Cette étude présente un flux de travail intégré de visualisation combinant la collecte et le traitement standardisés du liquide de lavage bronchoalvéolaire, un panel cytométrique à sept marqueurs, un dosage multiplex de 13 analytes pour les cytokines et un pipeline d'analyse unifié.
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Article de recherche
Visualisation intégrée du recrutement des neutrophiles et du profilage des cytokines inflammatoires dans le liquide de lavage broncho-alvéolaire
Dans cet article
Résumé
Résumé
Le liquide de lavage broncho-alvéolaire (BALF) est la matrice d'échantillonnage la plus directement accessible pour l'étude de l'inflammation des voies respiratoires inférieures, mais les analyses conventionnelles reposent sur la cytométrie en flux à un seul marqueur combinée à des dosages immunoenzymatiques (ELISA) effectués analyte par analyte, une approche qui limite la densité d'information et masque les interactions entre cellules et facteurs. Cette étude présente un flux de travail intégré de visualisation associant une collecte et une préparation standardisées à un panel cytométrique à sept marqueurs pour les neutrophiles et les monocytes, un dosage multiplexé de 13 analytes pour les cytokines, ainsi qu’un pipeline d’analyse unifié basé sur l’approximation uniforme des variétés et la projection (UMAP), le meta-clustering FlowSOM, le regroupement hiérarchique, les réseaux de corrélation de Spearman et l’analyse en composantes principales (PCA).
Le flux opérationnel a été appliqué à une cohorte prospective monocentrique de 112 adultes subissant une bronchoscopie, comprenant 64 patients présentant une infection pulmonaire confirmée microbiologiquement et 48 témoins sans infection. Les analyses cytologiques et cytométriques en flux ont révélé un important décalage d’un profil alvéolaire dominé par les macrophages vers un profil dominé par les neutrophiles durant l’infection, le pourcentage de neutrophiles passant d’une médiane de 3,2 % à 68,4 %, et la concentration absolue de neutrophiles augmentant d’environ 50 fois. Le profilage multiplex a mis en évidence une réponse coordonnée en trois modules de cytokines, les modules chimiotactiques, proinflammatoires et régulateurs étant tous surexprimés, avec CXCL8/IL-8, IL-1β, IL-6, CXCL1/GRO-α et G-CSF présentant la meilleure discrimination individuelle entre marqueurs au sein de la cohorte étudiée (aire sous la courbe [AUC] de 0,89 à 0,94). Une visualisation intégrative utilisant l’ACP, une matrice de corrélation et un graphe de réseau a révélé, au niveau des participants, un axe neutrophile–chimiotactique étroitement couplé, le nombre de neutrophiles dans le lavage broncho-alvéolaire apparaissant comme le nœud central du réseau.
Le flux opérationnel utilise uniquement des échantillons habituellement obtenus lors d'une LBA indiquée sur le plan clinique, ne nécessite aucun volume d'échantillon supplémentaire et fournit un cadre riche en informations pour analyser l'inflammation des voies respiratoires lors d'une infection respiratoire, une approche potentiellement réalisable dans des laboratoires de soins tertiaires équipés de cytomètres en flux multiparamétriques et de plateformes de puces à billes multiplex, s'étendant à des études longitudinales, à l'analyse unique cellulaire et à l'évaluation thérapeutique. Une adoption clinique plus large de chaque analyte en tant que biomarqueur exigera une validation prospective dans des cohortes indépendantes multicentriques.
Introduction
Les décès dus aux infections des voies respiratoires inférieures restent une cause importante de mortalité mondiale, bien que des progrès aient été réalisés dans les stratégies vaccinales et les modalités de traitement ; cela reste particulièrement vrai chez les populations pédiatriques et âgées1. Les neutrophiles sont les cellules principales observées lors des premiers stades de la réponse immunitaire innée dans le système respiratoire affecté, un processus essentiel pour éliminer l'agent pathogène envahissant ; toutefois, une inflammation neutrophilique incontrôlée entraîne la rupture de la barrière alvéolo-capillaire, des dommages tissulaires par stress oxydatif et le développement d'un syndrome de détresse respiratoire aiguë (SDRA)2,3. Dans l'espace aérien pulmonaire, les neutrophiles présentent également des cinétiques de recrutement, des profils de rétention et des comportements effecteurs différents de ceux observés dans d'autres tissus, et ces différences influencent la résolution de l'infection ou sa progression vers une pneumonie sévère4.
Le liquide de lavage bronchoalvéolaire (LLBA) constitue une source d'information importante sur le microenvironnement alvéolaire et offre la représentation la plus fidèle de l'immunité clinique à ce niveau5. La chimiochine CXCL8 joue un rôle essentiel dans le recrutement des neutrophiles vers les poumons via ses récepteurs, CXCR1 et CXCR2, ainsi que d'autres chimioquines telles que CXCL1, CXCL2 et CXCL56. Les cytokines IL-1β, IL-6 et TNF-α renforcent davantage ce processus, tandis que l'IL-10 agit comme une cytokine antagoniste. Leurs concentrations dans le LLBA ont été associées à la gravité des infections pulmonaires et au développement de complications pulmonaires dues aux pneumonies bactériennes, virales et atypiques7, et des profils multiplex de biomarqueurs dans le LLBA sont de plus en plus utilisés pour un diagnostic précoce et une discrimination des pathogènes dans les infections des voies respiratoires inférieures8.
Les tests de routine de la LBA ne parviennent généralement pas à rendre pleinement compte de la biologie sous-jacente à l'analyse. Les numérations cellulaires peuvent être estimées en différenciant manuellement les cellules sur des échantillons de cytocentrifugation, tandis que les médiateurs solubles sont mesurés à l’aide de dosages immunoenzymatiques individuels (ELISA) et présentés sous forme de graphique à barres. Les chimiotactiques, les cytokines et chaque type cellulaire sont évalués séparément, aucune corrélation n’étant établie entre un gradient de concentration particulier d’un chimiotactique et les populations cellulaires qu’il affecte dans l’échantillon. La combinaison de modules de cytokines, des relations dose-réponse entre chimiotactiques et neutrophiles, ainsi que des sous-populations de patients présentant leurs propres signatures inflammatoires, est souvent négligée en l’absence d’analyse multivariée9.
Les progrès en informatique rendent cette approche holistique de plus en plus réaliste. La combinaison de la cytométrie en flux multiparamétrique et de la cytométrie spectrale avec des méthodes de réduction de dimensionnalité, telles que l'embedding stochastique de voisins distribués en t (t-SNE) ou l'approximation uniforme de projection sur variété (UMAP), permet de représenter des phénotypes immunitaires en haute dimension dans un espace bidimensionnel, l'UMAP s'avérant offrir une meilleure préservation de la topologie globale et une plus grande reproductibilité lorsqu'il est appliqué à des données de cytométrie10. Des panels multiparamétriques de cytokines, suivis d'un regroupement hiérarchique et de réseaux de corrélation, permettent d'identifier des signatures corrélées à la gravité, qui ne sont pas détectables par des approches basées sur une seule cytokine11. Malgré les avancées dans ce domaine, aucun protocole n'a encore combiné ces méthodes pour étudier simultanément le recrutement des neutrophiles et les signatures de cytokines à partir des mêmes échantillons de LBA dans les infections respiratoires. Cette étude décrit un protocole intégré de visualisation permettant d'analyser le recrutement des neutrophiles par cytologie et cytométrie en flux multiparamétrique, suivi d'analyses par UMAP et d'identification de signatures de cytokines par immunoessai multiplexe, incluant un regroupement hiérarchique, des matrices de corrélation et une analyse en composantes principales. Ce protocole produit une visualisation intégrée qui regroupe, dans un seul graphique, les paramètres cellulaires et solubles de la réponse immunitaire des voies respiratoires, à partir d'échantillons de LBA obtenus de façon routinière lors de bronchoscopies cliniquement indiquées en cas d'infection du tractus respiratoire inférieur.
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Protocole
Population étudiée et éthique
Il s'agissait d'une étude observationnelle prospective monocentrique menée dans un hôpital universitaire entre janvier 2026 et avril 2026. Le protocole a été approuvé sous le numéro 2026HL-038, et un consentement éclairé écrit a été obtenu de chaque participant avant toute procédure liée à l'étude.
Des adultes âgés de 18 à 75 ans subissant une bronchoscopie souple diagnostique avec lavage broncho-alvéolaire (LBA) dans le cadre de soins cliniques de routine ont été recrutés consécutivement et répartis en un groupe d'infection ou un groupe témoin sans infection selon leurs diagnostics cliniques et microbiologiques finaux. Un aperçu du flux de travail intégré de visualisation, du recrutement des patients jusqu'aux sorties visuelles intégrées, est présenté dans la Figure 1.
Figure 1 : Aperçu du flux de travail intégré de visualisation pour le profilage, basé sur le LBA, du recrutement des neutrophiles et des réponses inflammatoires en cytokines. Les cinq étapes résument, de gauche à droite, le recrutement prospectif des groupes infecté et témoin par bronchoscopie et LBA, le prétraitement du LBA en culot cellulaire et fraction surnageante, les mesures cellulaires parallèles (cytologie de Wright-Giemsa et cytométrie en flux multiparamétrique) et solubles (immunodosage multiplex à 13 paramètres sur billes), le pipeline unifié de visualisation (UMAP avec méta-clustering FlowSOM, carte thermique hiérarchique, analyse en composantes principales et réseau de corrélation de Spearman), ainsi que la sortie visuelle intégrée. Abréviations : BAL = lavage broncho-alvéolaire ; LBA = liquide de lavage broncho-alvéolaire ; UMAP = projection uniforme d'approximation de variété. Veuillez cliquer ici pour visualiser une version agrandie de cette figure.
Les critères d'inclusion du groupe infection étaient les suivants : (1) patients diagnostiqués avec une pneumonie communautaire (CAP), une pneumonie acquise en milieu hospitalier (HAP) ou une pneumonie associée à la ventilation (VAP) conformément aux recommandations de la société des maladies infectieuses (IDSA) et de la société thoracique américaine (ATS) ; (2) détection d'un ou de plusieurs agents pathogènes par culture du LBA avec une concentration ≥104 unités formant colonies (UFC)/mL, par réaction en chaîne par polymérase (PCR) respiratoire multiplex, par séquençage génomique métagénomique de nouvelle génération du LBA ou par test antigénique/anticroprorique spécifique à partir d'échantillons respiratoires/sériques appariés.
Les critères du groupe témoin étaient les suivants : (1) des motifs non infectieux de bronchoscopie, comprenant l'évaluation d'un nodule pulmonaire indéterminé, des résultats radiologiques anormaux ne suggérant pas une infection, ou un examen pour une toux chronique ; (2) l'absence d'infection pulmonaire aiguë, démontrée par des résultats négatifs aux tests microbiologiques et par l'absence de tout signe d'inflammation ou d'infection systémique au moment de la bronchoscopie ; et (3) l'absence d'utilisation d'antibiotiques dans les 30 jours précédant la participation. Les témoins ont été recrutés parmi les patients subissant une bronchoscopie pour d'autres affections pulmonaires cliniquement indiquées, plutôt que parmi des volontaires sains, reflétant ainsi la population à partir de laquelle le LBA cliniquement indiqué est habituellement obtenu dans le centre d'étude.
Les critères d'exclusion comprenaient : (1) une malignité et/ou une chimiothérapie cytotoxique au cours des six mois précédents ; (2) une séropositivité au VIH ; (3) une transplantation d'organe solide ou de cellules souches hématopoïétiques ; (4) un traitement immunosuppresseur prolongé impliquant une dose quotidienne équivalente de prednisone > 0,3 mg/kg pendant plus de 3 semaines ; (5) femmes enceintes ou allaitantes ; (6) antécédents de diathèse hémorragique ou de toute contre-indication à la bronchoscopie souple ; (7) maladie respiratoire chronique sévère préexistante (maladie pulmonaire obstructive chronique [MPOC] stade III/IV selon l'Initiative mondiale pour la maladie pulmonaire obstructive chronique [GOLD], fibrose pulmonaire idiopathique, asthme sévère persistant ou bronchectasies cliniquement significatives) ; (8) tuberculose active ; (9) participation à une autre étude interventionnelle au cours des 30 derniers jours. Un lavage broncho-alvéolaire (LBA) a été réalisé lors de la première bronchoscopie, dans les 72 heures suivant l'admission pour infection, et dans les 48 heures suivant l'intubation chez les patients sous ventilation mécanique présentant une infection.
Les calculs de taille d'échantillon ont porté sur le critère de jugement cellulaire principal : le nombre de neutrophiles dans le LBA entre les groupes. Compte tenu de la taille d'effet attendue de 0,6 DS entre les voies respiratoires infectées et non infectées, et en considérant une marge de 15 % pour les abandons, une taille d'échantillon minimale de 45 sujets par groupe était nécessaire pour un seuil de signification bilatéral α = 0,05 et une puissance statistique de 80 %. Sur les 156 candidats éligibles, 27 ne satisfaisaient pas aux critères d'éligibilité (18 n'ont pas rempli les critères d'inclusion, principalement en raison de l'impossibilité d'identifier un agent pathogène responsable de leur maladie dans le délai imparti ou du refus du protocole lui-même ; 9 ont enfreint les critères de non-inclusion, principalement en raison d'une malignité active ou d'un antécédent de chimiothérapie, d'une utilisation chronique de corticostéroïdes, d'une maladie pulmonaire chronique préexistante sévère ou d'une diathèse hémorragique). Les 129 participants restants ont subi une bronchoscopie. Par la suite, 17 sujets ont été exclus de l'étude (7 en raison d'un rendement insuffisant de LBA < 40 % ; 4 en raison du retrait du consentement pendant l'hospitalisation ; et 6 en raison d'une reclassement des sujets après l'évaluation microbiologique finale – 4 candidats témoins diagnostiqués avec une infection occulte selon les résultats de culture ; et 2 candidats infectés chez qui aucune preuve d'infection n'a été trouvée après analyse des cultures). Le groupe final des sujets de l'étude comprenait 112 participants : 64 avec infection et 48 sans infection.
Prélèvement et prétraitement du LBA
La bronchoscopie a été réalisée par des opérateurs qualifiés selon le protocole institutionnel standard, conforme aux recommandations techniques publiées pour le lavage broncho-alvéolaire12. La lidocaïne a été utilisée par voie topique, et les patients ont reçu une sédation intraveineuse modérée, tandis qu'un apport supplémentaire en oxygène était administré afin de maintenir la saturation en oxygène (SpO₂) >92 %. Le bronchoscope souple a été inséré et positionné dans le segment bronchopulmonaire présentant des anomalies radiologiques. Dans les cas où les anomalies radiologiques étaient diffuses ou non localisables, les segments du lobe moyen droit ou de la langue gauche ont été choisis. Après chaque instillation, une aspiration manuelle douce avec une pression négative < 100 mmHg a été effectuée. Un total de trois à cinq instillations de sérum physiologique stérile à 37 °C, de 20 à 40 mL chacune, pour un volume total de 100 à 150 mL, ont été administrées. Le taux de récupération a été estimé comme le volume récupéré rapporté au volume instillé, et seuls les échantillons présentant un taux de récupération ≥40 % ont été pris en compte pour l'analyse.
Les échantillons recueillis lors du deuxième lavage et des lavages ultérieurs ont été regroupés afin de réduire la contamination bronchique et d'obtenir un échantillon enrichi en alvéoles. Le prélèvement de liquide de lavage bronchoalvéolaire (BALF) a été conservé sur glace et traité dans les 2 heures suivant sa collecte, en tenant compte des résultats récents concernant les modifications de la composition cellulaire et des comptages différentiels après un stockage prolongé et une élévation de la température des échantillons humains de BALF13. Après filtration à l’aide d’un tamis stérile en nylon de 70 microns pour éliminer le mucus, réalisée uniquement par passage mécanique sans ajout d’agent mucolytique ou anti-agglutination tel que le dithiothréitol, car des tests préliminaires ont montré que cette méthode suffisait à éliminer les agrégats de mucus sans perte mesurable de l’intégrité des épitopes de surface en aval, le liquide a été soumis à une centrifugation à 400 × g pendant 10 min à 4 °C. Le surnageant a été décanté et réparti en aliquotes dans des cryotubes à faible liaison aux protéines pour l’analyse des cytokines, tandis que les cellules ont été mises en suspension dans une solution saline tamponnée au phosphate (PBS) contenant 0,5 % d’albumine sérique bovine et 2 mM d’acide éthylènediaminotétraacétique (EDTA), une partie d’entre elles étant conservée pour la cytologie et la cytométrie en flux. Les échantillons de cytokines ont été congelés dans de l’azote liquide, stockés à –80 °C, et soumis à un maximum d’un cycle de congélation-décongélation avant utilisation.
Cytologie des neutrophiles et quantification par cytométrie en flux
En ce qui concerne la cytopathologie, 100 µL de la suspension cellulaire de LBA ont été appliqués sur une lame de verre à l’aide d’un cytocentrifugeur (voir Tableau des matériaux) à 300 × g pendant 5 min, séchés à l’air, puis colorés selon la méthode de Wright-Giemsa. Le décompte différentiel a été effectué par un technologiste en hématologie ignorant l’historique médical du patient, qui a compté un minimum de 400 cellules par lame et calculé les pourcentages de macrophages, de lymphocytes, de neutrophiles et d’éosinophiles. Le pourcentage de neutrophiles dans le LBA a été considéré comme la mesure principale du résultat en cytopathologie, étant donné les données actuelles suggérant leur utilité pour distinguer les affections pulmonaires infectieuses des affections non infectieuses chez les patients présentant des infiltrats pulmonaires14.
Le protocole de quantification par cytométrie en flux était basé sur une récente validation du protocole de différenciation des leucocytes dans le liquide de lavage broncho-alvéolaire (LLBA) en quatre couleurs15 et incluait des marqueurs supplémentaires pour identifier les neutrophiles. Plus précisément, environ 5 × 105 cellules isolées du LLBA ont été bloquées avec un réactif de blocage des récepteurs Fc humains (voir Tableau des matériaux) pendant 10 min à 4 °C, puis marquées pendant 20 min à 4 °C avec des anticorps dirigés contre CD45 (clone HI30), CD66b (clone G10F5), CD15 (clone HI98), CD16 (clone 3G8), CD11b (clone ICRF44), CD14 (clone M5E2) et HLA-DR (clone L243), en plus d’un colorant vital fixable (voir Tableau des matériaux). Pour la lyse des érythrocytes, une solution commerciale de lyse des érythrocytes (voir Tableau des matériaux) a été utilisée pendant 10 min à température ambiante. Après la lyse des érythrocytes, les cellules ont été lavées deux fois avec du PBS enrichi en 2 % de sérum de veau fœtal et resuspendues dans du tampon d’écoulement, puis analysées à l’aide d’un cytomètre en flux multicolore (voir Tableau des matériaux). La compensation a été effectuée à l’aide de billes de compensation monocolorées (voir Tableau des matériaux), et des témoins fluorescence-minus-one et non marqués ont été inclus pour chaque panel.
Au moins 1 × 105 événements CD45⁺ ont été acquis pour chaque échantillon. Les événements uniques sur le tracé FSC-A/FSC-H ont d'abord été sélectionnés, suivis des leucocytes CD45⁺ viables (négatifs pour le colorant de viabilité), puis l'exclusion des monocytes-macrophages CD14⁺HLA-DR⁺ a été effectuée afin de sélectionner les granulocytes CD66b⁺ à forte diffusion latérale. Les neutrophiles ont ensuite été définis au sein de la population de granulocytes comme des événements CD15⁺CD16⁺CD11b⁺. Cette première fenêtre de sélection des granulocytes CD66b⁺ a été dessinée de manière large autour de tous les événements à forte diffusion latérale, sans se limiter au contour CD15⁺CD16⁺CD11b⁺, afin que les neutrophiles activés CD16-faible, CD11b-élevé ainsi que d'autres formes de granulocytes moins matures restent inclus dans le décompte automatisé total des neutrophiles ; la définition plus stricte CD15⁺CD16⁺CD11b⁺ n’a été appliquée que pour caractériser la sous-population de neutrophiles matures, rapportée séparément dans les analyses de regroupement ultérieures. Le nombre de neutrophiles dans le LBA (cellules/µL) a été estimé à partir du pourcentage de neutrophiles et du nombre total de cellules nucléées déterminé à l’aide d’un analyseur hématologique automatisé (voir Tableau des matériaux). Les matrices de compensation, la stratégie de sélection et les rapports individuels de contrôle qualité des échantillons ont été archivés, et les analystes sont restés aveugles aux attributions des groupes des participants tout au long de l’acquisition et de l’analyse.
Profilage multiplex des cytokines inflammatoires
Les surnageants de LBA ont été décongelés une seule fois sur de la glace fondante, puis vortexés brièvement et clarifiés par centrifugation à 10 000 × g pendant 5 min à 4 °C juste avant le dosage. La mesure de 13 analytes répartis en trois catégories fonctionnelles a été réalisée à l'aide d'une plateforme d'immunodosage multiplex basée sur des billes, avec un panel personnalisé de billes magnétiques (voir Table des matériels). Le groupe pro-inflammatoire comprenait l'IL-1β, l'IL-6, l'IL-17A et le TNF-α ; le groupe des chimiotactiques comprenait la CXCL8/IL-8, la CXCL1/GRO-α, la CXCL10/IP-10, la CCL2/MCP-1 et la CCL3/MIP-1α ; et le groupe régulateur comprenait l'IL-10, l'IFN-γ, l'IL-1RA et le G-CSF. Le choix des analytes était fondé sur ceux qui sont le plus fréquemment rapportés comme informatifs dans les analyses multiplex de cytokines dans le liquide de lavage broncho-alvéolaire ou le sérum lors d'études sur la pneumonie ou les infections respiratoires sévères.7,11. Le facteur de dilution (1:2 dans le tampon d'analyse) a été déterminé à partir d'une expérience pilote réalisée sur un sous-ensemble représentatif d'échantillons infectés et de témoins afin de s'assurer que >90 % des mesures se situaient à l'intérieur de la courbe standard.
Les courbes standards ont été établies à l'aide de dilutions sérielles à sept points des étalons recombinants fournis par le fabricant, préparées en double sur chaque plaque, y compris un puits témoin pour soustraire le fond. L'ajustement des courbes a été effectué par régression logistique à cinq paramètres (5PL) à l'aide du logiciel propriétaire d'acquisition et d'analyse de l'appareil (voir Tableau des matériaux). La limite inférieure de quantification (LIQ) a été calculée comme la plus faible quantité d'étalon produisant un taux de récupération par réajustement compris entre 80 % et 120 %, ainsi qu'un coefficient de variation (CV) intrarun ≤ 20 %. Les valeurs inférieures à la LIQ ont été remplacées par LIQ/√2. Deux échantillons de contrôle qualité de liquide de lavage bronchoalvéolaire (BALF), chacun provenant d'un patient infecté représentatif et d'un sujet non affecté, ont été aliquotés et ajoutés à chaque plaque afin de suivre la performance à long terme. Les normes d'assurance qualité étaient fondées sur des recommandations issues des meilleures pratiques, dérivées d'un programme d'aptitude plurisite et multiplex sur 12 ans utilisant des billes16, incluant des exigences de CV intra-essai ≤ 10 % dans les puits en double, de CV inter-plaque ≤ 20 % pour le contrôle qualité, et un nombre minimum de billes ≥ 50 par analyte et par puits. Les plaques n'ayant pas satisfait à ces critères ont été refaites. L'analyse a été réalisée en un seul lot dans un délai de quatre semaines, en utilisant un seul lot de kit, avec un mélange aléatoire des échantillons infectés et des témoins.
Pipeline d'analyse de visualisation
Les fichiers au format Flow Cytometry Standard (FCS) ont d'abord été analysés à l'aide d'un logiciel commercial de cytométrie en flux (voir Tableau des matériaux) afin de compenser et de sélectionner les événements uniques vivants CD45⁺, puis exportés pour une analyse sans biais dans R v4.4. Pour chaque échantillon, 10 000 événements CD45⁺ ont été sous-échantillonnés et concaténés, et les intensités de signal ont été transformées à l'aide de la fonction arcsinh avec un coefficient de 150. La réduction de dimension et les projections UMAP ont été réalisées à l'aide du package uwot avec 15 voisins les plus proches et une distance minimale de 0,1, ainsi que des projections t-SNE parallèles utilisant le package Rtsne avec une perplexité de 3010. Les groupes phénotypiques ont été identifiés à l'aide de FlowSOM avec 100 nœuds de cartes auto-organisatrices, puis divisés en 12 à 15 groupes par méta-clustering, en utilisant une approche par optimisation récemment validée pour les données de cytométrie en haute dimension17. Chaque groupe a été annoté en fonction de l'expression médiane des marqueurs d'origine cellulaire et d'activation, puis comparé aux portes définies manuellement.
Pour l'analyse des données multiplex de cytokines, les valeurs brutes ont d'abord été transformées en log₁₀, puis normalisées entre les analytes par calcul de scores z avant toute autre analyse. Les analytes et les patients ont tous deux fait l'objet d'un regroupement hiérarchique utilisant la distance euclidienne et le lien de type Ward.D2 ; les résultats ont été présentés sous forme de carte thermique avec regroupement des lignes et des colonnes. Cette approche a permis de détecter des modules de cytokines coexprimées et de classer des sous-groupes de patients dans des cohortes inflammatoires multiplex9. Des matrices de corrélation ont été générées pour tous les biomarqueurs cellulaires et solubles à l'aide de corrélations de rang de Spearman par paires. Les cartes thermiques des matrices de corrélation ont été tracées en parallèle avec un réseau dans lequel les nœuds correspondent aux biomarqueurs et les arêtes indiquent les corrélations ayant résisté à la correction pour tests multiples selon la méthode de Benjamini–Hochberg (BH). L'épaisseur des arêtes a été ajustée en fonction de l'amplitude du coefficient de corrélation |ρ|, et les arêtes n'ont été incluses que si |ρ| ≥ 0,30 et p < 0,05 après correction. Une analyse en composantes principales (ACP) a été réalisée sur la matrice normalisée contenant les cellules et les cytokines à l'aide de la fonction prcomp() avec mise à l'échelle par variance unitaire. Les participants ont été projetés sur les deux premières composantes principales, avec superposition des groupes d'infection et témoins. Un sous-échantillonnage et une normalisation systématiques de toutes les analyses ont assuré la comparabilité entre les lectures des biomarqueurs cellulaires et solubles dans l'ensemble des visualisations.
Analyse statistique
Les variables continues ont été décrites à l'aide de la médiane (écart interquartile, EI) lorsque leur distribution n'était pas normale selon les tests de Shapiro–Wilk, et de la moyenne (écart-type, ET) dans le cas contraire. Les variables catégorielles ont été décrites à l'aide de fréquences et de proportions. Les comparaisons entre groupes ont été réalisées à l'aide du test de Mann–Whitney U test lorsque les variables continues présentaient des distributions non normales, le test de Welch t-test lorsque les variables continues suivaient une distribution normale, et le test du chi-deux ou le test exact de Fisher selon le cas pour les variables catégorielles. Les associations entre variables continues ont été évaluées à l’aide du coefficient de corrélation de rang de Spearman. Afin de tenir compte du taux de faux positifs (FDR) dans les analyses multiplex de cytokines et les analyses de corrélation, les p-values ont été ajustées selon la méthode de Benjamini–Hochberg avec un seuil de q < 0,05. Bilatéral p < Une valeur de 0,05 a été considérée comme statistiquement significative dans toutes les analyses principales. Dans la mesure du possible, les cas présentant des données manquantes pour des variables individuelles ont été conservés et analysés selon une analyse sur cas complets pour la variable concernée, tandis que des imputations multiples par équations enchaînées (m = 20) ont été réalisées afin d'effectuer des analyses de sensibilité. Des courbes caractéristiques de fonctionnement du récepteur (ROC) et les aires sous la courbe (AUC) correspondantes ont été générées pour chaque cytocine à l’aide du package pROC au sein de la cohorte complète de l’étude ; aucune cohorte externe de validation distincte n’a été utilisée. Des analyses de sensibilité préétablies ont répété les comparaisons principales entre groupes après exclusion des participants ayant reçu des antibiotiques dans les 72 heures précédant la bronchoscopie, puis après stratification du groupe d’infection selon le statut de ventilation mécanique et selon le sous-type de pneumonie (pneumonie communautaire, nosocomiale ou associée à la ventilation). Les analyses ont été réalisées à l’aide des packages rstatix, FlowSOM, uwot, ComplexHeatmap, igraph, pROC et mice dans R v4.4. Les figures ont été générées à l’aide d’un logiciel scientifique commercial de création de graphiques (voir Table des matériels).
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Résultats
Caractéristiques de la population étudiée et de l'échantillon
L'analyse finale a porté sur 112 sujets, dont 64 dans le groupe d'infection et 48 dans le groupe témoin sans infection. Les caractéristiques démographiques de base étaient similaires entre les groupes, tandis que les paramètres de laboratoire liés à l'infection étaient plus élevés dans le groupe d'infection, comme indiqué dans le tableau 1. Les infections étaient principalement causées par des bacté...
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Discussion
La robustesse de ce protocole dépend de quelques décisions prises avant et pendant l'analyse. Fixer le taux de récupération minimal à 40 % et combiner la deuxième aliquote et les suivantes a été une décision délibérée, car la première aliquote contient un enrichissement plus élevé en matériaux des voies respiratoires bronchiques, tandis que le taux de récupération varie systématiquement selon l'âge, le sexe, l'historique de tabagisme et le bronche cible18. Bloquer les récepteurs Fc et titrer les a...
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Déclarations de divulgation
Les auteurs n'ont aucun conflit d'intérêts à déclarer.
Remerciements
Nous remercions sincèrement tous les patients et volontaires ayant participé à cette étude pour leur précieuse coopération. Nous reconnaissons avec gratitude le Comité d'éthique pour l'approbation éthique (n° d'approbation 2026HL-038) et pour son encadrement normatif tout au long du processus de recherche.
Nous remercions le personnel médical du service de pneumologie, du centre de bronchoscopie et du laboratoire clinique pour leur soutien dans la collecte des échantillons cliniques, le traitement des échantillons de lavage bronchoalvéolaire et la détection microbiologique. Nous tenons également à remercier la plateforme technique du laboratoire central de l'hôpital pour son appui dans les expériences de cytométrie en flux en haute dimension et de profilage multiplex de cytokines.
Cette recherche n'a reçu aucune subvention spécifique des agences de financement des secteurs public, commercial ou à but non lucratif.
Nous remercions tous les chercheurs, techniciens et personnel infirmier ayant participé à ce projet pour leurs efforts dans le dépistage des patients, la gestion des échantillons, les opérations expérimentales et l'organisation des données.
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Matériaux
| Nom | Entreprise | Numéro de catalogue | Commentaires |
|---|---|---|---|
| Anticorps anti-CD11b humain, Brilliant Violet 421, clone ICRF44 | BioLegend | Cat. No. 301323 | Marqueur d'activation des neutrophiles ; canal laser violet URL: https://www.biolegend.com |
| Anticorps anti-CD14 humain, APC/Cyanine7, clone M5E2 | BioLegend | Cat. No. 301820 | Marqueur d'exclusion monocyte-macrophage ; canal laser rouge URL: https://www.biolegend.com |
| Anticorps anti-CD15 humain, PE, clone HI98 | BioLegend | Cat. No. 301906 | Marqueur de lignée des neutrophiles ; canal laser bleu URL: https://www.biolegend.com |
| Anticorps anti-CD16 humain, Brilliant Violet 510, clone 3G8 | BioLegend | Cat. No. 302048 | Marqueur de maturation des neutrophiles et des cellules NK ; canal laser violet URL: https://www.biolegend.com |
| Anticorps anti-CD45 humain, PerCP, clone HI30 | BioLegend | Cat. No. 304026 / RRID: AB_893338 | Marqueur pan-leucocytaire ; canal laser bleu URL: https://antibodyregistry.org/AB_893338 |
| Anticorps anti-CD66b humain, FITC, clone G10F5 | BioLegend | Cat. No. 305103 | Marqueur des granulocytes ; canal laser bleu URL: https://www.biolegend.com |
| Anticorps anti-HLA-DR humain, PerCP/Cyanine5.5, clone L243 | BioLegend | Cat. No. 307629 | Marqueur des cellules présentatrices d'antigènes ; canal laser bleu URL: https://www.biolegend.com |
| Analyseur automatisé d'hématologie (Sysmex XN-1000) | Sysmex Corporation | Instrument (modèle XN-1000) | Utilisé pour déterminer le nombre total de cellules nucléées afin de calculer le nombre absolu de neutrophiles URL: https://www.sysmex.com |
| Albumine sérique de bovin | Sigma-Aldrich (MilliporeSigma) | Cat. No. A7906 | Utilisée dans le tampon de marquage en cytométrie en flux (0,5 % p/v dans le PBS avec 2 mM EDTA) URL: https://www.sigmaaldrich.com/US/en/product/sigma/a7906 |
| Pack ComplexHeatmap (R/Bioconductor) | Projet Bioconductor | v2.20 (open-source) | Utilisé pour les cartes thermiques de regroupement hiérarchique des données multiplex de cytokines URL: https://bioconductor.org/packages/ComplexHeatmap |
| Cytocentrifugeuse (Cytospin 4) | Thermo Fisher Scientific | Cat. No. A78300003 | Utilisée pour préparer des lames de cytologie à partir de la suspension cellulaire de LBA URL: https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/A78300003 |
| Solution de lyse des érythrocytes (BD FACS Lysing Solution, concentré 10X) | BD Biosciences | Cat. No. 349202 | Utilisée pour la lyse des érythrocytes après marquage de surface URL: https://www.bdbiosciences.com |
| Acide éthylènediaminotétraacétique (EDTA), 0,5 M pH 8,0 | Thermo Fisher Scientific (Invitrogen) | Cat. No. AM9260G | Utilisé dans le tampon de marquage en cytométrie en flux à 2 mM URL: https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/AM9260G |
| Colorant vital fixable (Zombie NIR Fixable Viability Kit) | BioLegend | Cat. No. 423105 | Exclusion vivant-mort avant le traçage ; canal laser rouge URL: https://www.biolegend.com |
| Endoscope vidéo souple | Olympus Corporation (BF-1TQ290) | Instrument (modèle BF-1TQ290) | Utilisé pour le LBA sous sédation modérée URL: https://www.olympus-global.com |
| Cytomètre en flux multicolore (CytoFLEX LX) | Beckman Coulter Life Sciences | Instrument (modèle CytoFLEX LX, configuration à six lasers) | Utilisé pour l'acquisition du panel à sept marqueurs pour les neutrophiles/monocytes en cytométrie en flux URL: https://www.beckman.com |
| Logiciel d'analyse en cytométrie en flux (FlowJo) | BD Biosciences (FlowJo LLC) | v10.10 | Utilisé pour la compensation et le traçage manuel des fichiers FCS URL: https://www.flowjo.com |
| Pack FlowSOM (R/Bioconductor) | Projet Bioconductor | v2.12 (open-source) | Utilisé pour le regroupement par carte auto-organisatrice et le méta-regroupement des données de cytométrie en flux URL: https://bioconductor.org/packages/FlowSOM |
| GraphPad Prism (logiciel de représentation statistique) | GraphPad Software (Dotmatics) | v10 | Utilisé pour générer les figures finales URL: https://www.graphpad.com |
| Réactif de blocage des récepteurs Fc humains (Human TruStain FcX) | BioLegend | Cat. No. 422301 / RRID: AB_2818986 | Blocage des récepteurs Fc avant le marquage par anticorps URL: https://antibodyregistry.org/AB_2818986 |
| Pack igraph (R) | CRAN | v2.0 (open-source) | Utilisé pour construire et visualiser le graphe du réseau de corrélation URL: https://cran.r-project.org/package=igraph |
| Flacons cryogéniques à faible liaison protéique, 2,0 mL | Thermo Fisher Scientific (Nunc) | Cat. No. 375418 | Utilisés pour les aliquots de surnageant de LBA destinés à l'analyse des cytokines URL: https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/375418 |
| Plateforme d'immunodosage multiplex à billes magnétiques (MAGPIX) | Luminex Corporation (DiaSorin) | Instrument (modèle MAGPIX) | Utilisée pour l'acquisition du dosage multiplex des cytokines URL: https://www.luminexcorp.com |
| Solution de coloration May-Grünwald-Giemsa | Sigma-Aldrich (MilliporeSigma) | Cat. No. GS500 | Utilisée pour le décompte différentiel des cellules sur cytospin URL: https://www.sigmaaldrich.com/US/en/product/sigma/gs500 |
| Pack mice (R) | CRAN | v3.16 (open-source) | Utilisé pour l'imputation multiple par équations enchaînées dans l'analyse de sensibilité URL: https://cran.r-project.org/package=mice |
| Panier multiplex de billes magnétiques pour cytokines/chimiokines (13-plex, personnalisé ; MILLIPLEX MAP Human Cytokine/Chemokine) | Merck / MilliporeSigma | Cat. No. HCYTOMAG-60K | Panier personnalisé mesurant les 13 analytes décrits à la section 2.4 URL: https://www.merckmillipore.com |
| Filtre en maille de nylon, 70 µm | Corning (Falcon) | Cat. No. 352350 | Utilisé pour la filtration mécanique du LBA afin d'éliminer les grumeaux de mucus URL: https://www.corning.com |
| Solution tampon phosphate (PBS), pH 7,4 | Thermo Fisher Scientific (Gibco) | Cat. No. 10010023 | Tampon de base pour la resuspension et le marquage des cellules URL: https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/10010023 |
| Pack pROC (R) | CRAN | v1.18 (open-source) | Utilisé pour générer les courbes ROC et les valeurs AUC URL: https://cran.r-project.org/package=pROC |
| R (environnement de calcul statistique) | Équipe R Core | v4.4 (open-source) | Plateforme pour les analyses statistiques et la visualisation URL: https://www.r-project.org |
| Pack rstatix (R) | CRAN | v0.7 (open-source) | Utilisé pour les comparaisons de groupes et les statistiques de corrélation URL: https://cran.r-project.org/package=rstatix |
| Pack Rtsne (R) | CRAN | v0.17 (open-source) | Utilisé pour les projections t-SNE URL: https://cran.r-project.org/package=Rtsne |
| Billes de compensation monocolorées (UltraComp eBeads Compensation Beads) | Thermo Fisher Scientific (Invitrogen) | Cat. No. 01-2222-42 | Utilisées comme témoins de compensation monocanal URL: https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/01-2222-42 |
| Solution de chlorure de sodium pour injection, 0,9 % (sérum physiologique stérile) | Baxter International | Cat. No. 2B1324 | Utilisée pour l'instillation en LBA (100–150 mL, aliquots de 20–40 mL à 37 °C) URL: https://www.baxter.com |
| Pack uwot (R) | CRAN | v0.2 (open-source) | Utilisé pour la réduction de dimensionnalité UMAP URL: https://cran.r-project.org/package=uwot |
| xPONENT (logiciel d'acquisition et d'ajustement de courbe pour dosage multiplex) | Luminex Corporation (DiaSorin) | v4.3 | Logiciel propriétaire de l'instrument pour l'ajustement de courbe standard à 5PL URL: https://www.luminexcorp.com |
Références
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