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Article de recherche

Identification des gènes pivots liés au vieillissement et aux mitochondries dans la cardiomyopathie dilatée

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DOI :

10.3791/72286

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25 août 2026

1Henan University of Chinese Medicine, 2The Second Affiliated Hospital of Henan University of Chinese Medicine

Dans cet article

Résumé

Ce protocole intègre des données transcriptomiques multidimensionnelles avec l'apprentissage automatique afin d'identifier des gènes liés au vieillissement et aux mitochondries dans la cardiomyopathie dilatée, pour la découverte de biomarqueurs et le sous-typage moléculaire.

Résumé

La cardiomyopathie dilatée (DCM) se caractérise par une dilatation du ventricule gauche et une dysfonction systolique, et est associée à un dysfonctionnement mitochondrial ainsi qu'à une activation immuno-inflammatoire. Toutefois, les signatures moléculaires liées au vieillissement et les voies régulatrices mitochondriales dans la DCM restent incomplètement comprises. Cette étude a analysé six jeux de données transcriptomiques en masse et un jeu de données de séquençage ARN unicellulaire provenant de la base de données Gene Expression Omnibus. Après normalisation des données, correction par lot et annotation des types cellulaires, les gènes candidats liés au vieillissement et aux mitochondries ont été identifiés à l’aide d’une analyse d’expression différentielle, d’une analyse de réseau de co-expression génique pondéré et de la construction d’un réseau d’interactions protéine-protéine. Les gènes centraux ont été sélectionnés davantage à l’aide d’une régression par l’opérateur de réduction et de sélection absolue minimale (LASSO), d’une forêt aléatoire et d’une élimination récursive de caractéristiques par machine à vecteurs de support. Des analyses d’infiltration des cellules immunitaires, de communication intercellulaire et de sous-typage moléculaire ont été réalisées afin de caractériser le microenvironnement immunitaire cardiaque dans la DCM. Un total de 66 gènes liés au vieillissement et de 16 gènes liés aux mitochondries ont été associés à la DCM et étaient principalement enrichis dans les voies de signalisation du facteur inductible par l’hypoxie-1, la phosphorylation oxydative et les voies liées à la synthase de l’oxyde nitrique. Des analyses par apprentissage automatique et par séquençage ARN unicellulaire ont identifié SERPINE1, TGFB2, CYBB et TLR2 comme gènes centraux. CYBB et TLR2 étaient fortement exprimés dans les monocytes et les macrophages, tandis que SERPINE1 et TGFB2 étaient principalement exprimés dans les cellules stromales. L’analyse du paysage immunitaire a révélé une activation accrue des macrophages pro-inflammatoires et une communication intercellulaire altérée dans les échantillons de DCM. Sur la base de l’expression des gènes centraux, les échantillons de DCM ont été divisés en deux sous-types moléculaires associés respectivement à la signalisation du facteur de croissance endothélial vasculaire et à la biosynthèse des acides biliaires primaires. Ce protocole fournit un cadre intégré pour l’identification de biomarqueurs candidats et de sous-types moléculaires dans la DCM.

Introduction

La cardiomyopathie dilatée (DCM) est un trouble myocardique caractérisé par une dilatation du ventricule gauche et une altération de la fonction systolique. Elle est la troisième cause la plus fréquente d'insuffisance cardiaque et l'indication principale de transplantation cardiaque dans le monde entier1. Des études basées sur des populations estiment une prévalence d'environ 1 cas pour 250 adultes, avec une prévalence plus élevée chez les hommes et une proportion importante de cas attribuable à des variants monogéniques2. Ces résultats indiquent que la susceptibilité génétique et les facteurs environnementaux contribuent tous deux à l'apparition et à la progression de la DCM.

La pathogenèse de la MDC implique des processus interconnectés, notamment l'activation inflammatoire, le stress oxydatif, l'apoptose des cardiomyocytes et une signalisation profibrotique dysrégulée. Des polymorphismes génétiques inflammatoires, notamment des variants du promoteur du facteur de nécrose tumorale-α, ont été associés à la susceptibilité à la MDC d'origine virale3. Une augmentation du stress oxydatif a également été associée à la mort des cardiomyocytes et à un dysfonctionnement du ventricule gauche dans différents sous-types humains de MDC4. De plus, une activation anormale des voies de signalisation Wnt/β-caténine et calcineurine/facteur nucléaire des lymphocytes T activés favorise l'hypertrophie myocardique et la fibrose interstitielle, contribuant ainsi à la progression de la maladie5,6. Le dysfonctionnement mitochondrial constitue un autre élément important de la MDC, car les cardiomyocytes ont des besoins énergétiques élevés. L'altération de la biogenèse mitochondriale, de l'homéostasie calcique, de la mitophagie et de l'intégrité de l'ADN mitochondrial peut compromettre la phosphorylation oxydative et contribuer à un dysfonctionnement cardiaque progressif7,8,9,10.

Malgré ces découvertes mécanistiques, des lacunes importantes subsistent dans les connaissances. En particulier, les relations temporelles et causales entre le remodelage structural des mitochondries et le dysfonctionnement bioénergétique durant l'initiation et la progression de la cardiomyopathie dilatée (DCM) n'ont pas été entièrement définies11. Plusieurs stratégies thérapeutiques ont été étudiées. La thérapie par cellules souches a montré un potentiel régénératif grâce à des effets paracrines, cytoprotecteurs et immunomodulateurs, mais l'optimisation des sources cellulaires, des voies d'administration et de la survie post-greffe reste nécessaire12. Les approches de thérapie génique, notamment la livraison basée sur le virus adéno-associé et l'édition du génome basée sur les répétitions palindromiques courtes régulièrement espacées en palindromes (CRISPR), offrent également des stratégies de traitement ciblé prometteuses. Toutefois, des limites liées à la tropisme cardiaque, à l'immunogénicité des vecteurs et à la sécurité à long terme restent à résoudre13.

Les jeux de données transcriptomiques publics provenant de référentiels tels que le Gene Expression Omnibus (GEO) sont largement utilisés pour la découverte de biomarqueurs dans la MCD. Ces ressources offrent un accès à des cohortes cliniques multicentriques, permettent des investigations rentables et reproductibles, et peuvent améliorer la puissance statistique grâce à l'intégration croisée des jeux de données14. Le profilage transcriptomique permet également le criblage de gènes candidats à l'échelle du génome, le sous-typage moléculaire et l'analyse au niveau des voies biologiques15. Toutefois, les jeux de données publics présentent des limites inhérentes, notamment des effets techniques liés aux lots, une hétérogénéité clinique et étiologique, une capacité limitée à établir des inférences causales, ainsi qu'une information longitudinale ou pronostique incomplète16. Par conséquent, les résultats obtenus à partir de jeux de données transcriptomiques publics conviennent surtout à la génération d'hypothèses et à la priorisation de biomarqueurs candidats, et nécessitent une validation dans des cohortes indépendantes et des modèles expérimentaux.

De nombreuses études bioinformatiques sur la MDC reposent principalement sur l'analyse de l'expression différentielle, méthode qui peut produire des résultats faussement positifs et ne caractérise pas pleinement les réseaux de co-expression génique ni l'hétérogénéité cellulaire au sein du tissu cardiaque. Pour pallier ces limites, la présente étude a mis en œuvre une stratégie analytique intégrée combinant des méthodes complémentaires. L'analyse transcriptomique globale fournit des profils d'expression au niveau tissulaire, adaptés aux comparaisons cas-témoins. L'analyse par réseau pondéré de co-expression génique (WGCNA) permet d'identifier des modules de gènes associés à des caractéristiques phénotypiques et de hiérarchiser des ensembles de gènes fonctionnellement liés plutôt que des gènes individuellement différentiellement exprimés. L'analyse du réseau d'interactions protéine-protéine (PPI) permet d'identifier les gènes fortement connectés en se basant sur la topologie du réseau. Trois algorithmes d'apprentissage automatique — la régression par sélection et contraction absolue minimale (LASSO), la forêt aléatoire et la machine à vecteurs de support avec élimination récursive des caractéristiques — ont été utilisés pour identifier des biomarqueurs candidats parmi les jeux de données intégrés¹⁷. Le séquençage de l'ARN à l'échelle de la cellule unique (scRNA-seq) a ensuite été utilisé pour examiner les profils d'expression spécifiques aux types cellulaires ainsi que les réseaux de communication intercellulaire18.

Bien que les dysfonctionnements mitochondriaux et les modifications moléculaires liées au vieillissement aient chacun été étudiés dans la cardiomyopathie dilatée (DCM), leurs associations combinées avec les modifications transcriptionnelles liées à la maladie restent insuffisamment explorées. La présente étude a intégré plusieurs jeux de données transcriptomiques en masse et en scRNA-seq afin d'identifier des gènes centraux liés au vieillissement et aux mitochondries dans la DCM, de caractériser le microenvironnement immunitaire cardiaque et d'analyser des sous-types moléculaires basés sur les gènes identifiés. Cette approche intégrée a permis de hiérarchiser des biomarqueurs candidats et de fournir une base pour des études mécanistiques et de validation ultérieures.

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Protocole

Toutes les procédures animales ont été examinées et approuvées par le Comité d'éthique des animaux de laboratoire du Deuxième Hôpital Affilié de l'Université de médecine chinoise du Henan (n° d'approbation : HNSZYYYJS2023011150). Toutes les procédures ont été réalisées conformément aux Lignes directrices pour l'évaluation éthique du bien-être des animaux de laboratoire (GB/T 35892-2018) et aux principes 3R de substitution, réduction et raffinement. Les réactifs, bases de données, logiciels et équipements utilisés dans cette étude sont répertoriés dans le Tableau des matériaux. 

1. Ressources de données et matériaux expérimentaux
Des souris transgéniques mâles CTNTR141W de qualité SPF, présentant un phénotype de cardiomyopathie dilatée spontanée (DCM) et un poids corporel de 25 ± 2 g, ont été utilisées comme groupe modèle. Des souris mâles C57BL/6J de qualité SPF, appariées par âge, avec un poids corporel de 25 ± 2 g, ont été utilisées comme groupe témoin. Chaque groupe comprenait 12 souris. Tous les animaux provenaient d'institutions titulaires de licences valides de production d'animaux de laboratoire et étaient élevés dans un environnement à barrière de qualité SPF à 22 ± 2 °C et une humidité relative de 40 % à 60 %, sous un cycle lumière/obscurité de 12 h, avec un accès libre à de la nourriture et de l'eau stériles. Après une semaine d'acclimatation, toutes les souris ont été maintenues dans les mêmes conditions pendant 4 semaines supplémentaires avant l'évaluation de la fonction cardiaque et la collecte d'échantillons. Toutes les souris avaient entre 6 et 8 semaines au début de l'expérience. Les souris ont été profondément anesthésiées puis euthanasiées par dislocation cervicale.

Sept jeux de données transcriptomiques publics de tissu myocardique du ventricule gauche provenant de patients atteints de cardiomyopathie dilatée (DCM) ont été récupérés à partir de la base de données Gene Expression Omnibus (GEO)19. Ces jeux de données comprenaient six jeux de données transcriptomiques en masse et un jeu de données de séquençage de l'ARN monocellulaire (scRNA-seq), GSE145154. Les fractions positives et négatives pour CD45 ont été incluses dans l'analyse. Les fractions cellulaires positives et négatives pour CD45 ont été combinées avant le regroupement. L'identité des échantillons a été utilisée comme variable principale de lot pour l'intégration Harmony. Des échantillons normaux du ventricule gauche et des échantillons de ventricule gauche atteint de DCM provenant de GSE145154 ont été inclus, spécifiquement GSM4307515, GSM4307516, GSM4307520 et GSM4307521. Les jeux de données utilisés dans cette étude étaient GSE145154, GSE5406, GSE42955, GSE57338, GSE79962, GSE116250 et GSE141910. Tous les échantillons autres que ceux de DCM ont été exclus, et seuls les échantillons témoins (groupe Témoin) et les échantillons de DCM (groupe DCM) ont été conservés. Aucun échantillon n’a été éliminé après le contrôle de qualité. Les informations sur les échantillons des jeux de données GEO inclus sont résumées comme suit : GSE5406 contenait 102 échantillons (16 témoins et 86 échantillons de DCM) ; GSE42955 contenait 17 échantillons (5 témoins et 12 échantillons de DCM) ; GSE57338 contenait 231 échantillons (136 témoins et 95 échantillons de DCM) ; GSE79962 contenait 20 échantillons (11 témoins et 9 échantillons de DCM) ; GSE116250 contenait 51 échantillons (14 témoins et 37 échantillons de DCM) ; et GSE141910 contenait 322 échantillons (161 témoins et 161 échantillons de DCM).

2. Prétraitement des données de transcriptome en masse
Les matrices d'expression brutes et les fichiers d'annotation clinique pour les six jeux de données en masse ont été téléchargés à l'aide du package GEOquery20. Les fichiers CEL bruts ont été récupérés pour les jeux de données de puces Affymetrix, et les matrices de comptages bruts ont été récupérées pour les jeux de données d'ARN-séquençage. La correction du bruit de fond, la normalisation par quantiles et le calcul de l'expression pour les données de puces ont été effectués à l'aide de l'algorithme robuste de moyenne multi-puce (RMA) implémenté dans le package affy21.

Les données de décompte de RNA-seq ont été normalisées à l'aide de la méthode de la moyenne tronquée des valeurs M dans le package edgeR22 et converties en valeurs logarithmiques en base 2 des décomptes par million. Les identifiants de sondes ont été convertis en symboles génétiques officiels à l'aide de fichiers d'annotation spécifiques à la plateforme. Lorsque plusieurs sondes étaient associées au même gène, la valeur moyenne d'expression a été calculée.

Les effets techniques de lot entre les jeux de données ont été éliminés à l'aide de l'algorithme ComBat du package sva23. La source du jeu de données et la plateforme de détection ont été indiquées comme facteurs de lot. Une analyse en composantes principales a été réalisée avant et après la correction des lots afin d'évaluer l'efficacité de la suppression des effets de lot.

3. Prétraitement des données de transcriptome en cellule unique et annotation cellulaire
La matrice d'expression génique provenant de GSE145154 a été importée dans Seurat afin de construire un objet Seurat à l'aide de la version 5 de Seurat24. Les cellules de faible qualité ont été exclues selon les seuils suivants : 200 à 6 000 gènes détectés par cellule, nombre total de descripteurs moléculaires uniques supérieur à 500, et pourcentage de gènes mitochondriaux inférieur à 25 %. Les cellules situées en dehors de ces seuils de contrôle qualité ont été exclues car considérées de faible qualité ou rompues. L'exclusion des cellules de faible qualité a été effectuée uniquement selon les seuils de contrôle qualité décrits ci-dessus.

Une normalisation logarithmique a été effectuée à l'aide de la fonction NormalizeData avec un facteur d'échelle de 10 000. Les 3 000 gènes les plus variables ont été sélectionnés à l'aide de la fonction FindVariableFeatures avec la méthode vst. Les données ont été mises à l'échelle à l'aide de ScaleData, suivies d'une analyse en composantes principales pour la réduction de dimensionnalité linéaire.

Les effets de lot ont été corrigés à l'aide de l'algorithme Harmony25 via la fonction RunHarmony, l'identité de l'échantillon étant précisée comme variable de regroupement. Les 15 premières composantes principales ont été utilisées pour regrouper les cellules à l'aide des fonctions FindNeighbors et FindClusters. Le regroupement a été effectué à l'aide de l'algorithme de Leiden avec une résolution de 0,15. La réduction non linéaire de la dimensionnalité et la visualisation ont été réalisées à l'aide de l'approximation uniforme de variétés et de la projection.

Les types cellulaires ont été annotés à l'aide de gènes marqueurs canoniques ainsi que par une annotation automatisée utilisant le package SingleR26. Les gènes marqueurs étaient les suivants : cellules B, IGKC, MS4A1 et CD79A ; cardiomyocytes, TNNI3, MYL2 et ACTC1 ; cellules endothéliales, VWF, PECAM1 et EGFL7 ; macrophages, C1QC, C1QB et C1QA ; monocytes, S100A8, S100A9 et G0S2 ; cellules natural killer, NKG7, GNLY et CCL5 ; cellules musculaires lisses, MYL9, TAGLN et ACTA2 ; cellules stromales, FBLN1, LUM et DCN ; et cellules T, CD3E, CD3G et CD3D.

4. Analyse de l'expression différentielle et score d'enrichissement des ensembles de gènes
Un modèle linéaire a été construit à l'aide du package limma27 afin de comparer l'expression génique entre les groupes atteints de CMD et les groupes témoins sains. Les gènes présentant une valeur P < 0,05 et un changement d'expression absolue supérieur à 1,5, correspondant à un changement d'expression logarithmique en base 2 (log₂) absolu supérieur à 0,58, ont été considérés comme significativement différemment exprimés.

Une analyse d'enrichissement de gènes à échantillon unique a été réalisée afin de calculer les scores d'enrichissement pour les ensembles de gènes liés au vieillissement et aux mitochondries dans chaque échantillon28. Les différences de scores d'enrichissement entre les groupes DCM et témoins sains ont été évaluées à l'aide du test de somme des rangs de Wilcoxon, un seuil de significativité statistique étant fixé à une valeur de P < 0,05.

Au niveau de la cellule unique, les scores des modules liés au vieillissement et aux mitochondries ont été calculés à l'aide de la fonction AddModuleScore dans Seurat. Les différences de scores de module entre les groupes ont été évaluées à l'aide du test de somme des rangs de Wilcoxon.

Les signatures génétiques associées au vieillissement ont été extraites de la base de données CellAge (https://genomics.senescence.info/cells/), et les ensembles de gènes liés aux mitochondries ont été obtenus à partir de GeneCards (https://www.genecards.org/). Les listes complètes des gènes utilisées pour le calcul du score sont fournies dans le fichier supplémentaire 1.

5. Construction du réseau de co-expression génique pondéré
Les 5000 gènes codant pour des protéines présentant la plus forte variance d'expression dans les données transcriptomiques globales ont été conservés pour la construction du réseau. La fonction pickSoftThreshold a été appliquée pour calculer l'indice d'ajustement à la topologie sans échelle sous plusieurs puissances de seuil doux. Le seuil optimal a été déterminé comme étant la puissance minimale permettant d'obtenir un réseau sans échelle dont la valeur de R2 est supérieure à 0,9. En conséquence, une puissance de seuil doux de β = 5 a été adoptée pour les analyses ultérieures du réseau.

Un réseau de co-expression pondéré et signé a été construit à l'aide de la fonction blockwiseModules avec une taille de module minimale de 30. Les coefficients de corrélation de Pearson ont été calculés entre chaque eigengène de module et le score d'enrichissement lié au vieillissement ou mitochondrial. Les modules présentant un coefficient de corrélation absolu supérieur à 0,4 et une valeur P < 0,001 ont été considérés comme des modules significativement associés.

Les gènes appartenant aux modules significativement associés ont été croisés avec les gènes différentiellement exprimés afin d'identifier les gènes candidats liés au vieillissement associé à la DCM et les gènes candidats mitochondriaux associés à la DCM.

6. Analyse d'enrichissement fonctionnel
Des analyses d'enrichissement fonctionnel, incluant les analyses de l'Ontologie Génétique (GO) et des voies de la Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes (KEGG), ont été réalisées sur les gènes candidats à l'aide du package clusterProfiler29. L'enrichissement GO couvrait les trois catégories standard : processus biologique, composant cellulaire et fonction moléculaire.

Toutes les analyses ont été effectuées avec l'annotation de l'espèce humaine, un taux de faux positifs (FDR) pour la correction de la valeur P, et un seuil de q-valeur de 0,05. Les ensembles de gènes ont été restreints à une plage de taille de 10 à 500 gènes, et les termes présentant un FDR < 0,05 ont été considérés comme statistiquement significatifs. Enfin, les résultats d'enrichissement GO ont été visualisés via des diagrammes en barres groupées, tandis que les résultats d'enrichissement KEGG ont été affichés à l'aide de graphiques en bulles.

7. Construction du réseau PPI et sélection des gènes centraux
Les gènes candidats ont été soumis à la base de données STRING version 11.530, avec l'organisme défini comme Homo sapiens et le seuil de confiance des interactions fixé à un score combiné supérieur à 0,7. Les nœuds déconnectés ont été masqués, et les données d'interaction ont été exportées au format de valeurs séparées par des tabulations.

Les données d'interaction ont été importées dans Cytoscape version 3.9.1 pour visualisation31. Les scores topologiques des nœuds ont été calculés à l'aide du module complémentaire CytoHubba32 selon trois algorithmes : Degré, composante de voisinage maximale et centralité de la clique maximale.

Les modules fonctionnels principaux du réseau ont été identifiés à l'aide du plugiciel MCODE33 avec les paramètres par défaut suivants : seuil de degré, 2 ; k-core, 2 ; seuil de score des nœuds, 0,2 ; et profondeur maximale, 100. Les gènes classés parmi les 10 premiers par les trois algorithmes topologiques ont été croisés avec les gènes du sous-réseau principal MCODE afin d'identifier les gènes centraux finaux d'interaction protéine-protéine.

8. Sélection des gènes centraux et construction du modèle diagnostique basées sur l'apprentissage automatique
Afin d'assurer la reproductibilité et une représentation équilibrée, le jeu de données transcriptomiques intégré a été divisé aléatoirement en ensembles d'apprentissage et de validation selon un ratio de 7:3, en utilisant une graine aléatoire fixe (seed = 123456). Cette répartition a été stratifiée selon le groupe de maladie (CMID par rapport au témoin) afin de maintenir des proportions de classes cohérentes dans les deux ensembles. Avant la division, les effets de lot provenant de différentes sources de jeux de données ont été corrigés à l'aide du package sva, et les échantillons intégrés ont été traités comme une cohorte unique durant l'affectation aléatoire.

Trois algorithmes d'apprentissage automatique ont été appliqués pour sélectionner des gènes candidats. Premièrement, une régression logistique LASSO a été effectuée via la fonction cv.glmnet du package glmnet34. Un modèle de classification binaire par validation croisée en cinq parties a été construit, l'AUC étant adoptée comme métrique d'évaluation. Les gènes présentant des coefficients non nuls à lambda.min ont été retenus comme gènes candidats.

Deuxièmement, un modèle de classification par forêt aléatoire composé de 500 arbres décisionnels a été construit à l'aide du package randomForest35. Le nombre de variables échantillonnées pour chaque division a été fixé à la racine carrée du nombre total de caractéristiques. L'importance des gènes a été quantifiée selon le coefficient de Gini, et les 10 gènes présentant les scores d'importance les plus élevés ont été conservés.

Troisièmement, l'analyse SVM-RFE a été mise en œuvre à l'aide de la fonction rfe du package caret.36Les nombres de caractéristiques ont été fixés entre 1 et 10, et une validation croisée à 5 plis a été utilisée pour l'apprentissage du modèle. Le sous-ensemble de gènes présentant la précision optimale en validation croisée a été sélectionné en fin de compte.

Les gènes identifiés par les trois algorithmes ont été définis comme les gènes mitochondriaux et liés au vieillissement constituant le noyau final de la MCD. Des modèles diagnostiques ont ensuite été construits à l'aide de 10 algorithmes de classification : arbre de décision, machine à renforcement par gradient, modèle linéaire généralisé renforcé, k-plus proches voisins, régression logistique, réseau de neurones, moindres carrés partiels, forêt aléatoire, machine à vecteurs de support et boosting extrême du gradient.

Des courbes de caractéristique de fonctionnement du récepteur ont été générées à l'aide du package pROC37. La surface sous la courbe, la précision, la sensibilité et la spécificité ont été calculées afin d'évaluer la performance diagnostique dans les jeux d'apprentissage et de validation.

Une analyse SHapley Additive exPlanations a été réalisée pour calculer la contribution de chaque gène central aux prédictions du modèle38. Des graphiques récapitulatifs et des graphiques en cascade par échantillon ont été générés. Un modèle diagnostique final présentant une aire sous la courbe supérieure à 0,8 dans l'ensemble de validation a été considéré comme ayant une bonne performance diagnostique.

9. Inférence de la communication cellule-cellule
Les réseaux de communication cellule-cellule dans le microenvironnement cardiaque ont été inférés à l'aide du package CellChat39. Un objet CellChat a été construit en utilisant la base de données CellChatDB.human. Les ligands et récepteurs différentiellement exprimés ont été identifiés à l'aide de identifyOverExpressedGenes, et les paires d'interactions significatives ont été filtrées à l'aide de identifyOverExpressedInteractions.

Les probabilités de communication entre les types de cellules ont été calculées à l'aide de computeCommunProb. Le réseau global de communication au niveau des types de cellules a été agrégé à l'aide de aggregateNet. Le nombre d'interactions et la force de communication entre chaque paire de types de cellules ont été quantifiés et visualisés à l'aide de cartes thermiques et de diagrammes en barres.

10. Quantification de l'infiltration des cellules immunitaires
Des scores d'enrichissement pour 28 types de cellules immunitaires ont été calculés pour chaque échantillon global à l'aide d'une analyse d'enrichissement de gènes par ensemble de gènes spécifique à une cellule immunitaire28 et d'un ensemble de gènes signatures de cellules immunitaires40. Le test de Wilcoxon a été utilisé pour comparer les scores d'enrichissement des cellules immunitaires entre les groupes atteints de CMD et les groupes témoins sains. Une valeur de P < 0,05 a été considérée comme statistiquement significative.

Une analyse de corrélation de Pearson a été réalisée pour évaluer l'association entre les niveaux d'expression des gènes centraux et les scores d'enrichissement des cellules immunitaires. Toutes les corrélations ayant une valeur de P < 0,05 ont été considérées comme statistiquement significatives.

11. Clustering de consensus pour la sous-typage moléculaire
Un clustering de consensus non supervisé des échantillons de DCM a été réalisé à l'aide des profils d'expression génique principaux via le package ConsensusClusterPlus41. Les paramètres de clustering ont été définis avec un nombre maximal de clusters fixé à 6, 1000 itérations de rééchantillonnage et une proportion de rééchantillonnage de 0,8. Le partitionnement autour des médoides avec distance euclidienne a été utilisé pour le clustering, et une graine aléatoire fixe a été appliquée afin d'assurer la reproductibilité.

Le nombre optimal de sous-types a été déterminé à partir du tracé de la variation de la surface et des scores de stabilité du regroupement par consensus, avec une valeur finale de K = 2. Une analyse en composantes principales a ensuite été réalisée afin de confirmer la séparation nette des deux sous-types moléculaires.

Une analyse de la variation des ensembles de gènes42 a été appliquée pour calculer les scores d'enrichissement des voies KEGG spécifiques à chaque échantillon. Le package limma27 a été utilisé pour détecter l'activation différentielle des voies entre les sous-types, et une valeur P inférieure à 0,05 a été considérée comme statistiquement significative.

12. Évaluation échocardiographique de la fonction cardiaque
Les souris ont été anesthésiées via injection intrapéritonéale de pentobarbital sodique à 1 % (30 mg/kg) et fixé en position supine sur une table opératoire thermostatée. Après épilation thoracique, du gel de couplage échographique a été appliqué uniformément sur la région précordiale.

Une échographie en mode M guidée en deux dimensions a été réalisée au niveau des muscles papillaires du ventricule gauche à l'aide d'un système d'échographie pour petits animaux. Trois cycles cardiaques stables consécutifs ont été enregistrés afin de mesurer le diamètre diastolique final, le diamètre systolique final, la fraction d'éjection et le raccourcissement fractionné du ventricule gauche. Toutes les évaluations échocardiographiques ont été effectuées en aveugle par un ultrasonographe professionnel.

Trois souris ont été sélectionnées aléatoirement dans chaque groupe pour un examen échocardiographique, et ces 6 animaux au total ont ensuite été sacrifiés pour la collecte de tissu myocardique et la mesure par ELISA. Les animaux expérimentaux restants ont subi des tests de laboratoire parallèles supplémentaires, et leurs données n'ont pas été incluses dans la présente étude.

13. Prélèvement du tissu myocardique, extraction des protéines et dosage immunoenzymatique
Après l'évaluation échocardiographique, les souris ont été euthanasiées sous anesthésie profonde. Les tissus cardiaques ont été prélevés rapidement. via thoracotomie médiane, et le myocarde du ventricule gauche a été disséqué sur glace. Les tissus isolés ont été soigneusement rincés avec une solution saline tamponnée au phosphate glacée pour éliminer le sang intracardiaque résiduel. Après élimination du liquide excédentaire à l’aide de papier filtre stérile, les échantillons ont été immédiatement congelés par trempe dans l’azote liquide et stockés à −80 °C pour une extraction protéique ultérieure, en évitant strictement les cycles répétés de congélation-décongélation.

Les tissus myocardiques congelés ont été pesés et découpés en fragments d'environ 1 mm3 sur de la glace. Les tissus ont été lysés dans un tampon de lyse RIPA glacé contenant des inhibiteurs de protéase et de phosphatase, selon un rapport standardisé de 100 µL de tampon pour 10 mg de tissu. Les échantillons ont été homogénéisés complètement par voie mécanique sur de la glace, puis incubés pendant 30 min afin d'obtenir une lyse cellulaire complète.

Les lysats ont été centrifugés à 12 000 × g pendant 15 min à 4 °C. Les surnageants obtenus ont été recueillis dans des tubes exempts d'enzymes, et la concentration totale en protéines a été quantifiée à l'aide d'un kit de dosage des protéines par l'acide bicinchoninique, conformément aux protocoles du fabricant. Tous les échantillons ont été normalisés à une concentration identique en protéines à l'aide du tampon de lyse.

Les niveaux d'expression protéique des quatre gènes centraux dans les lysats myocardiques ont été mesurés à l'aide des kits correspondants de dosage immunoenzymatique (ELISA). Des étalons dilués en série et des lysats tissulaires normalisés ont été ajoutés en double (100 µL par puits) dans des microplaques prérecouvertes. Les plaques ont été incubées pendant 2 h à température ambiante, puis soigneusement lavées avec le tampon de lavage fourni avec le kit.

Chaque puits a reçu un anticorps conjugué à une enzyme et a été incubé pendant 1 h à température ambiante, suivi d'un lavage complet. Une solution de chromogène substrat a ensuite été ajoutée, et les plaques ont été incubées pendant 20 min à température ambiante à l'abri de la lumière. La réaction colorimétrique a été arrêtée à l'aide de la solution d'arrêt, et les valeurs d'absorbance ont été mesurées à 450 nm (longueur d'onde de référence : 570 nm) à l'aide d'un lecteur de microplaques à longueur d'onde complète.

14. Analyse statistique
Toutes les analyses statistiques et visualisations de données ont été réalisées à l'aide de R version 4.2.3. Pour les mesures de concentration par ELISA de chaque gène cible (TGFB2, SERPINE1, CYBB, TLR2), le test de Shapiro-Wilk a d'abord été appliqué afin d'évaluer la normalité des données dans les groupes Témoin et MCD séparément. Ensuite, un test F a été utilisé pour évaluer l'homogénéité des variances entre les deux groupes. La méthode de comparaison intergroupe a été déterminée selon les résultats du test d'homogénéité des variances : si les variances étaient homogènes (P ≥ 0,05), un test t de Student non apparié a été utilisé pour comparer les moyennes entre les groupes ; si les variances étaient hétérogènes (P < 0,05), le test t de Welch corrigé a été employé pour l'analyse. Tous les tests étaient bilatéraux, et le seuil de significativité statistique a été fixé à P < 0,05. Les données ont été représentées sous forme de boîtes à moustaches superposées avec des points individuels dispersés. Les valeurs P de tous les tests ainsi que le type de test t utilisé ont été indiqués en détail sur chaque graphique.

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Résultats

Prétraitement des données et analyse d'expression différentielle
Les six jeux de données transcriptomiques en bloc ont subi un prétraitement normalisé et une correction des effets de lot avant l'analyse en aval. Les données de puces à ADN ont été normalisées à l'aide de l'algorithme de moyenne robuste multi-puce, tandis que les données de comptage issues de l'ARN-séquençage ont été normalisées selon la méthode de la moyenne tronquée des valeurs M. L'algorithme ComBat a été appliqué pour éliminer les ...

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Discussion

Le flux de travail intégré et multicouche combinait une méta-analyse de transcriptomique globale, la construction d'un réseau de co-expression génique pondéré, un apprentissage automatique ensembliste, une validation par transcriptomique unicellulaire et une vérification in vivo sur un modèle animal. Quatre gènes centraux liés au vieillissement et aux mitochondries — CYBB, SERPINE1, TGFB2 et TLR2 — ont été identifiés comme biomarqueurs diagnostiques candidats pour la cardiomyopathie dilatée (DCM). L'intégration ...

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Déclarations de divulgation

L'auteur déclare ne pas avoir d'intérêts concurrents.

Remerciements

Nous remercions sincèrement pour les données accessibles au public fournies par la base de données Gene Expression Omnibus. Nous remercions également les relecteurs et les rédacteurs pour leurs commentaires constructifs sur le manuscrit. Ce travail a été soutenu par le projet provincial de recherche scientifique de niveau départemental (subvention n° 2021JDZX2026), « Mécanisme de la formule Yiqi Huoxue dans l'atténuation du remodelage vasculaire athéroscléreux via la régulation inflammatoire médiée par KLF2-Nrf2 ».

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
Gel d'échographie Aquasonic ClearParker Laboratories, Inc.Mar-34Utilisé pour l'imagerie échocardiographique chez les petits animaux.
Kit d'analyse des protéines BCAThermo Fisher Scientific23227Détection à 562 nm ; plage, 20–2 000 µg/mL ; utilisé pour la quantification totale des protéines dans les lysats cardiaques de souris.
Base de données CellAgeRessources génomiques sur le vieillissement humainhttps://genomics.senescence.info/cells/Source de signatures génétiques liées au vieillissement.
CytoHubba, greffon CytoscapeBoutique d'applications CytoscapeVersion 0.1Utilisé pour le score de topologie des nœuds dans les réseaux d'interactions protéine-protéine.
CytoscapeConsortium CytoscapeVersion 3.9.1Utilisé pour la visualisation des réseaux d'interactions protéine-protéine.
Lecteur de microplaque à spectre completThermo Fisher ScientificMultiskan FCUtilisé pour mesurer l'absorbance dans les dosages ELISA.
Gene Expression OmnibusCentre national pour les ressources en biotechnologiehttps://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/Référentiel public utilisé pour obtenir des jeux de données transcriptomiques.
GeneCardsInstitut Weizmann des scienceshttps://www.genecards.org/Source de jeux de gènes liés aux mitochondries.
Cocktail inhibiteur de protéases et de phosphatases Halt, 100×, sans EDTAThermo Fisher Scientific78441Conservé à 4 °C ; ajouté au tampon RIPA à raison de 10 µL/mL juste avant utilisation.
Azote liquideFournisseur local de gaz pour laboratoireNon applicableUtilisé pour la congélation rapide du tissu myocardique.
Souris mâles C57BL/6J de qualité SPF, âgées de 6–8 semaines, pesant 25 ± 2 gBeijing Vital River Laboratory Animal Technology Co., Ltd.Non applicableNuméro de licence de production animale SCXK (Jing) 2021-0006 ; utilisées comme témoins normaux.
Souris transgéniques mâles DCM CTNTR141W de qualité SPF, âgées de 6–8 semaines, pesant 25 ± 2 gInstitut des sciences des animaux de laboratoire, Académie chinoise des sciences médicalesNon applicableNuméro de licence de production animale SCXK (Jing) 2021-0065 ; utilisées comme modèle spontané de DCM.
MCODE, greffon CytoscapeBoutique d'applications CytoscapeVersion 2.0.2Utilisé pour identifier les sous-réseaux fonctionnels centraux dans les réseaux d'interactions protéine-protéine.
Kit ELISA souris CYBBBiogradetechA-QEK09250-96wellsUtilisé dans cette étude pour mesurer CYBB dans les lysats tissulaires myocardiques de souris.
Kit ELISA souris PAI-1EK-BIOML30970Utilisé dans cette étude pour mesurer PAI-1, la protéine codée par SERPINE1, dans les lysats tissulaires myocardiques de souris.
Kit ELISA souris TGF-β2ElaBoXSEKM-0036Utilisé dans cette étude pour mesurer TGF-β2 dans les lysats tissulaires myocardiques de souris.
Kit ELISA souris TLR-2SolarbioSEKM-0163Utilisé dans cette étude pour mesurer TLR-2 dans les lysats tissulaires myocardiques de souris.
Solution tamponnée au phosphate, pH 7,4, sans calcium ni magnésiumBiological Industries02-024-1ACSSolution stérile 1× ; conservée à 4 °C ; utilisée pour le lavage et la dilution des tissus.
Package R : caretCRANVersion 6.0-94Utilisé pour l'élimination récursive de caractéristiques par machine à vecteurs de support.
Package R : CellChatDéveloppeurs de CellChatVersion 1.6.1Utilisé pour l'inférence des communications intercellulaires à partir de données de séquençage ARN unicellulaire.
Package R : clusterProfilerBioconductorVersion 4.8.3Utilisé pour l'analyse d'enrichissement fonctionnel.
Package R : ConsensusClusterPlusBioconductorVersion 1.64.0Utilisé pour le regroupement par consensus non supervisé.
Package R : edgeRBioconductorVersion 3.42.4Utilisé pour la normalisation des données de séquençage ARN par la méthode de la moyenne tronquée des valeurs M.
Package R : GEOqueryBioconductorVersion 2.68.0Utilisé pour télécharger des données à partir du Gene Expression Omnibus.
Package R : glmnetCRANVersion 4.1-8Utilisé pour la régression logistique par l'opérateur de sélection et de réduction absolue minimale.
Package R : limmaBioconductorVersion 3.56.2Utilisé pour l'analyse d'expression différentielle et la modélisation statistique.
Package R : pROCCRANVersion 1.18.5Utilisé pour l'analyse des courbes ROC (caractéristique de fonctionnement du récepteur).
Package R : randomForestCRANVersion 4.7-1.2Utilisé pour l'apprentissage automatique par forêts aléatoires.
Package R : SeuratCRANVersion 5.0.1Utilisé pour l'analyse des données de séquençage ARN unicellulaire.
Package R : SingleRBioconductorVersion 2.2.0Utilisé pour l'annotation automatisée des types cellulaires.
Package R : svaBioconductorVersion 3.48.0Utilisé pour la correction des effets de lot avec ComBat.
Centrifugeuse réfrigéréeSigma-AldrichSIGMA 3-KUtilisée pour la centrifugation des lysats tissulaires myocardiques.
Solution de lyse et d'extraction RIPAThermo Fisher Scientific89900Solution prête à l'emploi 1× ; conservée à 4 °C ; supplémentée avec des inhibiteurs de protéases et de phosphatases avant utilisation.
Système d'imagerie par ultrasons pour petits animauxVINNO Technology Co., Ltd.VINN06LABUtilisé pour l'évaluation échocardiographique de la fonction cardiaque.
Pentobarbital de sodiumSinopharm Chemical Reagent Co.20040428Préparé sous forme de solution à 1 %, 10 mg/mL, dans du sérum physiologique stérile ; utilisé pour l'anesthésie intrapéritonéale à 30 mg/kg.
Base de données STRINGConsortium STRINGVersion 11.5Utilisée pour la construction de réseaux d'interactions protéine-protéine.
Homogénéisateur de tissus TGrinder H24TIANGENOSE-TH-01Utilisé pour homogénéiser le tissu myocardique de souris dans du tampon RIPA à 6,0 m/s pendant 30–60 s, sur 2–3 cycles.
Plateforme animale thermostatée/table chauffante pour petits animauxShanghai Yuyan Scientific Instrument Co., Ltd.T-30350Utilisée pour maintenir les souris à 37 °C pendant l'échocardiographie ; plage de fonctionnement, de la température ambiante à 50 °C.

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