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Reconstitution fonctionnelle des supercomplexes respiratoires mitochondriaux

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DOI :

10.3791/72243

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21 août 2026

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1Department of Molecular and Cellular Biology, University of California, 2Department of Biochemistry and Molecular Biology, Biomedicine Discovery Institute, Monash University

* These authors contributed equally

Dans cet article

Résumé

Nous présentons un protocole simple permettant de reconstituer des supercomplexes respiratoires mitochondriaux fonctionnels dans des protéoliposomes bien définis, en vue d'une caractérisation corrélée de leur structure et de leur fonction.

Résumé

Les mitochondries sont des centres essentiels du métabolisme bioénergétique et constituent la principale source d'ATP. La membrane mitochondriale interne abrite le système de phosphorylation oxydative, qui comprend les complexes de la chaîne de transport des électrons (CI, CII, CIII2, et CIV) et l'ATP synthase (CV). Chez les mammifères, CI, CIII2, et les CIV forment des structures de haut niveau appelées supercomplexes (SC), tels que le SC I+III2+IV, SC I+III2, et SC III2+IV. Bien que les facteurs physiologiques favorisant la formation des supercomplexes (SC) restent mal compris, on a proposé que cette formation pourrait augmenter les taux de transfert d'électrons entre les complexes, réduire la production d'espèces réactives de l'oxygène ou prévenir l'agrégation non spécifique des protéines au sein de la membrane interne mitochondriale fortement compactée. Les études structurales et fonctionnelles des SC respiratoires se sont largement appuyées sur des complexes extraits par des détergents. Bien que ces études aient amélioré notre compréhension de la chaîne de transport des électrons, l'absence d'une bicouche membranaire scellée limite leur capacité à explorer les avantages fonctionnels de l'assemblage en supercomplexes. Toutefois, des progrès récents ont montré que les protéines membranaires peuvent être caractérisées structuralement dans des environnements membranaires reconstitués et proches du milieu natif, offrant un contexte plus physiologique pour ces investigations. Nous présentons ici un protocole simple, rapide et reproductible permettant de reconstituer des supercomplexes respiratoires dans des liposomes. Cette méthode permet d'évaluer les effets de variations de composition lipidique, de concentration en protéines et de potentiel membranaire sur la fonction des supercomplexes respiratoires, fournissant ainsi un outil précieux pour de futures études mécanistiques.

Introduction

Les mitochondries jouent un rôle central dans la respiration eucaryote. La membrane interne mitochondriale (MIM) abrite le système de phosphorylation oxydative, composé des complexes de la chaîne de transport des électrons (CI–CIV) et de l'ATP synthase (CV)1. CI et CII transfèrent des électrons à partir de substrats réduits à l'ubiquinone (CoQ), produisant l'ubiquinol (CoQH2), qui transmet les électrons via CIII2 et le cytochrome c jusqu'à CIV, où l'oxygène est réduit en eau. Le pompage de protons par CI, CIII2 et CIV établit la force proton-motrice (FPM), qui est utilisée par CV pour synthétiser de l'ATP à partir d'ADP et de phosphate inorganique (P)1.

Outre leur fonctionnement indépendant, les complexes CI, CIII2 et CIV peuvent s'assembler en des structures de supercomplexes (SC) d'ordre supérieur ayant des stœchiométries définies, telles que le SC I+III2+IV (également connu sous le nom de respirasome), le SC I+III2 et le SC III2+IV2,3,4,5. Les avantages fonctionnels de ces assemblages restent mal compris6. Les hypothèses concernant leur fonction vont de rôles dans l'assemblage et le canalisation des substrats à une simple conséquence de la forte densité protéique dans la membrane interne mitochondriale (IMM)3,7,8,9,10,11,12,13,14,15. Des études récentes suggèrent que les propriétés membranaires, notamment la contrainte membranaire induite par un désaccord hydrophobe, les interactions protéine-protéine et les interactions protéine-lipide, contribuent à la formation et à la stabilité des SC16.

Les études structurales et fonctionnelles des protéines membranaires ont traditionnellement reposé sur des complexes solubilisés par des détergents, qui perturbent l'environnement membranaire natif et limitent l'analyse des processus dépendant du potentiel membranaire et des gradients ioniques. En revanche, des progrès récents montrent que les protéines membranaires peuvent être caractérisées structuralement dans des membranes reconstituées17,18,19 ou natives20,21,22,23, améliorant ainsi significativement notre capacité à examiner les mécanismes fonctionnels des protéines membranaires dépendant du potentiel membranaire et des gradients ioniques.

Ce protocole décrit une méthode simple et reproductible pour réconstituer des supercomplexes respiratoires mitochondriaux (SC) dans des protéoliposomes définis. Le système obtenu constitue une plateforme puissante pour étudier des questions fondamentales liées à la formation, la stabilité et la fonction des supercomplexes respiratoires dans un environnement membranaire contrôlé et proche du milieu naturel. En incorporant du CoQ10 et du cytochrome c lors de la réconstitution, nous démontrons que les supercomplexes réconstitués dans les protéoliposomes permettent une consommation d'oxygène dépendante du NADH, indiquant que les complexes conservent leur compétence fonctionnelle au sein de la bicouche lipidique. Nous montrons en outre que les supercomplexes peuvent être facilement visualisés dans les protéoliposomes par microscopie électronique cryogénique (cryo-EM), permettant ainsi une corrélation directe entre l'organisation structurale et l'activité biochimique.

Bien que la méthode soit robuste et facilement reproductible, la reconstitution réussie dépend d'une optimisation minutieuse de la composition lipidique, de la concentration en détergent, du rapport protéine/lipide et d'un scellement membranaire efficace afin de préserver la stabilité et l'activité des supercomplexes.

L'objectif général de cette méthode est de permettre une analyse intégrée de la structure et de la fonction des SC respiratoires dans des conditions membranaires définies. Cette approche remédie aux limitations principales des systèmes basés sur les détergents en réinsérant les SC dans une bicouche lipidique scellée capable de soutenir la formation d'un potentiel membranaire et des interactions physiologiquement pertinentes entre protéines et lipides. En outre, le système permet un contrôle précis de la composition lipidique, des cofacteurs et de la teneur en protéines, ce qui le rend particulièrement adapté aux tests systématiques de l'influence des propriétés membranaires sur la stabilité et l'activité des SC. Par rapport aux préparations solubilisées par détergent ou aux approches in situ, cette méthode présente l'avantage distinct de combiner des essais fonctionnels, tels que la consommation d'oxygène induite par le NADH, avec une analyse structurale basée sur la cryo-microscopie électronique, permettant ainsi des corrélations structure-fonction difficiles à obtenir avec d'autres systèmes.

Protocole

Les membranes mitochondriales de cœur porcin ont été isolées à partir de cœurs achetés commercialement. tissu prélevé sur des animaux abattus pour la consommation humaine. Aucun animal vivant n'a été utilisé spécifiquement pour ce protocole. L'utilisation de ce matériel a été considérée comme exemptée de l'approbation éthique relative aux animaux, car le tissu a été obtenu comme sous-produit provenant de animaux abattus pour la consommation humaine

1. Purification des supercomplexes mitochondriaux SC I+III2/SC I+III2+IV à partir de membranes lavées de mitochondries de cœur de porc

  1. Décongeler 40 mg (4 mL) de membranes mitochondriales lavées sous forme d'aliqotes de 10 mg/mL (les membranes lavées sont préparées comme décrit précédemment24,25).
  2. Diluer les membranes dans 4 mL de tampon MX (30 mM HEPES, pH 7,7, 150 mM acétate de potassium, 10 % de glycérol, 1 mM EDTA, 0,002 % (p/v) de fluorure de phénylméthylsulfonyle, 0,1 % (p/v) de CHAPS (3-[(3-cholamidopropyl)diméthylammonio]-1-propanesulfonate), 1 mM ferricyanure de potassium). Ajouter 8 mL de digitonine à 2 % (p/v) dans le tampon MX (160 mg de digitonine dans 8 mL ; rapport final 4:1, mg de digitonine par mg de protéines membranaires totales). Le volume final est de 16 mL.
  3. Homogénéiser manuellement à l’aide d’un homogénéisateur Dounce (50 coups), en prenant soin de ne pas introduire de bulles. Incuber (sous agitation rotative) pendant 1 h à 4 °C.
  4. Centrifuger l’homogénat à 16 000 × g, à 4 °C pendant 30 min. Récupérer le surnageant.
  5. Concentrer le surnageant à 1 mL à l’aide d’un concentrateur par filtration centrifuge avec une coupure à 100 kDa, à 3000 × g, à 4 °C. Effectuer la concentration par cycles de 10 min, en remélangeant soigneusement entre chaque centrifugation, jusqu’à atteinte du volume souhaité (les échantillons ont tendance à s’agréger s’ils ne sont pas resuspendus entre les cycles de centrifugation en raison de la concentration locale accrue du détergent près du filtre).
  6. Répartir l’échantillon concentré en quatre aliqotes de 250 µL. 
  7. Équilibrer la colonne de chromatographie d’exclusion stérique (volume de colonne : 24 mL) avec le tampon de chromatographie d’exclusion stérique (tampon SEC ; 30 mM HEPES pH 7,8, 150 mM acétate de potassium, 1 mM EDTA, 0,005 % de détergent glycocide) pour un volume de 48 mL (2 volumes de colonne).
  8. Configurer le programme de chromatographie pour recueillir des fractions de 1 mL à partir d’un volume d’élution de 6 mL et continuer jusqu’à un volume d’élution de 24 mL. Injecter une aliquote de 250 µL (de l’étape 1.6) sur une résine de chromatographie d’exclusion stérique de 24 mL. Utiliser la colonne pré-équilibrée avec le tampon de chromatographie d’exclusion stérique (de l’étape 1.7). Collecter les fractions du fractionneur avant de commencer le prochain passage.
  9. Répéter les étapes 1.7 et 1.8 pour les autres aliqotes concentrées de l’étape 1.6.
  10. Effectuer une migration de 10 µL de chaque fraction des courses SEC, mélangés à 5 µL de colorant de charge pour électrophorèse native bleue sur gel de polyacrylamide (BN-PAGE), sur un gradient d’acrylamide de 3 % à 12 %, puis réaliser un dosage d’activité en gel NADH/chlorure de nitrotétrazolium bleu pour le CI26  afin de vérifier la présence d’activité CI dans les fractions. 
    REMARQUE : Les complexes respiratoires SC sortent du milieu de filtration sur gel d’agarose réticulé de 24 mL à un volume d’élution d’environ 11,5 mL.
  11. Rassembler les fractions présentant une activité CI de haut poids moléculaire maximale dans le test d’activité en gel du CI. Concentrer l’échantillon comme décrit à l’étape 1.5 ci-dessus.
    REMARQUE : Les SC concentrés dans un détergent glycosidique, la glyco-diosgénine (GDN), peuvent être stockés avec 30 % (v/v) de glycérol à une concentration finale d’environ 10 mg/mL dans l’azote liquide N2. À partir de 40 mg de complexe mitochondrial lavé, on obtient 3,4 mg de protéines totales selon un dosage BCA.

2. Préparation du mélange lipidique

REMARQUE : Modifié à partir de protocoles précédemment publiés27,28. Le chloroforme est toxique, volatil et suspecté d'être cancérigène. Manipuler uniquement dans une hotte chimique certifiée et avec des équipements de protection individuelle (EPI) adaptés. Le pentane est hautement inflammable. Tenir éloigné de toute source d'ignition. Manipuler uniquement dans une hotte chimique certifiée et avec des EPI adaptés. Éliminer les déchets de solvants organiques dans des récipients approuvés pour déchets de solvants halogénés/non halogénés, conformément aux directives EHS institutionnelles.&S politiques.

  1. En travaillant sous hotte, préparer séparément des solutions mères à 25 mg/mL de POPC (1-palmitoyl-2-oléoyl-sn-glycero-3-phosphocholine), de POPE (1-palmitoyl-2-oléoyl-sn-glycero-3-phosphoéthanolamine) et de CL (cardiolipine : 1,3-bis(sn-3’-phosphatidyl)-sn-glycérol ; issue de tissu cardiaque de bovin) dans le chloroforme. 
  2. Préparer du CoQ10 à 10 mM dans le chloroforme. Pour 25 mg de mélange lipidique total, ajouter dans un tube à essai en verre de 13 mL : 0,4 mL (10 mg) de POPC, 0,4 mL (10 mg) de POPE, 0,2 mL (5 mg) de CL et 50 µL de CoQ10 à 10 mM (soit 500 nmol de CoQ10 au total, soit 20 nmol de CoQ10/mg de lipide) à partir des solutions mères. Le rapport final en masse de POPC:POPE:CL est de 2:2:1.
  3. Sécher le mélange sous un flux de gaz inerte (argon ou azote) pour éliminer le chloroforme, tout en faisant doucement tourner le tube afin de former une couche mince de mélange lipidique sur les parois du tube. Poursuivre le séchage sous un flux constant de gaz inerte pendant 10 min.
  4. Redissoudre la couche lipidique sèche dans 1 mL de pentane et répéter l'étape 2.3, afin de faciliter l'élimination du chloroforme résiduel.
  5. Incuber le tube contenant les lipides séchés dans un dessiccateur sous vide à température ambiante pendant toute une nuit afin d'éliminer complètement les solvants. 
  6. Ajouter 5 mL de tampon de protéoliposomes (PLB ; 10 mM MOPS pH 7,4, 150 mM KCl) pour réhydrater le mélange lipidique, bien sceller le tube afin d'éviter tout déversement, puis agiter doucement au vortex jusqu'à dissolution complète des lipides (aucun dépôt lipidique visible ne doit subsister sur la paroi du tube).
  7. Retirer le scellage, remplir le tube avec du gaz inerte (argon ou azote), refermer le tube et incuber 1 h à température ambiante. Après 1 h d'incubation, prélever des aliquotes de 300 µL du mélange lipidique et les conserver à −20 °C. 
    REMARQUE : Le mélange POPC:POPE:cardiolipine (2:2:1) a été choisi suite à une optimisation empirique et parce que la PE et la cardiolipine sont des constituants majeurs de la membrane interne mitochondriale ; toutefois, le protocole peut facilement être adapté pour tester d'autres compositions lipidiques.

3. Reconstitution de SC mitochondriaux dans des liposomes

  1. Dégeler les aliquotes de SC conservées dans l'azote liquide  (étape 1.12) sur de la glace. Effectuer un échange de tampon pour éliminer le glycérol de l'échantillon en resuspendant l'échantillon dans le tampon SEC. Concentrer l'échantillon à l’aide de filtres centrifuges avec une coupure à 100 kDa à 3000 × g à 4 °C. Entre chaque centrifugation de concentration (~toutes les 5 min), poursuivre l’échange de tampon en resuspendant l’échantillon dans le tampon SEC.
  2. Vérifier la concentration finale du SC à l’aide d’un dosage BCA (kit de dosage protéique à l’acide bicinchoninique).
  3. Dégeler une aliquote de 300 µL du mélange lipidique préparé à l’étape 2.7 et l’extruder à travers un extrudeur équipé d’une membrane en polycarbonate de 100 nm pendant six cycles à température ambiante (un cycle consiste à faire passer le mélange lipidique de la seringue gauche à la seringue droite et inversement). Une fois les cycles d’extrusion terminés, récupérer les liposomes de 100 nm obtenus dans la seringue opposée à celle de départ. Alternativement, les liposomes peuvent être générés par sonication. 
  4. Ajouter 9 µL de détergent à 20 % (p/v) (concentration finale de 0,6 % p/v) à 250 µL du mélange lipidique extrudé dans un tube séparé.
    NOTE : Il est possible d’essayer différents détergents. Le cholate de sodium, un détergent anionique de type sel biliaire, a donné les meilleurs résultats dans ces expériences.
  5. Mélanger par retournements successifs et incuber à 4 °C pendant 30 min. 
  6. Ajouter 120 µg (ou plus) de SC mitochondrial et 3 µL de cytochrome c à 10 mM (concentration finale de 100 µM) au mélange. Compléter le volume à 300 µL avec le tampon PLB. Le rapport final lipide : protéine est d’environ 10:1 (p:p). En tant que contrôle supplémentaire, générer en parallèle des liposomes vides en ajoutant au mélange lipide-détergent le tampon SEC (30 mM HEPES, pH 7,8, 150 mM acétate de potassium, 1 mM EDTA, 0,005 % d’un détergent glycosidique) au lieu de SC mitochondriaux et de cytochrome c. 
  7. Mélanger par retournements successifs et incuber à 4 °C pendant 30 min. 
  8. Laver une colonne de désalinisation préremplie contenant de la résine G-25 avec le tampon PLB quatre fois par écoulement gravitationnel. Puis, effectuer un lavage par centrifugation de la colonne à 1 000 × g pendant 2 min.
  9. Ajouter l’échantillon de protéoliposomes à la colonne de désalinisation préremplie et lavée contenant de la résine G-25, puis centrifuger la colonne à 1 000 × g à 4 °C pendant 2 min afin d’éliminer le détergent. Récupérer l’éluate.
    NOTE : Les liposomes préparés par extrusion présentaient une distribution de taille plus homogène que ceux générés par sonication. Ne pas centrifuger la colonne de désalinisation préremplie plus longtemps que ce que recommande le fabricant, afin d’éviter une contamination de l’échantillon par le détergent. Les protéoliposomes ont été conservés à 4 °C et utilisés généralement dans les 36 heures suivant leur préparation afin de minimiser toute perte d’activité potentielle et de préserver l’intégrité des supercomplexes.

4. Essai de flottaison des lipides29

  1. Préparer des solutions de saccharose à 27 % et 7 % (p/v) dans du PLB. Réaliser un gradient par paliers en superposant 1,5 mL de saccharose à 27 % et 0,9 mL de saccharose à 7 % dans un tube de centrifugation de 3,5 mL.
  2. Déposer délicatement 300 µL de protéoliposomes (de l'étape 3.9) contenant SC sur le gradient de saccharose. Centrifuger les gradients à 100 000 × g dans un rotor à angle fixe pendant 2 h à 4 °C.
  3. Prélever soigneusement (en évitant de mélanger autant que possible) neuf fractions de 300 µL (ou dix fractions de 270 µL) du haut vers le bas. Resuspendre le culot, s'il est présent, dans la dernière fraction et le récupérer comme fraction 9 ou 10. Tout SC non réconstitué devrait s'accumuler dans la fraction 9 ou 10.
    REMARQUE : Le test de flottaison permet de séparer les protéoliposomes réconstitués des liposomes vides et des complexes protéiques non réconstitués. Il est utilisé pour optimiser la réconstitution.

5. Dosage spectroscopique de l'activité de la ferricyanure de CI et dosage de l'activité de CI en gel

  1. Préparer la quantité nécessaire de tampon de réaction au ferricyanure (FRB ; 20 mM Tris HCl, pH 7,4, 50 mM NaCl, 0,1 % p/v de 3-[(3-cholamidopropyl)diméthylammonio]-1-propanesulfonate (CHAPS), 1 mM de ferricyanure de potassium).
  2. Prélever 990 µL de tampon de réaction dans une cuvette de 1 mL. Ajouter 5 µL de l'échantillon (provenant de chaque fraction de gradient) à la cuvette, puis ajouter 5 µL de NADH à 20 mM (concentration finale de 100 µM) à la réaction. Sceller la cuvette avec un film transparent et mélanger par retournement.
  3. Surveiller la vitesse de décroissance de l'absorbance à 340 nm à 25 °C dans un spectromètre. La décroissance de l'absorbance à 340 nm indique l'oxydation du NADH. Répéter pour toutes les fractions en triplicata. Utiliser 5 µL de PLB à la place de l'échantillon pour enregistrer le blanc.
  4. Calculer la vitesse d'oxydation du NADH après soustraction du blanc et tracer l'activité totale de chacune des fractions.
    NOTE : Alternativement, l'expérience peut être réalisée dans une plaque de 96 puits.
  5. Rassembler les fractions présentant l'activité totale maximale (éviter les fractions situées au fond du tube qui contiennent de l'activité, car elles correspondent à des protéines non réconstituées). Ajuster le volume des fractions regroupées à 20 mL avec du PLB afin de diluer le saccharose.
  6. Centrifuger les échantillons à 150 000 × g, à 4 °C pendant 1 h dans un rotor à angle fixe. Jeter le surnageant et resuspendre le culot dans 200 µL de PLB.
  7. Mélanger 25 µL du culot resuspendu provenant de l'étape précédente avec 25 µL de digitonine à 2 % p/v dans du PLB et incuber (sous agitation rotative) à 4 °C pendant 1 h.
  8. Centrifuger les protéines non extraites à 16 000 × g pendant 20 min. Récupérer le surnageant.
  9. Ajouter 10 µL de colorant de charge pour BN-PAGE à 30 µL du surnageant et charger sur une BN-PAGE en gradient de 3 % à 12 %. Réaliser deux gels pour effectuer les dosages d'activité in-gel des CI et CIV26.
  10. Faire migrer le gel à 150 V pendant 30 min avec le tampon BN-PAGE sombre (25 mM Tris, 0,192 g de glycine, 200 mg de bleu de Coomassie). Remplacer le tampon bleu foncé par un tampon bleu clair (25 mM Tris, pH 8,3, 0,192 g de glycine, 20 mg de bleu de Coomassie) et faire migrer encore 2 h à 200 V.
  11. Après la migration, transférer les gels dans un récipient approprié et réaliser les dosages d'activité in-gel des CI et CIV26.
    NOTE : Pour des études structurales et fonctionnelles de complexes réconstitués dans des liposomes, utiliser les protéoliposomes resuspendus restants de l'étape 5.6. Une fois la réconstitution entièrement optimisée, on peut omettre les étapes 4 et 5 et utiliser directement les protéoliposomes réconstitués provenant de l'étape 3.

6. Dosage de la fluorescence par inhibition de l'ACMA pour mesurer l'intégrité membranaire des protéoliposomes reconstitués29

  1. Préparer la quantité nécessaire de tampon de réaction ACMA (9-amino-6-chloro-2-méthoxyacridine) (10 mM MOPS pH 7,4, 15 mM KCl, 4 µM ACMA, 0,5 mg/mL d'albumine sérique bovine (BSA), 2 mM 2-mercaptoéthanol). 
  2. Prélever 930 µL de tampon de réaction dans une cuvette de 1 mL. Ajouter 50 µL de protéoliposomes reconstitués à la cuvette, sceller la cuvette et mélanger par retournement. Incuber à l’abri de la lumière pendant 8 min.
  3. Régler les paramètres du spectromètre sur : longueur d'onde d'excitation 410 nm, longueur d'onde d'émission 490 nm. 
  4. Après l'incubation, mélanger à nouveau la cuvette par retournement et mesurer la fluorescence au spectromètre à température ambiante pendant 8 min.
  5. Ajouter 4 µL de valinomycine à 20 µM (concentration finale de 80 nM) à la cuvette, mélanger par retournement et mesurer pendant 8 min.
  6. Ajouter 6 µL de CCCP à 1 mM (carbonyl cyanide m-chlorophényl hydrazone) (concentration finale de 6 µM) à la cuvette, mélanger par retournement et mesurer pendant 8 min.
  7. Pour établir un témoin de vésicules vides, répéter les étapes 6.2 à 6.6, mais remplacer les protéoliposomes reconstitués par des « liposomes vides ». Les liposomes vides sont préparés selon les mêmes étapes que les protéoliposomes reconstitués, mais le tampon SEC remplace l'ajout des SCs lors de la reconstitution (étape 3.6).
  8. Répéter la mesure en triple exemplaire pour les protéoliposomes reconstitués et les liposomes vides, puis tracer leur fluorescence relative en fonction du temps.
    REMARQUE : Les données obtenues avec les protéoliposomes reconstitués ou les liposomes vides sont normalisées selon (Fi − Fmin)/(Fmax−Fmin), où Fmax correspond à la valeur initiale de fluorescence de base de l'échantillon et Fmin à la valeur minimale de fluorescence de base de l'échantillon après ajout de CCCP.
    AVERTISSEMENT : Le CCCP est un découpleur mitochondrial toxique et doit être manipulé avec des gants sous hotte aspirante.

7. Mesures de consommation d'oxygène par respirométrie pour évaluer la fonction des SC reconstitués30.

REMARQUE : Le taux de consommation d'oxygène est mesuré à l'aide d'un système d'électrode à oxygène de type Clark. Les tests fonctionnels des SC reconstitués sont réalisés directement sur l'éluat de la colonne de désalinisation (étape 3.9).

  1. Installez l'appareil du système d'électrode à oxygène conformément aux instructions du fabricant et ouvrez le logiciel de contrôle de l'appareil. Ajoutez 2 mL d'eau ultrapure dans la chambre de mesure.
  2. Réglez la vitesse d'agitation jusqu'à ce que le graphique de concentration en oxygène reste stable lorsque la vitesse d'agitation augmente (commencez à 10, augmentez par incréments de 10). Retirez l'eau MQ et ajoutez de l'eau oxygénée (eau MQ dans un flacon agité vigoureusement).
  3. Cliquez sur Étalonnage > Étalonnage en phase liquide > Eau saturée en air et attendez que l'étalonnage se stabilise (taux de 0 nmol par minute). À l'aide d'une petite spatule, ajoutez quelques cristaux (4 à 6) de dithionite de sodium dans le récipient de réaction afin d'établir une concentration nulle en oxygène dans la chambre.
  4. Attendez que le signal atteigne un plateau avant de poursuivre. Enregistrez l'étalonnage et nettoyez la chambre de réaction avec 5 × 1 mL d'éthanol à 70 %, puis avec 5 × 1 mL d'EDTA 0,1 mM, avec 5 × 1 mL d'eau MQ, et avec 5 × 1 mL de tampon de réaction pour oxygraphe (ORB ; 150 mM KCl, 50 mM MOPS pH 7,4, 5 mM MgCl2, 5 mM KH2PO4, 0,02 mM EGTA, 0,5 mg/mL BSA).
  5. Ajoutez 2 mL d'ORB, cliquez sur le bouton « démarrer la lecture » dans le logiciel et attendez que le graphique se stabilise. Pendant l'ajout des protéoliposomes (échantillon) dans la chambre de réaction, étiquetez le graphique dans le logiciel pour indiquer l'ajout de l'échantillon.
    NOTE : La concentration en protéines dans l'échantillon de protéoliposomes est estimée à partir de la quantité totale de protéines ajoutée aux liposomes. Un rapport protéine : lipide de 1:12 et une concentration finale de 50 µg/mL de protéine dans la chambre du système d'électrode à oxygène (2 mL) ont donné les meilleurs résultats. Le rendement précis des protéoliposomes n'a pas été mesuré.
  6. Une fois que la lecture du système d'électrode à oxygène est stabilisée, ajoutez du NADH dans la chambre de réaction et étiquetez simultanément l'ajout sur le graphique dans le logiciel. Poursuivez la lecture pendant 5 minutes.
  7. Ajoutez du CCCP, étiquetez l'ajout dans le logiciel, puis continuez la lecture pendant 5 minutes.
  8. Ajoutez un inhibiteur (par exemple, un inhibiteur du CI (piericidine A), ou un inhibiteur du CIII2 (myxothiazol), ou un inhibiteur du CIV (NaN3)), étiquetez l'ajout sur le graphique dans le logiciel, lisez pendant 2 minutes, puis arrêtez la lecture. 
  9. Enregistrez le graphique et nettoyez la chambre de réaction avec 5 × 1 mL d'éthanol à 70 %, 5 × 1 mL d'EDTA 0,1 mM, 7 × 1 mL d'eau MQ, et 5 × 1 mL d'ORB avant d'effectuer une autre mesure.
  10. Pour corriger les données du taux de fond, calculez le taux de fond, c'est-à-dire la pente de la lecture avant l'ajout de NADH, puis extrapolez linéairement ce taux sur toute la durée de la mesure afin de calculer une concentration en [O2] de fond attendue pour chaque point temporel. Soustrayez ensuite la [O2] de fond extrapolée de la valeur mesurée de [O2] à chaque point temporel.
  11. Calculez les taux de consommation d'oxygène (OCRs) comme la pente des mesures de concentration en [O2] corrigées du fond après l'ajout de chaque réactif.
  12. Pour calculer les taux relatifs par rapport à l'OCR après ajout de NADH, divisez, pour chaque tracé individuel, chaque OCR mesuré (par exemple, OCR après ajout de NADH, de CCCP et de l'inhibiteur, respectivement) par l'OCR mesuré après ajout de NADH.     
    NOTE : ATTENTION : Le dithionite de sodium est un agent réducteur puissant et peut réagir violemment avec des oxydants ou en présence d'humidité. Manipulez-le avec des gants. Éliminez les déchets contenant des inhibiteurs comme déchets chimiques dangereux conformément aux directives institutionnelles.

8. Estimation de la taille des liposomes reconstitués par diffusion dynamique de la lumière

  1. Allumez l'instrument de diffusion dynamique de la lumière (DLS) et laissez-le se stabiliser environ 30 minutes pour que le laser atteigne une stabilité optimale.
  2. Démarrez le logiciel d'acquisition de l'instrument et fermez tous les fichiers précédents.
  3. Filtrez les protéoliposomes (0,2 μm) afin d'éliminer toute particule indésirable.
  4. Transférez 70 µL de protéoliposomes dans une cuvette propre, en évitant tout contact avec les doigts ou toute trace.
  5. Insérez la cuvette dans l'instrument et refermez le couvercle fermement.
  6. Créez un nouveau fichier et sélectionnez Mesure manuelle > Taille.
  7. Réglez la température à 25 °C et laissez l'indice d'atténuation en mode automatique.
  8. Définissez les propriétés du dispersant (viscosité et indice de réfraction ; par exemple, RI = 1,330 pour l'eau ou le tampon).
  9. Paramétrez les conditions d'acquisition (durée automatique, environ 3 mesures, traitement à usage général).
  10. Lancez la mesure et surveillez la taille, l'indice de polydispersité (PDI) et le taux de comptage (cible : ~100–500 kcps).
  11. Analysez les résultats : vérifiez la distribution de taille (en intensité/volume), le PDI (<0,3 acceptable) et la qualité de l'autocorrélation (décroissance lisse, ligne de base stable) ; enregistrez les données.

9. Préparation et examen des grilles de microscopie électronique cryogénique

  1. Utiliser l'échantillon de protéoliposomes de l'étape 5.11 (ou de l'étape 3.9 si les étapes 4 et 5 sont omises) pour préparer les grilles de microscopie électronique. Concentrer les protéoliposomes si nécessaire en répétant l'étape 5.6 et en les resuspendant dans un volume plus faible de PLB.
  2. Plasma-traiter sous air pendant 90 s à 20 mA des grilles en cuivre de 300 mesh recouvertes de carbone perforé dans un système de nettoyage par décharge lumineuse.
  3. Configurer un système automatisé de congélation par immersion pour congeler à 95 % d'humidité et à 15 °C avec les paramètres suivants : temps de capillarité 10 s, force de capillarité −8, temps d'attente 10 s, et temps d'écoulement 0.
  4. Fixer la pince munie de la grille plasma-traitée au système de congélation par immersion.
  5. Ajouter 4,0 µL de l'échantillon de protéoliposomes sur la grille plasma-traitée à l’aide d’un plongeur automatique.
  6. Incuber les grilles pendant 10 s, puis effectuer la capillarité pendant 10 s et plonger dans de l'éthane liquide. Transférer soigneusement les grilles vers la boîte à grilles dans la chambre d'azote liquide N2, puis ultérieurement vers le dewar de stockage d'azote liquide N2.
  7. Charger les grilles congelées et les examiner au microscope électronique en transmission équipé d’un système de chargement d’échantillons cryogénique. Un microscope électronique en transmission muni d’un détecteur électronique direct a été utilisé.
  8. Configurer le microscope selon les instructions du fabricant et examiner les grilles à la recherche de protéoliposomes reconstitués. Enregistrer les images.
    REMARQUE : PRÉCAUTION : L'éthane liquide est hautement inflammable et cryogénique ; manipuler avec des équipements de protection individuelle adaptés et à l’écart de toute source d’ignition afin d’éviter les risques d’incendie et de brûlures par le froid. L’azote liquide est cryogénique et peut provoquer de graves brûlures par le froid ainsi qu’un déplacement de l’oxygène. Manipuler avec des équipements de protection individuelle cryogéniques adaptés et utiliser uniquement dans des zones bien ventilées.

Résultats

À l'aide de ce protocole, nous avons identifié les conditions optimales de reconstitution des supercomplexes mitochondriaux (SC) isolés à partir de mitochondries de cœur de porc (Figure 1A,B). Le protocole de gradient discontinu de saccharose permet efficacement de séparer les protéoliposomes reconstitués des vésicules vides et des protéines non incorporées, ce qui permet un test rapide et une optimisation des conditions. Les résultats représentatifs présentés dans la Figure 2 montrent un gradient avec l'échantillon appliqué avant et après centrifugation. De plus, nous avons optimisé le détergent utilisé pour la reconstitution des supercomplexes respiratoires dans des liposomes. Quatre détergents différents — un détergent anionique de sel biliaire, le CHAPS, la digitonine et un détergent glycosidique — ont été utilisés séparément pour la reconstitution avec les supercomplexes. L'activité totale de la CI dans les fractions a été mesurée par le test d'oxydoréduction NADH-ferricyanure pour chaque détergent testé (Figure 3A–D). Pour des reconstitutions réussies, une activité maximale de la CI a été observée dans les fractions situées à l'interface des deux concentrations de saccharose (27 % p/v de saccharose et 7 % p/v de saccharose). Notamment, une activité minimale est détectée dans la Fraction #10 avec le détergent anionique de sel biliaire et le CHAPS, tandis que la Fraction #10 avec la digitonine et le détergent glycosidique présente une activité importante, indiquant que la digitonine et un détergent glycosidique ne reconstituent pas efficacement les supercomplexes dans les liposomes. Un détergent anionique de sel biliaire a été utilisé pour toutes les reconstitutions ultérieures.

Le dosage d'activité CI et CIV en gel, effectué sur un gel d'électrophorèse polyacrylamide native bleue (BN-PAGE) de protéoliposomes POPC:POPE:CL (2:2:1) extraits à la digitonine, démontre les quantités relatives des supercomplexes (SC) et des complexes individuels de la chaîne de transport d'électrons (ETC) après reconstitution (Figure 4). Les résultats indiquent que l'interaction entre CI et CIII2 est largement maintenue dans les protéoliposomes après la réextraction à la digitonine et la BN-PAGE. Bien qu'une certaine activité CIV soit présente dans la bande du supercomplexe, un signal intense est également observé à un poids moléculaire plus faible, compatible avec la CIV seule, indiquant une dissociation. La perméabilité membranaire des liposomes reconstitués a été mesurée à l'aide du test de désactivation de la fluorescence ACMA, indiquant que les protéoliposomes n'étaient pas significativement perméables aux protons (Figure 5A,B). La taille des liposomes reconstitués a été estimée par diffusion dynamique de la lumière (DLS), montrant que l'extrusion avant la reconstitution conduit à une distribution finale de taille des protéoliposomes de 82,9 ± 0,8 nm de diamètre pour les vésicules vides et de 110,6 ± 0,4 nm pour les protéoliposomes de supercomplexes reconstitués (RSPs) (Figure 6). La consommation d'oxygène par les protéoliposomes a été utilisée pour évaluer la fonction du SC, révélant une consommation d'oxygène clairement sensible aux inhibiteurs et induite par le NADH (Figure 7A). Le tracé des taux de consommation d'oxygène (OCR) par rapport à l'OCR après l'ajout de NADH rend compte directement du degré de couplage au sein des RSPs, c'est-à-dire que l'OCR augmente d'un facteur d'environ 1,5 après l'ajout de CCCP par rapport à l'ajout de NADH seul (Figure 7B). Les grilles de cryo-MET examinées ont permis la visualisation des SCs dans la membrane des protéoliposomes, confirmant la reconstitution réussie (Figure 8A–I).

Processus de chromatographie, graphique d'absorption UV, gel BN-PAGE, purification de protéines, résultats de dosage.
Figure 1: Isolation et caractérisation de supercomplexes solubilisés par détergent provenant de mitochondries de cœur de porc. (A) Chromatogramme représentatif de la purification par chromatographie d'exclusion stérique (SEC) des complexes membranaires mitochondriaux de porc extraits avec de la digitonine. (B) PAGE en milieu natif bleu (BN-PAGE) des fractions issues de A, visualisée par coloration in-gel de l'activité enzymatique de la CI. Veuillez cliquer ici pour consulter une version agrandie de cette figure.

Centrifugation en gradient de densité, schéma de séparation des protéoliposomes ; analyse des couches de vésicules et de protéines.
Figure 2 : Gradients discontinus de saccharose avec des protéoliposomes. Avant la centrifugation (à gauche), après la centrifugation (à droite) à 100 000 × g pendant 2 h dans une ultracentrifugeuse. L'échantillon de protéoliposomes déposé sur le gradient est séparé en vésicules vides, protéoliposomes et protéines agrégées au fond. Ce gradient est ensuite fractionné pour une caractérisation ultérieure, comme décrit. L'étendue approximative de chaque fraction est indiquée et étiquetée. Veuillez cliquer ici pour visualiser une version agrandie de cette figure.

Histogramme montrant l'activité enzymatique avec des détergents : cholate de sodium, CHAPS, GDN, digitonine.
Figure 3 : Essai de flottation pour évaluer l'efficacité de reconstitution dans différents détergents. Activité CI NADH-ferricyanure sur les fractions issues du gradient discontinu de saccharose après reconstitution avec (A) un détergent de sel biliaire anionique, (B) du 3-[(3-cholamidopropyl)diméthylammonio]-1-propanesulfonate (CHAPS) (0,6 % (p/v)), (C) de la digitonine (0,6 % p/v), (D) un détergent glycosidique (GDN) (0,6 % (p/v)). La fraction #10 est obtenue en resuspendant tout culot dans la dernière fraction. L'activité dans la fraction #10 indique que les protéines ne se sont pas reconstituées. n = 3 et les barres d'erreur montrent l'écart type (SD). Veuillez cliquer ici pour visualiser une version agrandie de cette figure.

Schéma de gel électrophorétique montrant les résultats de la séparation des protéines ; les bandes étiquetées indiquent les types de protéines.
Figure 4 : Essai d'activité en gel sur des protéoliposomes extraits à la digitonine, analysés par BN-PAGE 3 %–12 %. Essai d'activité en gel pour le CI (à gauche) et le CIV (à droite). R = respirasome (SC I+III2+IV), SC1,3 (SC I+III2), IGA CI = (essai d'activité en gel du CI) ; IGA = essai d'activité en gel, CIV = (essai d'activité en gel du CIV). Veuillez cliquer ici pour afficher une version agrandie de cette figure.

Graphique de la diminution de la fluorescence, liposomes vides contre protéoliposomes, traitement au valinomycine et au CCCP.
Figure 5 : Essai de diminution de la fluorescence ACMA pour détecter les fuites protoniques dans les protéoliposomes reconstitués. À l’aide d’un colorant sensible au pH (ACMA), le pH interne des protéoliposomes reconstitués (en cyan) a été comparé à celui des liposomes vides (en orange) après l’ajout successif de valinomycine et de CCCP. Des tracés représentatifs de la fluorescence ACMA obtenus à partir de différentes préparations de protéoliposomes sont présentés à des fins de comparaison. (A) Liposomes reconstitués avec une membrane altérée (fuyante). (B) Liposomes reconstitués avec une membrane intacte. Veuillez cliquer ici pour visualiser une version agrandie de cette figure.

Graphique de distribution de taille comparant les protéoliposomes et les liposomes vides ; analyse du volume par rapport à la taille.
Figure 6 : Mesures de diffusion dynamique de la lumière des liposomes vides et des protéoliposomes SC réconstitués. Les distributions moyennes de taille pondérées en volume des liposomes vides extrudés (orange) et des protéoliposomes réconstitués avec le complexe SC (cyan) sont présentées. Les mesures ont été réalisées en trois réplicats techniques. Les liposomes vides ont un diamètre hydrodynamique moyen de 82,9 ± 0,8 nm, tandis que les RSP ont un diamètre hydrodynamique moyen de 110,6 ± 0,4 nm. Veuillez cliquer ici pour visualiser une version agrandie de cette figure.

Respiration cellulaire, graphique de consommation d'oxygène et histogramme analysant les effets du NADH, du CCCP et de la piericidine A.
Figure 7: Essais de consommation d'oxygène pour évaluer le couplage des SC reconstitués dans des liposomesLa consommation d'oxygène a été mesurée afin d'évaluer l'activité respiratoire et le couplage des complexes de la chaîne de transport des électrons après reconstitution dans des liposomes générés par extrusion. (A) Tracé représentatif de l'électrode à oxygène corrigé du fond, montrant les variations de concentration en oxygène suite à l'ajout séquentiel de NADH pour initier la respiration dépendante du CI, de CCCP pour dissiper le gradient de protons et mesurer la vitesse maximale de consommation d'oxygène déliée (OCR), de piericidine A pour inhiber le CI, et d'antimycine A pour inhiber le CIII2, ou NaN3 (azoture) pour inhiber le CIV. (B) Quantification de la OCR dans les conditions indiquées et corrigée selon l'étape 7.10. Les points de données relatifs à la OCR après l'ajout de NADH sont indiqués pour chaque tracé, accompagnés de la moyenne ± ÉT (barres d'erreur). Veuillez cliquer ici pour visualiser une version agrandie de cette figure.

Analyse en cryo-ME de la formation de vésicules lipidiques ; les flèches mettent en évidence les structures de vésicules ; échelle de 10 à 50 nm.
Figure 8 : Visualisation en cryo-ME de SC reconstitués dans des membranes de protéoliposomes. (A–C) Micrographies électroniques représentatives des grilles analysées, montrant des SC reconstitués associés aux membranes de protéoliposomes. Les SC reconstitués sont indiqués par des flèches jaunes. Les barres d'échelle = 50 nm. (D–I) Particules de SC représentatives observées à un grossissement plus élevé sur les membranes de protéoliposomes. Les barres d'échelle = 10 nm. Veuillez cliquer ici pour visualiser une version agrandie de cette figure.

Discussion

Une méthode simple et reproductible est présentée pour la reconstitution de complexes respiratoires mitochondriaux (SC) dans des protéoliposomes définis, permettant une étude contrôlée de leur structure et de leur fonction. Plusieurs étapes de ce protocole sont critiques pour une reconstitution réussie. Selon nos observations, les liposomes générés par extrusion présentent une distribution de taille plus uniforme (évaluée par diffusion dynamique de la lumière) que ceux produits par sonication. Un retrait efficace du détergent à l’aide d’une colonne tournante de désalinisation préalablement conditionnée est essentiel pour favoriser la fermeture membranaire et l’incorporation adéquate des SC dans une bicouche lipidique ; un retrait incomplet peut entraîner des protéoliposomes perméables ou instables. L’optimisation de la composition lipidique, des rapports protéine/lipide et du choix du détergent est tout aussi importante, car ces paramètres influencent fortement l’efficacité de la reconstitution et la stabilité des SC. Le test de flottaison sur gradient de saccharose est utile pour l’optimisation initiale ; toutefois, une fois les conditions établies, il est préférable d’utiliser directement les protéoliposomes après la colonne tournante de désalinisation préalablement conditionnée pour les analyses structurelles et fonctionnelles ultérieures, évitant ainsi la perte d’échantillon et les perturbations liées à la fractionnement sur gradient. Le volume de fraction nécessaire pour observer une activité varie selon les préparations. Ajustez le volume à ajouter dans le mélange réactionnel selon les différentes préparations. L’orientation du complexe respiratoire SC au sein de la membrane du protéoliposome peut influencer significativement les mesures respiratoires. La procédure de reconstitution n’a pas été optimisée pour imposer une topologie unique ; par conséquent, bien qu’une population mixte d’orientations soit attendue, les tests d’accès du ferricyanure à la CI indiquent une forte prédominance des bras périphériques de la CI orientés vers l’extérieur.

L'orientation des supercomplexes reconstitués a été évaluée expérimentalement, et l'activité de la ferricyanure de CI a été mesurée en présence et en l'absence de détergent. Dans les RSP intacts, le NADH ajouté de l'extérieur ne peut accéder qu'aux molécules de CI dont le bras périphérique est exposé au milieu externe, tandis que la perméabilisation par détergent permet au NADH d'accéder à tous les complexes. Ainsi, ce dosage estime la fraction de bras périphériques de CI fonctionnellement accessibles qui sont orientés vers le milieu externe, sans toutefois fournir une détermination structurale complète de la topologie des protéoliposomes. La comparaison des activités mesurées dans ces conditions a indiqué que 83,1 % ± 0,04 % des respirasomes (le SC) étaient orientés avec le bras périphérique de CI tourné vers l'extérieur, révélant un biais d'orientation significatif lors de la reconstitution.

Plusieurs modifications et stratégies de dépannage peuvent améliorer la reproductibilité et la stabilité. Les tests d'activité en gel pour le CI et le CIV, réalisés sur des fractions groupées extraites à la digitonine à partir de gradients de saccharose, révèlent des bandes correspondant aux supercomplexes (SC), indiquant que les SC ne se dissocient pas complètement lors de la reconstitution. Toutefois, la bande du SC est plus intense sur le gel d'activité du CI que sur celui du CIV, ce qui suggère que le CIV pourrait se dissocier partiellement du CI et du CIII2 après reconstitution (Figure 4). L'ajustement de la composition lipidique pourrait améliorer la stabilité des SC. Une dissociation partielle du CIV pourrait également résulter du choix du détergent ou d'une élimination rapide du détergent durant la reconstitution, ce qui pourrait compromettre les interactions protéine-protéine plus faibles au sein du supercomplexe. Une optimisation supplémentaire des conditions d'échange de détergent pourrait favoriser la rétention du CIV. En outre, limiter les contraintes mécaniques, éviter les étapes de purification inutiles et manipuler soigneusement les échantillons permettent de préserver l'intégrité des protéoliposomes. Pour les tests fonctionnels, il est essentiel de garantir l'étanchéité complète des protéoliposomes, car une perméabilité membranaire empêche le couplage au gradient de protons transmembranaire. Pour la préparation des grilles en cryo-EM, l'utilisation de grilles recouvertes d'un film de carbone continu est importante, car cela s'est révélé améliorer la distribution des particules dans les trous de la grille19.

Malgré ses avantages, cette approche présente des limites. Les protéoliposomes ne reproduisent pas entièrement la complexité compositionnelle et dynamique de la membrane interne mitochondriale native, et la dissociation partielle des composants du complexe superstructurel (SC), en particulier du complexe IV (CIV), demeure un défi. Les mesures fonctionnelles peuvent également être influencées par un couplage incomplet ou par une hétérogénéité de l'efficacité de reconstitution. Néanmoins, par rapport aux systèmes solubilisés par détergent, cette méthode préserve les interactions lipides-protéines et fournit un environnement membranaire proche de l'état natif, tout en offrant un meilleur contrôle expérimental que les approches in situ. Elle constitue donc une plateforme précieuse pour l'investigation systématique de la manière dont la composition lipidique et les propriétés membranaires régulent la stabilité et l'activité du complexe superstructurel.

Comprendre ces relations est particulièrement important car la perturbation de l'organisation des supercomplexes respiratoires a été mise en évidence dans un large éventail de troubles mitochondriaux et métaboliques31,32,33,34,35,36,37,38,39,40. Des défauts dans l'assemblage des complexes de la chaîne respiratoire, la synthèse de la cardiolipine ou le remaniement des lipides, tels qu'observés dans des affections comme le syndrome de Leigh41,42,43,44,45,46,47, le syndrome de Barth48,49,50,51,52,53,54 et le syndrome de Sengers48, peuvent déstabiliser les supercomplexes, altérer le transfert d'électrons, réduire la production d'ATP et augmenter la génération d'espèces réactives de l'oxygène. Ces déficits bioénergétiques affectent de manière disproportionnée les tissus à forte demande énergétique tels que le cœur, le muscle squelettique et le cerveau, entraînant des phénotypes incluant la cardiomyopathie, l'intolérance à l'exercice et la neurodégénérescence36,37,38. Inversement, des données récentes suggèrent que la formation de supercomplexes peut jouer un rôle compensatoire et protecteur en situation de stress, en stabilisant les complexes de la chaîne respiratoire et en limitant la production pathologique d'espèces réactives de l'oxygène55,56. La plateforme de protéoliposomes reconstitués décrite ici fournit un système contrôlé permettant de tester directement comment les remaniements lipidiques associés aux maladies, les mutations ou les interventions pharmacologiques modifient l'assemblage et la fonction des supercomplexes, permettant ainsi des études mécanistiques du dysfonctionnement mitochondrial et éclairant les stratégies thérapeutiques futures.

Des taux faibles de consommation d'oxygène peuvent résulter d'une incorporation insuffisante dans les supercomplexes, d'une dissociation partielle du CIV, d'un détergent résiduel, d'une concentration insuffisante de CoQ10 ou de cytochrome c, de NADH dégradé ou d'une faible concentration en protéines dans la chambre de l'oxymètre. Confirmez la réconstitution par un essai de flottaison ou par électrophorèse en gel natif (BN-PAGE), vérifiez l'intégrité membranaire par l'essai de piégeage de l'ACMA, préparez du NADH frais, et optimisez le rapport protéine/lipide, la concentration en cofacteurs, l'élimination du détergent et la concentration de l'échantillon. Des protéoliposomes perméables peuvent résulter d'une élimination incomplète du détergent, d'une concentration excessive de détergent, d'une manipulation brutale, de cycles répétés de congélation-décongélation ou de lipides endommagés. Si une fuite de protons est observée dans l'essai à l'ACMA, répétez l'élimination du détergent en utilisant une colonne de désalinisation fraîchement équilibrée, évitez de trop centrifuger la colonne, préparez de nouveaux liposomes, minimisez les contraintes mécaniques et utilisez les protéoliposomes immédiatement après la réconstitution. L'agrégation pendant les étapes de concentration peut survenir en raison de concentrations locales élevées de protéines ou de détergent au niveau de la membrane du concentrateur. Concentrez les échantillons en cycles de centrifugation courts (10 min), resuspendez délicatement l'échantillon entre chaque centrifugation, évitez la surconcentration, maintenez les échantillons à 4 °C, et éliminez les agrégats visibles par une clarification à basse vitesse avant toute utilisation ultérieure. Un comportement de flottaison irrégulier peut refléter une taille variable des liposomes, une élimination incomplète du détergent, une agrégation, un empilement incorrect des couches de saccharose ou une perturbation du gradient lors du chargement de l'échantillon ou de la collecte des fractions. Préparez des solutions fraîches de saccharose, superposez les gradients lentement sans mélanger les interfaces, utilisez des liposomes extrudés de manière uniforme, maintenez des conditions de centrifugation constantes, et collectez les fractions délicatement du haut vers le bas. Une mauvaise distribution des particules en cryo-ME peut résulter d'une faible concentration en protéoliposomes, d'une agrégation, d'une adsorption préférentielle sur le carbone, d'un mauvais mouillage de la grille, d'une couche de glace trop épaisse ou d'un temps de blotting excessif. Optimisez la concentration en protéoliposomes, éliminez les agrégats avant la préparation des grilles, ajustez les conditions de traitement sous plasma, testez la durée et la force du blotting, évaluez différents types de grilles ou supports en carbone, et utilisez des échantillons fraîchement préparés chaque fois que possible.

Déclarations de divulgation

Les auteurs déclarent qu'ils n'ont aucun conflit d'intérêts.

Remerciements

Les grilles ont été analysées à la plateforme BioEM du centre UC Davis. Nous remercions le Dr Fei Guo pour son aide lors de l'analyse. Ce travail a été financé par le NIGMS du NIH dans le cadre de la subvention R35GM137929 (JAL).

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
1-palmitoyl-2-oléoyl-sn-glycéro-3-phosphocholine (POPC)Avanti Research860320
1-palmitoyl-2-oléoyl-sn-glycéro-3-phosphoéthanolamine (POPE)Avanti Research850757
1,3-bis(sn-3’-phosphatidyl)-sn-glycérol (cardiolipine, provenant du tissu cardiaque de bovin)Avanti Research840012
2-[4-(2-hydroxyéthyl)pipérazin-1-yl]éthanesulfonique --- HEPESSigma-AldrichH23830
3-(N-morpholino)propanesulfonique (MOPS)Sigma-AldrichM12545
3,3′-Diaminobenzidine ---- DABBSigma-AldrichD4293
Cyanure de carbonyl m-chlorophénylhydrazone ---- CCCPSigma-AldrichC2759
CHAPSSigma-Aldrich220201
ChloroformeSigma-Aldrich650948
Coenzyme Q10Sigma-AldrichC9538
Cytochrome c provenant du cœur de chevalSigma-AldrichC2506
DigitonineSigma-Aldrich300410
Acide éthylène glycol-bis(2-aminoéthyléther)-N,N,N′,N′-tétraacétique --- EGTASigma-AldrichE3889
Acide éthylènediaminetétraacétique -- EDTASigma-AldrichE6758
GlycérolSigma-AldrichG7893
Glyco-diosgénineAnatraceGDN101détergent
Lauryl maltose néopentyl glycol ---- LMNGSigma-AldrichNG310
Chlorure de magnésiumSigma-AldrichM8266
MyxothiazolSigma-AldrichT5580
NADH, sel disodiqueSigma-Aldrich481913
Chlorure de nitrotétrazolium bleuSigma-AldrichN6876
Piericidine ASigma-Aldrich96861
Acétate de potassiumSigma-AldrichP5708
Chlorure de potassiumSigma-AldrichP3911
Ferricyanure de potassiumSigma-Aldrich702587
Phosphate monobasique de potassium ---- KH2PO4Sigma-AldrichP0662
Azoture de sodiumSigma-AldrichS2002
Cholate de sodium hydratéSigma-AldrichC1254
Chlorure de sodiumSigma-AldrichS9888
Dithionite de sodiumSigma-Aldrich71699
SaccharoseSigma-AldrichS9378
TRISSigma-AldrichT1503
ACMA (9-amino-6chloro-2-méthoxyacridine)Sigma-AldrichSML4162
Équipements et kits
Filtre centrifuge Amicon®, 100 kDa MWCO 0,5 mLMilliporeUFC5100
Filtre centrifuge Amicon®, 100 kDa MWCO 15 mLMilliporeUFC9100
Ultracentrifugeuse Beckman Optima TLXBeckman Coulter
Gel BN-PAGEgel d'électrophorèse native bleue sur polyacrylamide
Ultracentrifugeuse Beckman Optima XEBeckman Coulter
Système de nettoyage par décharge luminescentesystème de nettoyage par décharge luminescente
Glacios 2 Cryo-TEM avec détecteur Gatan K3Thermo Fisher Scientificle microscope électronique en transmission
Jeu de broyeur tissulaire KIMBLE DounceSigma-AldrichD9188
Plongeur automatique Leica GP2Leica
Microfuge 16Beckman CoulterA46474
Système de chromatographie NGC Discover 10Bio-Rad7880009
Oxygraph+système d'électrode à oxygène
Colonne de désalinisation PD-10Cytiva28918007colonne tournante de chromatographie par exclusion stérique
Kit d'analyse protéique Pierce BCAThermo Fisher Scientific23225kit d'analyse protéique à l'acide bichinconinique
Sonicateur Q-125Q-sonicaQ125-110
Colonne Sephadex G-25 Mcolonne tournante préremplie de résine G-25 pour désalinisation
Lecteur de microplaques SpectraMax M2Molecular Devices
Superose 6 increase 10/300 GLCytiva29091596milieu de filtration sur agarose réticulée
Pack rotor à angle fixe TLA-100.3Beckman Coulter349490
Rotor à angle fixe Type 50.2 TiBeckman Coulter337901
Eau Milli-Q (MQ)eau ultrapure
Malvern Zetasizer ZS Diffusion dynamique de la lumière (DLS)Malvern Paranytical
Système Hansatech Oxygraph+Hansatech Instruments
Système de nettoyage par décharge luminescente PELCO easiGlowTED PELLA, INC
Système Vitrobot Mark IVThermo Fisher Scientificle congélateur par plongée
Grilles en cuivre Quantifoil R 1.2/1.3 à 300 mailles avec 2 nm de carboneTED PELLA, INC668-300-Cu-100grilles à carbone perforé
Mini-extrudeuse AvantiAvanti Lipids610000

Références

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