Collecte volontaire d’échantillons fécaux compatibles en groupe chez la souris à l’aide d’un système de cage sur mesure

Résumé

Ce protocole décrit un système de cage personnalisé pour la collecte volontaire, favorable au bien-être sociale, simultanée et individuelle d’échantillons fécaux provenant de souris hébergées en groupe.

Résumé

La mesure fiable des métabolites fécaux de la corticostérone nécessite des échantillons fécaux pouvant être attribués à des animaux individuels et prélevés dans un délai défini. Cela est difficile chez les souris hébergées en groupe, où les échantillons regroupés en cage ne permettent pas d’assigner individuellement, et la séparation temporaire peut interférer avec le bien-être animal et les résultats de l’étude. L’objectif de ce protocole est de présenter un système de cage simple et peu coûteux permettant la collecte volontaire, simultanée et individuelle d’échantillons fécaux sur des souris hébergées en groupe. Le système se compose d’une cage domestique en polycarbonate à dessus de fil métallique reliée à trois boîtes de collecte individuelles. Après habituation et entraînement, les souris entrent volontairement dans les boîtes pour obtenir une petite récompense alimentaire. Les portes peuvent alors être fermées sans poursuite, manipulation ou transfert forcé. Les granulés fécaux sont prélevés séparément dans chaque boîte, permettant d’attribuer des échantillons à des animaux individuels tout en maintenant un logement social en dehors de la période d’échantillonnage. Ce protocole permet l’échantillonnage longitudinal non invasif et convient aux études mesurant les métabolites de corticostérone fécale ou d’autres biomarqueurs fécals. Le design est facile à construire avec un matériau standard pour cage et du verre acrylique, peut être démonté pour nettoyage, et permet d’échantillonner plusieurs cages en parallèle. En réduisant les perturbations liées à la manipulation et en améliorant la standardisation de la fenêtre d’échantillonnage, la méthode apporte un raffinement pratique pour la surveillance endocrinienne chez les souris hébergées en groupe.

Introduction

Un défi majeur dans l’évaluation des concentrations plasmatiques de corticostérone est que la procédure d’échantillonnage elle-même peut induire une augmentation aiguë de la corticostérone, ce qui perturbe la mesure et peut potentiellement affecter l’interprétation des résultats de ^{l’étude 1,2,3}. La mesure des métabolites fécaux de la corticostérone (FCM) constitue une alternative non invasive, car les concentrations de FCM reflètent les niveaux circulants de glucocorticoïdes plusieurs heures avant l’échantillonnage, selon l’espèce, la souche, le sexe et le temps de passage intestinal ^4,5. Cependant, une analyse fiable de la gestion des fréquences de la fréquence des corps chez les souris hébergées en groupe reste un défi. Les échantillons fécaux collectés dans la cage ne peuvent pas être attribués à des animaux individuels et peuvent présenter une grande variabilité due aux différences interindividuelles de sécrétion de glucocorticoïdes et à l’incertitude dans la fenêtre d’échantillonnage exacte. Séparer les animaux pendant de longues périodes peut interférer avec les objectifs de l’étude, tandis que la séparation à court terme pour la collecte individuelle d’échantillons est laborieux, limite le débit et peut elle-même induire un stress².

Pour permettre la collecte individuelle d’échantillons fécaux sur des souris hébergées en groupe avec une manipulation minimale, une cage de collecte fécale sur mesure a été développée (Figure 1A-E). Le design a été adapté d’une cage de collecte fécale précédemment décrite pour souris^{épineuses 6} et modifié pour une utilisation avec des souris de laboratoire. Le système se compose d’une cage standard en polycarbonate de type III reliée à trois boîtes de collecte individuelles, auxquelles les animaux peuvent accéder volontairement et fermer à l’aide de portes coulissantes. Cette configuration permet de prélever des échantillons fécaux sur des souris individuelles sans manipulation directe pendant la période d’échantillonnage et permet un échantillonnage simultané de plusieurs animaux. La cage offre donc une approche pratique pour l’échantillonnage FCM non invasif, attribuable individuellement, chez les souris hébergées en groupe.

Le protocole suivant décrit un système d’échantillonnage fécal permettant la collecte et l’identification d’échantillons fécaux sur des souris individuelles tout en maintenant un environnement de logement collectif, en utilisant des cages sur mesure pour le prélèvement sans contact des excréments.

Protocole

Le comité d’éthique animale responsable de l’Université médicale de Vienne a été consulté avant la réalisation de l’étude et a indiqué qu’aucune licence formelle d’expérimentation animale n’était requise ; par conséquent, aucun numéro d’approbation ou de protocole n’est disponible. L’étude a porté uniquement sur des pratiques établies de reproduction et d’élevage, ainsi que la collecte d’échantillons fécales non invasifs. Aucune intervention invasive n’a été réalisée. Conformément à la directive 2010/63/UE, la charge attendue pour les animaux a été évaluée comme étant inférieure au seuil de douleur, souffrance, détresse ou préjudice durable équivalent ou supérieur à celui causé par l’introduction d’une aiguille, conformément aux bonnes pratiques vétérinaires. Tous les animaux étaient hébergés et pris en charge selon les normes institutionnelles de bien-être animal.

1. Construction des cages (voir liste des matériaux)

1. Découpez les pièces 1 à 4 à partir de plexiglas de 5 mm/verre acrylique selon les modèles illustrés à la Figure 2A-C.
   REMARQUE : Les modèles avec des dimensions exactes peuvent être imprimés au format DIN A3 (Figure 1 et Figure 2 supplémentaires).
2. Coupez le fond de la cage en polycarbonate type II (PTII) comme indiqué dans la Figure 2D. Cette partie servira plus tard de couverture supérieure des boîtes de collecte fécale.
3. Perçez les trous et les fentes dans l’ancien fond de la cage PTII comme indiqué à la Figure 2D.
   REMARQUE : Les dimensions exactes sont fournies dans la Figure 3 supplémentaire.
4. Percez des trous dans le côté avant et le côté court de la cage PTIII comme indiqué à la Figure 2E.
   REMARQUE : Les dimensions exactes sont fournies dans la Figure 4 supplémentaire.
5. Utilisez la partie 2 comme gabarit pour marquer les trous de forage correspondants sur le côté court de la cage PTIII et sur le côté long de la cage PTII.
6. Perçez les trous marqués et fixez la cage PTIII, la cage PTII et la partie 2 à l’aide des vis filetées, comme montré à la Figure 2F.
7. Insérez la partie 1 au fond de la cage PTII. Positionnez les parties 4a et 4b de façon à ce qu’elles maintiennent la partie 1 en place et divisez la cage d’échantillonnage en boîtes de collecte séparées. Utilisez le pistolet à colle chaude pour les fixer en place.
8. Glissez les protubérances inférieures des parties 4a et 4b dans les fentes de la partie 1. Ces protubérances forment les pieds des boîtes de collecte.
9. Faites glisser les protubérances supérieures des parties 4a et 4b à travers le couvercle supérieur, l’ancien bas de la cage PTII, pour la maintenir en place.
10. Faites passer les baguettes ou tiges en bois à travers les trous des protubérances, en utilisant une tige en haut et deux en bas, pour stabiliser et fixer la construction.
    REMARQUE : Les matériaux en bois ne doivent être utilisés dans le vivarium que s’ils sont jetables, car ils ne sont pas nettoyables. Si ce n’est pas le cas, il faut utiliser des tiges de composition alternative.
11. Combler les espaces restants ou les petites imprécisions à l’aide d’un pistolet à colle chaude. Utilisez les pièces 3a, 3b et 3c (Figure 2B) comme portes coulissantes entre la cage de la maison et les boîtes de collecte.
    REMARQUE : Veillez à ce qu’aucun bord tranchant, résidu de colle ou matériau saillant ne reste accessible aux animaux. Les composants en verre acrylique/plexiglas utilisés dans ce prototype ne conviennent pas à la stérilisation à la vapeur par autoclave. Par conséquent, si le système est utilisé dans des installations SPF nécessitant du matériel stérilisé lié à la cage, soit une procédure de désinfection non autoclave approuvée par l’institution devrait être utilisée, soit les composants acryliques doivent être remplacés par un matériau autoclavable tout en conservant les mêmes dimensions.

2. Préparation et hébergement des animaux

1. Obtenez le nombre requis de souris de la ou des souches appropriées pour l’étude.
   REMARQUE : Les données représentatives ont été obtenues auprès de 30 souris C57BL/6J âgées de huit semaines, comprenant 20 femelles et 10 mâles. Les souris étaient exemptes de pathogènes spécifiques selon les normes FELASA et ont été obtenues auprès des laboratoires Charles River à Sulzfeld, Allemagne.
2. Animaux d’intérieur dans des conditions conventionnelles dans des cages adaptées en polycarbonate de type III avec un maximum de trois souris adultes par cage.
   REMARQUE : Les mâles séparés ont été hébergés dans des cages standard en polycarbonate de type II pour cette étude.
3. Maintenez la pièce des animaux à 22 ± 2 °C et 55 ± 10 % d’humidité relative sous un cycle clair/obscur de 12 heures avec la lumière allumée à 6h00.
4. Fournissez un régime d’entretien standard et de l’eau à volonté immédiate.
5. Ajoutez de la literie en bois de tremble, un papier toilette en papier, une maison en plastique transparent rouge et des essuie-tout comme matériau de nidification dans chaque cage.
6. Identifiez les souris principalement par des marques naturelles sur la queue. Appliquez temporairement des marques de parc sur les animaux ayant des marques similaires sur la queue lors de la pesée, si nécessaire.

3. Habituation et entraînement des animaux

REMARQUE : La cage achevée se compose d’une cage domestique, PTIII, reliée à une cage d’échantillonnage avec trois boîtes de collecte distinctes, PTII. Les cages domestiques peuvent être utilisées comme des cages conventionnelles, avec de la literie, un enrichissement de cage, un couvercle en fil de fer sans attaches externes, et fournissent nourriture et eau. Le système peut être démonté pour le lavage et ne peut être utilisé que pendant les semaines de prélèvement. Pendant les semaines sans échantillonnage, les animaux peuvent être hébergés dans des cages PTIII standard.

1. Placez les animaux dans le système de cage au moins deux semaines avant la première séance d’échantillonnage prévue.
2. Habituez les animaux aux caisses de collecte en retirant les portes coulissantes pendant une nuit, leur permettant ainsi d’explorer librement les boîtes.
3. Effectuez trois séances d’entraînement avant la première séance d’échantillonnage. Mener la formation dans les mêmes conditions de lumière et à la même heure de la journée, prévue pour un prélèvement ultérieur, idéalement sous feu rouge peu après le début de la phase sombre.
4. Appliquez une petite quantité de récompense, comme de la crème de noisette, du beurre de cacahuète, de la pâte de malt ou un aliment similaire au goût, sur le mur en face de l’entrée de chaque boîte de collecte.
5. Le premier jour d’entraînement, laissez les portes ouvertes et laissez les animaux découvrir et consommer la récompense volontairement.
6. Le deuxième jour d’entraînement, attendez qu’un animal entre dans une boîte de collecte et commence à lécher la récompense. Fermez soigneusement la porte coulissante derrière l’animal et relâchez-la après 10 minutes.
7. Le troisième jour d’entraînement, répétez la procédure et prolongez progressivement le temps que les animaux restent dans les caisses de collecte.
   REMARQUE : L’entraînement doit être calme et régulier. Évitez de poursuivre les animaux dans les boîtes, car cela peut augmenter le stress et réduire la participation volontaire aux séances d’échantillonnage ultérieures.

4. Collecte d’échantillons fécaux

1. Calendrier de la collecte des échantillons
   1. Planifiez le temps d’échantillonnage en fonction de la question biologique et du délai attendu entre l’excrétion de la corticostérone plasmatique et du métabolite de la corticostérone fécale. Chez la souris, les métabolites de la corticostérone fécale reflètent généralement les niveaux de glucocorticoïdes circulants environ 8 à 10 heures avant l’échantillonnage.
      REMARQUE : Si le timing précis est critique, réalisez une étude pilote pour déterminer le cours temporel de l’excrétion de la MCF dans la souche, le sexe et les conditions expérimentales spécifiques utilisées. Ce pilote peut être combiné avec les séances de formation.
   2. Prélève un prélèvement programmé pendant une période de forte production fécale. L’échantillonnage est généralement le plus efficace au début de la phase sombre et active.
   3. Effectuer toutes les séances d’échantillonnage à la même heure de la journée tout au long de l’étude afin de réduire la variation causée par le rythme diurne des niveaux de FCM.
      REMARQUE : D’après notre expérience, les événements survenant le matin vers 10h00 sont bien pris en compte lorsque le prélèvement est programmé entre 18h00 et 20h00, selon le planning de lumière de la salle des animaux.
2. Procédure d’échantillonnage et conseils pratiques
   1. Marquez les animaux individuellement avant de les prélever. Utilisez des marques d’oreilles ou des marques individuelles sur la queue.
      REMARQUE : Les marques des orteils et les codes couleur peuvent être difficiles à reconnaître à l’intérieur des boîtes sous lumière rouge.
   2. Préparez les boîtes de collecte pendant la phase de lumière en appliquant la récompense sur le mur du fond de chaque boîte.
      REMARQUE : Préparer les boîtes pendant la journée améliore la visibilité pour l’expérimentateur et permet aux animaux de sentir la récompense avant de prélever.
   3. Au moment prévu pour le prélèvement, ouvrez les boîtes de collecte et attendez que les animaux entrent volontairement.
   4. Une fois qu’une souris est entrée dans une boîte de collecte, fermez soigneusement la porte coulissante derrière elle.
   5. Après que tous les animaux ont été entrés dans une boîte, notez l’identité et la position de chaque souris dans une feuille d’échantillonnage préparée.
   6. Si plus de 10 cages sont échantillonnées lors d’une session, impliquez un second expérimentateur pour soutenir l’identification animale, la manipulation des portes et la documentation.
   7. Gardez les animaux dans les caisses de collecte pendant la durée prévue de l’échantillonnage, généralement de 30 minutes à 2 heures, selon la production fécale prévue et le plan de l’étude.
      REMARQUE : Excluez les échantillons si l’identité individuelle ne peut pas être attribuée avec certitude, si les granulés fécaux sont contaminés par de l’urine, de la litière ou des excréments d’un autre animal, si la durée de l’échantillonnage dévie considérablement de la fenêtre de temps prévue, ou si la quantité de matières fécales est insuffisante pour une analyse de la FCM.
      REMARQUE : L’utilisation de 50 mg est notre protocole standard, et cette quantité a été utilisée dans toutes les validations et tous les autres articles ^5,7,8. Normalement, il est facile d’obtenir.
   8. À la fin de la période d’échantillonnage, ouvrez les portes coulissantes et laissez les souris retourner dans la cage de la maison.
   9. Fermez les boîtes de collecte immédiatement après le départ des souris pour éviter la rentrée et la contamination croisée des échantillons.
   10. Retirez les granulés fécaux de chaque boîte de collecte à l’aide de longues pinces et transférez-les dans des tubes de collecte étiquetés individuellement.
   11. Conservez les échantillons à -20 °C jusqu’à la préparation supplémentaire du test FCM.
       REMARQUE : Si les boîtes sont bien fermées et ne peuvent pas être rentrées par les souris, la collecte des granulés fécaux peut être reportée jusqu’à la phase de lumière suivante. Cependant, cela doit être fait de manière cohérente dans une étude.
   12. Gardez les animaux dans la partie cage de la maison (PTIII) jusqu’au prochain changement de cage. Ensuite, ils peuvent être démontés et lavés dans une rondelle en cage classique.

Résultats

Les métabolites de corticostérone fécale (MFC) ont été quantifiés avec succès à partir d’échantillons collectés dans des cages d’échantillonnage fécales personnalisées lors d’une étude longitudinale comparant des souris reproduites de façon permanente et intermittente. L’analyse représentative de la MCF comprenait 30 animaux : groupe de reproduction permanente, n = 15 animaux dans 5 cages ; groupe de reproduction intermittente, n = 10 animaux dans 5 cages, avec 5 mâles hébergés seuls sau...

Discussion

Ce protocole décrit un système simple de cage pour prélever des échantillons fécaux assignables individuellement sur des souris hébergées en groupe. Le principal avantage de la méthode est qu’elle combine l’attribution individuelle d’échantillons avec le maintien des aspects clés du logement social, en particulier le contact visuel et olfactif avec les compagnons de cage. Cela est pertinent car le logement collectif est souvent nécessaire pour le bien-être animal et peut également faire ...

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Foret de 5 mm	Craftomat	22380487	Diamètre 5 mm ; Quantité 1
Forets de 60 mm	Bosch	32064647	Diamètre 60 mm ; Quantité 1
Forets de 7 mm	Craftomat	22380520	Diamètre 7 mm ; Quantité 1
Perceuse	Makita	25730054	Perceuse standard portable ou de banc ; Quantité 1
Pistolet à colle chaude	Einhell	29051207	Pour l'assemblage de la cage ; Quantité 1
Bâtonnets de colle chaude	Einhell	29049664	Compatible avec le pistolet à colle chaude ; Quantité 5-10
Cage Makrolon	Animalab	31200129	Cage standard Type II ; Quantité 1
Cage Makrolon	Animalab	31200256	Cage standard Type III ; Quantité 1
Plexiglas / verre acrylique	Bauhaus	29122352	Environ 0,25 m² au total ; 5 mm d'épaisseur ; Quantité  2 feuilles DIN A3
Disqueuse ou fraiseuse	Scheppach	32079641	Petite scie à ruban, scie sauteuse ou fraiseuse CNC ; Quantité 1
Vis filetées	Profi Depot	10807533	20 mm × 3 mm ; Quantité 4
Baguettes / tiges en bois	Ikea	903.429.71	Baguettes en bois rondes ; Quantité 3