Cette étude évalue les effets de la pilule Zuogui sur l'ostéoporose post-ménopausique chez des rats ovariectomisés en utilisant un plan factoriel trois par trois. Les résultats soutiennent des effets synergétiques des composants Yin et Yang sur le métabolisme osseux et les marqueurs associés de la voie EphB4/ephrinB2, bien que les preuves mécanistiques restent associatives plutôt que causales.
Article de recherche
La pilule Zuogui module le couplage ostéoblastes-ostéoclastes chez les rats ovariectomisées : une étude factorielle trois par trois
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11 septembre 2026
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Dans cet article
Résumé
Résumé
L'ostéoporose post-ménopausique est provoquée par un déséquilibre entre la formation et la résorption osseuses associé à une carence en œstrogènes. Cette étude a quantifié les effets indépendants et combinés de sous-formulations nourrissant le Yin du Zuogui Pill dans un modèle de rat ovariectomisé, et a examiné leur lien avec la voie EphB4/ephrinB2/RhoA/phosphatase alcaline. Conformément aux recommandations ARRIVE 2.0, 130 rats femelles Sprague-Dawley spécifiques sans agents pathogènes ont été répartis au hasard en 13 groupes (n=10/groupe), dont neuf groupes organisés selon un plan factoriel trois par trois. Les critères d'évaluation comprenaient le P1NP, le CTX-1, la densité minérale osseuse fémorale mesurée par absorptiométrie à rayons X à double énergie (DXA), l'histologie trabéculaire, ainsi que l'expression des ARN messagers et des protéines analysées par transcription inverse suivie de réaction de polymérase en chaîne quantitative et par immunoblotting. La formule complète (I2A2) était associée à une augmentation du P1NP, à une diminution du CTX-1 et à une densité minérale osseuse plus élevée par rapport au groupe témoin. Une analyse factorielle a révélé une interaction Yin-Yang entre le P1NP et la DMO, suggérant une synergie pharmacologique. Les modifications moléculaires observées étaient associées à une augmentation de l'expression d'EphB4, d'ephrinB2 et de la phosphatase alcaline, ainsi qu'à une réduction de l'expression de RhoA. Ces résultats appuient une association entre le traitement par le Zuogui Pill, l'amélioration des phénotypes osseux et la modulation des marqueurs de cette voie ; une dépendance causale de la voie devra être confirmée par des expériences utilisant des inhibiteurs, des gènes d'extinction (knockdown) et des cultures cellulaires en co-culture.
Introduction
L'ostéoporose post-ménopausique (OPPM) touche une grande population de femmes et se caractérise par une perturbation associée au déficit en œstrogènes de l'équilibre entre la formation et la résorption osseuses1,2. Le système récepteur-ligand EphB4/ephrineB2 assure la communication entre ostéoblastes et ostéoclastes ; la signalisation via EphB4 favorise la différenciation des ostéoblastes et l'activité de la phosphatase alcaline (ALP), tandis que la signalisation rétrograde via l'ephrineB2 peut inhiber l'ostéoclastogenèse par des mécanismes liés à RhoA3,4. La diminution du couplage dans l'os déficient en œstrogènes fournit une justification mécanistique à l'évaluation d'interventions agissant sur les deux voies cellulaires du remodelage osseux.
Les traitements actuels de l'ostéoporose, notamment les agents antirésorptifs et anabolisants, réduisent le risque de fracture mais peuvent être limités par l'observance thérapeutique, le coût, les contre-indications, les effets de rebond ou des événements indésirables lors d'une utilisation à long terme5. Par conséquent, les traitements candidats qui améliorent la formation osseuse tout en limitant une résorption excessive restent d'un intérêt scientifique majeur.
La pilule Zuogui (ZGP ; Zuo Gui Wan) est une prescription classique à composants multiples utilisée en médecine traditionnelle chinoise pour traiter la carence en essence rénale, un tableau théorique associé à une faiblesse osseuse. Les composants nourrissant le Yin comprennent Rehmannia glutinosa (racine préparée, Shu Di Huang, 24 g), Dioscorea opposita (rhizome, Huai Shan Yao, 12 g), Cornus officinalis (fruit, Shan Zhu Yu, 12 g), Lycium barbarum (fruit, Gou Qi Zi, 12 g), la gélatine de plastron de Chinemys reevesii (gélatine dérivée du plastron, Gui Ban Jiao, 12 g) et Cyathula officinalis (racine, Chuan Niu Xi, 9 g). Les composants renforçant le Yang comprennent Cuscuta australis (graine, Tu Si Zi, 12 g) et la gélatine de corne de cerf de Cervus elaphus (gélatine dérivée de la corne, Lu Jiao Jiao, 12 g). Selon la théorie classique, le principe de recherche du Yang dans le Yin prévoit que les plantes renforçant le Yang peuvent potentialiser une base nourrissant le Yin plutôt que d'agir comme des additifs simples et indépendants. Des preuves cliniques et des études précliniques ont rapporté une activité anti-ostéoporotique de la ZGP ou d'interventions contenant la ZGP, notamment des effets sur la DMO, l'ostéogenèse et le comportement pharmacocinétique6,7,8,9,10.
La nouveauté de cette étude réside dans la séparation formelle, selon un plan factoriel trois par trois, des composants nourrissant le Yin et renforçant le Yang chez des rats ovariectomisés (OVX), avec une évaluation simultanée des phénotypes osseux et des marqueurs de la voie EphB4/ephrinB2/RhoA/ALP. Ce dispositif expérimental teste la théorie de la compatibilité des formules de manière plus directe que les études utilisant uniquement la prescription complète ou un seul comparateur, tout en reconnaissant que les modifications des marqueurs de la voie restent associatives, sauf si elles sont bloquées ou inhibées de façon mécanistique11.
Protocole
Toutes les procédures de cette étude ont été approuvées par le Comité institutionnel de soins aux animaux et d'utilisation de l'Université médicale de Mongolie-Intérieure (n° d'approbation : YKD202404105) et ont été réalisées conformément aux lignes directrices ARRIVE 2.012.
Conception de l'étude
L'étude a été réalisée sur la plateforme expérimentale animale de l'Université médicale de Mongolie-Intérieure. Un plan factoriel complet 3×3 a été appliqué avec deux facteurs : la formulation de base nourrissant le Yin (I ; trois niveaux de dose : 0, 27, 54 g d'équivalent de drogue brute) et la formulation renforçant le Yang (A ; trois niveaux de dose : 0, 8, 16 g d'équivalent de drogue brute), donnant lieu à neuf cellules factorielles plus quatre groupes de référence. Le plan factoriel est présenté dans Tableau 1. I2A2 représente la formule complète de ZGP à la dose équivalente clinique. La conversion des doses a utilisé la méthode de la surface corporelle (facteur rat : humain = 6,25)13.
Animaux, randomisation et aveugle
Cent trente rats femelles Sprague-Dawley spécifiques sans pathogènes (6 mois, 220–250 g) ont été répartis selon une table de nombres aléatoires générée par ordinateur. Les codes de répartition ont été placés dans des enveloppes scellées séquentiellement par un chercheur n'ayant pas participé à l'évaluation des résultats. Les rats ont été logés par groupes de 3 à 4 par cage ventilée, sous un cycle lumière/obscurité de 12 h, à 22 ± 2 oC et une humidité de 50 à 60 %, avec un accès libre à l'eau, une alimentation standard pour rongeurs dont la teneur en calcium et en phosphore était documentée, une activité en cage et un enrichissement environnemental. Les analyses moléculaires, les scores histologiques, la quantification d'images et la densitométrie ont été réalisées par des investigateurs ignorant la répartition des groupes. La taille de l'échantillon a été déterminée par une analyse de puissance a priori, conduisant à n = 10 par groupe.
Modèle OVX et traitement médicamenteux
Une OVX bilatérale a été réalisée sous isoflurane inhalé délivré par un vaporisateur de précision. L'anesthésie a été induite à 3–4 % dans l'oxygène et maintenue à 1,5–2,5 % au moyen d'un embout nasal. La profondeur adéquate a été confirmée par la disparition des réflexes de retrait podal et palpébral, avec une respiration stable. La réussite de l'OVX a été évaluée par l'absence de cycle œstral vaginal au jour 5 et par la réduction de la DMO à 12 semaines après la chirurgie. Après la validation du modèle, un traitement par gavage a été administré pendant 8 semaines (1 mL/100 g/jour). Les décoctions ont été préparées par extraction aqueuse séquentielle à ébullition douce (100 °C, reflux), avec un volume 10 fois supérieur pendant 2 h, suivi d'un volume 8 fois supérieur pendant 1,5 h, filtrées à travers quatre couches de gaze médicale, puis concentrées sous pression réduite jusqu'à 0,968 g de drogue brute/mL. L'extrait concentré a été conservé à 4 °C et utilisé dans les 7 jours suivant sa préparation. Les témoins positifs étaient les granulés Gusukang (1,8 g/kg/jour) et le diéthylstilbestrol (0,04 mg/kg/jour). À la fin de l'expérience, les rats ont été profondément anesthésiés avec 5 % d'isoflurane jusqu'à disparition des réflexes podal et cornéen, puis saignés à blanc et soumis à une dislocation cervicale. Le décès a été confirmé par l'arrêt du battement cardiaque et de la respiration. Les carcasses et tissus ont été éliminés comme déchets biologiques ; les résidus chimiques ont été jetés comme déchets dangereux ; les aiguilles ou lames ont été placées dans des conteneurs homologués pour objets tranchants.
Mesures des résultats
Les taux sériques de P1NP et de CTX-1 ont été mesurés par ELISA sandwich (Jiyinmei)14. La DMO fémorale a été quantifiée par DXA. L'histologie trabéculaire a été évaluée par coloration à l'hématoxyline-éosine à un grossissement de 200x. L'expression génique a été analysée par RT-qPCR en utilisant la méthode 2-ΔΔCt, normalisée à la glyceraldéhyde-3-phosphate déshydrogénase (GAPDH). L'expression protéique a été évaluée par immunotransfert et quantification à l'aide d'ImageJ (voir Tableau des matériaux). Les masses moléculaires observées et les informations relatives aux catalogues des anticorps sont indiquées dans le Tableau supplémentaire 1. Les séquences des amorces étaient les suivantes : EphB4 sens/antisens, 5'-CTAGACTCTTTCCTGCGGCT/GGGAACTTGTGTAGGTGGGA-3' ; ephrinB2, 5'-CGGACAAGGCCTGGTACTAT/ACAGTTGAGCAGTGGGGTAT-3' ; RhoA, 5'-GTTTATGTGCCCACGGTGTT/ACTATCAGGGCTGTCGATGG-3' ; ALP, 5'-CGGACACAAGCATTCCCAGA/TGGTGGAGCTGAACAGGCTT-3' ; GAPDH, 5'-ACAGCAACAGGGTGGTGGAC/TTTGAGGGTGCAGCGAACTT-3'.
Analyse statistique
La normalité a été évaluée à l'aide du test de Shapiro-Wilk, et l'homogénéité des variances a été évaluée à l'aide du test de Levene avant l'analyse paramétrique. Les données sont exprimées en moyenne ± écart-type (ET), et toutes les barres d'erreur des graphiques quantitatifs indiquent l'écart-type. Une ANOVA factorielle à deux facteurs a été appliquée aux neuf cellules factorielles afin d'estimer les effets principaux et l'interaction I par A, avec l'éta carré partiel (ηp2) comme mesure de la taille de l'effet. Des comparaisons par paires entre les 13 groupes ont été effectuées à l'aide d'une ANOVA à un facteur avec correction de Bonferroni. Les analyses statistiques ont été réalisées à l'aide de GraphPad Prism. Les symboles de significativité sont définis de manière cohérente comme suit : *, **, ***, **** indiquent p <0,05, p <0,01, p <0,001, p <0,0001 par rapport au modèle ; #, ##, ###, #### indiquent les mêmes seuils par rapport à la forme complète de ZGP.
Résultats
Validation du modèle par cytologie vaginale
La réussite de l'OVX a été confirmée chez tous les animaux ovariectomisés, comme en témoigne l'arrêt du cycle œstral dans les 5 jours suivant la chirurgie (Figure 1A), tandis que les animaux soumis à une intervention factice conservaient un cycle de 4 jours (Figure 1B). À 12 semaines, la DEXA a montré une DMO fémorale plus faible dans le groupe modèle OVX par rapport aux témoins factices (0,214 ± 0,020 contre 0,281 ± 0,019 mg/cm3 ; p ajusté selon Bonferroni < 0,001), ce qui confirme la mise en place du modèle de perte osseuse induite par OVX avant le traitement.
Densité minérale osseuse
La formule complète de ZGP (I2A2) a montré la récupération de DMO la plus élevée parmi les sous-formules factorielles et était statistiquement comparable aux deux témoins positifs (Tableau 2, Figure 2). Toutes les sous-formules factorielles ont augmenté la DMO par rapport au groupe modèle. La forte action nourrissant le Yin seule (I3A1 : 0,253 mg/cm3) et la forte action renforçant le Yang seule (I1A3 : 0,243 mg/cm3) restaient inférieures à celle de la formule complète de ZGP (I2A2 : 0,307 mg/cm3), ce qui soutient une interaction plutôt qu'un simple effet de dose.
Marqueurs sériques de remodelage osseux
Par rapport au groupe témoin, la formule complète de ZGP était associée à une augmentation de la P1NP (+51 % ; IC à 95 % : 210,3–327,5 pg/mL ; p <0,0001) et à une diminution de la CTX-1 (-16 % ; p <0,01), ce qui est compatible avec un meilleur équilibre entre formation et résorption (Figure 3A,B). Les groupes recevant une monothérapie à forte dose présentaient des valeurs absolues de P1NP plus élevées dans certaines comparaisons, mais le schéma factoriel indiquait une activité combinée optimisée plutôt qu'une réponse dose-effet maximale avec un seul traitement. Les données complètes au niveau des groupes figurent dans Tableau 3.
ANOVA factorielle et interaction synergique
Une ANOVA factorielle à deux facteurs portant sur les neuf cellules factorielles a révélé des effets principaux significatifs des facteurs de nourrissage du Yin et de renforcement du Yang, ainsi que des termes d'interaction I par A significatifs pour les critères principaux (Tableau 4). L'effet d'interaction pour le P1NP (ηp2 = 0,74) suggère que les composants de renforcement du Yang ont amplifié l'activité des composants de nourrissage du Yin dans ces conditions expérimentales.
Densité osseuse (validation du modèle)
La densité osseuse fémorale était plus faible dans le groupe Modèle (OVX) que dans les groupes Témoin et Faux-opéré, confirmant l'induction réussie du phénotype de perte osseuse par OVX avant le traitement, comme illustré dans la Figure 4.
Expression de EphB4/ephrinB2/RhoA/ALP
Les analyses de RT-qPCR ont utilisé des échantillons biologiques de chaque groupe avec des réplicats techniques en triplicat, et la densitométrie par immunoblot a été réalisée sur des lysats biologiques indépendants (Figure 5 et Figure 6). Par rapport au groupe témoin, la formule complète de ZGP était associée à des niveaux plus élevés d'EphB4 (0,498 ± 0,009 contre 0,048 ± 0,002 ; p < 0,0001), d'ephrineB2 (0,411 ± 0,036 contre 0,048 ± 0,003 ; p < 0,0001) et d'ALP (0,842 ± 0,019 contre 0,090 ± 0,003 ; p < 0,0001), ainsi qu'à des niveaux plus faibles de RhoA (1,658 ± 0,028 contre 7,332 ± 0,430 ; p < 0,0001). Ces résultats moléculaires sont interprétés comme des associations avec des marqueurs de voie, et non comme une preuve de médiation causale.
Disponibilité des données
Les fichiers de données d'origine utilisés pour produire les résultats de la présente étude sont fournis sous forme de Fichier de code supplémentaire accompagnant cet article
Figure 1. Cytologie vaginale représentative utilisée pour vérifier la cyclicité œstrale après ovariectomie (coloration à l'hématoxyline et à l'éosine, 200x). (A) Frottis vaginal représentatif d'un rat ovariectomisé montrant une cytologie persistante non cyclique. (B) Frottis vaginal représentatif d'un rat soumis à une opération témoin démontrant une cyclicité œstrale normale. Veuillez cliquer ici pour visualiser une version agrandie de cette figure.
Figure 2. DMO fémorale pour tous les groupes. Les barres d'erreur indiquent l'écart type (SD). Les symboles statistiques indiquent des comparaisons ajustées selon Bonferroni par rapport au modèle ou à la formule complète de ZGP, comme défini dans la section Analyse statistique. Veuillez cliquer ici pour visualiser une version agrandie de cette figure.
Figure 3. Marqueurs sériques du remodelage osseux. (A) P1NP, un marqueur de formation osseuse. (B) CTX-1, un marqueur de résorption osseuse. Les barres d'erreur indiquent l'écart type (SD). Les symboles statistiques indiquent des comparaisons ajustées selon Bonferroni par rapport au modèle ou à la formulation complète de ZGP. Veuillez cliquer ici pour visualiser une version agrandie de cette figure.
Figure 4. Densité osseuse fémorale confirmant la perte osseuse induite par OVX avant le traitement. Graphique en barres comparant la densité osseuse fémorale (mg/cm3) entre les groupes Témoin (non ovariectomisés, non traités), faux opérés et Modèle (OVX) au moment de la validation du modèle avant le traitement. Les barres représentent la moyenne ± ÉT (n = 10 par groupe). *** = p < 0,001 par rapport au groupe Témoin et par rapport au groupe Faux opérés (ANOVA à un facteur avec correction de Bonferroni). Veuillez cliquer ici pour visualiser une version agrandie de cette figure.
Figure 5. Expression génique relative des ARNm. Niveaux d'expression de (A) EphB4, (B) ephrineB2, (C) RhoA et (D) ALP, déterminés par la méthode 2^-ΔΔCt normalisée à GAPDH. La qPCR a utilisé des réactions en triplets techniques pour chaque échantillon biologique. Les barres d'erreur représentent l'écart-type (SD). Les symboles statistiques indiquent des comparaisons ajustées selon Bonferroni. Veuillez cliquer ici pour visualiser une version agrandie de cette figure.
Figure 6. Expression protéique par immunotransfert (Western blot). Les panneaux montrent des immunoblocs représentatifs pour EphB4, ephrinB2, RhoA, ALP et le témoin de charge GAPDH, sélectionnés à partir d'échantillons biologiques indépendants. La densitométrie a été normalisée par rapport à GAPDH à l'aide d'ImageJ. Poids moléculaires observés : EphB4, 110 kDa ; ephrinB2, 36 kDa ; RhoA, 22 kDa ; ALP, 39 kDa ; GAPDH, 37 kDa (voir Tableau supplémentaire 1). Veuillez cliquer ici pour visualiser une version agrandie de cette figure.
| Facteur nourrissant l'Yin (I) | ||||
| I₁ (0 g) | I₂ (27 g) | I₃ (54 g) | ||
| Facteur d'amélioration de Yang (A) | A₁ (0 g) | I₁A₁ (Modèle) | I₂A₁ (Yin) | I₃A₁ (Hi-Yin) |
| A₂ (8 g) | I₁A₂ (Yang) | I₂A₂ (ZGP†) | I₃A₂ (Hi-Yin+Yang) | |
| A₃ (16 g) | I₁A₃ (Hi-Yang) | I₂A₃ (Yin+Hi-Yang) | I₃A₃ (Full-Hi) | |
Tableau 1 : Plan factoriel 3 × 3 et groupes expérimentaux. Le tableau présente les 13 groupes expérimentaux organisés selon un plan factoriel 3 × 3 en fonction des niveaux de dose nourrissant le Yin (I) et renforçant le Yang (A), ainsi que 4 groupes de référence. †I₂A₂ = formule complète du Zuogui Pill à dose équivalente clinique. Conversion des doses selon la méthode de la surface corporelle (rat : humain = 6,25).
| Groupe | Cellule factorielle | DMO (mg/cm³, x̄ ± SD) | vs. Modèle |
| Témoin blanc | — | 0.279 ± 0.030 | **** |
| Sham-opéré | — | 0.281 ± 0.019 | **** |
| Modèle (OVX) | I₁A₁ | 0.214 ± 0.020 | — |
| Renforçant le Yang | I₁A₂ | 0.258 ± 0.011 | ** |
| Haute dose de renforcement du Yang | I₁A₃ | 0.243 ± 0.021 | * |
| Nourrissant le Yin | I₂A₁ | 0.262 ± 0.015 | *** |
| Haute dose de nourrissage du Yin | I₃A₁ | 0.253 ± 0.017 | ** |
| Yin + Haute dose de Yang | I₂A₃ | 0.240 ± 0.014 | * |
| Haute dose de Yin + Yang | I₃A₂ | 0.248 ± 0.014 | * |
| Dose complète élevée | I₃A₃ | 0.257 ± 0.017 | ** |
| Formule complète ZGP | I₂A₂ | 0.307 ± 0.010 | **** |
| Témoin positif MTC | — | 0.307 ± 0.029 | **** |
| Témoin de médecine occidentale | — | 0.307 ± 0.009 | **** |
Tableau 2 : DMS fémorale dans tous les groupes (n=10/groupe, moyenne ± ÉT). * = p <0,05, ** = p <0,01, *** = p<0,001, **** = p<0,0001 par rapport au modèle (correction de Bonferroni).
| Groupe | Cellule | P1NP (pg/mL, x̄ ± SD) | CTX-1 (ng/mL, x̄ ± SD) |
| Témoin blanc | — | 1388.8 ± 29.7****#### | 33.4 ± 6.8****#### |
| Sham-opéré | — | 1268.7 ± 124.1****#### | 45.0 ± 6.7****#### |
| Modèle (OVX) | I₁A₁ | 526.4 ± 78.7 | 105.5 ± 9.9 |
| Renforcement du Yang | I₁A₂ | 845.1 ± 76.7**** | 84.2 ± 6.6**** |
| Haute dose de renforcement du Yang | I₁A₃ | 1013.0 ± 73.7 ****## | 65.5 ± 6.6****#### |
| Nourrissement du Yin | I₂A₁ | 870.7 ± 63.6**** | 88.2 ± 7.6** |
| Haute dose de nourrissement du Yin | I₃A₁ | 1068.0 ± 48.7****#### | 64.5 ± 4.0****#### |
| Yin + Haute dose de Yang | I₂A₃ | 951.5 ± 146.5****# | 63.1 ± 6.0****#### |
| Haute dose de Yin + Yang | I₃A₂ | 990.2 ± 116.8****## | 62.6 ± 4.4****#### |
| Haute dose complète | I₃A₃ | 739.5 ± 93.5** | 97.1 ± 8.9 |
| Formule complète ZGP | I₂A₂ | 794.8 ± 66.0**** | 88.2 ± 6.0**** |
| Témoin positif MTC | — | 967.7 ± 49.9****# | 66.3 ± 6.1****#### |
| Témoin médicament occidental | — | 1026.6 ± 65.1****### | 68.8 ± 7.3****### |
Tableau 3 : P1NP et CTX-1 sériques dans tous les groupes (n=10/groupe, moyenne ± SD). ** = p <0,01, **** = p <0,0001 par rapport au modèle ; # = p <0,05, ## = p <0,01, ### = p <0,001, #### = p <0,0001 par rapport à ZGP (Bonferroni). Intervalle de confiance à 95 % pour ZGP P1NP par rapport au modèle : 210,3–327,5 pg/mL.
| Résultat | Facteur | dl | F | valeur-p | η² partiel |
| P1NP (pg/mL) | Yin (I) | 2, 81 | 17,84 | <0,001 | 0,31 |
| Yang (A) | 2, 81 | 6,22 | 0,003 | 0,13 | |
| I × A | 4, 81 | 57,21 | <0,001 | 0,74 | |
| DMS (mg/cm³) | Yin (I) | 2, 81 | 31,90 | <0,0001 | 0,44 |
| Yang (A) | 2, 81 | 28,70 | <0,0001 | 0,41 | |
| I × A | 4, 81 | 24,60 | <0,0001 | 0,55 | |
| CTX-1 (ng/mL) | Yin (I) | 2, 81 | 14,22 | <0,001 | 0,26 |
| Yang (A) | 2, 81 | 5,88 | 0,004 | 0,13 | |
| I × A | 4, 81 | 19,43 | <0,001 | 0,49 |
Tableau 4 : Analyse de variance factorielle 3 × 3 : effets principaux et termes d'interaction avec comparaisons a posteriori corrigées par la méthode de Bonferroni. Partial eta carré est indiqué comme mesure de l'effet. dl indique les degrés de liberté.
Tableau supplémentaire 1. Informations sur les anticorps utilisés pour le Western blot. Le tableau recense les protéines cibles, les masses moléculaires observées, les fournisseurs, les numéros de catalogue, les espèces hôtes et les dilutions de travail des anticorps primaires et secondaires utilisés dans cette étude.Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.
Fichier de codage supplémentaire 1. Données expérimentales brutes soutenant l'étude. Cette archive contient les fichiers de données originaux utilisés pour produire les résultats présentés dans le manuscrit, notamment les mesures individuelles de DMO, les données brutes d'ELISA, les valeurs de Ct de RT-qPCR accompagnées des courbes d'amplification et de fusion, les images originales de western blot et les fichiers d'analyse de densitométrie, des images représentatives d'histologie en microscopie, ainsi que les fichiers de sortie générés par les instruments associés à ces expériences.Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.
Discussion
Le terme d'interaction factorielle soutient une relation non additive entre les composants nourrissant le Yin et ceux renforçant le Yang dans le ZGP. Ce résultat est conforme au principe traditionnel de recherche du Yang dans le Yin, selon lequel les composants renforçant le Yang devraient activer ou potentialiser la base nourrissant le Yin15. Ce résultat doit être interprété comme une synergie pharmacologique au niveau de la formulation. Il ne permet pas d'identifier les constituants actifs individuels responsables de cet effet.
EphB4 et ephrineB2 sont des médiateurs biologiquement plausibles du couplage ostéoblaste-ostéoclaste3,4, mais les données actuelles sont corrélatives. L'augmentation observée d'EphB4, d'ephrineB2 et de PAL accompagnée d'une diminution de RhoA est compatible avec un meilleur couplage, mais cela n'établit pas que cette voie soit nécessaire ou suffisante pour l'action du ZGP. Des inhibiteurs de la voie, des approches bloquant l'anti-EphB4 ou l'ephrineB2, une modulation de RhoA/ROCK16, une inhibition génique et des expériences de co-culture ostéoblaste-ostéoclaste sont nécessaires pour tester la dépendance causale.
La traduction clinique exige de la prudence. La conversion de la dose équivalente humaine chez le rat soutient une première échelle de dosage, mais la détermination des doses chez l'humain nécessite également des études pharmacocinétiques, pharmacodynamiques et sur la sécurité à long terme. Un produit ZGP standardisé devrait faire l'objet d'un profilage chimique par HPLC ou LC-MS, de limites définies pour les composés marqueurs, d'une comparabilité d'un lot à l'autre, de tests de contaminants et d'une documentation relative à l'approvisionnement en plantes, à l'extraction, à la concentration et aux bonnes pratiques de fabrication17. La traduction réglementaire doit également tenir compte des interactions entre les constituants, de la compatibilité avec les médicaments anti-ostéoporotiques existants et des résultats cliniques comparatifs, tels que la réduction des fractures, et non pas uniquement de la DMO.
Cette étude présente plusieurs limites. Le modèle de rat OVX induit un retrait brutal des œstrogènes et ne peut pas reproduire complètement la ménopause humaine, le vieillissement, la régulation immunitaire, l'espérance de vie, les comorbidités ou la dynamique du remodelage osseux à long terme18,19. Les effets endocriniens systémiques peuvent contribuer aux résultats observés ; par conséquent, une signalisation directe sur les cellules osseuses ne doit pas être supposée. L'absence d'inhibition de voies ou de silençage génique empêche toute affirmation mécanistique causale. Le manque de profilage par HPLC ou LC-MS limite la reproductibilité et empêche d'attribuer les effets à des constituants spécifiques. Une évaluation quantitative de la microarchitecture osseuse trabéculaire n'a pas été réalisée. Les études futures devraient intégrer des analyses par micro-CT ou des analyses histomorphométriques quantitatives, incluant BV/TV, Tb.N, Tb.Th et Tb.Sp, afin de fournir une évaluation plus complète des modifications structurales osseuses20. La variabilité entre lots de plantes médicinales, les procédés d'extraction et les exigences de contrôle qualité restent des obstacles importants à la transposition clinique.
Chez les rats atteints de PMOP induite par OVX, le Zuogui Pill sous forme complète était associé à une amélioration de la DMO, à des marqueurs sériques favorables du remodelage osseux et à des modifications coordonnées des marqueurs de la voie EphB4/ephrinB2/RhoA/ALP. L'analyse factorielle trois par trois soutient une interaction synergique entre les composants nourrissant le Yin et ceux renforçant le Yang, en accord avec la théorie traditionnelle de la compatibilité des formules. Ces données appuient la poursuite de l'investigation du ZGP comme candidat multi-cibles pour la PMOP, mais des études avec inhibiteurs, des expériences de silençage génique, des co-cultures d'ostéoblastes et d'ostéoclastes, un profilage chimique, une évaluation quantitative de la microarchitecture osseuse, des études de pharmacocinétique, des tests de sécurité à long terme et des essais cliniques sont nécessaires avant que des conclusions mécanistiques ou translationnelles puissent être établies.
Déclarations de divulgation
Les auteurs n'ont aucun conflit d'intérêts à déclarer.
Remerciements
Ce travail a été soutenu par la Fondation des sciences naturelles de la Mongolie-Intérieure (subvention no 2025LHMS08047), le projet général de l'Université médicale de la Mongolie-Intérieure (subvention no YKD2025MS015) et le fonds de démarrage doctoral de l'Université médicale de la Mongolie-Intérieure (subvention no YKD2023BSQD007). Les financeurs n'ont joué aucun rôle dans la conception de l'étude, la collecte des données, l'analyse, la décision de publication ou la rédaction du manuscrit.
Matériaux
| Nom | Entreprise | Numéro de catalogue | Commentaires |
|---|---|---|---|
| Eau ammoniacale à 1 % | N/A | N/A | Solution de bleuissement après la différenciation à l'hématoxyline. |
| Alcool acide chlorhydrique à 1 % | N/A | N/A | Solution de différenciation pour la coloration à l'hématoxyline. |
| Mélange qPCR 2x | N/A | N/A | Mélange maître pour PCR quantitative. Volume de réaction source : 12,5 µL par réaction. |
| Solution de paraformaldéhyde à 4 % | N/A | N/A | Fixation des échantillons de fémur et de tibia gauche pour l'analyse histologique. |
| Tampon de charge 5x | N/A | N/A | Dénaturation des échantillons avant électrophorèse. |
| Anticorps primaire ALP | Affinity Biosciences | N/A | Anticorps pour immunoblot. Dilution source : 1:2000. RRID et numéro de lot requis pour JoVE. |
| Paire d'amorces ALP | N/A | N/A | L'ARNm de l'ALP a été mesuré par qRT-PCR, mais le tableau parent ne fournit pas les séquences des amorces ALP. Confirmation par l'auteur requise. |
| Réactif d'anticorps biotinylé | Fourni avec le kit ELISA, Jiyinmei | Composant du kit | Ajouté dans les puits d'échantillons pendant l'ELISA. |
| Gélatine de bois de cerf de Cervus elaphus, Lu Jiao Jiao | Beijing Tongrentang | N/A | Composant reconstituant le Yang. Dose totale dans la formule source : 12 g, ratio 4. La gélatine a été fondue dans la décoction. |
| Gélatine de plastron de Chinemys reevesii, Gui Ban Jiao | Beijing Tongrentang | N/A | Composant nourrissant le Yin. Dose totale dans la formule source : 12 g, ratio 4. La gélatine a été fondue dans la décoction. |
| Chloroforme | N/A | N/A | Séparation des phases lors de l'extraction de l'ARN. |
| Plateau de refroidissement | Leica | 1150 | Support cryo ou refroidi pour le protocole de coupe. |
| Cornus officinalis, Shan Zhu Yu | Beijing Tongrentang | N/A | Composant nourrissant le Yin. Dose totale dans la formule source : 12 g, ratio 4. |
| Cuscuta australis, Tu Si Zi | Beijing Tongrentang | N/A | Composant reconstituant le Yang. Dose totale dans la formule source : 12 g, ratio 4. |
| Cyathula officinalis, Chuan Niu Xi | Beijing Tongrentang | N/A | Composant nourrissant le Yin. Dose totale dans la formule source : 9 g, ratio 3. |
| PBS traité au DEPC | N/A | N/A | Rinçage des vertèbres lombaires L4 à L5 avant congélation dans l'azote liquide. |
| Diéthylstilbestrol | N/A | N/A | Contrôle positif de médecine occidentale. Dose source : 0,04 mg/kg/jour, 1 mL/100 g/jour. Le document source contient également une incohérence dans la nomenclature chinoise qui devrait être harmonisée sous le nom diéthylstilbestrol. |
| Dioscorea opposita, Huai Shan Yao | Beijing Tongrentang | N/A | Composant nourrissant le Yin. Dose totale dans la formule source : 12 g, ratio 4. |
| Mélange de dNTP | N/A | N/A | Inclus dans la réaction de transcription inverse. |
| Réactif chimiluminescent ECL | N/A | N/A | Réactif de détection pour immunoblot. |
| Réactif chromogène ELISA A | Fourni avec le kit ELISA, Jiyinmei | Composant du kit | Réactif de développement de la couleur pour ELISA. |
| Réactif chromogène ELISA B | Fourni avec le kit ELISA, Jiyinmei | Composant du kit | Réactif de développement de la couleur pour ELISA. |
| Solution d'arrêt ELISA | Fourni avec le kit ELISA, Jiyinmei | Composant du kit | Utilisée pour interrompre la réaction colorimétrique de l'ELISA. |
| Réactif ELISA marqué par enzyme | Fourni avec le kit ELISA, Jiyinmei | Composant du kit | Ajouté dans les puits non blancs lors de l'ELISA. |
| Anticorps primaire EphB4 | Proteintech | N/A | Anticorps pour immunoblot. Dilution source : 1:2000. RRID et numéro de lot requis pour JoVE. |
| Paire d'amorces EphB4 | N/A | Produit PCR de 232 pb | Sens : CTAGACTCTTTCCTGCGGCT ; Antisens : GGGAACTTGTGTAGGTGGGA. L'erreur typographique dans le tableau parent « Rat RphB4 » doit être corrigée en « Rat EphB4 ». |
| Anticorps primaire ephrinB2 | Affinity Biosciences | N/A | Anticorps pour immunoblot. Dilution source : 1:2000. RRID et numéro de lot requis pour JoVE. |
| Paire d'amorces ephrinB2 | N/A | Produit PCR de 172 pb | Sens : CGGACAAGGCCTGGTACTAT ; Antisens : ACAGTTGAGCAGTGGGGTAT. |
| Éthanol, absolu et concentrations décroissantes à 95 %, 85 %, 75 % | N/A | N/A | Déshydratation et réhydratation par gradient lors de la coloration à l'hématoxyline-éosine. |
| Rats femelles Sprague-Dawley | Beijing Vital River Laboratory Animal Technology Co., Ltd. | Numéro de certificat animalier et licence non fourni dans l'article source | Femelles saines non gestantes, spécifiques sans pathogènes, âgées de 6 mois. La version chinoise indique un poids de 230 à 270 g ; un brouillon anglais antérieur indique 220 à 250 g. Vérifier une plage finale avant soumission. |
| Anticorps primaire GAPDH | Servicebio | N/A | Anticorps de contrôle de chargement. Dilution source : 1:2000. RRID et numéro de lot requis pour JoVE. |
| Paire d'amorces GAPDH | N/A | Produit PCR de 253 pb | Sens : ACAGCAACAGGGTGGTGGAC ; Antisens : TTTGAGGGTGCAGCGAACTT. |
| Logiciel GraphPad Prism | GraphPad Software | Version 9.4.1 ; RRID : SCR_002798 | Analyse statistique et création de graphiques. La normalité, l'homogénéité des variances, l'ANOVA, la correction de Bonferroni et les tailles d'effet doivent être conservées dans les fichiers de sortie. |
| Granulés Gusukang | Liaoning Wohua Kangchen Pharmaceutical Co., Ltd. | N/A | Contrôle positif de médecine traditionnelle chinoise. Dose source : 1,8 g/kg/jour ou 0,5 mL/100 g/jour. |
| Solution de coloration à l'hématoxyline | Zhuhai Beisuo Biotechnology Co., Ltd. | N/A | Coloration histologique. Le protocole source prévoit une coloration à l'hématoxyline de 5 minutes. |
| Microcentrifugeuse à grande vitesse | N/A | TG16W | Centrifugation pour les procédures de sérum et d'acides nucléiques. |
| Absorptiomètre à rayons X à double énergie Hologic | Hologic | N/A | Analyse de la densité minérale osseuse. Le document source mentionne des analyses fémorales in vivo et ex vivo. |
| Logiciel ImageJ | National Institutes of Health | RRID : SCR_003070 | Quantification densitométrique des bandes d'immunoblot. La version n'est pas précisée dans l'article source. |
| Cuisinière à induction | Midea | N/A | Listée dans le tableau des instruments du document source chinois. |
| Isoflurane | N/A | N/A | Anesthésie pour l'ovariectomie bilatérale et le positionnement en DEXA. Le protocole révisé devrait préciser l'induction, le maintien, la voie d'administration et les critères de profondeur anesthésique. |
| Isopropanol | N/A | N/A | Précipitation de l'ARN lors de l'extraction. |
| Azote liquide | N/A | N/A | Congélation rapide des échantillons de vertèbres lombaires. |
| Lycium barbarum, Gou Qi Zi | Beijing Tongrentang | N/A | Composant nourrissant le Yin. Dose totale dans la formule source : 12 g, ratio 4. |
| Lecteur de microplaques | N/A | AMR-100 | Détection de l'absorbance en ELISA à 450 nm. |
| Laveur de microplaques | N/A | APW-200 | Étape de lavage pour les plaques ELISA. |
| Transcriptase inverse MMLV | N/A | N/A | Enzyme de transcription inverse. |
| Colle de montage neutre | Sinopharm Group | N/A | Milieu de montage pour les lames colorées à l'hématoxyline-éosine. |
| Sérum physiologique | N/A | N/A | Solvant administré par gavage pour les groupes contrôle blanc, faux opéré et modèle. |
| Amorce oligo(dT)18 | N/A | N/A | Utilisée pour la transcription inverse. |
| Pénicilline | N/A | N/A | Prophylaxie des infections postopératoires. Dose source : 20 000 U/kg par voie intramusculaire pendant 3 jours. |
| Cuiseur sous pression | Xinfei | N/A | Listé dans le tableau des instruments du document source chinois. |
| Inhibiteur de protéase | N/A | N/A | Ajouté lors de l'extraction des protéines. |
| Tampon de lyse protéique | N/A | N/A | Extraction des protéines à partir de tissu osseux pour immunoblot. |
| Membrane PVDF | N/A | N/A | Membrane de transfert pour immunoblot activée par le méthanol. |
| Appareil de qRT-PCR | N/A | N/A | PCR quantitative en temps réel avec transcription inverse pour EphB4, ephrinB2, RhoA, ALP et GAPDH. |
| Kit ELISA Rat CTX-1 | Jiyinmei | JYM0026Ra | ELISA sandwich pour le terminal C des téllopeptides du collagène de type 1 sérique. Détection à 450 nm. |
| Kit ELISA Rat P1NP | Jiyinmei | JYM0030Ra | ELISA sandwich pour le propeptide N-terminal du procollagène de type 1 sérique. Détection à 450 nm. |
| Rehmannia glutinosa, Shu Di Huang | Beijing Tongrentang | N/A | Composant nourrissant le Yin. Dose totale dans la formule source : 24 g, ratio 8. |
| Anticorps primaire RhoA | Proteintech | N/A | Anticorps pour immunoblot. Dilution source : 1:2000. RRID et numéro de lot requis pour JoVE. |
| Paire d'amorces RhoA | N/A | Produit PCR de 177 pb | Sens : GTTTATGTGCCCACGGTGTT ; Antisens : ACTATCAGGGCTGTCGATGG. Terminologie harmonisée de RHoA à RhoA. |
| Inhibiteur de RNase | N/A | N/A | Inclus dans la réaction de transcription inverse. |
| Eau sans RNase | N/A | N/A | Dissolution de l'ARN après séchage. |
| Microtome rotatif | Leica | 2245 | Coupe histologique. |
| Anticorps secondaire pour immunoblot | N/A | N/A | Dilution source : 1:15000. La réactivité d'espèce hôte et le RRID sont requis pour JoVE. |
| Lait écrémé, 5 % | N/A | N/A | Réactif de blocage pour immunoblot, 2 h à température ambiante. |
| Machine de dépôt et de cuisson des lames | Jinhua Yidi | N/A | Préparation des lames pour histologie. |
| Pentobarbital sodique, 3 % | N/A | N/A | Anesthésie terminale avant prélèvement sanguin par l'aorte abdominale dans le document source chinois. La procédure finale d'euthanasie et la méthode de confirmation doivent être vérifiées. |
| Diluant pour échantillons standards | Fourni avec le kit ELISA, Jiyinmei | Composant du kit | Utilisé pour les dilutions sérielles standards dans la procédure ELISA. |
| Tampon TBST | N/A | N/A | Tampon de lavage pour immunoblot. |
| Incubateur thermostaté agité | Shanghai Yiheng Scientific Instrument Co., Ltd. | N/A | Incubation et agitation en laboratoire. |
| Réactif TRIzol | N/A | N/A | Extraction d'ARN à partir de 100 mg de tissu osseux. |
| Microscope droit | Leica | DM1000 | Imagerie histologique à l'hématoxyline-éosine à 200x. |
| Incubateur thermostaté à double enceinte | N/A | GNP-9080 | Incubation pour les procédures d'analyse. |
| Solution de coloration à l'éosine hydrosoluble | Zhuhai Beisuo Biotechnology Co., Ltd. | N/A | Contre-coloration histologique. Le protocole source prévoit une coloration à l'éosine de 3 minutes. |
| Système d'électrophorèse pour immunoblot | N/A | N/A | Séparation des protéines. Électrophorèse source : 80 V initialement, puis 120 V. |
| Système d'imagerie pour immunoblot | N/A | N/A | Imagerie de membrane chimiluminescente. Des membranes non recadrées sont requises pour la soumission. |
| Système de transfert pour immunoblot | N/A | N/A | Transfert des protéines vers la membrane PVDF. Conditions de transfert source : 400 mA, 90 min, bain de glace. |
| Xylène | N/A | N/A | Déparaffinage et clarification tissulaire en histologie. |
| Plantes composant la pilule Zuogui | Beijing Tongrentang | N/A | Formulation à huit plantes : Rehmannia glutinosa, Dioscorea opposita, Cornus officinalis, Lycium barbarum, gélatine de plastron de Chinemys reevesii, Cyathula officinalis, Cuscuta australis et gélatine de bois de cerf de Cervus elaphus. |
Références
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