Ici, nous présentons un protocole pour la conception, l'assemblage et le fonctionnement d'un dispositif microfluidique en boucle fermée sans bulles destiné à la culture de cellules endothéliales sous des conditions d'écoulement physiologiques en microgravité simulée.
Article de méthode
Une plateforme pour la culture continue de cellules endothéliales sous conditions de flux physiologique en microgravité simulée
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11 septembre 2026
Dans cet article
Résumé
Résumé
Les systèmes microphysiologiques (MPS) sont des modèles in vitro précieux qui recréent la structure et la fonction des tissus humains. Plus précisément, les puces tissulaires ou organiques intégrant la technologie microfluidique reproduisent l’environnement mécanique et biochimique in vivo tout en permettant une surveillance en temps réel de la croissance et du développement cellulaires. Ces systèmes peuvent être particulièrement utiles pour les études en vol spatial, car ils peuvent être envoyés dans l’espace, par exemple à la Station spatiale internationale (ISS), afin d’étudier l’impact des voyages spatiaux sur le corps humain. Un obstacle majeur au bon fonctionnement des MPS est la formation de bulles, phénomène particulièrement marqué en microgravité. Cet article décrit la conception, l’assemblage et le fonctionnement d’un système de culture cellulaire microphysiologique destiné à être utilisé en microgravité simulée (par exemple, sur une machine de positionnement aléatoire ou un clinostat). L’intégration d’un piège à bulles indépendant de l’orientation dans le circuit fluidique s’est révélée très efficace pour éliminer les bulles d’air en microgravité et permettre une culture prolongée de cellules endothéliales. Ce système microfluidique fermé et indépendant de l’orientation peut être utilisé pour faire fonctionner sans bulles des puces tissulaires ou des organes-sur-puce, afin de simuler les effets combinés de la microgravité et du flux, ou pour être déployé lors de missions spatiales.
Introduction
Il est désormais bien établi, par des mécanismes encore en cours d'étude, que les forces mécaniques jouent un rôle essentiel dans la fonction cellulaire et dans le maintien de l'équilibre subtil entre santé et maladie1. Parmi tous les stress environnementaux, la force gravitationnelle est unique et est à juste titre considérée comme un vecteur constant et invariable dans la grande majorité des domaines de la science biomédicale. Toutefois, le vol spatial offre un environnement de microgravité particulier, dans lequel le comportement des organismes peut différer de celui observé sur Terre. Des expériences menées dans l'espace avec des animaux et des sujets humains révèlent des changements physiologiques importants, soulignant ainsi le rôle de la gravité dans l'homéostasie cellulaire et organisme entier2.
Récemment, la NASA et d'autres agences privées ont manifesté un intérêt considérable pour le développement de puces tissulaires (ou organes-sur-puces) destinées à être utilisées lors de missions spatiales.3. Les puces tissulaires sont conçues pour imiter le in vivo architecture, leur permettant de modéliser avec une grande fidélité l'impact physiologique et mécanistique de la microgravité et du rayonnement spatial4En utilisant des cellules provenant de donneurs, les puces tissulaires peuvent également servir à étudier la sensibilité de l'astronaute à la microgravité et aux radiations spatiales, et à élaborer des contre-mesures préventives5. Au cours des cinq dernières années, plusieurs systèmes organiques, notamment le cerveau, le foie, l'intestin, les vaisseaux sanguins, le cœur, le rein et les poumons, ont été modélisés à l'aide de puces tissulaires et lancés à bord de la Station spatiale internationale (ISS)6. In vivo, les organes sont perfusés par le système vascululaire à des degrés variables, ce qui détermine leur physiologie – par exemple, le foie est fortement vascularisé, tandis que le cartilage l'est beaucoup moins. Par conséquent, afin de reproduire fidèlement la fonction organique in vitro, une prise en compte importante dans le développement de systèmes « organe-sur-puce » est l'intégration d'un flux de fluide au sein des tissus et des cellules.
La microfluidique a été utilisée pour perfuser des cellules et des tissus dans des systèmes organe-sur-puce7,8. Des niveaux appropriés d'écoulement du fluide soutiennent non seulement le transport des nutriments vers l'intérieur du système et l'élimination des déchets, mais maintiennent également les contraintes de cisaillement physiologiques subies par les cellules. Toutefois, à de petites échelles, les bulles constituent un défi persistant aux interfaces de phase, entraînant des mesures inexactes, des dommages et des obstructions9. Pour atténuer ce problème, des pièges à bulles aux conceptions actives (par exemple, dégazage sous vide ou champs externes tels que des champs acoustiques ou thermiques) et passives (par exemple, une membrane semi-perméable dépendant des propriétés de surface) ont été utilisés10,11. Toutefois, ces conceptions de débullateurs microfluidiques augmentent la complexité de la fabrication du dispositif, compromettent l'intégrité de l'échantillon et provoquent des colmatages ainsi que des ruptures de la barrière. Ces problèmes s'aggravent dans l'espace, où la nucléation et la formation de bulles sont beaucoup plus marquées, et où les stratégies d'atténuation des bulles efficaces sur Terre deviennent largement inefficaces12. Des analogues terrestres de la microgravité peuvent être générés à l'aide d'appareils tels qu'un réacteur à paroi tournante (RWV) ou une machine de positionnement aléatoire (RPM)13,14. Notamment, dans la RPM, le vecteur gravitationnel est continuellement réorienté, annulant ainsi presque entièrement le stimulus gravitationnel net moyenné dans le temps sur l'échantillon. Nous avons récemment décrit la conception, la fabrication et l'application d'un piège à bulles indépendant de l'orientation pour la culture en perfusion de cellules endothéliales sous microgravité simulée à l'aide d'une RPM15. Dans cet article, nous détaillons l'assemblage et le fonctionnement étape par étape d'un système de perfusion en boucle fermée utilisant ce piège à bulles indépendant de l'orientation, et nous démontrons son applicabilité pour la culture de cellules endothéliales de veine ombilicale humaine en tant que modèle de culture cellulaire continue en microgravité simulée.
Le système en boucle fermée est composé d'un microcontrôleur avec un pilote de moteur pour le fonctionnement de la micropompe contrôlée en fréquence et en tension, d'un capteur de débit de liquide, d'un piège à bulles15 et d'un canal microfluidique contenant des cellules endothéliales adhérentes. Les composants spécifiques sont détaillés dans le tableau des matériaux. Les protocoles ci-dessous décrivent l'assemblage de l'électronique du système (Étape 1), l'assemblage de la partie fluidique (Étape 2), la stérilisation et l'amorçage (Étapes 3 et 4), l'intégration de la culture cellulaire microfluidique (Étape 4), l'assemblage des micropompes et du contrôleur (Étape 5), ainsi que l'assemblage complet du système dans un boîtier (Étape 6). Le système de circulation en boucle fermée a été monté au-dessus du RPM afin de simuler la microgravité à l'aide d'un boîtier sur mesure (Étape 7).
Protocole
1. Électronique du système
- Connecter le pilote de pompe au microcontrôleur aux prises désignées marquées « mp-Highdriver4 ».
- Connecter un câble de pompe à l'emplacement désigné sur le côté du pilote de pompe marqué « CH1 CH2 ».
- Connecter une micropompe à l'un des ports du câble de pompe. Veiller à ce que le port de connexion blanc soit doucement tiré vers l'extérieur par rapport aux fils colorés afin d'insérer complètement la micropompe. Une fois la micropompe entièrement insérée dans le port de connexion, repousser délicatement le port de connexion blanc vers les fils colorés pour verrouiller la micropompe en place.
- Utiliser un câble USB macro-vers-mini pour connecter la carte Nano à un ordinateur sur lequel l'application du microcontrôleur est installée.
- Fixer deux raccords filetés à embout taraudé aux extrémités d'un capteur de débit de liquide. Utiliser le capteur de débit de liquide pour surveiller et enregistrer les données du débit du liquide. Le système assemblé est illustré dans Figure 1.
REMARQUE : Tous les composants de la section 1 doivent uniquement être remplacés si nécessaire, par exemple lorsqu'ils sont endommagés ou lorsque les performances commencent à se dégrader.
2. Raccordements fluidiques du système
- Remplir la cavité du piège à bulles indépendant de l'orientation à environ 80 % de sa capacité maximale avec le fluide opérationnel expérimental pendant la mise en service.
NOTE : Ce niveau de remplissage permet un taux de piégeage des bulles plus élevé tout en maintenant les ports d'entrée et de sortie immergés dans le fluide opérationnel. Le piège à bulles indépendant de l'orientation dispose de deux ports latéraux proches de son centre de gravité qui servent de connexions directes au système de circulation fermé, ainsi que d'un port supérieur compatible Luer qui permet un remplissage supplémentaire de la cavité lorsqu'il est ouvert. Avant le début de l'expérience, il est essentiel que le port supérieur du piège à bulles indépendant de l'orientation soit hermétiquement scellé à l'aide d'un ruban en téflon et d'un bouchon Luer afin d'assurer un système entièrement clos. - Couper quatre morceaux de tube en PVC de 10 cm de longueur (1,59 mm de diamètre intérieur × 3,18 mm de diamètre extérieur) pour relier entre eux tous les composants du circuit de circulation.
- Relier un morceau de tube en PVC à la sortie de la micropompe (la flèche indique le sens d'écoulement de l'entrée vers la sortie). Utiliser un entretoise ronde noire en nylon de 3 mm (3,2 mm de diamètre intérieur) autour du tube en PVC pour fixer solidement le tube à la micropompe. Relier l'autre extrémité du tube en PVC à l'un des ports latéraux du piège à bulles indépendant de l'orientation.
- Utiliser le deuxième morceau de tube en PVC pour relier l'autre port latéral du piège à bulles indépendant de l'orientation au raccord à emboîtement du capteur de débit liquide (la flèche indique le sens d'écoulement de l'entrée vers la sortie).
- Utiliser le troisième morceau de tube en PVC pour relier le raccord à emboîtement de sortie du capteur de débit liquide (c'est-à-dire le côté vers lequel pointe la flèche) à un raccord Luer coudé.
- Relier le dernier morceau de tube en PVC à l'entrée de la même micropompe (la flèche indique le sens d'écoulement de l'entrée vers la sortie). Utiliser un entretoise ronde noire en nylon de 3 mm (3,2 mm de diamètre intérieur) autour du tube en PVC pour fixer solidement le tube à la micropompe. Relier l'autre extrémité du tube en PVC à un raccord Luer coudé.
NOTE : Tous les tubes doivent être remplacés entre chaque expérience.
3. Préparation expérimentale et stérilisation du système
- Préparer une hotte de sécurité biologique pour le processus de stérilisation afin d'assurer une stérilité et une sécurité complètes pour la culture cellulaire.
- Préparer un tube de centrifugation autoportant de 50 mL contenant de l'éthanol à 70 % et un autre tube de centrifugation autoportant de 50 mL contenant de l'eau stérile pour culture cellulaire.
- Placer le microcontrôleur dans un petit sac en plastique, tout en laissant le câble de la pompe et la micropompe sortir du sac. Utiliser une bride de serrage pour fermer le sac plastique afin de protéger les composants électroniques.
- Utiliser un flacon pulvérisateur d'éthanol à 70 % et des essuie-tout pour stériliser l'extérieur de tous les composants du circuit de flux et de tous les matériaux expérimentaux divers. NE PAS utiliser l'éthanol à 70 % sur les connecteurs électriques. Placer chaque composant et matériau dans la hotte de sécurité biologique immédiatement après avoir été essuyé avec de l'éthanol à 70 %.
- Connecter une station informatique mobile au microcontrôleur à l’aide d’un câble USB de type macro à mini et ouvrir l’application informatique du microcontrôleur pour régler la fréquence et la tension des deux micropompes respectivement à 100 Hz et 240 V. Garder la micropompe éteinte.
- Plonger le raccord Luer coudé relié à la micropompe directement dans un tube de centrifugation autoportant de 50 mL contenant de l’éthanol à 70 %. Connecter une seringue de 12 mL munie d’un raccord Luer femelle-femelle à l’autre raccord Luer coudé du même circuit de flux.
- Pincer manuellement la longueur de tube en PVC reliant la micropompe au raccord Luer coudé, et s’assurer que l’orifice supérieur du piège à bulles indépendant de l’orientation est scellé avec du ruban téflon et un bouchon Luer. Utiliser l’autre main pour tirer la seringue de 12 mL d’environ 5 mL afin de créer un vide suffisant dans tout le système.
- Activer la micropompe et relâcher la pince de l’étape précédente. Laisser passer 5 mL d’éthanol à 70 % jusqu’à la seringue afin de garantir une stérilisation complète du système.
- Ouvrir l’orifice supérieur du piège à bulles indépendant de l’orientation pour lui permettre de se remplir d’éthanol à 70 %. Une fois que le piège à bulles indépendant de l’orientation est rempli à environ 80 % d’éthanol à 70 %, arrêter la pompe et sceller complètement l’orifice supérieur avec du ruban téflon et un bouchon Luer. Agiter doucement le piège à bulles indépendant de l’orientation pour s’assurer que l’intérieur est entièrement stérilisé.
- Retirer le raccord Luer coudé du tube de centrifugation contenant de l’éthanol à 70 % et activer la micropompe pour vider le système. Une fois que tout l’éthanol à 70 % a été aspiré dans la seringue de 12 mL, déconnecter le piège à bulles indépendant de l’orientation du système, retirer le bouchon Luer et vider directement le piège à bulles indépendant de l’orientation dans un récipient de déchets afin d’éliminer l’éthanol à 70 %.
- Répéter les étapes 3.6 à 3.10 en utilisant le tube de centrifugation autoportant de 50 mL contenant de l’eau stérile pour culture cellulaire au lieu de l’éthanol à 70 %, et laisser passer 15 mL d’eau stérile pour culture cellulaire dans chaque circuit de flux.
4. Amorçage du système et intégration du canal cellulaire microfluidique
- Une fois la stérilisation terminée, maintenir le système dans la hotte de sécurité biologique pour l'amorçage sous vide avec le fluide de travail.
- Plonger directement dans un récipient en plastique (dimensions approximatives : 80 mm × 50 mm × 25 mm) rempli de 30 mL de milieu de culture cellulaire le raccord coudé Luer connecté à la micropompe. Connecter la seringue de 12 mL à l'autre raccord coudé Luer du même circuit de flux à l’aide d’un raccord Luer femelle-femelle.
- Utiliser l’index et le pouce de la main gauche pour pincer la portion de tube en PVC Tygon reliant la micropompe au raccord coudé Luer, et utiliser la main droite pour tirer la seringue de 12 mL d’environ 5 mL afin de créer un vide suffisant dans tout le système. S’assurer que l’orifice supérieur du piège à bulles indépendant de l’orientation est obturé avec du ruban téflon et un bouchon Luer.
- Allumer la micropompe et relâcher le pincement effectué à l’étape précédente. Laisser passer 5 mL de milieu de culture cellulaire jusqu’à la seringue afin de garantir un amorçage complet du système.
- Ouvrir l’orifice supérieur du piège à bulles indépendant de l’orientation pour lui permettre de se remplir de milieu de culture cellulaire. Une fois que le piège à bulles indépendant de l’orientation est rempli à environ 80 % de milieu de culture cellulaire, arrêter la pompe et sceller complètement l’orifice supérieur avec du ruban téflon et un bouchon Luer.
- Placer directement le canal microfluidique contenant les cellules cultivées dans le récipient en plastique de dimensions 80 mm × 50 mm × 25 mm et positionner la barre magnétique agitatrice au centre du microcanal contenant les cellules pour l’empêcher de flotter. Remplir le récipient en plastique avec du milieu de culture cellulaire supplémentaire jusqu’à ce que toute la lame soit entièrement immergée.
REMARQUE : Les cellules endothéliales ont été cultivées dans une µ-lame ibidi VI0.4 jusqu’à une confluence de 80 % selon des protocoles standards avant leur intégration dans le circuit de flux16. - En maintenant les raccords coudés Luer d’un circuit de flux immergés dans le milieu de culture cellulaire, allumer la micropompe pour ce circuit de flux. Connecter soigneusement les raccords coudés Luer à l’un des microcanaux et s’assurer qu’aucune bulle d’air ne se forme aux points de connexion. Une fois cette opération terminée, éteindre la micropompe.
5. Boîtier pour microcontrôleur et micropompes (facultatif)
- Utiliser deux vis en acier inoxydable M3 × 8, deux rondelles en acier inoxydable M3 et deux écrous en acier inoxydable M3 pour fixer le support transversal sur mesure à la plaque de montage inférieure sur mesure.
- Utiliser quatre vis en acier inoxydable M3 × 12, quatre rondelles en acier inoxydable M3 et quatre écrous en acier inoxydable M3 pour fixer la partie inférieure de l'enceinte en polycarbonate à la plaque de montage inférieure sur mesure. Utiliser huit rondelles en nylon M3 (deux par vis M3 × 12) afin de laisser un petit espace entre le fond de l'enceinte et la plaque de montage inférieure.
- Utiliser quatre vis M3, quatre entretoises hexagonales mâle-femelle en nylon M3 et quatre écrous en acier inoxydable M3 pour fixer le microcontrôleur à la plaque de montage intérieure en acrylique sur mesure. Placer les entretoises hexagonales en nylon entre la face inférieure du microcontrôleur et la plaque de montage en acrylique.
- Utiliser deux vis en acier inoxydable M3 × 8, deux rondelles en acier inoxydable M3 et deux écrous en acier inoxydable M3 pour fixer le support de micropompe sur mesure à la face supérieure de la plaque de montage intérieure en acrylique.
- Placer les micropompes dans le support de micropompe sur mesure de sorte que la flèche située sur les micropompes soit orientée vers le pilote de pompe.
- Utiliser quatre vis tête bouton en acier inoxydable M3 × 8 et quatre rondelles en acier inoxydable M3 pour fixer la plaque de montage intérieure en acrylique à l'intérieur de l'enceinte en polycarbonate.
- Insérer quatre passe-fils en caoutchouc dans un côté de l'enceinte en polycarbonate comportant quatre trous consécutifs. Répéter l'opération pour le côté opposé comportant quatre trous consécutifs.
- Utiliser une étiqueteuse pour numéroter les passe-fils de 1 à 4 de gauche à droite sur les deux côtés de l'enceinte en polycarbonate.
- Fixer deux joints toriques autour de la partie filetée du câble mini-USB mâle-femelle. Une fois cette opération terminée, insérer l'extrémité femelle du câble mini-USB mâle-femelle à travers le trou dans l'enceinte en polycarbonate du côté où sont orientées les flèches des micropompes. Fixer le côté femelle du câble mini-USB mâle-femelle en serrant un autre joint torique autour de la partie filetée située à l'extérieur de l'enceinte en polycarbonate.
- Obturer le trou restant sur le côté de l'enceinte en polycarbonate avec du ruban adhésif universel. Le système assemblé est illustré dans Figure 2.
6. Plaque de montage du plateau supérieur (facultatif)
- Utiliser quatre M2 × 8 vis en acier inoxydable et quatre écrous M2 en acier inoxydable pour fixer deux colliers de montage de capteur de débit à la plaque de montage en acrylique sur mesure.
- Utiliser quatre M3 × 12 vis en acier inoxydable et quatre écrous M3 en acier inoxydable pour fixer deux supports personnalisés de piège à bulles, indépendants de l'orientation, sur la plaque de montage supérieure en acrylique sur mesure.
- Utiliser une pince pour couper une tige filetée en acier M4 en quatre morceaux d'environ 110 mm de longueur. Utiliser ces quatre morceaux comme montants verticaux afin de fixer la plaque de montage supérieure au-dessus de l'enceinte en polycarbonate.
- Utilisez des ciseaux pour couper quatre morceaux de tube en polyuréthane de 40 mm de longueur (6,35 mm de diamètre extérieur). Faites passer les tiges filetées en acier M4 à travers ces sections de tube afin d'assurer un espace suffisant entre la plaque de fixation du plateau supérieur et le couvercle de l'enceinte en polycarbonate.
- Avec les supports sur mesure pour pièges à bulles indépendants de l'orientation et les pinces de fixation orientées vers le haut, insérer l'une des quatre tiges filetées M4 en acrylique sur mesure à travers chaque coin de la plaque de fixation supérieure en acrylique, en la faisant passer à moitié. Au sommet de chaque tige filetée, fixer un écrou papillon M4, un écrou M4 et une rondelle.
- Faire passer chaque pièce de tige filetée M4 à travers un entretoise ronde en nylon noir de 6 mm (diamètre intérieur de 3,2 mm) et un morceau de tube en polyuréthane de 40 mm de longueur. Enfin, fixer un écrou papillon M4 à l'extrémité inférieure de chaque tige filetée M4. Disposer les composants dans l'ordre suivant : écrou papillon en acier M4, écrou en acier inoxydable M4, rondelle en acier inoxydable M4, plaque de fixation du plateau supérieur, entretoise ronde en nylon noir, tube en polyuréthane, et un autre écrou papillon en acier M4.
- Utiliser du ruban adhésif universel pour fixer deux bandes de 75 mm de longueur × des ébauches en acrylique de 25 mm de large l'une contre l'autre face à face, de sorte que les longueurs des plaques d'acrylique soient parallèles entre elles.
- Utiliser des ciseaux pour couper un morceau de ruban adhésif double face de 75 mm de longueur (25 mm de largeur) × épais de 1,6 mm). Collez un côté du ruban adhésif double face de 75 mm de longueur sur le côté de 75 mm de long × Un support en acrylique de 25 mm de large, de sorte que la longueur du ruban adhésif en mousse et la longueur du support en acrylique soient parallèles l'une à l'autre.
- Utilisez cette plaque acrylique munie de mousse adhésive comme coussin placé sur les raccords Luer coudés de la microplaque afin d'empêcher qu'ils ne se desserrent pendant les expériences de microgravité simulée. Maintenez ensemble le coussin en acrylique avec mousse adhésive et la microplaque à l’aide d’un support sur mesure pour microplaque.
7. Montage sur la machine à positionnement aléatoire (RPM)
- Utiliser un ruban adhésif double face en mousse pour fixer tous les composants du système de flux sur la plaque de montage du RPM. Éviter de coller directement sous les microcanaux de culture cellulaire afin de permettre les échanges gazeux cellulaires pendant l'expérimentation. S'assurer que la microplaque est fixée au centre de la plaque de montage, de sorte qu'elle reste alignée avec les axes de rotation du RPM durant l'expérimentation.
- Faire glisser la plaque de montage dans la fente la plus haute du cadre en U du RPM et fixer la plaque de montage au cadre en U du RPM à l’aide de la vis et de la rondelle fournies avec le RPM.
- Utiliser un connecteur de rupture DB15 correctement câblé au préalable pour relier directement la station informatique au RPM, qui sera ensuite connecté au microcontrôleur et aux capteurs de débit liquide à l’aide d’un second connecteur de rupture DB15 également câblé au préalable.
REMARQUE : L’anneau collecteur du RPM relie les deux connecteurs DB15, établissant ainsi une connexion effective entre la station informatique, le microcontrôleur et le capteur de débit. - Brancher les câbles d’alimentation du microcontrôleur et du capteur de débit, et fixer les longueurs de câble excédentaires à l’aide de colliers serrés. Les câbles doivent être solidement fixés, tout en veillant à ce que les connexions électriques ne soient pas soumises à une tension excessive. Le système assemblé est illustré dans Figure 3.
8. Collecte des données d'écoulement
- Ouvrez le logiciel du capteur de débit sur la station informatique pour surveiller le débit.
- Utilisez l'application informatique du microcontrôleur pour régler la tension de la pompe jusqu'à ce que le débitmètre affiche le débit souhaité.
- Une fois le débit fixé, commencez à enregistrer les données de débit pendant 24 h.
Résultats
Avant de recueillir des résultats sur la fluidique ou la culture cellulaire, comme décrit ci-dessous, l'intégrité du système doit être vérifiée à chaque point de contrôle majeur du protocole tout au long des processus d'assemblage et de amorçage. Les connexions électroniques peuvent être facilement vérifiées en connectant le microcontrôleur et le capteur de débit de liquide à un ordinateur et en communiquant avec chaque composant via leur logiciel d'application respectif. Les raccordements de tubulures aux raccords à épaulement sont considérés comme suffisants une fois que la tubulure est enfoncée au-delà de l'ergot, et tout composant fluidique présentant le moindre fissure doit être remplacé immédiatement. L'amorçage du système doit aboutir à une boucle d'écoulement qui soit non seulement stérile, mais aussi visiblement exempte de bulles ; déloger toute bulle visible en tapotant doucement l'emplacement de la bulle.
Une fois le dispositif expérimental terminé, le système de flux doit fonctionner et être surveillé pendant 1 h avant la période d'essai de 24 h, afin de s'assurer qu'il n'y a pas de fuites dans le système et qu'aucune bulle d'air n'est observée à la sortie du piège à bulles. En outre, si le système de flux fonctionne en conditions de microgravité simulée, l'appareil de microgravité simulée doit pouvoir tourner librement une fois le système de flux installé ; cela peut être vérifié en tournant simplement l'appareil à la main, ainsi qu'en observant le fonctionnement de son programme de microgravité simulée pendant 1 h avant la période d'essai de 24 h.
Performance du système de perfusion en boucle fermée
La sortie des capteurs de débit enregistrée sur une période de 24 heures est présentée dans la Figure 4. Cette figure compare le débit à la gravité normale sur une période de 24 heures dans un circuit de circulation avec et sans piège à bulles indépendant de l'orientation. Les bulles d'air sont représentées par des pics d'intensité élevée. Les pics persistants observés dans le circuit de circulation sans piège à bulles disparaissent lorsqu'un piège à bulles indépendant de l'orientation est introduit dans le circuit. Cette comparaison démontre non seulement la nécessité d'un piège à bulles, mais aussi la performance robuste du piège à bulles indépendant de l'orientation.
Culture de cellules endothéliales en conditions d'écoulement
Afin d'évaluer pleinement la viabilité du système d'écoulement sans bulles, une expérience de 24 heures en microgravité a été réalisée avec des cultures de cellules endothéliales, en présence et en l'absence de piège à bulles. À la fin de l'expérience, le système a été démonté, en prenant soin d'éviter que les cellules ne s'assèchent. Immédiatement, les cellules ont été fixées avec du formaldéhyde à 4 % et colorées avec la phalloïdine CF594 pour l'actine et l'Hoechst 33342 pour les noyaux, selon les protocoles standards d'immunomarquage15. L'observation des cellules a été effectuée par microscopie confocale (Zeiss LSM 700). Figure 5 présente des images représentatives des cellules pour chaque condition d'écoulement. Les images montrent que les pièges à bulles (Figure 5B) permettent de restaurer complètement la viabilité et la croissance des cellules, tandis que les cellules se détachent du canal en l'absence de piège à bulles (Figure 5A). Les noyaux visibles sur les images peuvent être quantifiés en termes d'orientation à l'aide du logiciel ImageJ dans le cas avec piège à bulles, puisqu'aucune cellule n'était présente en son absence15.
Figure 1. Composants du système de circulation en boucle fermée. Le fluide sortant d'une micropompe pénètre d'abord dans le piège à bulles pour la filtration des bulles, puis traverse un capteur destiné à l'enregistrement des données de débit, avant d'entrer dans la puce microfluidique. Le système est conçu pour supporter deux boucles de circulation fonctionnant simultanément, une seule boucle complète étant représentée ici. Veuillez cliquer ici pour visualiser une version agrandie de cette figure.
Figure 2. Sous-ensembles du système de débit destinés à être montés sur une machine de positionnement aléatoire (RPM). Les micropompes et l'électronique sont protégées à l'intérieur d'une enceinte. Après amorçage (c'est-à-dire remplissage avec un liquide), le plateau supérieur est fixé à l'enceinte à l'aide de tiges filetées, la puce microfluidique étant centrée entre les deux. Les capteurs de débit et les pièges à bulles sont montés sur le plateau supérieur. L'enceinte électronique est fixée à une plaque de montage munie d'une barre transversale permettant la fixation sur la RPM. Deux boucles de débit indépendantes sont représentées. Veuillez cliquer ici pour visualiser une version agrandie de cette figure.
Figure 3. Système de perfusion assemblé monté sur une machine de positionnement aléatoire (RPM). L'ensemble du système de perfusion est fixé en vissant la barre transversale de la plaque de montage sur la RPM. Les câbles d'alimentation électroniques sont organisés en les enroulant autour de la périphérie centrale, garantissant ainsi que l'ensemble tient dans les limites de l'espace utilisable du plateau de charge de la RPM. Veuillez cliquer ici pour visualiser une version agrandie de cette figure.
Figure 4. Comparaison de courbes représentatives du débit. Comparaison des courbes de débit entre (A) une boucle d'écoulement sans piège à bulles indépendant de l'orientation et (B) une boucle d'écoulement avec le piège à bulles indépendant de l'orientation. Cette expérience a été réalisée dans des conditions de gravité normale (c'est-à-dire sans RPM), le capteur de débit étant placé immédiatement avant la microplaque dans les deux boucles d'écoulement. Veuillez cliquer ici pour visualiser une version agrandie de cette figure.
Figure 5. Images représentatives de cellules endothéliales cultivées en conditions d'écoulement avec et sans piège à bulles indépendant de l'orientation. (A) Écoulement sans piège à bulles, montrant une faible adhérence cellulaire ; (B) Écoulement avec piège à bulles, montrant une forte adhérence cellulaire. L'actine est colorée en rouge et les noyaux en bleu. Échelle = 200 µm. Veuillez cliquer ici pour consulter une version agrandie de cette figure.
Discussion
Un système microfluidique fermé, indépendant de l'orientation et capable de fonctionner en l'absence de gravité, a été mis au point et s'est révélé viable pour la culture de cellules endothéliales dans des conditions d'écoulement physiologiques. Les composants principaux du système sont un microcontrôleur, une micropompe, un capteur de débit liquide, une micro-lame pour culture cellulaire et un piège à bulles personnalisé imprimé en 3D, indépendant de l'orientation.
Les pièges à bulles utilisés dans cette étude sont fabriqués à partir de résine stéréolithographique15, qui présente généralement une faible cyto-compatibilité lorsqu'elle est utilisée sans préalablement éliminer les monomères non polymérisés, même dans le cas de résines de qualité biomédicale17,18. Par conséquent, avant d'utiliser le piège à bulles dans le système, il est essentiel d'évaluer si les produits chimiques lixiviés par la matière du piège à bulles fabriqué sur mesure pourraient compromettre la viabilité cellulaire.
Outre le choix de matériaux cytocompatibles, les étapes les plus cruciales des protocoles de configuration expérimentale sont l'étanchéité du piège à bulles, l'immersion de la microplaque pour l'amorçage et l'organisation des câbles lors de l'utilisation d'un appareil de microgravité simulée. Une fois que le système fluidique amorcé apparaît sans bulles, le port supérieur du piège à bulles doit être scellé hermétiquement avec du ruban téflon et un bouchon Luer afin d'éviter toute fuite. La rugosité de surface inhérente aux couches imprimées par stéréolithographie lors de la fabrication sur mesure implique que le bouchon Luer seul ne suffit pas à assurer un bon scellement. L'immersion de la microplaque dans un réservoir de milieu de culture cellulaire s'est révélée être la méthode la plus efficace pour garantir un amorçage sans bulles, en particulier au niveau du raccord coudé entre la microplaque. D'autres méthodes d'amorçage testées, telles que l'intégration de robinets à trois voies dans la boucle d'écoulement, ont tendance à laisser un nombre important de bulles après l'amorçage, lesquelles sont presque impossibles à éliminer sans démonter le raccord coudé de la microplaque. Enfin, un enchevêtrement des câbles électroniques peut entraver le fonctionnement de l'appareil de microgravité simulée, provoquant son arrêt accidentel. Même après avoir fixé tous les câbles et vérifié que l'appareil peut tourner librement avant le début de l'expérience, le système et l'appareil doivent être surveillés toutes les 3 à 4 heures d'éveil afin de minimiser le risque d'arrêt.
Ce système peut être adapté à des cultures cellulaires plus complexes ou à des puces de tissus tridimensionnelles (3D), et pourrait constituer un outil précieux pour faire progresser les modèles in vitro afin de comprendre les mécanismes des maladies, soutenir le développement de médicaments, évaluer les effets des contraintes liées au vol spatial et élaborer des contre-mesures. Par exemple, les plates-formes tissulaires conçées envoyées à l'ISS ont été utilisées pour étudier les effets de la microgravité et de l'exposition aux radiations5, et l'environnement extrême de microgravité a été exploité pour imiter des phénotypes de vieillissement ou générer de grands sphéroïdes multicellulaires afin d'étudier le cancer19. Dans tous ces cas, le piège à bulles indépendant de l'orientation et le système d'écoulement peuvent être utilisés soit pour comprendre l'effet du stress de cisaillement, soit pour adapter le transport de masse en fonction des résultats souhaités.
Par rapport à d'autres approches de culture cellulaire, le système présenté ici présente deux avantages principaux : (1) assurer un écoulement continu en boucle fermée et (2) être compact et autonome. Certaines méthodes de culture cellulaire reposent sur des flacons ou puits statiques, qui ne reproduisent pas les contraintes de cisaillement exercées par les fluides dans les conditions physiologiques. Certains systèmes commerciaux (par exemple, le système de pompe ibidi, Gräfelfing, Allemagne) peuvent obtenir un écoulement continu unidirectionnel grâce à des vannes de commutation alternant entre deux seringues. Toutefois, l'utilisation d'un tel appareil nécessite généralement un système de commande d'actionneur distinct relié à un ordinateur, ce qui le rend ni compact ni autonome. En outre, l'intégration du piège à bulles robuste décrit dans cet article facilite la réalisation d'expériences de longue durée sans surveillance.
Une modification potentielle du système dans les itérations futures concerne la micropompe, plus précisément l'exploration des effets de contraintes de cisaillement plus élevées sur les cellules endothéliales. Les micropompes utilisées dans les données représentatives ne pouvaient produire des contraintes de cisaillement allant qu'à 7,5 dyn/cm2, alors que les cellules endothéliales in vivo sont généralement exposées à des contraintes de cisaillement presque trois fois plus élevées20. Parmi les applications futures possibles de ce système, outre la culture cellulaire continue en microgravité simulée, figurent d'autres applications portables nécessitant une recirculation continue de liquide. Ces possibilités incluent le criblage de médicaments, les essais de colmatage ou de toxicité, les tests de corrosion, le refroidissement liquide des composants électroniques et la surveillance environnementale des polluants.
Déclarations de divulgation
Le piège à bulles omnidirectionnel est protégé par la demande de brevet US 18634723. Il n'y a aucun intérêt concurrent supplémentaire.
Remerciements
Ce travail a été soutenu par la subvention NASA Space Biology n° 80NSSC21K0272.
Matériaux
| Nom | Entreprise | Numéro de catalogue | Commentaires |
|---|---|---|---|
| éthanol à 100 % | Fisher Scientific | A4094 | Utilisé pour préparer une solution d'éthanol à 70 % destinée à la stérilisation du système (besoin minimal de 35 mL) |
| Entretoise ronde en nylon noire de 6 mm, 7 mm de diamètre extérieur, 3,2 mm de diamètre intérieur | Exqutoo | ZH-0050 | Fixe le support supérieur au boîtier (au moins 4 nécessaires) |
| Plaque acrylique, 75 mm de long sur 25 mm de large | Polymersan | ACRCS | Fixe les raccords Luer coudés sur la lame à microcanaux (nombre minimal requis : 1) |
| Câble USB 2.0 de type A mâle à mini-B | Ugreen Group Limited | 10355 | Pour relier l'ordinateur au microcontrôleur (Minimum requis 1) |
| Piège à bulles | (Personnalisé) | Pour prévenir le passage de bulles vers la lamelle microscopique (Besoin minimum 1) | |
| Support pour piège à bulles | Personnalisé | Support imprimé en 3D pour maintenir le piège à bulles en place (minimum requis : 2) | |
| Eau de qualité pour culture cellulaire | Fisher Scientific | MT25055CI | Utilisé pour éliminer toutes les traces d'éthanol après la stérilisation (quantité minimale requise : 30 mL) |
| Contrôleur, pompe et support de boîtier (support intérieur) | Personnalisé | Plaque de fixation à l'intérieur de l'enceinte (besoin minimum : 1) | |
| Monture transversale | Personnalisé | Barre de fixation transversale fixée sur la plaque de montage de l'enceinte (au moins 1 nécessaire) | |
| Connecteurs mâles et femelles de rupture DB15 | ANMBEST | ANMBEST_MDDB15 | Pour connecter l'ordinateur à la machine de positionnement aléatoire, puis au microcontrôleur (Minimum requis 1) |
| Raccord coudé Luer à emboîtement | ibidi | 10802 | Relie la lamelle microscopique au circuit de flux (minimum 2 nécessaires) |
| Ruban adhésif double face en mousse | 3M | 4026 | Pour la compression des raccords Luer de coude sur la lame à microcanaux (besoin minimal : 1) |
| Enceinte (60 mm x 140 mm x 140 mm) | Hammond | 1554Q2GYCL | Héberge le microcontrôleur et les micropompes (besoin minimum : 1) |
| Montage en enceinte (montage inférieur) | Personnalisé | Plaque de fixation située sous l'enceinte (besoin minimum : 1) | |
| Raccord femelle-femelle de type Luer | Boao | Boao-Seringues-WAD2354 | Utilisé pour relier la seringue au raccord en Y de type Luer pour l'amorçage du milieu de culture cellulaire (besoin minimum : 1) |
| milieu de culture cellulaire Gibco RPMI 1640 | Thermo Fisher | 11875093 | Utilisé pour la culture des cellules endothéliales (volume minimum requis : 50 mL) |
| Grommets, 9/16" diamètre du trou et 1/8" épaisseur, 1/8" ID | McMaster-Carr | 9307K863 | Pour le passage de tubes entrant et sortant de l'enceinte (besoin minimum de 8) |
| Raccord d'adaptation IDEX P-646, 1/16" barb à 1/4-28 | IDEX | P-646 | Relie le capteur de débit au circuit de débit (minimum 2 nécessaires) |
| Capteur de débit de liquide | Sensirion | SLF3-1300F | Pour la collecte des données de cytométrie en flux (besoin minimum 1) |
| Collier de fixation du capteur de débit de liquide | Sensirion | SLF3x Support de fixation | Support SLF3x (besoin minimum de 2) |
| Seringue Luer lock (12 mL) | McKesson | 414624 | Pour l'amorçage sous vide (besoin minimum 1) |
| bouchon Luer | Cole-Parmer | UX-50110-33 | Pour sceller les pièges à bulles indépendants de l'orientation (minimum nécessaire : 1) |
| écrou en acier inoxydable M2 | VIGRUE | B07PJQC7T6 | Fixe les capteurs de débit de liquide sur le support supérieur (minimum nécessaire : 4) |
| M2×8 vis en acier inoxydable | VIGRUE | B07PJQC7T6 | Fixe les capteurs de débit de liquide sur le support supérieur (au minimum 4 nécessaires) |
| entretoise hexagonale mâle-femelle en nylon M3 | Meijubol | B0GC6GN9S7 | Fixe le mp-Multiboard sur le support intérieur (au minimum 4 nécessaires) |
| rondelle nylon M3 | Sutemribor | 7,81573E+11 | Fixer l'enceinte inférieure (au moins 16 nécessaires) |
| écrou M3 en acier inoxydable | VIGRUE | B07PJQC7T6 | Fixe l'enceinte au support inférieur, la barre transversale au support inférieur, le support de pompe au support intérieur (nécessite au minimum 16) |
| Rondelle en acier inoxydable M3 | VIGRUE | B07PJQC7T6 | Fixe la barre transversale au support inférieur, l'enceinte au support inférieur et au support intérieur, et le support intérieur au porte-pompe (minimum nécessaire : 12) |
| M3×12 vis à tête cylindrique en acier inoxydable | VIGRUE | B07PJQC7T6 | Fixe l'enceinte au support inférieur (au moins 4 nécessaires) |
| M3×12 vis à tête cylindrique à six pans creux en acier inoxydable | Fgruh | FG001-3 | Fixe le support du piège à bulles sur le montage du plateau supérieur (au moins 2 nécessaires) |
| M3×6 vis à tête cylindrique fendue Phillips | Meijubol | B0GC6GN9S7 | Fixe le mp-Multiboard sur le support intérieur (minimum 4 nécessaires) |
| M3×8 vis en acier inoxydable | VIGRUE | B07PJQC7T6 | Fixe la barre transversale au support inférieur, l'enceinte au support intérieur, le support de pompe au support intérieur (au minimum 8 nécessaires) |
| écrou M4 en acier inoxydable | VIGRUE | B07PJQC7T6 | Fixe le support supérieur à l'enceinte (au moins 4 nécessaires) |
| Rondelle en acier inoxydable M4 | VIGRUE | B07PJQC7T6 | Fixe le support supérieur au boîtier (au moins 4 nécessaires) |
| tige filetée en acier M4-0,7 | Arwnnklo | AR01 | Couper en morceaux d'environ 15 cm de longueur (minimum 4 nécessaires) |
| Câble mini USB mâle vers femelle | Plinkwirekb | PCM-0725-L | Pour relier l'ordinateur au microcontrôleur (minimum nécessaire 1) |
| Connecteur mini USB mâle vers femelle à angle droit | UCEC | 4326453558 | Pour connecter l'ordinateur au microcontrôleur (facultatif) (besoin minimum : 1) |
| Support de microcanal | Personnalisé | Support imprimé en 3D pour maintenir le microcanal centré (Nombre minimal requis : 1) | |
| lame à microcanaux, µ-lame VI 0,4 | ibidi | 80606 | Pour les essais cellulaires sous flux (besoin minimum 1) |
| Micropompe | Bartels | MP6-HYB | Pour produire un débit (besoin minimal 1) |
| Support pour micropompe | Personnalisé | Support de fixation pour micropompe (besoin minimum 1) | |
| mp-Multiboard avec mp-Highdriver4 | Bartels | BM-E-0005 | Pour contrôler les réglages de fréquence et de tension des micropompes (Minimum requis : 1) |
| Câble mp-pump | Bartels | BM-A-0055 | Utilisé pour connecter électriquement la mp-Multiboard aux micropompes (quantité minimale requise : 1) |
| Entretoise ronde en nylon, 7 mm de diamètre extérieur, 3,2 mm de diamètre intérieur | Harfington | 2037015 | Pour fixer le tube au micropompe (minimum requis : 2) |
| O-ring | ZDBB | 7,17327E+11 | Fixe le câble mini USB mâle à femelle sur le boîtier (facultatif) (Nécessité minimale 3) |
| Récipient en plastique | Herdusa | BOÎTE EN PLASTIQUE HDS10 | Utilisé comme réservoir ouvert pour le milieu de culture cellulaire (minimum nécessaire 1) |
| Tuyau en polyuréthane, 1/8 pouce" I.D., 1/4" D.O. | PARKER | 95U-4-062-BLU-0100 | Fixe le support supérieur au boîtier (longueur minimale requise : 1,6 cm) |
| Machine de positionnement aléatoire | AIRBUS | Machine de positionnement aléatoire 2.0 (nécessite au minimum 1 unité) | |
| câble SCC1-USB | Sensirion | SCC1-USB 2M | Connecte des capteurs de débit de liquide à l'ordinateur (au minimum 1 nécessaire) |
| Tube à centrifuger autoportante | PEKYBIO | B0C13GZVD6 | Utilisé pour contenir de l'eau pour culture cellulaire ou de l'éthanol à 70 % (minimum 2 nécessaires) |
| Entretoise, en aluminium, 8 mm de diamètre extérieur, 20 mm de longueur | McMaster-Carr | 94669A062 | Besoin minimal de 4 |
| Tygon PVC 1/16" ID x 1/8" Densité optique | Saint-Gobain | B-44-3 | Relie tous les composants du circuit de circulation (longueur minimale requise : 40 cm) |
| Montage du pont supérieur | Personnalisé | Plaque de montage reliée à des capteurs de débit liquide et à un piège à bulles (besoin minimum : 1) | |
| Écrou papillon, M4 x 0,7 mm, acier galvanisé | Siptenk | S-TH-DLM-002 | Fixe le support supérieur au boîtier (minimum 4 nécessaires) |
| Attache-câble | AVEZ-MOI TD | 7,32073E+11 | Fixe les câbles lors du montage du système sur le RPM (minimum nécessaire : 4) |
Références
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