Quarante rats adultes mâles Sprague–Dawley (SD) sans agents pathogènes spécifiques (SPF), pesant entre 240 et 280 g, ont été achetés auprès de Beijing Vital River Laboratory Animal Technology [Licence n° : SCXK (Jing) 2021-0011]. Tous les rats étaient hébergés au Centre des animaux de laboratoire de l’Université de médecine chinoise de Pékin dans des conditions contrôlées, avec une température ambiante de 23°C ± 1°C, une humidité relative de 50 % ± 5 %, et un cycle de 12 heures de lumière et 12 heures d’obscurité, avec un accès libre à la nourriture et à l’eau. Les rats ont été acclimatés pendant 5 jours, durant lesquels un entraînement d’acclimatation sur tapis roulant a été effectué simultanément. Les animaux passaient une acclimatation sur tapis roulant une fois par jour à une vitesse de 10 m/min pendant 15 minutes par séance, sans stimulation électrique pour réduire le stress de manipulation.
D’après notre étude précédente, le taux de réussite de l’induction PSS via la méthode d’occlusion de l’artère cérébrale moyenne (MCAO) est d’environ 60 %. À l’aide d’un tableau de nombres aléatoires, 9 rats ont été sélectionnés au hasard à l’avance comme groupe simulé ; les 31 rats restants ont été utilisés pour l’établissement de modèles. Après une modélisation réussie, ces rats ont été divisés aléatoirement en groupe modèle et groupe MSSA. Au final, neuf rats étaient inclus dans chaque groupe. Cette expérience a été menée conformément aux principes des 3R du bien-être des animaux de laboratoire et a été approuvée par le Comité d’éthique animale de l’Université de médecine chinoise de Pékin (BUCM 20250915-008).
Établissement modèle
Le modèle MCAO a été établi chez les rats en utilisant une technique de filament intraluminal modifié. Les rats ont été anesthésés avec 3 % d’isoflurane pour l’induction, et l’anesthésie a été maintenue avec 1,5 % d’isoflurane administré en oxygène à un débit constant de 1 L/min tout au long de la procédure chirurgicale. Une incision cervicale de la ligne médiane a été réalisée, suivie d’une dissection contondante pour exposer l’artère carotide commune droite (ACC), l’artère carotide externe (ECA) et l’artère carotide interne (ICA). Une suture monofilament en nylon (diamètre 0,36 ± 0,02 mm) a été introduite dans l’ACI via l’ECA et a avancé d’environ 18 à 20 mm jusqu’à l’origine de l’artère cérébrale moyenne (MCA) pour obtenir une occlusion artérielle. Les vaisseaux étaient ligaturés et l’incision fermée. Les rats étaient ensuite placés sur une bouillotte jusqu’à la convalescence de l’anesthésie. Les rats du groupe opéré par simulateur ont subi une exposition chirurgicale identique au CCA, à l’ICA et à l’ECA sans insertion du filament intraluminal.
Après l’opération, tous les rats MCAO ont reçu des soins postopératoires standardisés. Les animaux étaient maintenus sur un coussin chauffant à 37°C pendant les 12 premières heures pour éviter l’hypothermie. Les incisions chirurgicales ont été nettoyées quotidiennement pendant trois jours consécutifs, l’ampicilline (100 mg/kg) a été administrée par injection intrapéritonéale pour la prophylaxie des infections, et des aliments ramollis ont été fournis pour maintenir une nutrition adéquate. L’activité générale, la consommation alimentaire, l’état de la plaie et la fonction motrice des membres ont été surveillées quotidiennement des jours postopératoires 1 à 10.
Les déficits neurologiques ont été évalués par des chercheurs aveugles à l’allocation de groupe à l’aide du score de déficit neurologique Zea Longa, et le tonus musculaire a été évalué à l’aide de l’échelle d’Ashworth modifiée (MAS). Les évaluations ont été réalisées 1 jour avant l’opération (jour −1), le jour de l’opération avant MCAO (jour 0), et les jours postopératoires 1, 3, 5, 7 et 10. Les rats présentant des scores de Zea Longa et MAS ≥1 au troisième jour postopératoire ont été considérés comme ayant établi un modèle PSS réussi.
Traitement MSSA
Les interventions ont commencé au troisième jour postopératoire. Le site de stimulation par acupuncture du cuir chevelu était la ligne ipsilésionale de la SEP 6 (ligne pariétotemporale antérieure). Conformément à la norme nationale pour les manipulations standardisées de l’acupuncture du cuir chevelu (GB/T 21709.2-2021), la lignée MS 6 s’étend de GV 21 (Qianding) à GB 6 (Xuanli).
Des aiguilles d’acupuncture stériles jetables (0,25 × 13 mm) ont été insérées sous la galea aponeurotique au niveau GV 21 à un angle oblique d’environ 15° par rapport à la surface du cuir chevelu et ont avancé vers la GB 6 le long de la ligne oblique pariétotemporale antérieure jusqu’à une profondeur d’environ 10 mm. Une manipulation rapide en rotation (200 tours/min) était appliquée en continu pendant 1 minute. Après 15 minutes de rétention de l’aiguille, la même manipulation de rotation a été répétée une fois, ce qui a donné un temps total de rétention de 30 minutes. Pendant toute la période de rétention des aiguilles, les rats effectuaient simultanément des exercices sur tapis roulant à une vitesse constante de 10 m/min.
Les rats des groupes opérés par simulacre et modèles ne recevaient ni acupuncture ni exercice sur tapis roulant. Pour contrôler la manipulation non spécifique et le stress de contention, ils ont été manipulés et retenus avec douceur dans des supports non compressifs pendant 30 minutes par jour, correspondant à la durée totale quotidienne de l’intervention du groupe MSSA.
Évaluations comportementales
Score Zea Longa pour les déficits neurologiques :
Les déficits neurologiques chez les rats ont été évalués à l’aide du système de notation ZeaLonga 16. Les critères suivants ont été appliqués : un score de 0 indiquait qu’aucune altération neurologique et un mouvement normal sans contrainte ; un score de 1 indiquait une extension incomplète du membre antérieur ou du membre postérieur contralatéral au côté affecté ; un score de 2 indiquait un cercle vers le côté controlatéral pendant la locomotion ; un score de 3 indiquait une chute du côté controlatéral en marchant ; et un score de 4 indiquait une perte de conscience sans déplacement spontané.
MAS pour le tonus musculaire :
Le tonus musculaire a été évalué à l’aide du MAS17. Les critères étaient définis comme suit : grade 0, absence d’augmentation du tonus musculaire ; grade 1, légère augmentation du tonus musculaire, avec un arrêt transitoire ou une résistance minimale à la fin de la flexion et de l’extension passives ; grade 1+, augmentation marquée du tonus musculaire, avec un blocage transitoire en milieu de mouvement et une résistance persistante durant la seconde moitié du mouvement ; grade 2, augmentation marquée du tonus musculaire, avec une résistance évidente sur la majeure partie de la plage de mouvement, bien que le membre restât facilement mobile ; Grade 3, augmentation substantielle du tonus musculaire rendant la flexion et l’extension passives difficiles ; et grade 4, mouvement passif limité dû à la rigidité des articulations. Le grade 1+ s’est vu attribuer un score de 2 points, ce qui a donné un score MAS maximal de 5 points dans cette étude10.
Neuroimagerie T2WI pour la quantification du volume d’infarctus cérébral
Tous les scans T2WI ont été réalisés à l’aide d’un scanner IRM PharmaScan utilisé avec le logiciel ParaVision 360 (version 3.5). Une séquence d’impulsions d’acquisition turborapide pondérée en T2 avec amélioration de relaxation (T2_TurboRARE, également appelée RARE/écho rapide de spin [FSE]), a été appliquée aux rats MCAO pour quantifier le volume d’infarctus cérébral. Les paramètres d’imagerie étaient configurés comme suit : temps de répétition (TR) = 3000,0 ms, temps d’écho (TE) = 33,0 ms, champ de vision (FOV) = 35,00 × 35,00mm 2, taille de la matrice = 250 × 250, épaisseur de tranche = 0,80 mm, nombre de tranches = 35, nombre d’excitations (NEX) = 3,0, et angle de basculement (FA) = 180,0°. Les régions d’infarctus cérébraux ont été délimitées manuellement tranche par tranche dans le logiciel ITK-SNAP (version 4.4.0) par un seul chercheur aveuglé à l’attribution de groupes, utilisant les changements d’intensité du signal et des caractéristiques morphologiques compatibles avec un infarctus ischémique. Le volume de l’infarctus cérébral était alors calculé automatiquement par le logiciel.
DTI Neuroimagerie pour l’évaluation de l’intégrité microstructurale de la substance blanche
Les données IRM ont été acquises à l’aide d’un scanner à résonance magnétique PharmaScan 7,0 T. L’anesthésie a été induite avec 3 % d’isoflurane administré dans de l’air comprimé (0,4–0,6 L/min) et maintenue avec 1 % d’isoflurane tout au long de l’acquisition de la DTI. La température corporelle centrale a été maintenue à l’aide d’un bain-marie contrôlé par thermostat tout au long de la procédure d’imagerie.
Lors de l’IRM, une séquence de localisation en trois plans a d’abord été appliquée pour positionner le cerveau du rat à l’intérieur de l’aimant. La DTI a été réalisée à l’aide d’une séquence axiale d’imagerie écho-planaire spin-echo à un seul tir avec les paramètres suivants : TR/TE = 3000/27 ms, matrice = 90 × 75, FOV = 20 × 15 mm2, épaisseur de tranche = 0,7 mm, 30 directions de gradient de diffusion et valeurs b de 0 et 1000 s/mm 2. Pour l’analyse DTI, des régions d’intérêt ont été dessinées dans la capsule externe sur des tranches cérébrales situées à 1,3 mm postérieure à la brème. Les cartes paramétriques de l’anisotropie fractionnaire (FA), de la diffusivité moyenne (DM), de la diffusivité axiale (DA) et de la diffusivité radiale (RD) ont été reconstruites à l’aide du logiciel ParaVision 360. Les données sont exprimées comme le rapport entre l’hémisphère affecté et l’hémisphère sain controlatéral.
Coloration LFB pour l’évaluation de la lésion de la myéline et la rémyélinisation
Une coloration LFB a été réalisée pour évaluer les dommages structurels aux axones myélinisés dans la capsule externe. La lésion de la myéline, caractérisée par la raréfaction et la vacuolisation de la myéline, a été quantifiée en mesurant la densité optique intégrée (IOD) des fibres myélinisées colorées au LFB dans le ROI dans la capsule externe à l’aide du logiciel ImageJ (version 6.0 ; seuil en niveaux de gris, 35–225). Sur la base de l’atlas stéréotaxique cérébralde rat 18, trois coupes coronales ont été analysées pour chaque animal à des brèmes +1,0 mm, −1,3 mm et −1,6 mm, correspondant aux parties antérieure, moyenne et médiane-postérieure de la capsule externe. La moyenne de l’IOD sur les trois sections a été calculée pour représenter chaque animal (n = 4 par groupe). Les valeurs de la DIO ipsilatérale ont été normalisées du côté controlatéral et exprimées enpourcentage 19.
Enregistrements électrophysiologiques pour l’évaluation de l’excitabilité du réflexe spinal
Le réflexe H monosynaptique spinal a été enregistré à l’aide d’un système d’expérience de fonction biologique. Les rats ont été légèrement anesthésés avec α-chloralose (50 mg/kg, intrapéritonéale) afin de préserver l’excitabilité du réflexe spinal lors des enregistrements électrophysiologiques. Le nerf sciatique gauche a été exposé par dissection contondante et placé sur des électrodes à crochet bipolaire pour stimulation électrique. Une solution vitaminique huileuse a été appliquée de façon intermittente sur le nerf exposé pour maintenir l’hydratation des tissus et la viabilité neuronale. Une paire d’électrodes d’enregistrement en acier inoxydable a été insérée dans les muscles interosseux de la patte arrière gauche, et une électrode de terre a été placée dans la queue. Le H-reflex a été déclenché à l’aide d’un stimulateur d’impulsion monopolaire-bipolaire d’une durée d’impulsion de 100 μs. Le seuil du réflexe H et le seuil moteur (MT) ont été déterminés par stimulation électrique incrémentale, le courant augmentant par pas de 0,05 mA jusqu’à une intensité maximale de 3,0 mA afin d’éviter une lésion irréversible du nerf périphérique.
En utilisant la même intensité de stimulation qui a déclenché le réflexe H maximal (Hmax), des stimuli pulsés de fréquences variables (0,3, 5 et 10 Hz) ont été administrés pour obtenir des amplitudes du réflexe H à différentes fréquences de stimulation. Une stimulation pulsée répétée à 0,3 Hz a été appliquée pour vérifier que l’amplitude de l’onde M restait dans 95 % de sa valeur initiale ; sinon, le jeu de données était abandonné. La dépression dépendante de la fréquence (FDD) du réflexe H a été calculée comme le pourcentage du rapport d’amplitude H/onde M (rapport H/M) à 5 Hz et 10 Hz par rapport à 0,3 Hz, le rapport H/M à 0,3 Hz servant de référencede référence de base 10.
Analyse des données
Les analyses statistiques ont été réalisées à l’aide du logiciel SPSS (version 20.0). Les données continues sont présentées sous forme de la moyenne ± de l’écart-type (DE). La normalité des données a été évaluée à l’aide du test de Shapiro–Wilk. L’analyse unidirectionnelle de la variance (ANOVA) a été utilisée pour comparer les résultats d’imagerie conventionnelles et d’autres variables quantitatives entre groupes. Lorsque l’homogénéité de la variance était satisfaite, des tests post-hoc de Bonferroni étaient réalisés ; sinon, le test T3 de Dunnett a été appliqué. Les données comportementales ont été analysées à l’aide d’ANOVA bidirectionnelle, avec le groupe expérimental et le point temporel postopératoire comme facteurs fixes. L’analyse de corrélation de Spearman a été utilisée pour évaluer les associations entre les variables de l’étude. Une valeur de p < 0,05 était considérée comme statistiquement significative.