une augmentation significative de la surface totale de calcification (µm²) dans le groupe AWI par rapport aux témoins Sham (p < 0,0001 ; Figure 3L).

Figure 1 : Conception de la plateforme de soutien vasculaire imprimée en 3D, présentée sous quatre angles. (A) Vue oblique avant-gauche. (B) Vue oblique arrière-droite. (C) Vue latérale profilant la géométrie longitudinale globale de la plateforme. (D) Vue en angle mettant en évidence la région apicale en forme de V inversé. Légendes des composants : 110, corps de la plateforme ; 120, bras latéraux ; 121, encoches latérales en gradins ; 130, extrémité opératoire ; 140, apex d'insertion en forme de V inversé ; 150, surface de soutien en contact avec le vaisseau ; 160, pente de transition entre deux encoches adjacentes ; 190, artère carotide commune droite (RCCA). La plateforme est fabriquée à partir d'une résine photopolymère biocompatible (épaisseur structurelle : 1,07 mm). Le dessin structural en 3D a été généré par les auteurs à partir du fichier de conception CAO d'origine (.stp) de la plateforme de soutien vasculaire, à l'aide de FreeCAD, un logiciel gratuit et open source de modélisation et de visualisation CAO. Aucune illustration provenant d'une publication tierce ni aucun dessin sous copyright n'a été adapté. Le fichier de conception CAO d'origine est disponible en tant que fichier supplémentaire. Veuillez cliquer ici pour visualiser une version agrandie de cette figure.

Figure 2 : Confirmation peropératoire et échocardiographique du positionnement du fil-guide. (A) Photographie peropératoire montrant l'insertion rétrograde du fil-guide (flèche) à travers l'artériotomie transversale dans la lumière de l'artère carotide commune droite (RCCA), visualisée directement au microscope stéréoscopique. (B) Image échocardiographique en mode B montrant le fil-guide (identifié comme un artefact linéaire hyperéchogène ; flèche) traversant la valve aortique et pénétrant dans le ventricule gauche. (C) Image échocardiographique en Doppler couleur démontrant un flux turbulent localisé au niveau de la valve aortique, confirmant le positionnement du fil-guide à travers les feuillets valvulaires. La visualisation en temps réel du flux transvalvulaire en Doppler couleur pendant le positionnement du fil-guide est présentée dans la vidéo supplémentaire 1. Veuillez cliquer ici pour visualiser une version agrandie de cette figure.

Figure 3 : Résultats en termes de survie, hémodynamique, remodelage ventriculaire et histopathologie dans le modèle optimisé de lésion aortique par fil (AWI). (A) Courbe de survie à 24 heures selon Kaplan-Meier chez les souris AWI (n = 20). (B) Réussite (en rouge) par rapport à l’échec (en noir) dans le groupe AWI à 4 semaines (n = 20) ; la réussite était définie par une vitesse transvalvulaire maximale > 2 000 mm/s. (C) Fraction d’éjection (FE ; p = 0,0503). (D) Échocardiogrammes représentatifs en Doppler à onde pulsée (PW) provenant d’une souris Sham (à gauche) et d’une souris AWI (à droite). (E) Vitesse transvalvulaire maximale (n = 19 AWI, n = 6 Sham ; p < 0,0001). (F) Épaisseur diastolique de la paroi antérieure du ventricule gauche (LVAWd ; p = 0,0016). (G) Épaisseur diastolique de la paroi postérieure du ventricule gauche (LVPWd ; p = 0,0650). (H) Masse du ventricule gauche (p = 0,0961). (I) Sections représentatives de la racine aortique colorées à l’HE (Sham, à gauche ; AWI, à droite). (J) Épaisseur des feuillets de la valve aortique (p < 0,0001). (K) Sections représentatives de la racine aortique colorées à la Von Kossa (Sham, à gauche ; AWI, à droite). (L) Surface totale de dépôt de calcium (µm² ; p < 0,0001). Les échelles correspondent à 500 µm. Pour tous les histogrammes quantitatifs, les barres représentent les valeurs moyennes et les barres d’erreur représentent l’erreur standard de la moyenne (ESM). Les comparaisons quantitatives entre les groupes Sham et AWI dans les panneaux C, E–H, J et L ont été réalisées à l’aide d’un test t de Student non apparié bilatéral. Les données quantitatives proviennent des groupes Sham et AWI (n = 6 par groupe), sauf pour la vitesse transvalvulaire maximale dans le panneau E, qui a été mesurée chez toutes les souris AWI survivantes et les témoins Sham (n = 19 AWI, n = 6 Sham). Veuillez cliquer ici pour visualiser une version agrandie de cette figure.

Vidéo supplémentaire 1 : Visualisation échocardiographique Doppler couleur du flux sanguin transvalvulaire pendant le positionnement du fil-guide. Cette vidéo montre l'imagerie Doppler couleur en temps réel au niveau de la valve aortique pendant la procédure AWI, mettant en évidence un flux turbulent localisé induit par le positionnement du fil-guide à travers les feuillets valvulaires. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.

Discussion

Ce protocole fournit une description détaillée d'un modèle animal stable et sûr de sténose aortique. Une caractéristique de cette approche est une plateforme auxiliaire facilitant l'insertion du fil-guide dans l'artère carotide commune. La plateforme est fabriquée par impression stéréolithographique (SLA) à partir d'une résine photopolymère biocompatible (épaisseur structurelle de 1,07 mm) et comporte une surface apicale en forme de V inversé avec un angle au sommet de 120° ; le fichier de conception complet est librement accessible sous forme de fichier .stp supplémentaire. Ce dispositif assure une insertion fluide du fil-guide, contrôle objectivement la perte sanguine périopératoire et protège ainsi la survie des souris modèles à court et à long terme. Depuis la description initiale, le modèle induit par fil-guide a été davantage affiné et caractérisé, notamment par des variantes à gravité graduée permettant de titrer l'intensité de la lésion pour produire une sténose allant de légère à sévère¹⁷, ainsi que des rapports récents documentant ses complications périopératoires¹⁸ ; le présent protocole s'appuie sur ces travaux en abordant systématiquement l'hémorragie périopératoire.

Plusieurs étapes de ce protocole sont essentielles à une induction réussie du modèle et méritent une attention particulière. Premièrement, le degré de tension longitudinale appliquée via la plateforme imprimée en 3D doit être calibré avec précision : la tension ne doit être augmentée que jusqu’à ce que le pouls artériel devienne visuellement indiscernable. Une tension insuffisante entraîne une saignée persistante pendant l’artériotomie, tandis qu’une tension excessive risque d’endommager l’endothélium ou de provoquer une rupture du vaisseau. Deuxièmement, le nœud coulissant proximal doit être serré fermement autour du vaisseau et du fil-guide avant de retirer la plateforme ; le retrait prématuré de la plateforme avec un nœud coulissant insuffisamment fixé est la cause la plus fréquente d’hémorragie pendant l’intervention. Troisièmement, il est essentiel de confirmer, sous guidage échocardiographique, l’entrée du fil-guide dans le ventricule gauche. En l’absence de cette vérification, l’opérateur ne peut pas s’assurer que le fil-guide est correctement positionné au niveau de la valve aortique, et une lésion incomplète entraînera l’échec du modèle.

Plusieurs complications fréquentes peuvent être anticipées et gérées. En cas de saignement lors de l'insertion du fil-guide, la plateforme doit être repositionnée sous le vaisseau afin de rétablir une hémostase temporaire avant de poursuivre. Chez les animaux présentant des artères carotides de plus petit calibre, une légère réduction de la tension de la plateforme peut permettre d'élargir la lumière du vaisseau pour faciliter le passage du fil-guide. Ce modèle présente plusieurs limites qu'il convient de prendre en compte lors de l'interprétation des résultats. La lésion mécanique par fil produit une atteinte valvulaire aiguë, mécanique et inflammatoire, qui diffère du processus dégénératif chronique, lié aux lipides, caractéristique de la sténose aortique calcifiée humaine^17,19,20,21. Par conséquent, bien que les caractéristiques histologiques reproduisent un épaississement des feuillets et une calcification dystrophique, elles pourraient ne pas refléter intégralement tous les événements moléculaires de la maladie humaine. Le protocole a été développé et validé chez des souris C57BL/6 mâles et femelles âgées de 8 à 10 semaines ; toutefois, son applicabilité à d'autres souches ou à des animaux âgés nécessite une validation indépendante. Les différences liées au sexe en ce qui concerne le diamètre de l'artère carotide et l'anatomie cardiaque peuvent influencer la difficulté chirurgicale et les résultats hémodynamiques ; les chercheurs sont encouragés à tenir compte du sexe comme variable biologique dans les analyses ultérieures²². En outre, la ligature permanente de l'artère carotide commune droite fait intrinsèquement partie de la procédure ; bien que le cercle de Willis assure une perfusion cérébrale collatérale chez la souris et qu'aucun déficit neurologique manifeste n'ait été observé, des effets cognitifs ou cérébrovasculaires subtils ne peuvent être exclus. Une échocardiographie de base (préalable à la procédure) n'a pas été réalisée ; le groupe témoin soumis à une intervention factice a servi de contrôle pour une fonction valvulaire normale, et un examen échocardiographique de base est recommandé, lorsque cela est possible, afin de permettre une comparaison intra-animal et de dépister les rares anomalies spontanées de la valve aortique rapportées chez les souris C57BL/6 (~0,3 % dans les souches non modifiées). L'insuffisance aortique n'a pas été évaluée de manière systématique dans cette étude ; la fréquence de l'insuffisance aortique induite par la lésion ainsi que sa relation avec la gravité de la sténose méritent une évaluation spécifique et feront l'objet d'études futures.

Les inconvénients potentiels de la plateforme doivent également être pris en compte. Le dispositif pourrait irriter mécaniquement des structures adjacentes, notamment le nerf vague qui longe l'artère carotide ; ce risque est minimisé par les bords arrondis et émoussés de la plateforme, par son apex de 120° conforme à la forme du vaisseau, ainsi que par sa durée d'application brève, et aucune anomalie respiratoire ni aucune autre complication manifeste attribuable au dispositif n'a été observée dans cette étude. Par rapport aux approches alternatives établies, ce protocole optimisé présente plusieurs avantages pratiques. Les modèles alimentaires chez les souris ApoE⁻/⁻ nécessitent 20 à 24 semaines d'alimentation riche en graisses et conduisent à des phénotypes sténosants variables, de nombreux animaux ne développant pas une maladie hémodynamiquement significative. Le protocole actuel produit un phénotype sténosant reproductible en 4 semaines, avec un taux de réussite global de 90 % (18 animaux sur 20). Par rapport à la méthode initiale utilisant le fil-guide Honda, l'avancée principale de ce protocole réside dans le contrôle systématique des hémorragies périopératoires grâce à la plateforme imprimée en 3D.

Les hémorragies survenant lors de l'insertion du fil-guide ont été reconnues comme une complication de la technique initiale, mais elles ont été peu abordées. Dans l'expérience rétrospective du même laboratoire avec la procédure conventionnelle (avant la mise au point de la plateforme) (plus de 400 cas), une hémorragie majeure en cours d'intervention est survenue dans environ 40 % des cas, avec une mortalité post-hémorragie d'environ 60 % et un taux de survie à 24 heures d'environ 75 %, l'hémorragie — principalement au site d'accès carotidien — étant responsable de pratiquement tous les décès périopératoires. Ces résultats sont conformes à ceux de Qian et al., qui ont identifié le saignement au site de ponction carotidien comme la cause principale des décès périopératoires dans ce modèle. En contrôlant la perte sanguine, la plateforme imprimée en 3D a augmenté la survie à 24 heures à 95 %, aucune mort attribuable à une hémorragie n'ayant été observée dans la cohorte actuelle. Comme l'hémorragie n'est plus le facteur limitant, l'intensité de la lésion mécanique peut être modulée afin de produire une sténose de gravité graduée. Cette possibilité de réglage présente une pertinence translationnelle directe : pour des thérapeutiques candidates dont les effets sont modestes, une lésion de base plus sévère peut être nécessaire afin de révéler des différences liées au traitement qui seraient autrement masquées dans un modèle plus léger.

Ce modèle convient bien à plusieurs catégories d'analyses ultérieures. Étant donné que le phénotype sténosant se développe dans un délai défini et reproductible, il peut servir de plateforme pour l'évaluation préclinique de thérapies pharmacologiques candidates visant à ralentir la calcification ou la fibrose valvulaire²³. Le modèle est également compatible avec des approches génétiques : le protocole peut être appliqué à des souris transgéniques ou knock-out sur fond C57BL/6 afin d'élucider la contribution de voies de signalisation spécifiques à la progression de la maladie valvulaire. De plus, le point final à 4 semaines offre une fenêtre pratique pour un suivi échocardiographique sériel de l'évolution de la maladie ou de la réponse au traitement. Les fichiers de conception de la plateforme imprimée en 3D peuvent être partagés librement sous forme de fichier supplémentaire au format .stp, et une standardisation de cet appareil entre laboratoires devrait améliorer davantage la reproductibilité inter-laboratoires.

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Plateforme de soutien vasculaire imprimée en 3D	Personnalisé	N/D	Plateforme de soutien vasculaire personnalisée imprimée en 3D ; fichier CAO supplémentaire fourni au format .stp.
Paraformaldéhyde à 4 %	Servicebio	G1101-3ML	Fixation des tissus
Filet de suture en nylon 5-0	Jinhuan Medical	F503	Fermeture cutanée par points séparés
Filet de suture en soie 6-0	Jinhuan Medical	RC411	Ligation permanente de l'ACRC distale et nœud coulissant proximal
Gel de couplage acoustique (préchauffé)	Keppler	KL-250	Échocardiographie
Résine biocompatible photopolymérisable	Formlabs	RS-F2-BMCL-01	Matériau d'impression SLA utilisé pour fabriquer la plateforme de soutien vasculaire personnalisée imprimée en 3D.
Souris C57BL/6 (8–10 semaines ; mâles 22–25 g, femelles 18–20 g)	GemPharmatech	C57BL/6	Les deux sexes sont utilisés ; élevage en conditions standard
Gaz d'oxyde d'éthylène	Unité de stérilisation institutionnelle	N/D	Stérilisation de la plateforme de soutien vasculaire personnalisée imprimée en 3D.
FreeCAD	FreeCAD Project Association	1.1.1	Visualisation CAO et génération du dessin structural 3D à partir du fichier .stp.
GraphPad Prism	GraphPad Software	9.0	Analyse statistique et représentation graphique
Guide-fil, diamètre 0,014 pouce	Boston Scientific	H749393071900	Lésion mécanique de la valve aortique
Kit de coloration hématoxyline-éosine (H&E)	Beyotime	C0105S	Morphologie et épaisseur des feuillets valvulaires
Isoflurane	RWD Life Science	R510-22-2	Induction à 3 % ; entretien à 1,5–2 % dans O2 à 100 %
Lidocaïne	Groupe pharmaceutique de Shijiazhuang	H14024045	Infiltration locale préemptive au site d'incision (0,5 %, étape 1,5)
Ciseaux microchirurgicaux	RWD Life Science	F11022-11	Incision cutanée, artériotomie, thoracotomie
Transducteur MX550D (40 MHz)	FUJIFILM VisualSonics	MX550D	Échocardiographie
Crème dépilatoire Nair	Nair	255 g	Pour épilation de la région cervicale antérieure et de la paroi thoracique
Solution tamponnée au phosphate (PBS)	Servicebio	G4202-100ML	Perfusion
Microtome rotatif	Leica Biosystems	RM2125 RTS	Sérialisation en coupes de 4–5 µm
Stéréomicroscope (chirurgical)	Olympus	SZX7	Isolation des vaisseaux et microchirurgie
Système d'échographie haute résolution Vevo 3100	FUJIFILM VisualSonics	Vevo 3100	Échocardiographie
Kit de coloration de Von Kossa	Servicebio	G1043-20ML	Détection de la calcification dystrophique
Xylène	Société des réactifs chimiques de Nanjing, Ltd.	C0430530209	Clarification des tissus lors du traitement à la paraffine.