Collecte volontaire d’échantillons fécaux compatibles en groupe chez la souris à l’aide d’un système de cage sur mesure

Résumé

Ce protocole décrit un système de cage personnalisé pour la collecte volontaire, favorable au bien-être sociale, simultanée et individuelle d’échantillons fécaux provenant de souris hébergées en groupe.

Résumé

La mesure fiable des métabolites fécaux de la corticostérone nécessite des échantillons fécaux pouvant être attribués à des animaux individuels et prélevés dans un délai défini. Cela est difficile chez les souris hébergées en groupe, où les échantillons regroupés en cage ne permettent pas d’assigner individuellement, et la séparation temporaire peut interférer avec le bien-être animal et les résultats de l’étude. L’objectif de ce protocole est de présenter un système de cage simple et peu coûteux permettant la collecte volontaire, simultanée et individuelle d’échantillons fécaux sur des souris hébergées en groupe. Le système se compose d’une cage domestique en polycarbonate à dessus de fil métallique reliée à trois boîtes de collecte individuelles. Après habituation et entraînement, les souris entrent volontairement dans les boîtes pour obtenir une petite récompense alimentaire. Les portes peuvent alors être fermées sans poursuite, manipulation ou transfert forcé. Les granulés fécaux sont prélevés séparément dans chaque boîte, permettant d’attribuer des échantillons à des animaux individuels tout en maintenant un logement social en dehors de la période d’échantillonnage. Ce protocole permet l’échantillonnage longitudinal non invasif et convient aux études mesurant les métabolites de corticostérone fécale ou d’autres biomarqueurs fécals. Le design est facile à construire avec un matériau standard pour cage et du verre acrylique, peut être démonté pour nettoyage, et permet d’échantillonner plusieurs cages en parallèle. En réduisant les perturbations liées à la manipulation et en améliorant la standardisation de la fenêtre d’échantillonnage, la méthode apporte un raffinement pratique pour la surveillance endocrinienne chez les souris hébergées en groupe.

Introduction

Un défi majeur dans l’évaluation des concentrations plasmatiques de corticostérone est que la procédure d’échantillonnage elle-même peut induire une augmentation aiguë de la corticostérone, ce qui perturbe la mesure et peut potentiellement affecter l’interprétation des résultats de ^{l’étude 1,2,3}. La mesure des métabolites fécaux de la corticostérone (FCM) constitue une alternative non invasive, car les concentrations de FCM reflètent les niveaux circulants de glucocorticoïdes plusieurs heures avant l’échantillonnage, selon l’espèce, la souche, le sexe et le temps de passage intestinal ^4,5. Cependant, une analyse fiable de la gestion des fréquences de la fréquence des corps chez les souris hébergées en groupe reste un défi. Les échantillons fécaux collectés dans la cage ne peuvent pas être attribués à des animaux individuels et peuvent présenter une grande variabilité due aux différences interindividuelles de sécrétion de glucocorticoïdes et à l’incertitude dans la fenêtre d’échantillonnage exacte. Séparer les animaux pendant de longues périodes peut interférer avec les objectifs de l’étude, tandis que la séparation à court terme pour la collecte individuelle d’échantillons est laborieux, limite le débit et peut elle-même induire un stress².

Pour permettre la collecte individuelle d’échantillons fécaux sur des souris hébergées en groupe avec une manipulation minimale, une cage de collecte fécale sur mesure a été développée (Figure 1A-E). Le design a été adapté d’une cage de collecte fécale précédemment décrite pour souris^{épineuses 6} et modifié pour une utilisation avec des souris de laboratoire. Le système se compose d’une cage standard en polycarbonate de type III reliée à trois boîtes de collecte individuelles, auxquelles les animaux peuvent accéder volontairement et fermer à l’aide de portes coulissantes. Cette configuration permet de prélever des échantillons fécaux sur des souris individuelles sans manipulation directe pendant la période d’échantillonnage et permet un échantillonnage simultané de plusieurs animaux. La cage offre donc une approche pratique pour l’échantillonnage FCM non invasif, attribuable individuellement, chez les souris hébergées en groupe.

Le protocole suivant décrit un système d’échantillonnage fécal permettant la collecte et l’identification d’échantillons fécaux sur des souris individuelles tout en maintenant un environnement de logement collectif, en utilisant des cages sur mesure pour le prélèvement sans contact des excréments.

Protocole

Le comité d’éthique animale responsable de l’Université médicale de Vienne a été consulté avant la réalisation de l’étude et a indiqué qu’aucune licence formelle d’expérimentation animale n’était requise ; par conséquent, aucun numéro d’approbation ou de protocole n’est disponible. L’étude a porté uniquement sur des pratiques établies de reproduction et d’élevage, ainsi que la collecte d’échantillons fécales non invasifs. Aucune intervention invasive n’a été réalisée. Conformément à la directive 2010/63/UE, la charge attendue pour les animaux a été évaluée comme étant inférieure au seuil de douleur, souffrance, détresse ou préjudice durable équivalent ou supérieur à celui causé par l’introduction d’une aiguille, conformément aux bonnes pratiques vétérinaires. Tous les animaux étaient hébergés et pris en charge selon les normes institutionnelles de bien-être animal.

1. Construction des cages (voir liste des matériaux)

1. Découpez les pièces 1 à 4 à partir de plexiglas de 5 mm/verre acrylique selon les modèles illustrés à la Figure 2A-C.
   REMARQUE : Les modèles avec des dimensions exactes peuvent être imprimés au format DIN A3 (Figure 1 et Figure 2 supplémentaires).
2. Coupez le fond de la cage en polycarbonate type II (PTII) comme indiqué dans la Figure 2D. Cette partie servira plus tard de couverture supérieure des boîtes de collecte fécale.
3. Perçez les trous et les fentes dans l’ancien fond de la cage PTII comme indiqué à la Figure 2D.
   REMARQUE : Les dimensions exactes sont fournies dans la Figure 3 supplémentaire.
4. Percez des trous dans le côté avant et le côté court de la cage PTIII comme indiqué à la Figure 2E.
   REMARQUE : Les dimensions exactes sont fournies dans la Figure 4 supplémentaire.
5. Utilisez la partie 2 comme gabarit pour marquer les trous de forage correspondants sur le côté court de la cage PTIII et sur le côté long de la cage PTII.
6. Perçez les trous marqués et fixez la cage PTIII, la cage PTII et la partie 2 à l’aide des vis filetées, comme montré à la Figure 2F.
7. Insérez la partie 1 au fond de la cage PTII. Positionnez les parties 4a et 4b de façon à ce qu’elles maintiennent la partie 1 en place et divisez la cage d’échantillonnage en boîtes de collecte séparées. Utilisez le pistolet à colle chaude pour les fixer en place.
8. Glissez les protubérances inférieures des parties 4a et 4b dans les fentes de la partie 1. Ces protubérances forment les pieds des boîtes de collecte.
9. Faites glisser les protubérances supérieures des parties 4a et 4b à travers le couvercle supérieur, l’ancien bas de la cage PTII, pour la maintenir en place.
10. Faites passer les baguettes ou tiges en bois à travers les trous des protubérances, en utilisant une tige en haut et deux en bas, pour stabiliser et fixer la construction.
    REMARQUE : Les matériaux en bois ne doivent être utilisés dans le vivarium que s’ils sont jetables, car ils ne sont pas nettoyables. Si ce n’est pas le cas, il faut utiliser des tiges de composition alternative.
11. Combler les espaces restants ou les petites imprécisions à l’aide d’un pistolet à colle chaude. Utilisez les pièces 3a, 3b et 3c (Figure 2B) comme portes coulissantes entre la cage de la maison et les boîtes de collecte.
    REMARQUE : Veillez à ce qu’aucun bord tranchant, résidu de colle ou matériau saillant ne reste accessible aux animaux. Les composants en verre acrylique/plexiglas utilisés dans ce prototype ne conviennent pas à la stérilisation à la vapeur par autoclave. Par conséquent, si le système est utilisé dans des installations SPF nécessitant du matériel stérilisé lié à la cage, soit une procédure de désinfection non autoclave approuvée par l’institution devrait être utilisée, soit les composants acryliques doivent être remplacés par un matériau autoclavable tout en conservant les mêmes dimensions.

2. Préparation et hébergement des animaux

1. Obtenez le nombre requis de souris de la ou des souches appropriées pour l’étude.
   REMARQUE : Les données représentatives ont été obtenues auprès de 30 souris C57BL/6J âgées de huit semaines, comprenant 20 femelles et 10 mâles. Les souris étaient exemptes de pathogènes spécifiques selon les normes FELASA et ont été obtenues auprès des laboratoires Charles River à Sulzfeld, Allemagne.
2. Animaux d’intérieur dans des conditions conventionnelles dans des cages adaptées en polycarbonate de type III avec un maximum de trois souris adultes par cage.
   REMARQUE : Les mâles séparés ont été hébergés dans des cages standard en polycarbonate de type II pour cette étude.
3. Maintenez la pièce des animaux à 22 ± 2 °C et 55 ± 10 % d’humidité relative sous un cycle clair/obscur de 12 heures avec la lumière allumée à 6h00.
4. Fournissez un régime d’entretien standard et de l’eau à volonté immédiate.
5. Ajoutez de la literie en bois de tremble, un papier toilette en papier, une maison en plastique transparent rouge et des essuie-tout comme matériau de nidification dans chaque cage.
6. Identifiez les souris principalement par des marques naturelles sur la queue. Appliquez temporairement des marques de parc sur les animaux ayant des marques similaires sur la queue lors de la pesée, si nécessaire.

3. Habituation et entraînement des animaux

REMARQUE : La cage achevée se compose d’une cage domestique, PTIII, reliée à une cage d’échantillonnage avec trois boîtes de collecte distinctes, PTII. Les cages domestiques peuvent être utilisées comme des cages conventionnelles, avec de la literie, un enrichissement de cage, un couvercle en fil de fer sans attaches externes, et fournissent nourriture et eau. Le système peut être démonté pour le lavage et ne peut être utilisé que pendant les semaines de prélèvement. Pendant les semaines sans échantillonnage, les animaux peuvent être hébergés dans des cages PTIII standard.

1. Placez les animaux dans le système de cage au moins deux semaines avant la première séance d’échantillonnage prévue.
2. Habituez les animaux aux caisses de collecte en retirant les portes coulissantes pendant une nuit, leur permettant ainsi d’explorer librement les boîtes.
3. Effectuez trois séances d’entraînement avant la première séance d’échantillonnage. Mener la formation dans les mêmes conditions de lumière et à la même heure de la journée, prévue pour un prélèvement ultérieur, idéalement sous feu rouge peu après le début de la phase sombre.
4. Appliquez une petite quantité de récompense, comme de la crème de noisette, du beurre de cacahuète, de la pâte de malt ou un aliment similaire au goût, sur le mur en face de l’entrée de chaque boîte de collecte.
5. Le premier jour d’entraînement, laissez les portes ouvertes et laissez les animaux découvrir et consommer la récompense volontairement.
6. Le deuxième jour d’entraînement, attendez qu’un animal entre dans une boîte de collecte et commence à lécher la récompense. Fermez soigneusement la porte coulissante derrière l’animal et relâchez-la après 10 minutes.
7. Le troisième jour d’entraînement, répétez la procédure et prolongez progressivement le temps que les animaux restent dans les caisses de collecte.
   REMARQUE : L’entraînement doit être calme et régulier. Évitez de poursuivre les animaux dans les boîtes, car cela peut augmenter le stress et réduire la participation volontaire aux séances d’échantillonnage ultérieures.

4. Collecte d’échantillons fécaux

1. Calendrier de la collecte des échantillons
   1. Planifiez le temps d’échantillonnage en fonction de la question biologique et du délai attendu entre l’excrétion de la corticostérone plasmatique et du métabolite de la corticostérone fécale. Chez la souris, les métabolites de la corticostérone fécale reflètent généralement les niveaux de glucocorticoïdes circulants environ 8 à 10 heures avant l’échantillonnage.
      REMARQUE : Si le timing précis est critique, réalisez une étude pilote pour déterminer le cours temporel de l’excrétion de la MCF dans la souche, le sexe et les conditions expérimentales spécifiques utilisées. Ce pilote peut être combiné avec les séances de formation.
   2. Prélève un prélèvement programmé pendant une période de forte production fécale. L’échantillonnage est généralement le plus efficace au début de la phase sombre et active.
   3. Effectuer toutes les séances d’échantillonnage à la même heure de la journée tout au long de l’étude afin de réduire la variation causée par le rythme diurne des niveaux de FCM.
      REMARQUE : D’après notre expérience, les événements survenant le matin vers 10h00 sont bien pris en compte lorsque le prélèvement est programmé entre 18h00 et 20h00, selon le planning de lumière de la salle des animaux.
2. Procédure d’échantillonnage et conseils pratiques
   1. Marquez les animaux individuellement avant de les prélever. Utilisez des marques d’oreilles ou des marques individuelles sur la queue.
      REMARQUE : Les marques des orteils et les codes couleur peuvent être difficiles à reconnaître à l’intérieur des boîtes sous lumière rouge.
   2. Préparez les boîtes de collecte pendant la phase de lumière en appliquant la récompense sur le mur du fond de chaque boîte.
      REMARQUE : Préparer les boîtes pendant la journée améliore la visibilité pour l’expérimentateur et permet aux animaux de sentir la récompense avant de prélever.
   3. Au moment prévu pour le prélèvement, ouvrez les boîtes de collecte et attendez que les animaux entrent volontairement.
   4. Une fois qu’une souris est entrée dans une boîte de collecte, fermez soigneusement la porte coulissante derrière elle.
   5. Après que tous les animaux ont été entrés dans une boîte, notez l’identité et la position de chaque souris dans une feuille d’échantillonnage préparée.
   6. Si plus de 10 cages sont échantillonnées lors d’une session, impliquez un second expérimentateur pour soutenir l’identification animale, la manipulation des portes et la documentation.
   7. Gardez les animaux dans les caisses de collecte pendant la durée prévue de l’échantillonnage, généralement de 30 minutes à 2 heures, selon la production fécale prévue et le plan de l’étude.
      REMARQUE : Excluez les échantillons si l’identité individuelle ne peut pas être attribuée avec certitude, si les granulés fécaux sont contaminés par de l’urine, de la litière ou des excréments d’un autre animal, si la durée de l’échantillonnage dévie considérablement de la fenêtre de temps prévue, ou si la quantité de matières fécales est insuffisante pour une analyse de la FCM.
      REMARQUE : L’utilisation de 50 mg est notre protocole standard, et cette quantité a été utilisée dans toutes les validations et tous les autres articles ^5,7,8. Normalement, il est facile d’obtenir.
   8. À la fin de la période d’échantillonnage, ouvrez les portes coulissantes et laissez les souris retourner dans la cage de la maison.
   9. Fermez les boîtes de collecte immédiatement après le départ des souris pour éviter la rentrée et la contamination croisée des échantillons.
   10. Retirez les granulés fécaux de chaque boîte de collecte à l’aide de longues pinces et transférez-les dans des tubes de collecte étiquetés individuellement.
   11. Conservez les échantillons à -20 °C jusqu’à la préparation supplémentaire du test FCM.
       REMARQUE : Si les boîtes sont bien fermées et ne peuvent pas être rentrées par les souris, la collecte des granulés fécaux peut être reportée jusqu’à la phase de lumière suivante. Cependant, cela doit être fait de manière cohérente dans une étude.
   12. Gardez les animaux dans la partie cage de la maison (PTIII) jusqu’au prochain changement de cage. Ensuite, ils peuvent être démontés et lavés dans une rondelle en cage classique.

Résultats

Les métabolites de corticostérone fécale (MFC) ont été quantifiés avec succès à partir d’échantillons collectés dans des cages d’échantillonnage fécales personnalisées lors d’une étude longitudinale comparant des souris reproduites de façon permanente et intermittente. L’analyse représentative de la MCF comprenait 30 animaux : groupe de reproduction permanente, n = 15 animaux dans 5 cages ; groupe de reproduction intermittente, n = 10 animaux dans 5 cages, avec 5 mâles hébergés seuls sauf lors de 3 épreuves de reproduction, où ils étaient cologés avec les femelles. Des échantillons ont été prélevés à 19 heures toutes les deux semaines, les jours de changement de cage ainsi que les week-ends. Le temps moyen avant que la plupart des animaux entrent dans la boîte était de 7,5 min (DS = 3,07), la plupart des animaux représentant une moyenne de 27,6 (DS = 1,44) et 30 souris au total. Toutes les souris étaient entrées dans la boîte après une moyenne de 11,69 min (SD = 3,29). La durée moyenne de confinement pour toutes les souris était de 24,56 min (DS = 15,51), et le temps moyen entre la première souris entrant dans la boîte et le début de la libération était de 43,14 min (SD = 8,51). La durée moyenne de la libération était de 14,86 min (DS = 22,82), et la durée moyenne de l’ensemble de la procédure était de 68,00 min (DS = 11,87). Sur 19 échantillons (3 essais + 16 réguliers), en attendant 480 échantillons, deux échantillons manquaient car les souris ne déféquaient pas pendant le confinement, trois échantillons n’ont pas pu être prélevés car les souris étaient soit très enceintes, soit peu après la naissance, et 5 souris nécessitaient un soutien doux pour entrer. Le poids moyen des échantillons prélevés lors des trois premiers échantillonnages était de 51,16 mg (DE = 25,39). Parmi tous les échantillons collectés (475), 473 ont pu être analysés et ont donné des résultats.

Les animaux individuels étaient considérés comme des répliques biologiques. Les échantillons fécaux répétés prélevés sur les mêmes animaux au cours de la période de huit semaines ont été traités comme des mesures longitudinales répétées et non comme des répliques biologiques indépendantes. L’analyse a été réalisée à l’aide d’un modèle linéaire à effets mixtes avec le sexe, le groupe d’élevage, le jour de l’échantillonnage et le nombre de souris par cage comme effets fixes, et la cage comme interception aléatoire. Les interactions entre le sexe, le groupe de reproduction et le jour de l’échantillonnage ont été incluses dans le modèle. Le nombre de souris par cage a été inclus comme effet fixe supplémentaire mais n’a pas été testé en termes d’interaction, car cette variable était en partie confondue avec le plan expérimental, en particulier chez les mâles reproduits par intermittence.

Le modèle a montré un effet clair du sexe sur les concentrations de FCM (Figure 3A-D). Les femelles présentaient des concentrations de FCM plus élevées que les mâles à travers les conditions de reproduction et les jours d’échantillonnage, estimation = 28,30, SE = 2,58, t = 10,98, P < 0,0001. Des comparaisons post-hoc ont confirmé cette différence entre les sexes au sein des deux groupes de reproduction et lors des deux jours d’échantillonnage. Chez les animaux reproduits en permanence, les femelles présentaient des concentrations de MCC plus élevées que les mâles le dimanche, estimation = 53,41, SE = 8,28, P < 0,0001, et le mercredi, estimation = 55,27, SE = 8,37, P < 0,0001. Le même schéma a été observé chez les animaux élevés de façon intermittente le dimanche, estimation = 58,04, SE = 12,00, P < 0,0001, et le mercredi, estimation = 59,68, SE = 9,88, P < 0,0001.

Le modèle a également indiqué un effet principal significatif du groupe de reproduction, estimation = 11,59, SE = 4,65, t = 2,49, P = 0,0227. Cependant, les comparaisons post-hoc ajustées par Tukey n’ont pas révélé de différences significatives entre les animaux reproduits de façon permanente et intermittente au sein des combinaisons individuelles sexe/jour. Chez les femelles, les animaux reproduits de façon permanente et intermittente ne différaient pas significativement le dimanche, estimation = 24,51, SE = 12,20, P = 0,2085, ou le mercredi, estimation = 17,31, SE = 12,20, P = 0,4950. De même, chez les mâles, aucune différence significative entre les groupes de reproduction n’a été détectée le dimanche, estimation = 29,14, SE = 14,00, P = 0,1708, ou le mercredi, estimation = 21,72, SE = 13,30, P = 0,3682. L’effet principal significatif du groupe reproducteur doit donc être interprété comme un effet global au niveau du modèle, tandis que les comparaisons post-hoc ajustées par Tukey plus spécifiques au sein du sexe et du jour d’échantillonnage n’ont pas identifié de différence robuste par groupes.

L’absence d’une différence significative entre les mâles dans le groupe de reproduction est particulièrement importante, car les mâles étaient toujours en logement unique le dimanche. Ainsi, la comparaison du dimanche chez les mâles montre que la méthode d’échantillonnage elle-même n’augmente pas les concentrations de FCM, du moins chez les souris mâles. Les cages d’échantillonnage fécal ont également été utilisées pour une autre étude comparant les MCC chez des souris sentinelles en litière souillée par rapport aux^{témoins 9}.

Figure 1 : Aperçu de la cage d’échantillonnage fécal sur mesure. Le système de cage permet de prélever des échantillons fécaux sur des souris individuelles logées dans une cage collective sans manipulation directe lors de l’échantillonnage. (A) Système de cage entièrement assemblé composé d’une cage domestique et d’une cage d’échantillonnage fécal attachée. (B) Vue latérale de la cage d’échantillonnage attachée. (C) Vue du dessus montrant les trois entrées distinctes des boîtes de collecte individuelles. (D) Vue depuis l’intérieur de la cage de la maison vers les entrées des boîtes d’échantillonnage. (E) Ouverture de la cage d’échantillonnage, permettant l’accès aux caisses de collecte pour l’élimination et le nettoyage des granulés fécals. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figurine.

Figure 2 : Plan de construction et assemblage de la cage d’échantillonnage fécal. (A-C) Des pièces en verre acrylique sont utilisées pour construire le sol, les murs latéraux, les portes coulissantes et les séparateurs de la cage d’échantillonnage. (D) Modification de la cage en polycarbonate de type II en retirant le fond et en perçant des trous et des fentes pour le couvercle de la boîte de collecte. (E) Modification de la cage de maison en polycarbonate type III en perçant trois trous d’entrée dans la façade avant. (F) Vue latérale schématique du système de cage assemblé, montrant la cage domestique en polycarbonate type III reliée à la cage d’échantillonnage modifiée en polycarbonate type II et le positionnement des parties 1, 2 et 4. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figurine.

Figure 3 : Données représentatives de la FCM obtenues après la collecte d’échantillons fécales à l’aide d’une cage sur mesure. Les métabolites fécaux de la corticostérone (MCF) ont été mesurés dans des échantillons fécaux prélevés individuellement sur des souris hébergées en groupe à l’aide d’une cage d’échantillonnage fécale personnalisée. Les valeurs sont indiquées sur huit points d’échantillonnage hebdomadaires pour les souris créées de façon permanente et intermittente. Les échantillons ont été prélevés soit les jours de changement de cage, soit le week-end. Les points et les lignes de connexion représentent des moyennes de groupe à chaque point temporel. Les barres d’erreur et les rubans ombrés indiquent la moyenne ± l’écart-type (DE). (A) Femelles échantillonnées les jours de changement de cage. (B) Les femelles échantillonnées le week-end. (C) Mâles échantillonnés les jours de changement de cage. (D) Les mâles ont pris des échantillons le week-end. La figure illustre que la méthode a produit des concentrations mesurables de FCM à travers tous les groupes et tous les moments temporels. Les femelles présentaient généralement des concentrations de MCF plus élevées que les mâles, tandis que les différences entre les groupes reproducteurs étaient moins constantes. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figurine.

Figure supplémentaire 1 : Modèles pour les composants en verre acrylique 1 à 3. Modèles pour découper les parties 1, 2 et 3a-c en verre acrylique/plexiglas de 5 mm pour la construction de la cage d’échantillonnage fécal. La partie 1 sert d’insert inférieur de la cage en polycarbonate modifié de type II. La partie 2 sert à relier la cage en polycarbonate de type III à celle en polycarbonate de type II et à marquer les trous de forage correspondants. Les parties 3a-c forment des séparateurs internes/éléments structurels du système de collecte. Les marquages circulaires blancs indiquent les trous d’air, et les plus petits indiquent les trous de vis. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.

Figure supplémentaire 2 : Modèles pour les composants 4a et 4b en verre acrylique. Modèles pour découper les pièces 4a et 4b en verre acrylique/plexiglas de 5 mm. Ces parties sont insérées dans la Partie 1 pour maintenir l’insert du fond en place et diviser la cage d’échantillonnage en boîtes de collecte fécale séparées. Les protubérances inférieures forment les pieds des boîtes de collecte, tandis que les protubérances supérieures traversent le couvercle supérieur et sont fixées par des tiges en bois ou des baguettes pour stabiliser la construction. Des cercles blancs indiquent les ouvertures des tiges ou des trous d’air. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.

Figure 3 complémentaire : Modification de la cage en polycarbonate de type II. Modèle schématique pour modifier la cage en polycarbonate de type II. Le bas de la cage est coupé comme indiqué et utilisé plus tard comme couvercle supérieur des caisses de collecte fécale. Des trous et des fentes sont percés dans la partie inférieure retirée pour permettre l’insertion et la fixation des parties 4a et 4b. Des trous de vis sont utilisés pour fixer la cage en polycarbonate type II, la cage en polycarbonate type III et la Partie 2. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.

Figure 4 complémentaire : Modification de la façade de la cage en polycarbonate de type III. Modèle schéma pour percer la face avant de la cage en polycarbonate de type III. Trois ouvertures circulaires sont percées dans le côté court de la cage pour permettre l’accès entre la cage domestique et la cage d’échantillonnage fécal. Des trous de vis supplémentaires sont utilisés pour la fixation à la Partie 2 et à la cage en polycarbonate type II. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.

Discussion

Ce protocole décrit un système simple de cage pour prélever des échantillons fécaux assignables individuellement sur des souris hébergées en groupe. Le principal avantage de la méthode est qu’elle combine l’attribution individuelle d’échantillons avec le maintien des aspects clés du logement social, en particulier le contact visuel et olfactif avec les compagnons de cage. Cela est pertinent car le logement collectif est souvent nécessaire pour le bien-être animal et peut également faire partie du plan^{expérimental 10}. Contrairement à l’échantillonnage en cage maison en groupe, le système permet d’attribuer des valeurs de FCM à des animaux individuels, tout en évitant un hébergement prolongé avant ou pendant la collecte de l’échantillon.

Les approches couramment utilisées pour la collecte d’échantillons fécaux chez les souris de laboratoire incluent le prélèvement en cage maison en groupe, l’hébergement temporaire individuel dans des cages propres, les cages métaboliques et la collecte directe après manipulation ou transfert. Les échantillons en cage maison en pool sont faciles à obtenir, non invasifs, peu coûteux et compatibles avec l’échantillonnage parallèle de nombreuses cages, mais ils n’autorisent pas l’attribution individuelle chez les animaux hébergés en groupe. Un hébergement temporaire individuel ou un transfert dans des cages propres permet une attribution individuelle d’échantillons, mais éloigne les animaux de leur groupe social et peut entraîner un stress aigu dû à la manipulation, à la nouveauté ou à la séparation sociale. Cela est particulièrement pertinent pour l’analyse de la gestion de la fréquence des données (FCM), car les mesures liées à la corticostérone sont sensibles au stress causé par la procédure d’échantillonnage^{elle-même 11}. Les cages métaboliques permettent une collecte contrôlée d’échantillons et permettent la séparation des excréments et de l’urine, mais nécessitent un équipement spécialisé, sont moins compatibles avec l’entretien routinier et impliquent généralement un hébergement individuel. La collecte basée sur la manipulation directe peut également fournir des échantillons attribuables individuellement, mais nécessite une manipulation ou une manipulation répétée des animaux et peut donc affecter les lectures liées au stress.

Comparé à ces approches existantes, le système actuel a été conçu comme un raffinement compatible avec le logement collectif pour un échantillonnage fécal individuel répété et non invasif. Après habituation et entraînement, les souris entrent volontairement dans les boîtes d’échantillonnage en réponse à une petite récompense alimentaire. Les échantillons peuvent donc être collectés sans être poursuivis, manipulés ou forcés à être transférés dans une cage séparée. Le système ne doit pas être interprété comme ayant prouvé qu’il améliore le bien-être ou réduit le stress au sens strict expérimental, car les mesures directes de bien-être n’ont pas été incluses dans la présente étude. Cependant, elle a été conçue pour réduire le degré de séparation sociale lors de la collecte d’échantillons et peut donc être moins perturbatrice que les méthodes individuelles conventionnelles. De plus, plusieurs animaux et plusieurs cages peuvent être échantillonnés en parallèle, aidant à standardiser la fenêtre d’échantillonnage, ce qui est important car les concentrations de FCM dépendent du rythme circadien et reflètent la sécrétion de glucocorticoïdes plusieurs heures avant^{l’échantillonnage 5,12}.

Les résultats représentatifs démontrent que le système est adapté à la collecte d’échantillons fécaux pouvant être analysés pour les concentrations de FCM. Des concentrations mesurables de FCM ont été obtenues entre groupes et moments donnés, et la méthode a détecté la différence claire attendue entre les sexes, avec des concentrations de FCM plus élevées chez les femmes que chez les hommes. L’étude comprenait également une comparaison interne avec des logements individuels conventionnels chez les hommes. Le dimanche, les mâles du groupe de reproduction intermittente étaient en maison individuelle, tandis que les mâles de reproduction permanente étaient échantillonnés selon le système de collecte nouvellement développé. Les concentrations de FCM n’ont pas différé significativement entre ces groupes le dimanche. Cela suggère que l’entrée volontaire dans la cage d’échantillonnage et le séjour à court terme dans la caisse de collecte n’ont pas augmenté de manière significative les concentrations de FCM par rapport à la collecte conventionnelle dans un seul boîtier. Néanmoins, cette comparaison était limitée aux hommes et n’a pas été conçue comme une étude dédiée à l’équivalence ou à la validation croisée. D’autres études devraient donc comparer le système avec des approches établies d’hébergement individuel ou de cage métabolique dans des conditions expérimentales équilibrées et inclure des indicateurs comportementaux de stress aigu lors de l’échantillonnage.

Au-delà de l’évaluation des métabolites fécaux de la corticostérone, le système peut également être utile pour d’autres applications nécessitant une collecte à court terme d’échantillons fécaux individuels. Les applications potentielles incluent des examens parasitologiques, des analyses de microbiotes, des études de digestion ou d’autres tests de biomarqueurs fécals. Avec de légères modifications techniques, le système pourrait également être adapté à la collecte d’urine, par exemple en introduisant un sol perforé et un plateau de collecte adapté sous l’animal. Pour ces applications, la possibilité de maintenir la proximité des compagnons de cage lors de la collecte de l’échantillon peut être avantageuse par rapport aux approches conventionnelles d’hébergement individuel ou de cage métabolique. Cependant, il faudrait valider l’adéquation du système pour chaque type d’échantillon spécifique et chaque analyse en aval, en particulier lorsque la contamination, le volume d’échantillon, le temps de collecte ou les conditions de stockage sont critiques.

En général, les animaux doivent être habitués aux boîtes avant la première séance d’échantillonnage, les marques individuelles doivent être clairement visibles dans les conditions d’éclairage utilisées, et l’échantillonnage doit être effectué à la même heure de la journée tout au long de l’étude. Les échantillons doivent être exclus si l’identité individuelle est incertaine, si les granules sont contaminés, si la durée du prélèvement diffère substantiellement de la fenêtre temporelle prévue, ou si le matériel fécal est insuffisant pour l’analyse¹³. Plusieurs facteurs pratiques peuvent influencer l’applicabilité du système d’échantillonnage, notamment les hiérarchies de dominance, les interactions agressives, la variabilité de la motivation alimentaire, les différences de souche, ainsi que la mobilité réduite ou le comportement modifié chez les animaux obèses, âgés, enceintes, en post-partum ou autrement altérés. Cependant, dans la cohorte actuelle, l’entrée volontaire et le succès de l’échantillonnage étaient élevés. Sur 480 échantillons réguliers attendus, deux manquaient car les souris n’avaient pas déféqué pendant l’accouchement, et trois n’ont pas pu être prélevés car les animaux étaient soit très enceintes, soit peu après l’accouchement. Ainsi, 475 échantillons ont été prélevés, dont 473 ont donné des résultats analysables. Ces données indiquent que le refus d’entrer dans les boîtes et l’absence d’obtention d’échantillons étaient rares dans les conditions utilisées dans cette étude. Néanmoins, des habituations supplémentaires ou des ajustements protocolaires peuvent être nécessaires pour d’autres souches, des groupes plus larges ou des animaux présentant une mobilité modifiée, une condition corporelle, un état de santé ou un comportement social altérés. D’autres limites sont que la méthode nécessite une formation et est actuellement conçue pour de petits groupes de trois souris, et que les composants en verre acrylique/plexiglas ne sont pas autoclavables à la vapeur.

La cage est peu coûteuse, facile à construire avec un matériau standard et du verre acrylique, et ne nécessite pas de composants électroniques. Sa conception permet le démontage, le nettoyage et l’intégration dans les routines régulières de changement de cage, ce qui le rend adapté à des échantillonnages longitudinals répétés. Dans l’ensemble, le système représente une approche pratique compatible avec le logement de groupe pour l’échantillonnage fécal non invasif, assignable individuellement chez la souris.

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Foret de 5 mm	Craftomat	22380487	Diamètre 5 mm ; Quantité 1
Forets de 60 mm	Bosch	32064647	Diamètre 60 mm ; Quantité 1
Forets de 7 mm	Craftomat	22380520	Diamètre 7 mm ; Quantité 1
Perceuse	Makita	25730054	Perceuse standard portable ou de banc ; Quantité 1
Pistolet à colle chaude	Einhell	29051207	Pour l'assemblage de la cage ; Quantité 1
Bâtonnets de colle chaude	Einhell	29049664	Compatible avec le pistolet à colle chaude ; Quantité 5-10
Cage Makrolon	Animalab	31200129	Cage standard Type II ; Quantité 1
Cage Makrolon	Animalab	31200256	Cage standard Type III ; Quantité 1
Plexiglas / verre acrylique	Bauhaus	29122352	Environ 0,25 m² au total ; 5 mm d'épaisseur ; Quantité  2 feuilles DIN A3
Disqueuse ou fraiseuse	Scheppach	32079641	Petite scie à ruban, scie sauteuse ou fraiseuse CNC ; Quantité 1
Vis filetées	Profi Depot	10807533	20 mm × 3 mm ; Quantité 4
Baguettes / tiges en bois	Ikea	903.429.71	Baguettes en bois rondes ; Quantité 3