Le miR-93-5p cible directement le récepteur Toll-like 4 (TLR4) dans la pneumonie pédiatrique à Mycoplasma pneumoniae (MPP). Sa régulation négative pourrait contribuer à la progression de la maladie et aux lésions associées du système digestif. Ces résultats suggèrent que le miR-93-5p pourrait servir de biomarqueur diagnostique potentiel pour la MPP et la MPP accompagnée de lésions du système digestif.
Article de recherche
Évaluation du rôle du miR-93-5p chez les enfants infectés par Mycoplasma pneumoniae présentant une atteinte du système digestif
Dans cet article
Résumé
Résumé
La micro-ARN-93-5p est impliquée dans la modulation des lésions pulmonaires aiguës, mais son rôle et sa valeur diagnostique dans la pneumonie pédiatrique à Mycoplasma pneumoniae (MPP) associée à des atteintes du système digestif restent peu clairs. La présente étude a évalué le rôle de la micro-ARN-93-5p en tant que biomarqueur diagnostique potentiel de la MPP et des complications digestives associées chez l’enfant. Des échantillons cliniques ont été recueillis auprès de patients pédiatriques atteints de MPP et de témoins sains. L’expression de la micro-ARN-93-5p a été quantifiée par PCR quantitative en temps réel après transcription inverse. Des cellules A549 infectées par le Mycoplasma pneumoniae (MP) ont été utilisées pour établir un modèle cellulaire de MPP afin d’évaluer les modifications de la viabilité cellulaire et des cytokines pro-inflammatoires. L’interaction entre la micro-ARN-93-5p et le récepteur de type Toll 4 (TLR4) a été analysée à l’aide d’un essai rapporteur luciférase. La performance diagnostique a été évaluée par analyse de la courbe ROC (caractéristique de fonctionnement du récepteur). Les taux de micro-ARN-93-5p étaient significativement réduits chez les patients atteints de MPP par rapport aux témoins sains (P < 0,001) et étaient encore plus faibles chez les patients atteints de MPP avec atteinte du système digestif par rapport à ceux atteints de MPP seule. L’infection à MP réduisait la viabilité cellulaire et augmentait les concentrations d’IL-6 et de TNF-α, tandis qu’une surexpression de la micro-ARN-93-5p atténuait ces effets. L’expression de TLR4 augmentait après l’infection à MP et était régulée négativement par la micro-ARN-93-5p. Cliniquement, l’atteinte du système digestif chez les patients atteints de MPP était associée à des taux plus bas de micro-ARN-93-5p. Les analyses par courbe ROC ont révélé une bonne performance diagnostique pour distinguer les patients atteints de MPP des témoins sains, ainsi que les patients atteints de MPP avec atteinte digestive de ceux atteints de MPP seule. La micro-ARN-93-5p cible directement TLR4 dans la MPP pédiatrique, et sa diminution pourrait contribuer à la progression de la maladie et aux atteintes associées du système digestif. Ces résultats suggèrent que la micro-ARN-93-5p pourrait constituer un biomarqueur diagnostique potentiel pour la MPP et la MPP associée à une atteinte du système digestif.
Introduction
Mycoplasma pneumoniae (MP) est un agent pathogène prédominant responsable de pneumonie chez les enfants1, entraînant souvent une morbidité respiratoire importante à l'échelle mondiale. Bien que MP provoque principalement une infection pulmonaire, elle peut également provoquer des complications extrapulmonaires touchant plusieurs systèmes organiques.2. Lors de l'infection à M. pneumoniae, les symptômes gastro-intestinaux les plus fréquemment rapportés incluent des nausées, des vomissements, de la diarrhée et des douleurs abdominales3. Un éventail de troubles et de manifestations gastro-intestinaux a également été identifié comme faisant partie de M. pneumoniae-maladies extrapulmonaires associées (MPEPD)2. Patients pédiatriques présentant pneumonie à M. pneumoniae (MPP) compliquée par une atteinte du système digestif pose des défis cliniques pouvant aggraver la gravité de la maladie et compliquer la prise en charge4. Des éléments récents indiquent une interaction entre l'infection pulmonaire et le dysfonctionnement intestinal, qui pourrait expliquer cette association5,6. Une régulation anormale des réponses immunitaires lors de l'infection à MP pourrait également être associée à des lésions du système digestif7.
Malgré les progrès réalisés dans les modalités diagnostiques8, l'identification précoce et précise de la PPM reste difficile en raison de manifestations cliniques superposées à celles d'autres infections respiratoires et d'une atteinte extrapulmonaire variable9. Le poumon et l'intestin sont des composants clés du système immunitaire muqueux commun, et ces organes peuvent influencer réciproquement leur fonction, comme en témoignent les troubles intestinaux observés lors des maladies pulmonaires et leurs effets réciproques, un phénomène connu sous le nom de communication croisée poumon-intestin10. En outre, les soins infirmiers pédiatriques se concentrent principalement sur la prise en charge des symptômes respiratoires11, tandis que les manifestations gastro-intestinales peuvent être sous-estimées ou attribuées aux effets secondaires du traitement. Ce manque souligne la nécessité d'une évaluation globale intégrant à la fois l'exploration pulmonaire et gastro-intestinale afin d'optimiser les interventions infirmières de soutien12. De récentes études moléculaires ont mis en évidence des régulateurs des voies de signalisation inflammatoire impliqués à la fois dans la pathologie pulmonaire et l'inflammation intestinale au cours de la PPM12,13.
On a mis en évidence le rôle de la miR-93-5p dans la pathogenèse des lésions pulmonaires aiguës, où sa diminution s'accompagne d'une altération de la fonction pulmonaire et d'une exacerbation des réponses inflammatoires.14,15. Sur la base de ces résultats, on a émis l'hypothèse que le miR-93-5p était également régulé à la baisse dans le sérum d'enfants atteints de pneumonie à mycoplasmes. Une analyse bioinformatique à l'aide de la base de données TargetScan a identifié le récepteur de type Toll 4 (TLR4) comme cible directe potentielle du miR-93-5p. Le TLR4 a été décrit comme jouant un rôle important dans la modulation de l'axe poumon-intestin16,17 et a donc été considéré comme potentiellement associé à des complications gastro-intestinales dans la pneumonie à *Mycoplasma pneumoniae*. En conséquence, cette étude a examiné l'implication du miR-93-5p chez des patients pédiatriques atteints de pneumonie à *Mycoplasma pneumoniae* compliquée par une atteinte du système digestif.
Protocole
Cette étude a été examinée et approuvée par le Comité d'éthique de l'Hôpital affilié de l'Université de Yangzhou (n° d'approbation : 2023-YKL01-(16) ; 17 janvier 2023). Des échantillons de sang veineux périphérique ont été prélevés chez chaque participant pour les analyses de laboratoire pertinentes. Avant leur participation, le consentement éclairé a été obtenu auprès des tuteurs légaux de tous les participants. Les réactifs, équipements et outils utilisés dans ce protocole sont listés dans le Tableau des matériaux.
1. Prélèvement des échantillons cliniques
Un total de 108 enfants âgés de 2 à 14 ans ont été recrutés à l'Hôpital affilié de l'Université de Yangzhou entre février 2023 et décembre 2024. Les 108 enfants ont tous été diagnostiqués avec une PPM, confirmé par imagerie thoracique et test de réaction en chaîne par polymérase (PCR) pour l'ADN du MP sur des échantillons nasopharyngés. L'ADN du MP dans les prélèvements nasopharyngés a été détecté par PCR quantitative en temps réel ciblant le gène de l'adhésine P1 spécifique au MP.
Les patients ont été classés selon leur état pathologique en deux groupes : PPM sans IDS (n = 60) et PPM avec IDS (n = 48). L'IDS était définie par la présence d'au moins un symptôme gastro-intestinal, notamment une diarrhée (≥3 selles molles ou liquides par jour pendant >24 h), des nausées, des vomissements ou des douleurs abdominales persistantes avec ou sans douleur de rebond, accompagnés d'au moins un paramètre de laboratoire anormal et/ou d'un élément d'imagerie abdominale confirmatoire. Les paramètres de laboratoire anormaux comprenaient une élévation des transaminases sériques, de l'amylase ou de la lipase et/ou une augmentation des marqueurs de perméabilité intestinale, tels que le D-lactate et l'endotoxine. Les éléments d'imagerie abdominale confirmatoires comprenaient un épaississement de la paroi intestinale, des ganglions mésentériques augmentés de volume ou un épanchement péritonéal détecté par échographie ou tomodensitométrie. En outre, 60 enfants en bonne santé ayant subi des examens de routine ont servi de témoins.
- Critères d'inclusion
Les patients présentant des symptômes gastro-intestinaux associés à des anomalies biologiques ou d'imagerie ont été classés dans le groupe DSI. - Critères d'exclusion
Les critères d'exclusion comprenaient une pneumonie virale ou bactérienne, la tuberculose, des antécédents d'allergie médicamenteuse aux traitements étudiés, des troubles immunitaires, une malnutrition, une insuffisance rénale, des malformations gastro-intestinales et un traitement antibiotique préalable à l'admission.
2. Culture cellulaire et modèle MPP
Mycoplasma pneumoniae la souche témoin ATCC 15531 a été cultivée dans un bouillon PPLO. Les cellules épithéliales alvéolaires humaines A549 ont été cultivées dans un milieu RPMI-1640 contenant 10 % de sérum de veau fœtal, dans des conditions humidifiées à 37 °C avec 5 % de CO₂.
Afin de mettre en place un modèle in vitro de pneumonie à mycoplasmes, des cellules A549 ont été infectées par des suspensions de M. pneumoniae à une multiplicité d'infection (MOI) de 1:100.18Après l'infection, les bactéries non liées ont été éliminées en remplaçant le milieu de culture. L'efficacité de l'infection a été confirmée par détection par qPCR de l'ADN de MP dans les surnageants de culture après infection.
3. Construction du plasmide et transfection
Des mimiques de miR-93-5p, des plasmides d'overexpression de TLR4 (oe-TLR4) et leurs contrôles négatifs correspondants ont été synthétisés commercialement. Les cellules A549 infectées par des MP ont été transfectées à l'aide d'un réactif de transfection à base de lipides. L'efficacité de la transfection a été évaluée 48 h après la transfection par une PCR quantitative en temps réel après transcription inverse (RT-qPCR).
4. Analyse de RT-qPCR
L'ARN total a été extrait des cellules A549 récoltées à la fin des expériences. Les cellules ont été lysées et homogénéisées à l'aide d'une solution saline tamponnée au phosphate (PBS). L'ARN total a été purifié à l'aide d'un réactif d'extraction d'ARN à base de phénol. Un kit de transcription inverse a été utilisé pour la transcription inverse de miR-93-5p, tandis que l'ADN complémentaire destiné à l'analyse des ARNm a été synthétisé à l'aide d'un réactif de transcription inverse disponible commercialement. L'analyse RT-qPCR a été réalisée en utilisant la chimie SYBR Green.
5. Test MTT
Les cellules A549 transfectées de chaque groupe expérimental ont été récoltées et semées dans des plaques de 96 puits à une densité de 2 × 103 cellules par puit. Ensuite, 20 µL du réactif de bromure de méthylthiazolyldiphényl-tétrazolium (MTT) ont été ajoutés à chaque puit. Après une incubation supplémentaire de 2 h à 37 °C, les surnageants ont été soigneusement éliminés. Les cristaux de formazane formés par les cellules métaboliquement actives ont été solubilisés conformément aux instructions du test. La viabilité cellulaire a été quantifiée indirectement en mesurant la densité optique (DO) à 490 nm à l’aide d’un lecteur de microplaques.
6. Dosage immunoenzymatique
Des kits commerciaux de dosage immunoenzymatique (ELISA) ont été utilisés pour mesurer les concentrations d'interleukine-6 (IL-6) et de facteur de nécrose tumorale-α (TNF-α). Les dosages ont été réalisés conformément aux instructions du fabricant. Les mesures ont été effectuées en triplets sur deux réplicats expérimentaux indépendants afin d'assurer la précision et la reproductibilité.
7. Dosage double du luciférase-rapporteur
Les sites de fixation de miR-93-5p dans la région non traduite 3′ (UTR) de TLR4 ont été prédits à l'aide de la base de données TargetScan. Des fragments contenant les séquences de type sauvage (WT) ou mutées (MUT) ont été clonés dans un vecteur rapporteur de luciférase. Les cellules A549 ont été co-transfectées avec 500 ng du construct WT ou MUT, ainsi qu'avec des mimiques de miR-93-5p ou des contrôles, à l'aide d'un réactif de transfection à base de lipides. Après 48 heures, l'activité de la luciférase a été mesurée par un dosage rapporteur à double luciférase. L'activité de la luciférase de luciole a été normalisée par rapport à celle de la luciférase Renilla afin de tenir compte de l'efficacité de la transfection.
8. Test de transfert Western
Pour le transfert Western, les lysats cellulaires ont été mélangés avec du tampon de charge et centrifugés à 10 000 × g pendant 3 min. Les surnageants ont été soumis à une électrophorèse en gel de polyacrylamide en présence de dodécylsulfate de sodium, puis les protéines ont été transférées sur des membranes de fluorure de polyvinylidène. Les membranes ont été bloquées avec 5 % d'albumine sérique bovine (BSA) pendant 1 h à température ambiante, puis incubées toute la nuit à 4 °C avec des anticorps primaires dirigés contre la glyceraldehyde-3-phosphate déshydrogénase (GAPDH) et l'inhibiteur kappa B alpha (IκBα), dilués au 1/1000 dans une solution saline tamponnée au Tris contenant du Tween 20 et 5 % de BSA. Après trois lavages, les membranes ont été incubées avec une immunoglobuline G de chèvre anti-lapin conjuguée à la peroxydase (HRP) (1:500) pendant 1 h à température ambiante. Suite à d'autres lavages, les bandes protéiques ont été révélées à l'aide d'un substrat de chimiluminescence amplifiée et visualisées à l'aide d'un système d'imagerie par chimiluminescence. Les intensités des bandes des protéines cibles et de la GAPDH ont été quantifiées à partir de trois expériences indépendantes à l'aide d'un logiciel d'analyse d'images.
9. Analyse statistique
Les analyses statistiques ont été réalisées à l'aide d'un logiciel d'analyse statistique. La normalité des données de mesure a été évaluée à l'aide du test de Shapiro-Wilk. Les données normalement distribuées sont présentées comme moyenne ± écart-type et ont été comparées à l'aide de tests t pour échantillons indépendants pour deux groupes ou d'une analyse de variance unidirectionnelle (ANOVA) pour plusieurs groupes. Lorsque l'ANOVA indiquait une différence globale significative, un test a posteriori de Tukey était utilisé pour les comparaisons par paires. Les données non normalement distribuées ont été analysées à l'aide du test de Mann-Whitney U. Les variables catégorielles ont été exprimées en effectifs et en pourcentages et comparées à l'aide de tests du chi-deux. Une analyse de la courbe ROC (caractéristique de fonctionnement du récepteur) a été utilisée pour évaluer le potentiel diagnostique de miR-93-5p dans la prédiction de la MPP ou de la MPP avec DSI. Afin d'identifier les facteurs prédictifs associés à la MPP avec DSI, une régression logistique multivariée a été effectuée. Les variables introduites dans le modèle comprenaient l'âge, le sexe, la durée de la fièvre, la durée d'utilisation des antibiotiques et l'expression de miR-93-5p dichotomisée à la médiane. Une valeur de P bilatérale <0,05 a été considérée comme statistiquement significative.
Résultats
Le miR-93-5p est diminué dans la PPM pédiatrique
La performance diagnostique du miR-93-5p a été évaluée afin d'explorer son potentiel en tant que biomarqueur dans la PPM pédiatrique. Comme illustré dans la Figure 1A, l'expression du miR-93-5p était significativement réduite chez les patients pédiatriques atteints de PPM par rapport aux témoins sains. Les caractéristiques démographiques et hématologiques des deux groupes sont résumées dans le Tableau 1. Aucune différence statistiquement significative n'a été observée concernant l'âge ou la répartition par sexe entre les groupes (P > 0,05). Cependant, le nombre de globules blancs périphériques (GB), le pourcentage de neutrophiles (Neut %) et les taux de protéine C-réactive (CRP) étaient significativement élevés dans le groupe PPM par rapport aux témoins sains (P < 0,001).
Une analyse de la courbe caractéristique de fonctionnement du récepteur (ROC) a été réalisée afin d'évaluer davantage les performances diagnostiques du miR-93-5p pour distinguer les patients atteints de PPM des enfants en bonne santé (Figure 1B). La surface sous la courbe (AUC) était de 0,9009 [intervalle de confiance (IC) à 95 % : 0,8537–0,9482], avec une sensibilité de 80,56 % et une spécificité de 88,33 %. Ces résultats indiquent que des taux sériques réduits de miR-93-5p étaient associés à la PPM pédiatrique.
Effet de miR-93-5p sur les modèles cellulaires de MPP
Une série d'expériences in vitro a été réalisée pour évaluer l'effet de miR-93-5p dans le modèle cellulaire de MPP. Par rapport aux cellules témoins, l'expression de miR-93-5p était régulée à la baisse dans le modèle cellulaire de MPP (Figure 2A). L'infection par le MP était également associée à une diminution de la viabilité des cellules A549 (Figure 2B). De plus, les niveaux des cytokines pro-inflammatoires IL-6 et TNF-α étaient élevés dans le modèle de MPP par rapport aux témoins (Figure 2C).
Afin d'évaluer davantage l'effet fonctionnel du miR-93-5p, un modèle d'overexpression du miR-93-5p a été établi dans des cellules A549 infectées par le MP (Figure 2D). L'overexpression du miR-93-5p a significativement augmenté la viabilité cellulaire par rapport au modèle MPP sans overexpression du miR-93-5p (Figure 2E). Conformément à ces résultats, une expression accrue du miR-93-5p s'est accompagnée d'une diminution de la production d'IL-6 et de TNF-α (Figure 2F). Ces résultats indiquent qu'une expression réduite du miR-93-5p était associée à une viabilité cellulaire diminuée et à une réponse inflammatoire accrue durant l'infection par le MP, tandis que l'overexpression du miR-93-5p atténuait ces modifications.
Le miR-93-5p cible TLR4
Afin d'élucider la relation régulatoire entre le miR-93-5p et TLR4, une analyse bioinformatique a révélé un site de liaison prédit pour le miR-93-5p dans la région non traduite 3′ (3′ UTR) de l'ARNm de TLR4 (Figure 3A). L'expression de TLR4 était augmentée dans le modèle cellulaire MP par rapport aux témoins (Figure 3B). L'interaction prédite a ensuite été évaluée à l'aide d'un dosage rapporteur de luciférase. Une co-transfection avec des mimiques du miR-93-5p a réduit l'activité luciférase du construit de type sauvage, indiquant une liaison spécifique au site prédit (Figure 3C).
La surexpression de miR-93-5p dans les cellules infectées par MP a réduit l'expression de TLR4 par rapport aux témoins infectés non traités par le mimétique (Figure 3D). Afin d'étudier davantage les effets en aval associés à la modulation de TLR4, des modèles de cellules A549 avec surexpression de TLR4 ont été établis (Figure 3E). Une analyse par immunoblot a montré une augmentation des niveaux d'IκBα suite à la surexpression de TLR4 (Figure 3F).
La surexpression de TLR4 a fortement réduit la viabilité cellulaire après une infection par MP par rapport aux cellules témoins, tandis que la surexpression concomitante de miR-93-5p a inversé cette réduction (Figure 3G). La mesure des cytokines inflammatoires a en outre montré que la surexpression de TLR4 augmentait les niveaux de médiateurs pro-inflammatoires, alors que la surexpression de miR-93-5p atténuait ces modifications, même en présence d'une surexpression de TLR4 (Figure 3H). Ces résultats indiquent que miR-93-5p régule négativement l'expression de TLR4 et atténue les modifications cellulaires associées à l'infection par MP.
Valeur diagnostique de miR-93-5p dans la MPP et la MPP avec l’IDG
Des études antérieures ont décrit l'implication du TLR4 dans les tissus pulmonaires et coliques16. L'association potentielle entre miR-93-5p et les lésions du système digestif dans la MPP a donc été évaluée sur le plan clinique. Comme illustré sur la Figure 4A, l'expression de miR-93-5p était réduite dans le groupe MPP+IDG par rapport au groupe MPP.
Les caractéristiques démographiques et hématologiques sont résumées dans le Tableau 2. Aucune différence significative concernant l'âge ou le sexe n'a été observée entre les groupes. Toutefois, la durée de la fièvre et l'utilisation d'antibiotiques étaient significativement plus longues chez les patients présentant une ICD concomitante (P < 0,05).
La valeur diagnostique de miR-93-5p pour distinguer les cas de MPP avec DSI de ceux sans DSI a été évaluée à l'aide d'une analyse de la courbe ROC. La AUC était de 0,7866 (IC à 95 % : 0,6889–0,8843) (figure 4B), avec une sensibilité de 85,71 % et une spécificité de 57,45 %.
Une analyse de régression logistique multivariée a identifié une faible expression de miR-93-5p, une durée prolongée de fièvre et une utilisation prolongée d'antibiotiques comme des facteurs associés aux lésions du système digestif durant l'infection à MP (Tableau 3 ; P < 0,05).
Figure 1 : Expression et valeur diagnostique de miR-93-5p chez les témoins sains (n = 60) et les patients atteints de MPP (n = 108). (A) L'expression de miR-93-5p était diminuée chez les patients atteints de MPP. (B) Analyse par courbe ROC de miR-93-5p. Veuillez cliquer ici pour visualiser une version agrandie de cette figure.
Figure 2 : Effets fonctionnels du miR-93-5p dans le modèle cellulaire infecté par MP. (A) L'expression du miR-93-5p était diminuée dans le modèle infecté par MP. (B) La viabilité cellulaire était réduite dans le modèle infecté par MP. (C) Les niveaux de TNF-α et d'IL-6 étaient augmentés dans le modèle infecté par MP. (D) Efficacité de la transfection du mimétique du miR-93-5p. (E) La viabilité cellulaire était augmentée suite à la surexpression du miR-93-5p. (F) Les niveaux de TNF-α et d'IL-6 étaient diminués suite à la surexpression du miR-93-5p. n = 3. P < 0,05, P < 0,01, P < 0,001. Veuillez cliquer ici pour consulter une version agrandie de cette figure.
Figure 3 : Le miR-93-5p cible directement TLR4. (A) Site de liaison prédit entre le miR-93-5p et TLR4. (B) Expression de TLR4 dans le modèle infecté par MP. (C) Essai rapporteur double-luciférase. (D) Régulation négative de TLR4 par le miR-93-5p. (E) Efficacité de la surexpression de TLR4. (F) Analyse par immunoblotting de IκBα. (G) Viabilité cellulaire. (H) Niveaux de TNF-α et d'IL-6. n = 3. P < 0,05, P < 0,01, P < 0,001. Veuillez cliquer ici pour consulter une version agrandie de cette figure.
Figure 4 : Expression et valeur diagnostique du miR-93-5p chez les patients atteints de PPM (n = 60) et chez les patients atteints de PPM avec IDS (n = 48). (A) Expression du miR-93-5p dans le groupe PPM+IDS. (B) Analyse par courbe ROC du miR-93-5p. Veuillez cliquer ici pour visualiser une version agrandie de cette figure.
| Variable | Sain (n = 60) | MPP (n = 108) | P |
| âge (années) | 6,81 ± 3,14 | 7,12 ± 3,55 | 0,559 |
| sexe (masculin/féminin) | 28/32 | 49/59 | 0,872 |
| GB (× 109/L) | 7,27 ± 0,89 | 9,86 ± 1,36 | <0,001 |
| CRP (mg/L) | 2,35 ± 0,17 | 11,53 ± 2,01 | <0,001 |
| Neut % | 42,55 ± 5,62 | 56,51 ± 15,40 | <0,001 |
Tableau 1 : Comparaison des caractéristiques démographiques et des paramètres sanguins de routine entre les témoins sains et les patients atteints de PPM. Ce tableau résume les caractéristiques démographiques et les paramètres hématologiques de routine des témoins sains et des patients atteints de PPM, y compris l'âge, le sexe, les GB, le pourcentage de neutrophiles, le pourcentage d'éosinophiles, le pourcentage de basophiles et la CRP. Les comparaisons entre groupes et les valeurs de P correspondantes sont présentées.
| Variable | MPP (n = 60) | MPP+DSI (n = 48) | P |
| âge (années) | 6,88 ± 3,87 | 7,42 ± 3,11 | 0,441 |
| sexe (masculin/féminin) | 31/29 | 28/20 | 0,494 |
| GB ( × 109/L) | 8,9 ± 0,89 | 11,05 ± 0,76 | <0,001 |
| CRP (mg/L) | 10,94 ± 1,62 | 12,27 ± 2,22 | <0,001 |
| Neutrophiles (%) | 55,87 ± 14,75 | 57,32 ± 16,29 | 0,629 |
| Durée de la fièvre (jour) | 4,60 ± 1,83 | 7,26 ± 1,04 | <0,001 |
| Durée d'utilisation des antibiotiques (jour) | 4,65 ± 1,147 | 6,29 ± 0,771 | <0,001 |
Tableau 2 : Comparaison des caractéristiques démographiques et des paramètres sanguins de routine entre les patients atteints de PPM et les patients atteints de PPM+ISD. Ce tableau compare les caractéristiques démographiques, les paramètres hématologiques de routine et les caractéristiques cliniques pertinentes entre les patients présentant uniquement une PPM et ceux dont la PPM est compliquée par une ISD. Les comparaisons entre les groupes ainsi que les valeurs P correspondantes sont présentées.
| Variable | OR | IC à 95 % | Valeur p | |
| inférieur | supérieur | |||
| miR-93-5p (faible par rapport à élevé) | 6,702 | 1,487 | 30,211 | 0,013 |
| âge | 1,126 | 0,286 | 4,437 | 0,866 |
| sexe | 1,071 | 0,27 | 4,248 | 0,923 |
| Durée de la fièvre | 73,416 | 15,018 | 358,895 | <0,001 |
| Durée d'utilisation des antibiotiques | 7,921 | 1,877 | 33,421 | 0,005 |
Tableau 3 : Analyse de régression logistique des enfants atteints d'une infection à MP compliquée par une atteinte du système digestif. Ce tableau présente les résultats de l'analyse de régression logistique évaluant les facteurs associés à une atteinte du système digestif chez les enfants infectés par MP. L'analyse inclut l'OR, l'IC à 95 % et la valeur P pour chaque variable.
Abréviations : Baso %, pourcentage de basophiles ; CI, intervalle de confiance ; CRP, protéine C-réactive ; DSI, lésion du système digestif ; Eos %, pourcentage d'éosinophiles ; IκBα, inhibiteur kappa B alpha ; IL-6, interlukine-6 ; MP, Mycoplasma pneumoniae ; MPP, pneumonie à Mycoplasma pneumoniae ; NC, contrôle négatif ; Net %, pourcentage de neutrophiles ; oe-TLR4, surexpression de TLR4 ; OR, rapport de cotes ; ROC, caractéristique de fonctionnement du récepteur ; TLR4, récepteur de type Toll 4 ; TNF-α, facteur de nécrose tumorale-α ; WBC, numération des globules blancs.
DISPONIBILITÉ DES DONNÉES :
Les données numériques brutes à l'origine des figures et des tableaux sont fournies sous forme de Tableau Supplémentaire 1.
Tableau supplémentaire 1 : Données numériques brutes des figures et tableaux. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.
Discussion
Bien qu'il soit principalement considéré comme un agent pathogène pulmonaire, l'infection à MP peut provoquer diverses complications extrapulmonaires affectant plusieurs systèmes organiques au-delà des poumons19,20. Des données récentes suggèrent une interaction selon l'axe poumon-intestin, dans lequel les médiateurs inflammatoires libérés lors de la pathologie pulmonaire perturbent l'équilibre de la flore intestinale21 et la fonction intestinale22. Ce jeu d'interactions bidirectionnel souligne l'importance d'une évaluation globale du patient, prenant en compte à la fois les symptômes respiratoires et la santé gastro-intestinale. Les biomarqueurs sériques circulants ont donc suscité un intérêt croissant en tant qu'outils peu invasifs possédant une valeur diagnostique ou pronostique potentielle23,24. Les ARN interférents (miARN) se sont révélés des candidats prometteurs en raison de leur stabilité et de leur rôle dans la régulation des voies de signalisation liées à l'inflammation impliquées dans la pathogenèse du MP25,26,27. Cette étude a exploré de manière systématique le rôle et l'importance clinique du miR-93-5p dans la pneumonie à mycoplasmes chez l'enfant, notamment lorsqu'elle est compliquée par une atteinte du système digestif. Les taux de miR-93-5p étaient diminués chez les enfants atteints de PPM par rapport aux témoins sains, et encore davantage réduits chez ceux présentant une atteinte du système digestif. Ces résultats indiquent un rôle potentiel de la dysrégulation du miR-93-5p dans la pathologie pulmonaire, ainsi que sa possible utilisation comme biomarqueur des manifestations extrapulmonaires.
Les ARNmi ont démontré une valeur diagnostique dans la pneumonie sévère, avec une sensibilité, une spécificité et une précision diagnostique globale prometteuses28,29. Cliniquement, les enfants atteints de PPM compliquée par une atteinte digestive (DSI) présentaient une durée de fièvre plus longue et un traitement antibiotique prolongé par rapport à ceux sans complications digestives. Des taux plus faibles de miR-93-5p étaient indépendamment associés à l'atteinte du système digestif, en plus de ces paramètres cliniques, dans une analyse de régression logistique multivariée. De plus, l'analyse de la courbe ROC a montré une performance diagnostique satisfaisante de l'ARNmi-93-5p sérique pour distinguer les patients atteints de PPM avec DSI de ceux sans DSI. Ainsi, la mesure de l'ARNmi-93-5p pourrait offrir une valeur ajoutée pour l'identification précoce et la stratification du risque dans les infections à mycoplasmes chez l'enfant.
En ce qui concerne les performances diagnostiques du miR-93-5p circulant par rapport aux marqueurs inflammatoires cliniques habituels, les résultats suggèrent que le miR-93-5p pourrait offrir une valeur complémentaire plutôt que de remplacer les indicateurs conventionnels. La protéine C-réactive (CRP) et la procalcitonine (PCT) restent des biomarqueurs couramment utilisés en pratique clinique pour évaluer la gravité de l'infection et guider le traitement antibiotique, des méta-analyses montrant que la PCT présente une précision diagnostique légèrement supérieure à celle de la CRP dans la pneumonie bactérienne30. Toutefois, ces réactants de phase aiguë sont largement non spécifiques, car ils réagissent à divers stimuli inflammatoires et ne permettent pas de distinguer de manière fiable l'infection à MP des autres pathogènes respiratoires ni de refléter spécifiquement le risque de complications extrapulmonaires. En revanche, le miR-93-5p, en tant que molécule régulatrice associée à la voie de signalisation TLR4/nuclear factor kappa B (NF-κB), pourrait fournir des informations physiopathologiques distinctes qui complètent les marqueurs conventionnels. La corrélation entre le miR-93-5p et la CRP a été rapportée comme relativement faible (r de Pearson = 0,2698), suggérant que le miR-93-5p pourrait refléter un aspect différent de la réponse inflammatoire par rapport à la réponse systémique de phase aiguë.
Des preuves émergentes provenant de modèles animaux ont démontré que l'infection par Mycoplasma pneumoniae peut induire non seulement une pathologie respiratoire, mais aussi des lésions du système digestif via l'axe pulmonaire-intestinal, médié par la flore intestinale31. Chez des souris infectées par MP, des lésions pathologiques au niveau des poumons et du côlon ont été observées, accompagnées de modifications de la composition du microbiote intestinal, notamment une diminution de l'abondance de bactéries bénéfiques telles que Corynebacterium glutamicum et une augmentation de l'abondance de pathogènes potentiels tels que le Lachnospiraceae NK4A136 group et Escherichia-Shigella, ainsi qu'une élévation des concentrations de lipopolysaccharide (LPS) dans le contenu colique et dans le sang32. On a également rapporté que la baïcaline atténue l'inflammation pulmonaire et régule la flore intestinale chez des souris atteintes de MPP par l'intermédiaire de la voie TLR4/NF-κB, ce qui soutient le rôle de cette cascade de signalisation dans la communication croisée entre poumons et intestins33. Ces résultats sont compatibles avec un rôle possible de la signalisation NF-κB dans l'axe miR-93-5p/TLR4 étudié dans le présent travail.
Au niveau mécanistique, TLR4, un médiateur clé de l'immunité innée associé aux réponses pro-inflammatoires34,35,36,37, était surexprimé durant l'infection à MP. Une expression accrue de TLR4 s'accompagnait d'une augmentation des niveaux des cytokines inflammatoires IL-6 et TNF-α et d'une réduction de la viabilité des cellules épithéliales. La surexpression de miR-93-5p a supprimé l'expression de TLR4, atténué la libération des cytokines inflammatoires et amélioré la survie cellulaire en conditions infectieuses. Par conséquent, la diminution de l'expression de miR-93-5p chez les patients atteints de MPP, en particulier ceux présentant une atteinte du système digestif, pourrait être associée à une activation accrue de la signalisation inflammatoire médiée par TLR4 et à des réponses inflammatoires systémiques plus étendues. Les résultats actuels n'établissent pas l'activation de la voie NF-κB en aval, car les formes phosphorylées de IκBα et de p65 n'ont pas été évaluées.
Plusieurs limites de cette étude doivent être reconnues. Premièrement, il s'agissait d'une étude monocentrique avec une taille d'échantillon relativement petite, en particulier pour le sous-groupe DSI, ce qui pourrait limiter la puissance statistique et la généralisabilité. Une validation externe dans des cohortes plus larges et multicentriques est nécessaire pour confirmer ces résultats et établir des seuils cliniques fiables. Deuxièmement, bien que l'IκBα ait été détecté par immunotransfert, une validation complète d'autres composants en aval de la voie TLR4/NF-κB, notamment MyD88, p-IκBα et p65, n'a pas été réalisée. Une validation au niveau protéique de ces composants de signalisation renforcerait l'interprétation mécanistique. Troisièmement, le dispositif observationnel ne permet pas d'établir une relation causale ; des expériences de perte et de gain de fonction, incluant des mimiques ou inhibiteurs d'ARNmi in vitro ou in vivo, sont nécessaires pour déterminer si le miR-93-5p contribue directement aux lésions digestives associées à la PAM. Quatrièmement, les expériences in vitro ont été menées sur des cellules épithéliales pulmonaires A549. Bien que ce modèle soit adapté à l'évaluation des effets anti-inflammatoires du miR-93-5p dans un contexte pulmonaire, il ne peut pas modéliser directement la pathologie gastro-intestinale. L'association proposée entre la signalisation pulmonaire miR-93-5p/TLR4 et les manifestations digestives, potentiellement médiée par l'axe poumon-intestin, nécessite une validation directe dans des modèles de cellules épithéliales intestinales, comme les cellules Caco-2, ainsi que dans des modèles animaux in vivo d'infection à MP. Enfin, les difficultés techniques liées à la détection des ARNmi, notamment la stabilité de l'ARN et les stratégies de normalisation, restent des obstacles à une mise en œuvre clinique routinière. Malgré ces limites, les résultats fournissent une base pour de futures études mécanistiques et des efforts de validation à grande échelle.
En conclusion, la surexpression de l'ARNm miR-93-5p a atténué l'inflammation induite par les MP dans les cellules épithéliales pulmonaires par inhibition de TLR4. Sur le plan clinique, une diminution des niveaux circulants de miR-93-5p était associée à une lésion du système digestif chez les enfants atteints de MPP, suggérant un rôle potentiel comme biomarqueur complémentaire pour identifier les patients à risque de complications gastro-intestinales.
Déclarations de divulgation
Les auteurs déclarent qu'ils n'ont aucun conflit d'intérêts.
Matériaux
| Nom | Entreprise | Numéro de catalogue | Commentaires |
|---|---|---|---|
| Lignée cellulaire humaine d'épithélium alvéolaire A549 | ATCC, USA | Cat# CCL-185 ; RRID : CVCL_0023 | Lignée cellulaire d'épithélium alvéolaire humain utilisée pour le modèle in vitro de MPP |
| Anticorps anti-GAPDH | Hangzhou XianZhi Biological Technology, Chine | Cat# AB-P-R001 ; RRID : AB_3096355 | Anticorps primaire utilisé pour la détection de GAPDH comme contrôle de chargement en immunobuvardage |
| Anticorps anti-IκBα | Beyotime, Chine | Cat# AG2741 ; RRID : AB_3731391 | Anticorps primaire utilisé pour la détection de IκBα par immunobuvardage |
| Albumine sérique bovine (BSA) | Solarbio, Chine | Cat# A8012 | Réactif de blocage utilisé lors de l'immunobuvardage |
| Centrifugeuse | Thermo Fisher Scientific, USA | Multifuge X4 Pro ; Cat# 75016066 ; RRID : SCR_020726 | Centrifugeuse utilisée lors de la culture cellulaire et de la préparation des échantillons |
| Système d'imagerie chimiluminescente | Tanon, Chine | 5200Multi ; RRID : SCR_027114 | Système d'imagerie utilisé pour visualiser les signaux chimiluminescents de l'immunobuvardage |
| Système d'essai rapporteur Dual-Luciferase | Promega, USA | Cat# E1910 | Utilisé pour mesurer l'activité de la luciférase de luciole et de Renilla |
| Sérum de veau fœtal (FBS) | Gibco, USA | Cat# A5256701 | Complément sérique pour le milieu de culture cellulaire |
| Anticorps secondaire caprin anti-lapin IgG conjugué à la HRP | Cell Signaling Technology, USA | Cat# 7074 ; RRID : AB_2099233 | Anticorps secondaire conjugué à la HRP utilisé pour l'immunobuvardage |
| GraphPad Prism | GraphPad Software | Version 10.1.2 ; URL : https://www.graphpad.com | Logiciel utilisé pour l'analyse statistique et la présentation graphique |
| Kit ELISA Interleukine-6 (IL-6) | Elabscience, Chine | Cat# E-EL-H6156 ; RRID : AB_3665145 | Kit ELISA utilisé pour quantifier l'IL-6 |
| Réactif de transfection Lipofectamine 3000 | Thermo Fisher Scientific | Cat# L3000015 | Réactif à base de lipides utilisé pour la transfection des cellules A549 |
| Lecteur de microplaques | Tecan, Suisse | Infinite M Plex ; RRID : SCR_026522 | Lecteur de microplaques utilisé pour mesurer la densité optique à 490 nm |
| Similaires de miR-93-5p | Ribobio, Chine | Cat# miR10000093-1-5 | Similaire synthétique de miR-93-5p utilisé pour la surexpression de miR-93-5p |
| Contrôle négatif de miR-93-5p | Ribobio, Chine | Cat# miR1N0000001-1-5 | Contrôle négatif pour la transfection par le similaire de miR-93-5p |
| Kit d'essai de prolifération et de cytotoxicité cellulaire MTT | Beyotime, Chine | Cat# C0009S | Utilisé pour évaluer la viabilité cellulaire |
| Souche standard de Mycoplasma pneumoniae ATCC 15531 | ATCC, USA | Cat# 15531 | Souche standard de M. pneumoniae utilisée pour établir le modèle d'infection |
| Vecteur rapporteur luciférase pGL3-Basic | Promega, USA | Cat# E1751 | Vecteur rapporteur utilisé pour le dosage rapporteur dual-luciférase |
| Solution tampon phosphate (PBS) | Solarbio, Chine | Cat# IP9212 | Tampon utilisé pour le lavage des cellules et la préparation des échantillons |
| Substrat Western Pierce ECL | Thermo Scientific, USA | Cat# 32209 | Substrat chimiluminescent utilisé pour la détection en immunobuvardage |
| Milieu Pleuropneumonia-like organism (PPLO) | BD, USA | Cat# 255420 | Milieu de culture utilisé pour M. pneumoniae |
| Membre en fluorure de polyvinylidène (PVDF) | Bio-Rad | Cat# 1620177 | Membre utilisé pour le transfert des protéines lors de l'immunobuvardage |
| PrimeScript RT Master Mix (Perfect Real Time) | Takara Bio Inc., Japon | Cat# RR036A | Mélange maître de transcription inverse utilisé pour la synthèse d'ADNc |
| Kit de réactifs PrimeScript RT | Takara Bio Inc., Japon | Cat# RR037A | Kit de réactifs utilisé pour la transcription inverse |
| Système de PCR en temps réel | Applied Biosystems, USA | QuantStudio 3 Real-Time PCR System ; RRID : SCR_020238 | Instrument de PCR en temps réel utilisé pour l'analyse qPCR |
| Milieu RPMI-1640 | Gibco, USA | Cat# 11875135 | Milieu de culture cellulaire utilisé pour les cellules A549 |
| SPSS | IBM | Version 27.0 ; RRID : SCR_016479 | Logiciel utilisé pour l'analyse statistique |
| Contrôle négatif pour la surexpression de TLR4 | Ribobio, Chine | NA | Contrôle négatif pour les expériences de surexpression de TLR4 |
| Plasmide de surexpression de TLR4 (oe-TLR4) | Ribobio, Chine | NA | Plasmide utilisé pour la surexpression de TLR4 |
| Réactif TRIzol | Invitrogen, Thermo Fisher Scientific | Cat# 15596026 | Réactif utilisé pour l'extraction d'ARN total |
| Kit ELISA Facteur de nécrose tumorale-α (TNF-α) | Elabscience, Chine | Cat# E-EL-H0109 ; RRID : AB_3665144 | Kit ELISA utilisé pour quantifier le TNF-α |
| Universal SYBR qPCR Master Mix | Takara Bio Inc., Japon | Cat# BL697A | Mélange maître utilisé pour la PCR quantitative |
| Système d'électrophorèse pour immunobuvardage | Bio-Rad, USA | Mini-PROTEAN Tetra Cell ; Cat# 1658004 | Système d'électrophorèse utilisé pour la séparation des protéines |
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