Ligation de précision de l'artère coronaire descendante antérieure gauche en utilisant des repères anatomiques dans un modèle murin d'infarctus du myocarde

Résumé

Ce protocole induit un infarctus du myocarde chez la souris par ligature permanente de l'artère coronaire descendante antérieure, en utilisant le sillon interventriculaire antérieur comme repère superficiel reproductible pour un positionnement précis du point de suture. L'infarctus est validé par électrocardiographie, échocardiographie, coloration histologique et analyse des biomarqueurs sériques.

Résumé

La ligature permanente de l'artère coronaire antérieure descendante (LAD) est l'approche la plus couramment utilisée pour établir des modèles murins d'infarctus du myocarde (IDM) en recherche cardiovasculaire préclinique. Toutefois, dans les protocoles classiques, le site de ligature est généralement placé à 1–2 mm sous l'appendice auriculaire gauche, un repère souvent difficile à identifier de manière fiable pendant la chirurgie. Associé à une variabilité interindividuelle importante de l'anatomie coronaire chez la souris, cela conduit fréquemment à une localisation imprécise de la LAD, à des sites de ligature inconstants et à une reproductibilité réduite entre opérateurs. Pour remédier à ces limites, cette protocole introduit le sillon interventriculaire antérieur (SIA) comme repère guide pour la ligature de la LAD. Le SIA est un sillon superficiel peu profond directement visible au microscope, la LAD passant immédiatement en dessous. Contrairement aux approches conventionnelles, il fournit une référence anatomique stable qui permet une sélection plus reproductible du site de ligature et est plus facile à identifier par des opérateurs peu expérimentés. Le protocole associe une anesthésie standardisée par inhalation d'isoflurane à une intubation trachéale non invasive et valide l'IDM par électrocardiographie, échocardiographie, dosage immunoenzymatique (ELISA), coloration histopathologique et imagerie tridimensionnelle des artères coronaires. Ce protocole fournit une méthode expérimentale fiable et reproductible pour induire un IDM chez la souris afin d'étudier les modifications physiopathologiques et immunitaires suivant l'IDM.

Introduction

L'infarctus du myocarde (IDM), l'une des principales causes de morbidité et de mortalité cardiovasculaires dans le monde, constitue une menace importante pour la santé humaine¹. Caractérisé par une survenue brutale, un déroulement clinique critique et un taux de létalité élevé, l'IDM est principalement dû à une occlusion thrombotique des artères coronaires et peut entraîner une ischémie myocardique profonde, une nécrose ultérieure des cardiomyocytes et une cascade de complications, notamment des arythmies, une insuffisance cardiaque et une mort subite cardiaque². Malgré des progrès notables en cardiologie clinique, l'accès limité aux tissus myocardiques humains continue de freiner l'étude des mécanismes physiopathologiques sous-jacents à l'IDM et le développement de stratégies thérapeutiques efficaces³. Par conséquent, des modèles animaux in vivo fiables, reproductibles et cliniquement pertinents, capables de reproduire fidèlement les caractéristiques cliniques et l'évolution de l'IDM, restent essentiels pour les études mécanistiques et l'évaluation préclinique de thérapies.

Depuis que Johns et Olson ont établi pour la première fois un modèle d'infarctus du myocarde (MI) chez la souris en 1954, les méthodologies permettant d'induire un infarctus du myocarde chez la souris ont fait l'objet d'améliorations continues⁴. La ligature permanente de l'artère coronaire antérieure descendante (LAD) sous visualisation microscopique directe est devenue la technique la plus largement adoptée, car elle reproduit des caractéristiques pathologiques clés de l'infarctus du myocarde humain, notamment l'ischémie myocardique localisée, la nécrose myocardique et le remodelage ventriculaire post-infarctus⁵. Toutefois, la ligature conventionnelle de l'artère LAD exige une expertise microchirurgicale considérable, généralement acquise uniquement après une formation approfondie, ce qui limite la cohérence et la reproductibilité de la procédure entre différents opérateurs et laboratoires⁶. De plus, des complications per- et postopératoires — telles que des hémorragies, des lésions ou un collapsus pulmonaire, un mauvais positionnement du ligature, et des dommages tissulaires mécaniques dus à une ventilation inadéquate — contribuent à une mortalité périopératoire relativement élevée, restreignant ainsi davantage l'application généralisée de ce modèle⁷. En réponse à ces limites, Gao et al. ont introduit une technique modifiée consistant en une ligature de l'artère LAD par évagination cardiaque, qui simplifie la procédure chirurgicale et abaisse le seuil technique requis pour établir le modèle⁸. D'autres approches expérimentales, notamment la cryolésion coronaire et l'induction pharmacologique de lésions myocardiques, ont également été développées pour des applications de recherche spécifiques^9,10. Néanmoins, la ligature permanente de l'artère LAD sous visualisation directe reste la méthode privilégiée, car elle reproduit le plus fidèlement les principales caractéristiques physiopathologiques de l'infarctus du myocarde humain tout en permettant un contrôle précis de la taille et de la localisation de l'infarctus.

Malgré son utilisation répandue, la ligature conventionnelle de l’artère descendante antérieure (LAD) reste limitée par une identification variable du site de ligature, une procédure peu reproductible, une mortalité périopératoire relativement élevée et une variabilité inter-laboratoires en termes de reproductibilité, facteurs qui peuvent tous compromettre la fiabilité et la comparabilité des résultats expérimentaux¹¹. L’objectif général du présent protocole est d’établir une méthode plus standardisée et reproductible de ligature permanente de la LAD chez la souris, en utilisant le sillon interventriculaire antérieur (AIS) comme repère anatomique externe pour la localisation du vaisseau. Plutôt que d’estimer le site de ligature à une distance fixe sous l’appendice auriculaire gauche, ce protocole s’appuie sur l’AIS — une rainure superficielle peu profonde directement visible en vision microscopique et située juste au-dessus de la LAD — comme référence anatomique stable pour guider la ligature. Comparée à l’estimation classique fondée sur des repères anatomiques, cette approche vise à faciliter une sélection plus reproductible du site de ligature, à réduire la variabilité dépendant de l’opérateur et à améliorer l’accessibilité pour les chirurgiens moins expérimentés, tout en restant compatible avec les procédures standards de modélisation de l’infarctus du myocarde (MI) chez la souris. Ce protocole est donc adapté aux chercheurs souhaitant disposer d’une méthode chirurgicale reproductible pour générer des modèles d’infarctus du myocarde permanent, destinés à l’étude des lésions myocardiques, du remodelage ventriculaire, de l’inflammation et des mécanismes associés aux maladies cardiovasculaires.

Protocole

Toutes les expériences impliquant des animaux ont été réalisées avec l'approbation du Comité d'éthique du centre d'expérimentation animale de l'Université médicale du Sud-Ouest (numéro d'approbation : SWMU20240146). Des souris mâles C57BL/6J (sans pathogène spécifique [SPF]), âgées de 8 à 10 semaines et pesant 20,0 ± 3,0 g, ont été utilisées dans cette étude. Acclimater les souris pendant 1 semaine dans des conditions standard de laboratoire (22 °C ± 2 °C ; cycle lumière/obscurité de 12 h/12 h) avant de commencer les expériences.

1. Préparation préchirurgicale

1. Préparez et stérilisez tous les instruments chirurgicaux le jour de l'intervention, y compris des pinces, des ciseaux ophtalmiques, un porte-aiguille, un hémostat micro-moustique, un retractor de paupière en forme de V, des sutures en nylon 7-0 à 3/8 de cercle avec aiguille, des sutures en nylon 6-0 et des sutures en nylon 5-0. Stérilisez tous les instruments métalliques en autoclave à 121 °C pendant 20 min avant la procédure, puis stérilisez-les à nouveau entre chaque animal à l’aide d’un stérilisateur à billes de verre (250 °C pendant 15 s), suivis d’un refroidissement sur un tampon stérile. Utilisez des fils de suture provenant d’emballages stériles scellés.
2. Aménagez deux zones de travail distinctes afin de maintenir une technique aseptique. Préparez une première zone avec des pinces, un kit d’intubation trachéale pour rongeur et une machine à anesthésie, et préparez une deuxième zone chirurgicale stérile avec les instruments stérilisés, des cotons-tiges, de la povidone-iodée et de la gaze stérile.
3. Appliquez une crème dépilatoire sur la région thoracique pendant 1 min. Retirez délicatement la crème et les poils à l’aide d’une gaze stérile humidifiée avec de l’eau stérile ou du sérum physiologique.
   1. La simple épilation ne constitue pas une préparation cutanée chirurgicale. Réalisez la désinfection cutanée aseptique définitive et le drapage stérile uniquement après avoir anesthésié, intubé et fixé la souris sur la plateforme chirurgicale, immédiatement avant l’incision cutanée (Étape 2.6).
4. Administrez du cefazolin (300 mg/kg) par injection intrapéritonéale 1 h avant la chirurgie. Reconstituez le cefazolin sodique pour injection dans du sérum physiologique stérile à 0,9 % pour obtenir une concentration d’emploi de 30 mg/mL, et administrez environ 0,2 mL par 20 g de poids corporel afin d’atteindre la dose cible. Poursuivez l’administration une fois par jour pendant 5 jours consécutifs après la chirurgie.
   REMARQUE : N’administrez aucun agent hémostatique pharmacologique systémique ou topique dans ce protocole. Obtenez l’hémostase peropératoire en appliquant une pression douce et continue avec un coton-tige stérile pendant 10 à 30 s, ou jusqu’à l’arrêt du saignement.

2. Induction de l'anesthésie et intubation trachéale

1. Placer la souris dans la chambre d'induction (16 × 10 × 11 cm) reliée à l'appareil d'anesthésie. Régler le débit du gaz vecteur à 0,5 L/min et induire l'anesthésie avec 3,5 % à 4,0 % d'isoflurane.
   NOTE : Confirmer une anesthésie adéquate par l'absence du réflexe de retrait podal. Dans ces conditions, la souris atteint généralement un stade chirurgical d'anesthésie en 2 à 4 minutes.
2. Positionner la souris anesthésiée en décubitus dorsal sur la plateforme d'intubation trachéale murine. Suspendre la souris en accrochant ses incisives supérieures à l'élastique de la plateforme afin que la tête et le cou soient étendus selon un angle d'environ 45°. Aligner les axes oral, pharyngé et laryngé pour rendre la glotte directement visible.
3. Réaliser une intubation oro-trachéale
   1. Réaliser l'intubation oro-trachéale sous laryngoscopie directe sans trachéotomie afin d'établir une ventilation mécanique contrôlée. Utiliser un cathéter intraveineux de 20 G (diamètre externe d'environ 0,9 mm ; longueur d'environ 15 mm) comme tube endotrachéal.
   2. Ouvrir la bouche et déplacer doucement la langue sur le côté à l'aide de forceps. Insérer la lame d'un laryngoscope pour petit animal le long du dos de la langue et abaisser la base de la langue.
   3. Faire progresser le laryngoscope jusqu'à ce que l'épiglotte devienne visible. Soulever le laryngoscope vers le haut et vers l'avant selon l'axe du manche afin de soulever l'épiglotte et exposer l'ouverture glottique en forme de V ainsi que les cordes vocales pâles.
   4. Faire avancer le cathéter à travers la glotte ouverte pendant l'inspiration tout en maintenant une visualisation directe des cordes vocales. Retirer le laryngoscope une fois que le cathéter a franchi la glotte.
   5. Faire avancer le cathéter à une profondeur d'environ 5 à 7 mm. Retirer le stylet et connecter le cathéter au ventilateur.
      NOTE : Confirmer le bon positionnement du tube endotrachéal en observant un mouvement symétrique bilatéral de la paroi thoracique synchronisé avec le ventilateur. Si le mouvement de la paroi thoracique est minime et qu'un mouvement abdominal rythmique apparaît à la place, accompagné d'un allègement progressif de l'anesthésie, retirer le cathéter de l'œsophage et répéter l'intubation.
   6. Si la glotte n'est pas visible, retirer le laryngoscope et repositionner la souris sur la plateforme d'intubation avec la tête et le cou étendus à environ 45°. Réaligner les axes oral, pharyngé et laryngé, éliminer toute sécrétion oropharyngée à l'aide d'un coton stérile et répéter la laryngoscopie. Si la souris présente des signes de réveil de l'anesthésie, la replacer dans la chambre d'induction, approfondir l'anesthésie, puis réitérer la tentative d'intubation.
   7. Interrompre la procédure si la souris développe une cyanose, un saignement laryngé ou une apnée persistante. Arrêter l'administration d'isoflurane et placer la souris sur un tapis chauffant à température contrôlée (37 °C) jusqu'à ce qu'elle soit complètement réveillée.
   8. Ne pas procéder à la thoracotomie si l'intubation trachéale échoue. Reprogrammer la procédure à une autre séance ou exclure l'animal de l'étude et le consigner comme un échec procédural.
      NOTE : Des tentatives répétées d'intubation peuvent provoquer un œdème laryngé, augmentant ainsi le risque de détresse respiratoire postopératoire. Dans la plupart des cas, une intubation réussie est obtenue lors des deux premières tentatives après visualisation directe de la glotte. La maîtrise de l'intubation oro-trachéale nécessite de la pratique et une bonne connaissance de la technique.
4. Utiliser de l'air comme gaz vecteur à un débit de 0,5 L/min et maintenir l'anesthésie avec 1,5 % à 2,0 % d'isoflurane. Régler le ventilateur à une fréquence respiratoire de 130 cycles/min, un volume courant de 2 mL et un rapport inspiratoire sur expiratoire de 5:4.
   NOTE : Le volume courant réglé sur le ventilateur dépasse la valeur théorique estimée à partir du poids corporel, car il compense le volume compressible du circuit du ventilateur et l'espace mort du tube endotrachéal. Évaluer la ventilation tout au long de la procédure en surveillant la présence de cyanose et de signes de barotraumatisme, notamment un pneumothorax ou un emphysème sous-cutané.
   1. Surveiller en continu la profondeur de l'anesthésie pendant toute la procédure. Évaluer le schéma respiratoire et le réflexe de retrait podal toutes les 2 minutes. Surveiller la fréquence cardiaque en continu à l'aide de l'électrocardiogramme (ECG) et ajuster la concentration d'isoflurane pour maintenir une fréquence cardiaque de 400 à 500 battements/min ; une concentration d'isoflurane de 1,5 % à 2,0 % est généralement suffisante. Observer tout au long de la procédure la présence d'efforts respiratoires spontanés contre le ventilateur, de mouvements des vibrisses et de changements de couleur des muqueuses.
   2. Augmenter la concentration d'isoflurane par incréments de 0,5 %, jusqu'à un maximum de 3,0 %, si le réflexe de retrait podal réapparaît, si des mouvements des vibrisses sont observés ou si des efforts respiratoires spontanés contre le ventilateur surviennent. Diminuer la concentration d'isoflurane par pas de 0,5 %, jusqu'à un minimum de 1,0 %, si la fréquence cardiaque descend en dessous de 350 battements/min. Interrompre la procédure chirurgicale chaque fois que ces signes sont observés, continuer à surveiller la fréquence cardiaque, le schéma respiratoire, la couleur des muqueuses et les mouvements des vibrisses, et reprendre la procédure uniquement après stabilisation des paramètres physiologiques.
5. Incliner la souris vers le côté droit, le côté gauche étant en position supérieure, afin d'exposer la paroi thoracique gauche. Fixer les quatre membres et la queue à la plateforme à l'aide de ruban adhésif.
6. Assainir le site chirurgical par trois applications successives de povidone-iodée. Pour chaque application, utiliser un coton stérile neuf, en commençant au niveau du site d'incision prévu et en se déplaçant vers l'extérieur selon une spirale concentrique jusqu'à environ 1 cm au-delà de l'incision prévue dans toutes les directions. Jeter le coton après chaque application et ne jamais réutiliser un coton usagé au centre du champ opératoire. Laisser la dernière application sécher complètement à l'air, puis poser un champ stérile en ne laissant exposé que le champ opératoire avant de pratiquer l'incision cutanée.

3. Thoracotomie et exposition du cœur

REMARQUE : Le déroulement chirurgical global, incluant le positionnement de l'animal, la thoracotomie, l'exposition du cœur, la ligature de l'artère coronaire antérieure descendante (LAD), la fermeture thoracique et la récupération postopératoire, est illustré dans la Figure 1 et Figure 2.

Figure 1 : Localisation anatomique du site de ligature de l'artère coronaire descendante antérieure en utilisant le sillon interventriculaire antérieur. (A) Vue ventrale du cœur de rongeur exposé avant la ligature, montrant le sillon interventriculaire antérieur (SIA). (B) Vue de la même région après ligature de l'artère coronaire descendante antérieure (AD). La zone entourée indique le site de ligature. (C) Schéma montrant la relation spatiale entre le SIA et les artères coronaires. L'AD suit le trajet du SIA, et le point de ligature se situe au tiers supérieur du sillon. RCA, artère coronaire droite ; LCA, artère coronaire gauche ; LCX, artère coronaire circonflexe gauche. Veuillez cliquer ici pour visualiser une version agrandie de cette figure.

Figure 2 : Procédure chirurgicale de ligature, guidée par le sillon interventriculaire antérieur, de l'artère coronaire descendante antérieure chez la souris. (A) Positionner et immobiliser la souris anesthésiée après épilation de la région thoracique gauche. (B) Réaliser une incision cutanée au niveau de la paroi thoracique gauche. (C) Séparer les muscles pectoraux et identifier l'espace intercostal approprié pour la thoracotomie. (D,E) Insérer et positionner le rétracteur thoracique afin d'élargir l'espace intercostal et exposer le champ opératoire. (F) Visualiser le cœur exposé et identifier le sillon interventriculaire antérieur (SIA). (G) Passer une suture en nylon 7-0 au-dessus du SIA et sous l'artère coronaire descendante antérieure (AD). (H) Serrer la suture afin d'obtenir une ligature permanente de l'AD. (I) Retirer le rétracteur thoracique et fermer la paroi thoracique. (J,K) Fermer successivement les plans musculaire et cutané. (L) Permettre à la souris de se rétablir sous une source de chaleur après l'intervention chirurgicale. Veuillez cliquer ici pour visualiser une version agrandie de cette figure.

1. À l’aide de ciseaux ophtalmiques, pratiquer une incision cutanée longitudinale de 1 cm sur la paroi thoracique gauche, parallèlement à l’axe long du sternum et environ à 2 mm latéralement par rapport au bord sternal gauche. Exposer les muscles pectoraux sous-jacents.
2. À l’aide de pinces fines, disséquer par émoussement les muscles grand et petit pectoraux dans le sens de leurs fibres. Écarter les muscles latéralement pour exposer les côtes et les espaces intercostaux, en évitant de sectionner les muscles afin de minimiser les saignements.
3. Identifier l’espace intercostal approprié avant d’ouvrir la cavité thoracique. Localiser l’artère intercostale antérieure, branche de l’artère thoracique interne qui chemine dans un espace intercostal parallèlement aux côtes, et repérer l’espace intercostal troisième immédiatement au-dessus de l’artère la plus visiblement constante dans l’espace intercostal quatrième.
4. Si l’artère intercostale antérieure n’est pas clairement visible, palper la première côte et compter caudalement pour identifier l’espace entre la troisième et la quatrième côte. Confirmer que l’espace intercostal sélectionné permet une vue directe et sans obstacle de l’appendice auriculaire gauche et de la paroi libre antérieure du ventricule gauche avant de poursuivre.
   NOTE : Une identification précise de l’espace intercostal troisième est essentielle, car un site de thoracotomie incorrect pourrait réduire la visualisation du cœur et compromettre la procédure.
5. Réaliser une thoracotomie par l’espace intercostal gauche troisième. Écarter délicatement l’espace intercostal à l’aide d’un rétracteur en forme de V pour paupière jusqu’à ce que l’appendice auriculaire gauche et le tiers supérieur du ventricule gauche soient clairement exposés dans le champ opératoire.
   NOTE : À ce stade, le cœur reste recouvert par le péricarde ; par conséquent, l’AIS ne peut pas être identifiée de façon fiable. Identifier l’AIS uniquement après ouverture du péricarde (étape 3.6), comme décrit dans les étapes 4.2 à 4.3.
6. Saisir délicatement le péricarde avec une première paire de pinces fines et le soulever loin du myocarde. Utiliser une deuxième paire de pinces fines pour déchirer lentement le péricarde et exposer complètement le cœur.

4. Ligature de l'artère coronaire antérieure descendante guidée par repères anatomiques

1. Faire passer un fil de suture en nylon 6-0 à travers la paroi thoracique et exercer une légère traction pour élargir le champ opératoire. Exposer complètement l’ASI avant d’identifier le site de ligature (Figure 1A).
2. Identifier l’ASI comme un sillon peu profond qui traverse obliquement la base cardiaque vers l’apex, marquant la limite superficielle entre les ventricules gauche et droit Figure 1C. Au microscope, l’identifier comme une dépression quasi circulaire située environ à 1–2 mm sous la marge inférieure de l’appendice auriculaire gauche.
3. Si l’identification de l’ASI est difficile, tamponner délicatement la surface épipéricardique avec un coton-tige humidifié de sérum physiologique tiède. Réexaminer le champ opératoire au microscope afin de mieux visualiser le sillon.
   NOTE : Au microscope stéréoscopique, l’ASI est un sillon peu profond facilement identifiable qui délimite anatomiquement la frontière interventriculaire, avec l’artère coronaire antéro-interne (LAD) qui passe immédiatement en dessous. Si l’ASI reste floue après le tamponnement, vérifier d’abord que la thoracotomie assure une exposition adéquate. Ensuite, identifier directement la LAD selon les méthodes décrites précédemment : par rapport à la veine cardiaque associée, l’artère est de couleur plus rose, de calibre plus petit et nettement pulsatile¹².
   1. Si l’ASI ou l’artère coronaire LAD ne peuvent être identifiées, vérifier d’abord que la thoracotomie a été réalisée par l’espace intercostal gauche numéro trois. Si nécessaire, repositionner la thoracotomie comme décrit aux étapes 3.3–3.5, puis répéter l’identification de l’ASI et de la LAD comme décrit aux étapes 4.1–4.3.
   2. Interrompre la procédure si l’ASI ou la LAD ne peuvent être identifiées après 10 minutes d’examen attentif, en cas de saignement incontrôlable, si la durée totale de l’intervention à thorax ouvert dépasse 20 minutes, ou si la fréquence cardiaque reste inférieure à 300 battements/minute malgré l’ajustement de la profondeur d’anesthésie. Anesthésier profondément la souris avec 5 % d’isoflurane, procéder à l’euthanasie par dislocation cervicale, et enregistrer l’animal comme un échec opératoire à inclure dans l’analyse des résultats chirurgicaux.
4. Faire passer un fil de suture en nylon 7-0 en travers du sillon au tiers supérieur de l’ASI Figure 1B. Introduire l’aiguille perpendiculairement à la surface épipéricardique sur une profondeur d’environ 0,5–1 mm, avec les points d’entrée et de sortie situés de part et d’autre du sillon et couvrant approximativement sa largeur maximale.
5. Fixer la ligature à l’aide d’un nœud chirurgical. Ajuster la ligature jusqu’à ce qu’un blanchiment immédiat du myocarde situé en aval du site de ligature apparaisse après le premier nœud, sans indentation tissulaire locale notable.
   NOTE : Ne serrer la suture que suffisamment pour bloquer le flux sanguin coronaire. Une tension excessive peut endommager le myocarde adjacent ou provoquer la section du vaisseau et des tissus environnants par le fil.
6. Confirmer l’occlusion coronaire réussie dans la minute suivant la ligature en observant un blanchiment ischémique irrégulier du myocarde situé en aval du site de ligature¹². Confirmer davantage l’occlusion en détectant une élévation du segment ST sur l’ECG.
7. Si la zone ischémique est excessivement petite ou si le blanchiment est absent, desserrer la ligature et répéter la procédure de ligature.

5. Fermeture et récupération postopératoire

1. Retirer soigneusement le retractor en forme de V de la paupière. Fermer la thoracotomie à l’aide d’un point simple interrompu en soie nylon 5-0 en passant l’aiguille autour des troisième et quatrième côtes adjacentes afin de réapprocher l’espace intercostal troisième. Maintenir l’aiguille près de la surface de la côte pour éviter de lésionner le cordon neurovasculaire intercostal. Avant de nouer le point, comprimer doucement le thorax en fin d’expiration pour évacuer l’air intrathoracique résiduel, puis maintenir la compression tout en fixant le point avec un nœud chirurgical.
2. Fermer l’incision cutanée par plans successifs à l’aide de fils de nylon 5-0. S’assurer d’une apposition complète des bords de la plaie avant de poursuivre.
3. Placer la souris sur un tapis chauffant à température contrôlée (37°C), arrêter l’administration d’isoflurane et poursuivre la ventilation mécanique jusqu’à la reprise de la respiration spontanée. Observer l’animal pendant la récupération de l’anesthésie, notamment le mouvement de la queue ou des vibrisses, ainsi que la restauration d’un rythme respiratoire régulier d’environ 150 mouvements/min.
4. Confirmer la préparation à l’extubation en vérifiant la régularité de la respiration spontanée, un mouvement visible de la paroi thoracique synchronisé avec le cycle du ventilateur, et des mouvements volontaires des membres ou des vibrisses. Retirer lentement le tube endotrachéal pendant la phase expiratoire, puis continuer à surveiller la souris sur le tapis chauffant pendant 3 à 5 min afin de confirmer l’absence de détresse respiratoire.
   REMARQUE : La détresse respiratoire après l’extubation est le plus souvent causée par un pneumothorax résultant d’une fermeture incomplète de l’espace intercostal. En cas de détresse respiratoire, réanesthésier temporairement la souris et la ventiler, rouvrir les points cutanés, inspecter la fermeture intercostale et poser des points supplémentaires à tout site de fuite d’air avant de répéter la procédure d’extubation.
5. Replacer la souris dans sa cage d’origine après la récupération de l’anesthésie. Administrer de la buprénorphine (0,1 mg/kg, par voie sous-cutanée) immédiatement après la chirurgie, puis toutes les 4 à 6 heures pendant les 48 premières heures.
6. Surveiller chaque souris au moins deux fois par jour pendant les 3 premiers jours postopératoires, puis une fois par jour par la suite. Évaluer le poids corporel, la posture, l’activité, le rythme respiratoire et l’état de la plaie chirurgicale, et euthanasier tout animal atteignant les critères prédéfinis d’euthanasie humanitaire, notamment une respiration laborieuse persistante, l’incapacité d’accéder à la nourriture ou à l’eau, ou une posture voûtée et immobile ne répondant pas à la stimulation.

6. Évaluation électrocardiographique (ECG)

1. Enregistrer les signaux électrocardiographiques à l'aide d'un système d'enregistrement physiologique multicanal équipé d'un amplificateur d'ECG. Insérer trois électrodes périphériques sous-cutanées chez la souris, en connectant l'entrée positive (VIN+) à la patte postérieure gauche, l'entrée négative (VIN−) à la patte antérieure droite et la masse (GND) à la patte postérieure droite.
2. Connecter le module amplificateur d'ECG à l'unité d'acquisition de données. Régler le filtre d'élimination sur 50 Hz (ou 60 Hz, selon la fréquence du courant local), puis ouvrir le logiciel d'acquisition et ajouter un nouveau module amplificateur d'ECG dans les paramètres du canal analogique.
   1. Configurer l'amplificateur avec les paramètres suivants : gain = 2000, mode = normal, filtre passe-bas = 150 Hz et filtre passe-haut = 0,05 Hz. Ouvrir les paramètres d'acquisition, régler la fréquence d'échantillonnage à 1 kHz, puis fermer la fenêtre de configuration.
   2. Après avoir placé les électrodes, cliquer sur Démarrer pour commencer l'enregistrement. Régler la base de temps de l'affichage sur 0,5 s par division principale et l'échelle verticale sur 0,25 mV par division principale, puis enregistrer l'ECG en continu pendant au moins 30 s. Sélectionner un segment stable, sans artefacts, pour l'analyse et une présentation représentative.
3. Enregistrer l'ECG immédiatement après la ligature, tout en maintenant la souris sous anesthésie à 1,5 % d'isoflurane et en préservant une normothermie à l'aide d'un tapis chauffant. Enregistrer les ECG des groupes d'infarctus du myocarde (MI) et de contrôle normal (NC) au même point temporel et dans des conditions anesthésiques comparables.

7. Échocardiographie

1. Raser la région thoracique antérieure à l’aide d’une crème dépilatoire 1 jour avant l’imagerie. Anesthésier la souris avec 1,5 % d’isoflurane pendant toute la durée de l’examen.
2. Placer la souris en position dorsale sur une plateforme chauffée, fixer les quatre membres aux électrodes d'ECG et appliquer du gel échographique sur le précardium. Ajuster la concentration d'isoflurane selon les besoins afin de maintenir une fréquence cardiaque supérieure à 400 battements/min.
3. Placer la sonde échographique au niveau de l'espace intercostal troisième-quatrième le long du bord sternal gauche. Orienter la marqueur de la sonde vers le membre antérieur droit selon un angle d'environ 30° et aligner la sonde selon l'axe long du cœur.
4. Effectuer tous les examens d'imagerie à l'aide d'un transducteur en réseau linéaire doté d'une fréquence d'émission centrale de 30 MHz, d'une bande passante de 20 à 46 MHz et d'une résolution axiale de 50 μmRégler la puissance d'émission à 100 %, la profondeur d'image à 13 mm, la largeur d'image à 11 mm, la dynamique à 60 dB et le gain en deux dimensions à 40 dB. Acquérir des séquences ciné en mode B à une fréquence de 210 images/s.
5. Enregistrez ces paramètres d'acquisition comme un préréglage système. Utilisez le même transducteur, le même préréglage, la même puissance d'émission, la même plage dynamique, la même profondeur d'image et la même largeur d'image pour tous les animaux et toutes les séances d'imagerie, et ne modifiez pas la profondeur d'image entre les groupes NC et MI.
6. Dans la même vue selon l’axe long, positionner la ligne d’échantillonnage en mode M au niveau médio-ventriculaire, perpendiculairement au septum interventriculaire et à la paroi postérieure du ventricule gauche, de sorte que la fenêtre d’échantillonnage couvre tout le diamètre antéropostérieur du ventricule gauche. Enregistrer l’enregistrement en mode M pour analyse ultérieure.
7. Acquérir des images en mode B dans lesquelles le ventricule gauche, l'oreillette gauche et la racine aortique sont clairement visualisés, et enregistrer des séquences ciné pour analyse ultérieure. Acquérir des images correspondantes en mode M sur le même plan d'imagerie.
8. Mesurer le diamètre interne en fin de diastole du ventricule gauche (D_d), le diamètre interne en fin de systole du ventricule gauche (Ds) et l'épaisseur du septum interventriculaire à partir des images obtenues. Enregistrer cinq cycles cardiaques consécutifs et indiquer les valeurs moyennes.
   REMARQUE : Calculer automatiquement le volume télédiastolique du ventricule gauche (LVEDV) et le volume télésystolique du ventricule gauche (LVESV) à l’aide du logiciel d’imagerie. Calculer la fraction de raccourcissement (FS) selon la formule : FS = (D_d − D_s) / D_d × 100 % et la fraction d'éjection (FE) selon la formule : FE = (VTDG − VESG) / VTDG × 100 %.

8. Prélèvement des tissus, coloration histologique et ELISA

1. Récupération du tissu
   1. Le jour 7 après l'induction de l'infarctus du myocarde (IM), réaliser une échocardiographie sur chaque souris. Anesthésier la souris avec 4 % d'isoflurane, prélever environ 1,5 mL de sang par saignement rétro-orbitaire, euthanasier la souris par dislocation cervicale, puis exciser le cœur.
   2. Laisser les échantillons de sang coaguler toute la nuit à 4 °C. Centrifuger les échantillons à 2000 × g pendant 10 min à 4 °C, récupérer le sérum et le conserver à −80 °C jusqu'à l'analyse.
2. Dosage immunoenzymatique (ELISA)
   1. Quantifier le peptide natriurétique de type B (BNP), l'interleukine-1β (IL-1β), le facteur de nécrose tumorale-α (TNF-α) et le facteur nucléaire-κB p65 (NF-κB p65) sériques à l'aide de kits de dosage immunoenzymatique (ELISA).
      1. Porter tous les réactifs et échantillons de sérum à température ambiante et préparer les solutions de travail conformément aux instructions du kit. Diluer les échantillons de sérum au 1:5 dans une solution saline tamponnée au phosphate (PBS), c'est-à-dire un volume de sérum plus quatre volumes de PBS.
      2. Ajouter 50 μL d'étalons, de PBS et d'échantillons de sérum dilués respectivement dans les puits d'étalonnage, de zéro et d'échantillons, en laissant le puit témoin vide. Ajouter 100 μL d'anticorps de détection conjugué à la peroxydase de raifort (HRP) dans tous les puits sauf le témoin, sceller la plaque et incuber à 37 °C pendant 60 min à l'abri de la lumière.
      3. Jeter le contenu de chaque puit et laver la plaque cinq fois avec le tampon de lavage, en laissant le tampon dans chaque puit pendant 20 s à chaque cycle de lavage. Sécher la plaque en l'essuyant sur du papier sans peluches.
      4. Ajouter 100 μL de substrat fraîchement préparé (solutions A et B mélangées à un rapport volumétrique de 1:1) dans chaque puit. Incuber la plaque scellée à 37 °C pendant 15 min à l'abri de la lumière, ajouter 50 μL de solution d'arrêt, puis mesurer la densité optique à 450 nm.
   2. Soustraire la densité optique du témoin à chaque mesure et établir une courbe d'étalonnage à l'aide d'un modèle de régression logistique à quatre paramètres (4PL). Calculer la concentration de chaque échantillon à partir de la courbe ajustée, multiplier la valeur par le facteur de dilution de 5 et indiquer la valeur moyenne obtenue à partir des puits en double.
3. Transformation du tissu, inclusion et coupe
   1. Rincer brièvement chaque cœur excisé dans une solution saline tamponnée au phosphate glacée pour éliminer le sang résiduel. Fixer le tissu dans du paraformaldéhyde à 4 % pendant au moins 24 h à température ambiante.
   2. Sectionner chaque cœur afin d'exposer une surface plane en axe court et le placer dans une cassette tissulaire étiquetée. Déshydrater le tissu à l'aide d'une série d'éthanol à concentration croissante (75 % d'éthanol pendant 4 h, 85 % d'éthanol pendant 2 h, 90 % d'éthanol pendant 2 h, 95 % d'éthanol pendant 1 h, et deux changements d'éthanol absolu de 30 min chacun). Transférer le tissu dans un mélange éthanol–xylène pendant 5 à 10 min, le clarifier dans deux changements de xylène de 10 min chacun, puis l'imbiber avec trois changements de paraffine fondue de 1 h chacun.
   3. Inclure chaque cœur avec l'axe court orienté vers la surface du bloc. Réaliser des coupes sériées de 3 μm au niveau médian des muscles papillaires, faire flotter les sections sur un bain d'eau à 40 °C, les monter sur des lames de verre et les sécher à 60 °C.
   4. Déparaffiner les sections dans deux changements de xylène (15 min chacun), suivis de trois changements d'éthanol absolu (5 min chacun), d'éthanol à 75 % (5 min) et d'eau par osmose inverse (RO) (5 min).
      ATTENTION : Le paraformaldéhyde est un cancérogène probable et un irritant respiratoire et cutané, et le xylène est inflammable et neurotoxique. Manipuler ces réactifs sous une hotte chimique tout en portant des gants médicaux stériles, une blouse de laboratoire et une protection oculaire, et éliminer les déchets conformément aux procédures institutionnelles de gestion des déchets dangereux. L'éthanol et le n-butanol sont inflammables ; les tenir éloignés de toute source d'ignition.
4. Coloration histologique
   1. Coloration à l'hématoxyline-éosine
      1. Immerger les sections déparaffinées et réhydratées dans l'hématoxyline pendant 3 à 5 min. Rincer les sections à l'eau.
      2. Différencier les sections dans de l'alcool acide à 1 %, puis les rincer à l'eau. Bleuir les sections dans de l'ammoniaque aqueux à 0,5 %, puis les rincer à nouveau.
      3. Transférer les sections successivement dans de l'éthanol à 85 %, à 95 % et absolu pendant 5 min chacun. Contre-colorer les sections à l'éosine pendant 3 à 5 min.
      4. Déshydrater les sections dans trois changements d'éthanol absolu de 5 min chacun, puis dans du n-butanol pendant 5 min. Clarifier les sections dans trois changements de xylène de 5 min chacun, puis les monter avec une résine neutre.
         REMARQUE : Les noyaux apparaissent bleus, tandis que le cytoplasme et la matrice extracellulaire apparaissent rouges.
   2. Coloration trichrome de Masson
      1. Mordancer les sections déparaffinées et réhydratées dans une solution de dichromate de potassium à 2,5 % pendant toute la nuit, soit environ 15 h à température ambiante. Rincer les sections sous un filet d'eau pendant environ 30 s jusqu'à disparition de la teinte jaune.
      2. Colorer les sections dans la solution de Ponceau–fuchsine acide pendant 6 min jusqu'à ce que le tissu apparaisse rouge vif. Prolonger le temps de coloration si la couleur reste pâle, puis rincer les sections sous un filet d'eau jusqu'à ce que l'eau de rinçage soit incolore.
      3. Éliminer l'excès d'eau sans laisser les sections sécher. Différencier les sections dans de l'acide phosphomolybdique aqueux pendant 1 à 2 min jusqu'à ce que le collagène apparaisse pâle et que les fibres musculaires restent rouges.
      4. Transférer directement les sections dans la solution d'aniline bleue sans rinçage. Incuber les sections pendant 6 à 30 s.
      5. Différencier les sections dans trois à cinq changements d'acide acétique à 1 % pendant environ 8 s par changement. Les déshydrater rapidement dans trois changements d'éthanol absolu d'environ 3, 5 et 5 s respectivement.
      6. Clarifier les sections dans du n-butanol pendant 5 min, puis dans du xylène pendant 5 min. Monter les sections avec une résine neutre.
         REMARQUE : Les fibres de collagène apparaissent bleues, tandis que les fibres musculaires, le fibrine et les érythrocytes apparaissent rouges.
   3. Coloration au Rouge de Sirius
      1. Incuber les sections déparaffinées et réhydratées dans la solution A de Rouge de Sirius dans un four à 65 °C pendant 30 min. Laver les sections sous un filet d'eau jusqu'à disparition de la teinte jaune.
      2. Éponger l'excès de liquide et immerger les sections dans la solution B de Rouge de Sirius pendant 2 min. Laver brièvement les sections et éponger l'excès de liquide.
      3. Immerger les sections dans la solution C de Rouge de Sirius pendant 30 min. Les rincer brièvement pendant 1 à 2 s.
      4. Déshydrater les sections dans trois changements d'éthanol absolu d'environ 3 s chacun. Les clarifier dans trois changements de xylène de 5 min chacun, puis les monter avec une résine neutre.
         REMARQUE : En éclairage en champ clair, les fibres de collagène apparaissent rouges sur un fond jaune.
5. Acquisition et quantification des images
   1. Acquérir toutes les images histologiques à l'aide d'un scanner numérique de lames. Utiliser des réglages identiques d'éclairage, de balance des blancs, d'exposition et de grossissement pour toutes les sections de tous les groupes, et inclure une barre d'échelle de calibration dans chaque image.
   2. Étalonner l'échelle spatiale avant l'analyse des images. Charger une image de référence contenant la barre d'échelle acquise à la même résolution et aux mêmes dimensions de pixels que les images d'étude. Sous Mesure > Étalonnage > Définir le système, créer un nouvel étalonnage spatial, définir l'unité en μm, définir la conversion pixel-micromètre en alignant les points d'étalonnage avec la barre d'échelle, enregistrer l'étalonnage et l'appliquer à toutes les images.
   3. Charger une section colorée à la trichrome de Masson et délimiter le ventricule gauche à l'aide de l'outil de zone d'intérêt (AOI) irrégulière. Exclure la cavité ventriculaire, le ventricule droit et les artefacts liés à la transformation du tissu, puis enregistrer la surface totale du ventricule gauche.
   4. Ouvrir Mesure > Compter/Taille et sélectionner Sélectionner les couleurs pour ouvrir la boîte de dialogue de segmentation. Choisir la segmentation basée sur le cube de couleur et régler les paramètres comme suit : sensibilité = 4, extension de la sélection de 1 index de couleur, taille minimale de couleur = 1 pixel, taille du noyau = 3 × 3. Appliquer les mêmes paramètres de segmentation à toutes les sections.
   5. Sélectionner les pixels positifs au collagène de couleur bleue à l'aide de l'outil pipette comme points de départ. N'échantillonner que des régions clairement positives au collagène, générer une image de prévisualisation et vérifier que le masque inclut les zones positives au collagène tout en excluant le myocarde coloré en rouge, la cavité ventriculaire et le fond. Ajuster les points de départ si nécessaire avant d'appliquer le masque.
      REMARQUE : Re-sélectionner les pixels de départ pour chaque section afin de tenir compte des légères différences d'intensité de coloration entre les sections. Maintenir des paramètres de segmentation identiques (sensibilité, degré d'extension, taille minimale de couleur et taille du noyau) pour toutes les images, et n'accepter la segmentation que lorsque la prévisualisation montre une couverture complète des zones positives au collagène avec exclusion des structures non collagéniques.
   6. Appliquer le masque de segmentation et fermer la boîte de dialogue. Sous Mesure > Sélectionner les mesures, sélectionner Surface, cliquer sur Compter, ouvrir Affichage > Statistiques, puis enregistrer la surface positive au collagène cumulée.
   7. Calculer la fraction volumique de collagène (CVF) en divisant la surface positive au collagène par la surface totale du ventricule gauche et exprimer le résultat en pourcentage.

9. Clarification des tissus et imagerie tridimensionnelle des artères coronaires

1. Marquage par fluorescence du réseau vasculaire coronaire
   1. Injecter 200 µL d'une solution de bleu d'Évans à 2 % dans la veine caudale latérale afin de marquer le réseau vasculaire coronaire. Remettre la souris dans sa cage pendant 60 min pour permettre la circulation systémique du colorant.
   2. Placer la souris dans une chambre d'induction (16 × 10 × 11 cm) reliée à l'appareil d'anesthésie et induire l'anesthésie avec 4 % d'isoflurane. Euthanasier la souris par dislocation cervicale, ouvrir la cavité thoracique, exciser le cœur intact, le rincer dans du PBS, puis le fixer dans du paraformaldéhyde (PFA) à 4 % pendant 24 h à 4 °C.
      ATTENTION : Le PFA est un cancérogène probable et un irritant respiratoire et cutané. Manipuler le PFA sous une hotte chimique en portant des gants médicaux stériles, une blouse de laboratoire et une protection oculaire, et éliminer les déchets conformément aux procédures institutionnelles de gestion des déchets dangereux.
   3. Préparer une solution d'agarose à 3 % dans de l'eau RO et inclure le cœur fixé en orientant correctement le site de ligature pour l'imagerie. Injecter 1 µL de solution de DAPI dans chacun des huit sites entourant la zone de ligature à l'aide d'une seringue microlitrique, puis incuber l'échantillon à température ambiante pendant 2 jours.
2. Transparence tissulaire
   1. Réaliser la transparence tissulaire à l'aide d'un kit de transparence tissulaire FDISCO (imagerie tridimensionnelle d'organes clarifiés par solvant avec une capacité supérieure de préservation de la fluorescence), conformément aux instructions du fabricant. Le kit comprend six réactifs (A–F) : les réactifs A, B, C, D et E contiennent respectivement 50 %, 70 %, 80 %, 100 % et 100 % de tétrahydrofurane (THF) dans l'eau, et le réactif F est de l'éther dibenzyle.
      ATTENTION : Le THF est hautement inflammable, forme des peroxydes explosifs lors du stockage, et est un irritant respiratoire et cutané. L'éther dibenzyle est un irritant cutané et oculaire. Manipuler tous les réactifs sous une hotte chimique en portant des équipements de protection individuelle appropriés, y compris des gants médicaux stériles, une blouse de laboratoire et une protection oculaire. Éliminer les déchets conformément aux procédures institutionnelles de gestion des déchets dangereux.
   2. Incuber chaque cœur successivement dans les réactifs A, B, C, D et E pendant 6 h par réactif. Utiliser 10 mL de chaque réactif par cœur, correspondant à un rapport minimal volume échantillon/volume réactif de 1:5.
   3. Transférer l'échantillon dans le réactif F et poursuivre l'incubation jusqu'à ce que le tissu devienne optiquement transparent, généralement pendant environ 1 h.
   4. Réaliser toutes les étapes de clarification à 6 °C–8 °C avec agitation douce. Placer l'échantillon dans un récipient en verre enveloppé dans du papier d'aluminium et le protéger de la lumière tout au long de la procédure afin de préserver la fluorescence.
3. Imagerie par feuillet de lumière en fluorescence
   1. Monter l'échantillon clarifié sur le support d'échantillon. Utiliser un microscope à feuillet de lumière équipé d'un objectif 4× (ouverture numérique = 0,28 ; distance de travail = 20,0 mm).
   2. Immerger l'échantillon monté dans de l'éther dibenzyle à l'intérieur de la chambre d'imagerie. Illuminer l'échantillon des deux côtés et exciter successivement le DAPI à 405 nm et le bleu d'Évans à 647 nm.
   3. Régler les paramètres d'acquisition comme suit : pour le canal 405 nm, utiliser une intensité laser de 3 000 unités arbitraires et un temps d'exposition de 30 ms ; pour le canal 647 nm, utiliser une intensité laser de 4 000 unités arbitraires et un temps d'exposition de 30 ms. Acquérir toutes les images avec une taille de pas en z de 6 μm et une résolution d'image de 1 024 × 1 024 pixels.
   4. Régler le mode d'acquisition de la caméra sur XYCZT, dans lequel les images latérales (XY) sont acquises en premier, suivies de l'acquisition séquentielle des canaux (C), du pas axial (Z) et de l'acquisition des points temporels (T), tel que configuré par le logiciel d'imagerie.
4. Traitement des données d'image et reconstruction tridimensionnelle
   1. Assembler les fichiers d'images bruts au format TIFF à l'aide du logiciel de traitement d'image fourni avec le microscope. Convertir les fichiers d'images assemblés au format IMS en sélectionnant Fichier > Convertir en Imaris.
   2. Importer les fichiers IMS convertis dans le logiciel d'analyse tridimensionnelle. Générer des reconstructions rendues en volume à l'aide des paramètres de rendu par défaut, et exporter des images représentatives à l'aide du module Snapshot.
      REMARQUE : Les reconstructions tridimensionnelles sont générées à l'aide du pipeline de rendu par défaut du logiciel, sans modification. Aucun segmentage d'image, seuillage, suppression du bruit, soustraction du fond ou autre prétraitement n'est appliqué. Les images reconstruites sont utilisées pour la visualisation qualitative du réseau vasculaire coronaire et ne sont pas destinées à une analyse quantitative.

10. Analyse statistique

1. Exprimer toutes les données sous forme de moyenne ± erreur standard de la moyenne (ESM). Réaliser les analyses statistiques à l'aide du logiciel GraphPad Prism (version 5.0).
2. Définir l'unité expérimentale comme étant l'animal individuel. Analyser n = 8 souris par groupe pour tous les critères d'évaluation fonctionnels, les biomarqueurs et les analyses histomorphométriques.
3. Effectuer la collecte et l'analyse des données à l'aide d'identifiants codés pour les échantillons, tout en maintenant l'aveugle de l'investigateur concernant l'affectation aux groupes. Ne dévoiler les attributions de groupe qu'après l'achèvement de toutes les analyses quantitatives.
4. Évaluer la normalité des données à l'aide du test de Shapiro-Wilk et l'homogénéité des variances à l'aide du test de Levene dans GraphPad Prism (version 5.0) avant de choisir le test statistique approprié.
5. Comparer deux groupes à l'aide d'un test t de Student bilatéral non apparié t-test lorsque les hypothèses de normalité et d'égalité des variances sont satisfaites. Sinon, effectuez un test de Mann-Whitney U test.
6. Considérer P < 0,05 statistiquement significatif. Indiquer la signification statistique comme P < 0,05, P < 0,01, et P < 0.001.

Résultats

Le SAI a servi de repère anatomique pour la localisation de l'artère coronaire antérieure descendante (LAD) et l'identification du site de ligature (Figure 1A–C). Après identification du SAI, le déroulement chirurgical séquentiel pour l'induction de l'infarctus du myocarde (IM), comprenant la thoracotomie, l'exposition du cœur, la ligature de la LAD, la fermeture thoracique et la récupération postopératoire, a été réalisé comme illustré dans la Figure 2A–L. Le protocole simplifié a permis une induction rapide et reproductible de l'IM chez la souris. Ce protocole nécessite une période prolongée de formation pratique avant de pouvoir être réalisé de façon fiable ; l'intubation trachéale et la ligature guidée par le SAI sont les deux étapes dont la courbe d'apprentissage est la plus abrupte. Pendant les premières phases de formation, la mortalité périopératoire au cours des 7 premiers jours postopératoires peut atteindre 50 % ou plus, et le taux de réussite de l'induction du modèle peut chuter à 30 % ou moins. Une fois ces techniques maîtrisées, le taux de réussite chirurgicale dépasse régulièrement 90 %. Dans la présente étude, aucun décès périopératoire n'a été observé durant les 7 premiers jours postopératoires. Toutes les procédures de formation ont été effectuées conformément au même protocole institutionnel d'utilisation des animaux approuvé.

Après la ligature de l'artère coronaire descendante antérieure (LAD), des anomalies électrocardiographiques caractéristiques ont été observées, notamment un approfondissement marqué de l'onde Q, un relèvement du segment ST avec une morphologie convexe vers le haut, un pic hyperaigu de l'onde T (qui évolue généralement vers une inversion de l'onde T durant la phase subaiguë), une augmentation de la tension du complexe QRS avec une amplitude élargie, ainsi qu'une tachycardie prononcée (Figure 3A). L'examen macroscopique a révélé un blanchiment localisé du myocarde et une dilatation ventriculaire en aval du site de ligature dans le groupe IM par rapport au groupe CN (Figure 3B). L'examen histopathologique a mis en évidence une désorganisation des fibres myocardiques, un élargissement des espaces intercellulaires, une infiltration par des cellules inflammatoires, un dépôt de collagène et une rupture de la structure myocardique dans le groupe IM, comme le montrent les colorations à l'hématoxyline-éosine (H&E), à la trichrome de Masson et au rouge de Sirius (Figure 3C). L'analyse quantitative des sections colorées à la trichrome de Masson a montré une fraction volumique du collagène (CVF) significativement plus élevée dans le groupe IM que dans le groupe CN (18,24 % ± 1,67 % contre 0,05 % ± 0,01 % ; P < 0,001 ; Figure 3D).

Figure 3 : Modifications électrocardiographiques, anatomiques macroscopiques et histopathologiques après la ligature de l'artère coronaire descendante antérieure chez la souris. (A) Électrocardiogrammes (ECG) représentatifs enregistrés immédiatement après la chirurgie chez les groupes témoin normal (NC) et infarctus du myocarde (MI). (B) Images macroscopiques représentatives de cœurs des groupes NC et MI. Échelles = 1 mm. (C) Sections transversales cardiaques représentatives des groupes NC et MI colorées à l'hématoxyline-éosine (H&E ; à gauche), à la trichrome de Masson (au centre) et au Rouge de Sirius (à droite). Sur les coupes colorées à la trichrome de Masson, le collagène apparaît en bleu et le myocarde en rouge ; sur les coupes colorées au Rouge de Sirius, le collagène apparaît en rouge sur un fond jaune. Échelles = 1 000 µm. (D) Fraction volumique de collagène (CVF), calculée comme la surface positive au collagène divisée par la surface totale du ventricule gauche et exprimée en pourcentage, dans les groupes NC et MI. Les données sont présentées comme moyenne ± erreur standard de la moyenne (SEM) ; n = 8 souris par groupe. La significativité statistique par rapport au groupe NC est indiquée par **P < 0,001. Veuillez cliquer ici pour visualiser une version agrandie de cette figure.

Une altération de la fonction cardiaque a été confirmée par échocardiographie. Des images représentatives en mode M ont montré une contractilité ventriculaire gauche réduite dans le groupe IM (Figure 4A). L'analyse quantitative a révélé une fraction d'éjection (FE) et une fraction de raccourcissement (FS) du ventricule gauche significativement diminuées dans le groupe IM par rapport au groupe CN (Figure 4B,C). Le dosage immunoenzymatique (ELISA) a mis en évidence des concentrations sériques significativement augmentées de BNP, de TNF-α, de NF-κB p65 et d'IL-1β dans le groupe IM (Figure 4D–G), en accord avec une dysfonction cardiaque et une réponse inflammatoire.

Figure 4 : Modifications fonctionnelles cardiaques et concentrations sériques des biomarqueurs après la ligature de l'artère coronaire descendante antérieure. (A) Images représentatives d'échocardiographie en mode M provenant des groupes témoin normal (NC) et d'infarctus du myocarde (MI). (B) Fraction d'éjection du ventricule gauche (EF). (C) Fraction de raccourcissement du ventricule gauche (FS). (D–G) Concentrations sériques de (D) la peptide natriurétique de type B (BNP), (E) le facteur de nécrose tumorale-α (TNF-α), (F) le facteur nucléaire-κB p65 (NF-κB p65) et (G) l'interleukine-1β (IL-1β), mesurées par dosage immunoenzymatique (ELISA). L'EF et la FS sont exprimées en pourcentage ; le BNP, le TNF-α et l'IL-1β sont exprimés en pg/mL ; le NF-κB p65 est exprimé en ng/mL. Les données sont présentées sous forme de moyenne ± erreur standard de la moyenne (ESM) ; n = 8 souris par groupe. La significativité statistique par rapport au groupe NC est indiquée par *P < 0,01 et **P < 0,001. Veuillez cliquer ici pour visualiser une version agrandie de cette figure.

L'imagerie de fluorescence tridimensionnelle de cœurs rendus transparents a démontré le trajet de l'artère interventriculaire antérieure (AIA) sous l'artère interventriculaire sus-épicardique (AIS) et a montré que la ligature au site défini anatomiquement provoquait une occlusion coronaire (Figure 5A–F). Dans leur ensemble, ces résultats démontrent une induction réussie d'un phénotype d'infarctus du myocarde (IDM) dans cette première série de huit animaux par groupe, caractérisé par une dysfonction du ventricule gauche, une fibrose myocardique et une inflammation systémique. La présente étude avait pour objectif d'établir et de démontrer la faisabilité du modèle d'IDM guidé par l'AIS, plutôt que de fournir une validation exhaustive de la taille de l'échantillon, de la stabilité à long terme du modèle ou de la concordance anatomique entre l'AIS et l'AIA. En conséquence, ces aspects sont reconnus comme des limites de la présente étude et sont abordés dans la section Discussion. Plus précisément, les évaluations fonctionnelles et biochimiques ont été limitées à la phase aiguë suivant l'IDM, et la relation entre l'AIS et l'AIA a été démontrée de manière qualitative, mais n'a pas encore été quantifiée dans une cohorte suffisamment large.

Figure 5 : Imagerie par fluorescence tridimensionnelle de la vascularisation coronaire murine rendue transparente. Des cœurs entiers rendus transparents ont été marqués au bleu d'Évans afin de visualiser la vascularisation coronaire et à l'aide de la 4′,6-diamidino-2-phénylindole (DAPI) pour visualiser les noyaux, puis soumis à une imagerie par feuillet de lumière en fluorescence et à une reconstruction tridimensionnelle. (A–C) Reconstructions du cœur entier montrant respectivement le canal (A) DAPI, le canal (B) bleu d'Évans et les canaux (C) superposés. Les échelles correspondent à 1 000 µm. (D–F) Vues agrandies de la région vasculaire coronaire montrant le canal (D) DAPI, le canal (E) bleu d'Évans et les canaux (F) superposés. Les échelles correspondent à 400 µm. Veuillez cliquer ici pour consulter une version agrandie de cette figure.

Toute procédure ne donne pas lieu à un modèle optimal, et la reconnaissance des résultats sous-optimaux est essentielle pour le dépannage. Une ligature placée trop proximalement ou le passage de l'aiguille trop en profondeur peut entraîner un infarctus excessivement étendu, accompagné d'une insuffisance cardiaque sévère, d'arythmies ou d'une rupture ventriculaire, conduisant à une mortalité précoce. Inversement, une ligature placée trop distalement ou trop superficiellement peut provoquer un infarctus minime ou ne pas induire d'infarctus du tout. L'induction réussie du modèle doit donc être évaluée selon plusieurs critères. Pendant l'intervention chirurgicale, le blanchissement du myocarde en aval du site de ligature fournit un indicateur immédiat d'occlusion coronaire, bien que ce signe ne soit pas toujours facilement visible. L'échocardiographie postopératoire et l'examen histopathologique apportent une confirmation supplémentaire de la mise en place réussie du modèle. Supplementary Figure 1 montre un modèle infructueux représentatif, dans lequel l'examen histopathologique ne révèle aucune infiltration de cellules inflammatoires ni fibrose apparente.

Figure supplémentaire 1. Résultats histologiques représentatifs d'un modèle d'infarctus du myocarde infructueux. Sections transversales cardiaques représentatives d'une souris chez laquelle l'induction d'un infarctus du myocarde a échoué, colorées avec (A) l'hématoxyline-éosine (H&E), (B) la trichromie de Masson et (C) le rouge de Sirius. Contrairement à une induction réussie d'infarctus du myocarde, ces sections ne montrent aucune infiltration évidente de cellules inflammatoires ni remodelage fibrotique dans le myocarde du ventricule gauche, ce qui est compatible avec une occlusion artérielle coronaire infructueuse. Échelles = 1 000 µm.Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.

Discussion

Ces dernières années, les modèles cliniques et expérimentaux de l'infarctus du myocarde (IM) sont devenus de plus en plus importants dans la recherche cardiovasculaire, mais de nombreuses questions concernant la pathogenèse de l'IM et les stratégies de traitement restent sans réponse. Cet article décrit une méthode améliorée pour établir un modèle murin d'IM, dans laquelle plusieurs étapes critiques du protocole nécessitent une attention particulière. La première étape critique est l'intubation trachéale. Certains protocoles antérieurs établissent la voie aérienne par trachéotomie, ce qui nécessite une incision de la peau cervicale et la dissection des tissus pour exposer la trachée avant l'intubation¹³ ; d'autres conservent l'intubation oro-trachéale mais recommandent une incision cervicale médiane afin d'améliorer la visualisation pendant l'intervention¹⁴. Contrairement à ces deux approches, le présent protocole utilise un laryngoscope pour éclairer l'oropharynx et réalise une intubation oro-trachéale sous visualisation directe de la glotte, sans incision cervicale. Bien que cette méthode exige davantage de compétences techniques de la part de l'opérateur, elle évite les traumatismes des tissus cervicaux, réduit le risque d'infection et de douleur postopératoire, et diminue la durée de l'intervention. L'erreur la plus fréquente lors de l'intubation est le placement involontaire dans l'œsophage. Si le thorax ne se soulève pas pendant la ventilation et si le tube endotrachéal ne présente aucune condensation lors de l'expiration, retirez immédiatement le tube et répétez l'intubation. Ne branchez le ventilateur qu'après avoir confirmé un mouvement symétrique bilatéral de la paroi thoracique.

La deuxième étape, et la plus critique, consiste à identifier l'artère coronaire antérieure descendante (LAD) et à positionner précisément le ligature. Les méthodes conventionnelles rencontrent plusieurs difficultés à ce stade. La fréquence cardiaque au repos de la souris est d'environ 500 à 600 battements/min, et la LAD se situe adjacente à plusieurs veines coronaires accompagnantes, ce qui rend l'identification en temps réel de l'artère intrinsèquement difficile pendant l'intervention chirurgicale. De plus, même dans des conditions optimales, une proportion importante de LAD ne peut pas être clairement visualisée au microscope stéréoscopique¹⁵. Dans ce contexte, les protocoles antérieurs qui estiment le site de ligature à un point situé à 1–2 mm sous l'appendice auriculaire gauche sont limités par l'identification inconstante, pendant l'intervention, de cette référence anatomique^12,14, tandis que le schéma complexe de ramification de l'artère coronaire gauche peut encore compromettre la reproductibilité¹⁶. Pour surmonter ces difficultés, le présent protocole utilise l'incisure interventriculaire antérieure (AIS) comme repère anatomique pour positionner le ligature. Au microscope stéréoscopique, l'AIS apparaît comme un sillon peu profond sur la face ventrale du cœur, la LAD courant immédiatement en dessous. Elle fournit donc une référence anatomique relativement stable, moins dépendante de l'expérience de l'opérateur. Le positionnement du ligature au tiers supérieur de l'AIS offre une cible anatomique constante pour l'occlusion coronaire. Les résultats représentatifs démontrent que cette approche a permis de produire avec succès le phénotype attendu d'infarctus aigu du myocarde chez les animaux examinés.

Le repère du SAI n'est pas fiable dans toutes les circonstances. Lorsque l'exposition thoracique est limitée ou qu'un saignement épipéricardique obscurcit la surface cardiaque et rend difficile l'identification du SAI, nettoyez délicatement le champ opératoire avec un coton-tige humidifié à la solution saline et réévaluez le sillon avant la ligature. Si le SAI ne peut toujours pas être identifié avec certitude, identifiez directement la DA selon la description du protocole et effectuez la ligature sous visualisation directe plutôt que de vous fier au SAI. Si nécessaire, confirmez l'espace intercostal correct en comptant de manière caudale à partir de la première côte afin d'assurer une exposition adéquate de l'appendice auriculaire gauche et de la paroi antérieure du ventricule gauche.

Parmi les complications postopératoires, le pneumothorax est la plus fréquente et se manifeste généralement par une détresse respiratoire après l'extubation. La clé pour prévenir le pneumothorax consiste à évacuer complètement l'air résiduel de la cavité thoracique avant la fermeture de l'espace intercostal. En cas de suspicion de pneumothorax, réanesthésiez brièvement et ventilez la souris, rouvrez les points de suture cutanés, puis examinez la fermeture intercostale. Si un ou plusieurs sites de fermeture incomplète sont identifiés, placez des points de suture supplémentaires au niveau de la fuite d'air avant de répéter la procédure d'extubation. Une autre complication possible est le saignement peropératoire, qui survient le plus souvent lorsque l'aiguille perce un petit vaisseau épicrodien ou une veine coronaire adjacente lors de la ligature. Le saignement est généralement limité et peut habituellement être contrôlé en appliquant une pression douce avec un coton-tige humidifié à la solution saline pendant plusieurs secondes. Avant de fermer la cavité thoracique, vérifiez qu'aucun saignement actif n'est présent dans le champ opératoire afin de minimiser les complications postopératoires. En outre, les souris peuvent présenter des arythmies, notamment des contractions ventriculaires prématurées ou une fibrillation ventriculaire transitoire, pendant ou immédiatement après la procédure. Ces arythmies sont souvent atténuées en maintenant la température corporelle, en stabilisant la profondeur de l'anesthésie et en interrompant temporairement la procédure pour permettre une récupération spontanée du rythme cardiaque. Enfin, les complications liées à l'anesthésie résultent le plus souvent de l'incapacité à réduire rapidement la concentration d'isoflurane après une intubation trachéale réussie. Réduisez immédiatement la concentration d'isoflurane au niveau d'entretien après avoir raccordé le tube endotrachéal au ventilateur, et surveillez continuellement la respiration et la fréquence cardiaque tout au long de la procédure.

Dans l'ensemble, cette méthode exige une compétence microchirurgicale importante et, comme d'autres modèles de ligature permanente de l'artère coronaire antérieure descendante (LAD), reste soumise à des variations dues aux différences anatomiques coronariennes et à l'expérience de l'opérateur. Néanmoins, avec une formation adéquate et une technique chirurgicale rigoureuse, les chercheurs peuvent établir le modèle d'infarctus du myocarde avec une reproductibilité raisonnable, tout en améliorant la reproductibilité de la procédure et la survie postopératoire.

Plusieurs limites de cette méthode doivent être reconnues. Premièrement, les évaluations fonctionnelles et biochimiques ont été réalisées dans la semaine suivant l'induction de l'infarctus du myocarde (IM) et reflètent donc uniquement la phase aiguë de l'IM, sans évaluation systématique des résultats à long terme tels que le remodelage ventriculaire entre 4 et 8 semaines après la chirurgie. Deuxièmement, comme pour d'autres modèles d'IM par ligature permanente utilisant des fils non résorbables, ce protocole peut entraîner des adhérences péricardiques chroniques. Ceci représente une caractéristique intrinsèque du modèle par ligature, plutôt qu'une limitation propre à l'approche guidée par l'AIS. Toutefois, la gravité de ces adhérences et leurs effets sur la fonction cardiaque à long terme n'ont pas été quantifiés dans la présente étude. De futures recherches pourraient explorer l'utilisation de fils résorbables et évaluer leurs effets sur la formation d'adhérences et la performance du modèle. Troisièmement, bien qu'une imagerie coronaire tridimensionnelle ait démontré qualitativement que l'artère interventriculaire antérieure (AIA) passe sous l'AIS, la concordance anatomique entre ces structures n'a pas encore été quantifiée dans un échantillon suffisamment large. Quatrièmement, cette étude n'a inclus que des souris mâles de souche C57BL/6J. Bien que l'AIS doive représenter un repère anatomique constant, son applicabilité chez les souris femelles, d'autres souches murines et d'autres espèces nécessite une validation supplémentaire. Enfin, les avantages potentiels de ce protocole en termes de reproductibilité du site de ligature et de reproductibilité procédurale reposent sur l'expérience acquise dans un seul laboratoire et n'ont pas été évalués par comparaison directe avec les méthodes conventionnelles de ligature de l'AIA ni entre plusieurs opérateurs et institutions. Des études de validation supplémentaires seront donc nécessaires pour établir la généralisabilité plus large de la méthode.

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Soluté physiologique stérile à 0,9 %	Sichuan Kelun Pharmaceutical Co., Ltd.	-	Reconstitution de la céfazoline
Agarose à 3 %	Sigma-Aldrich	A0169	Inclusion des échantillons
Paraformaldéhyde à 4 %	Sigma-Aldrich	158127	Fixation des tissus
Éthanol absolu	Chengdu Kelong Chemical Co., Ltd.	05.001.0170A	Déshydratation des tissus ; inflammable
Fuchsine acide	Aladdin	A104916-100g	Préparation de la solution de Ponceau–fuchsine acide pour la coloration trichrome de Masson
Logiciel AcqKnowledge	BIOPAC Systems	AcqKnowledge 4.0	Acquisition et analyse de l'électrocardiogramme
Solution d'ammoniaque, aqueuse à 0,5 %	Chengdu Kelong Chemical Co., Ltd.	05.001.2528A	Rebleuissement lors de la coloration à l'hématoxyline-éosine
Bleu d'aniline, soluble dans l'acide	Aladdin	A111200-100g	Préparation de la solution de bleu d'aniline pour la coloration trichrome de Masson
Gants médicaux stériles	Nanchang Feixiang Latex Products Co., Ltd.	-	Protection chimique et biologique
Buprénorphine	Qinghai Pharmaceutical Factory Co., Ltd.	H10940181	Analgésie postopératoire
Céfazoline sodique pour injection	CSPC Zhongnuo Pharmaceutical (Shijiazhuang) Co., Ltd.	-	Antibiothérapie prophylactique périopératoire
Compresseurs en coton	Shijiazhuang Kangertai Medical Equipment Co., Ltd.	-	Étamponnage épipéricardique et préparation aseptique
Solution de coloration DAPI	Thermo Fisher	D1306	Marquage nucléaire
Crème dépilatoire	Veet	-	Épilation thoracique
Scanner numérique de lames	3DHISTECH	Pannoramic MIDI II	Imagerie complète de lame
Amplificateur d'ECG	BIOPAC Systems	ECG100C	Amplification de l'électrocardiogramme
Système d'enregistrement d'électrocardiogramme	BIOPAC Systems	MP160	Enregistrement de l'électrocardiogramme
Kit ELISA, peptide natriurétique de type B murin	Quanzhou Ruixin Biological Technology Co.	RXW202726M	Quantification sérique du BNP
Kit ELISA, interleukine-1β murine	Quanzhou Ruixin Biological Technology Co.	RX203063M	Quantification sérique de l'IL-1β
Kit ELISA, facteur nucléaire-κB p65 murin	Quanzhou Ruixin Biological Technology Co.	RX201879M	Quantification sérique du NF-κB p65
Kit ELISA, facteur de nécrose tumorale-α murin	Quanzhou Ruixin Biological Technology Co.	RX202412M	Quantification sérique du TNF-α
Cassettes d'inclusion	Jiangsu Shitai	22022	Inclusion des tissus
Cathéter endotrachéal, 20 G	Shenzhen Bailide Biotechnology Co., Ltd.	B11103	Intubation orale ; diamètre externe d'environ 0,9–1,0 mm ; raccourci à environ 15 mm avant utilisation
Éosine Y, soluble dans l'alcool	Hefei BASF Biotechnology Co., Ltd.	Y0310-100G	Contre-coloration cytoplasmique lors de la coloration à l'hématoxyline-éosine
Bleu d'Évans	Jarvisbio	A312001	Marquage de la vascularisation coronaire
Pince fine	RWD Life Science	F12011-10	Manipulation des tissus et ouverture du péricarde
Pince fine microchirurgicale	RWD Life Science	FC12002T-08	Manipulation microchirurgicale des tissus
Ciseaux fins	RWD Life Science	S12000-09	Ciseaux ophtalmiques pour incision cutanée et dissection
Acide acétique glacial	Chengdu Kelong Chemical Co., Ltd.	-	Préparation d'acide acétique à 1 % pour la différenciation trichrome de Masson
Lames en verre	Jiangsu Shitai	80312/80302	Montage des sections
Stérilisateur à billes de verre	RWD Life Science	RS3002	Stérilisation des instruments entre les animaux
Logiciel GraphPad Prism	GraphPad Software	Version 5.0	Analyse statistique
Plaque chauffante	RWD Life Science	69020	Régulation thermique postopératoire
Solution de coloration à l'hématoxyline	Wuhan Servicebio Technology Co., Ltd.	G1004	Coloration nucléaire lors de la coloration à l'hématoxyline-éosine
Anticorps de détection conjugué à la peroxydase de raifort	Quanzhou Ruixin Biological Technology Co.	Inclus avec les kits ELISA	Détection ELISA
Acide chlorhydrique	Chengdu Kelong Chemical Co., Ltd.	05.001.1337A	Préparation de l'alcool acide pour la différenciation de l'hématoxyline
Logiciel Image-Pro Plus	Media Cybernetics	Version 6.0	Quantification de la fraction volumique de collagène
Logiciel Imaris	Bitplane	Version 7.2.3	Reconstruction et analyse tridimensionnelles
Isoflurane	RWD Life Science	R510-22-10	Anesthésique inhalé
Système d'anesthésie à l'isoflurane	RWD Life Science	TAIJI-IE	Distribution d'isoflurane
Laryngoscope pour petit animal	Shanghai Yuyan Scientific Instrument Co., Ltd.	SR310-MR	Visualisation directe pendant l'intubation
Microscope à feuillet de lumière à fluorescence	Light Innovation Technology	LiToneXL	Imagerie de fluorescence tridimensionnelle
Logiciel LitScan	Light Innovation Technology	Version 3.31	Assemblage et conversion d'images
Respirateur mécanique	Chengdu Taimeng Software Co., Ltd.	HX-101E	Ventilation mécanique ; 130 cycles/min ; volume courant de 2 mL
Hémostat micro-moustique	RWD Life Science	FC21001R-12	Prise de l'aiguille lors de la ligature et de la fermeture
Seringue microlitrique	Shanghai Gaoge Industry and Trade Co., Ltd.	-	Injection localisée de DAPI
Lecteur de microplaques	Molecular Devices (Shanghai) Co., Ltd.	SpectraMax iD5	Mesure de la densité optique à 450 nm
Microscope stéréoscopique	Maishidi (Dongguan) Technology Co., Ltd.	MSD204	Visualisation peropératoire
Microscope optique droit	Leica	DM500	Imagerie histologique
Lames de microtome	Epredia	MX35 ULTRA	Coupes en paraffine
Kit de coloration au rouge de Sirius modifié	Wuhan Servicebio Technology Co., Ltd.	G1078	Coloration du collagène ; inclut les solutions A, B et C
n-Butanol	Chengdu Kelong Chemical Co., Ltd.	05.001.0886A	Déshydratation et clarification histologiques ; inflammable
Résine de montage neutre	Shanghai Yiyang	YSQN41-91	Montage des lames
Filet de suture en nylon, 3/8 de cercle 7-0 avec aiguille	Ningbo Medical Needle Co., Ltd.	-	Ligation de l'artère coronaire antérieure descendante gauche
Filet de suture en nylon, 5-0	Ningbo Medical Needle Co., Ltd.	-	Fermeture thoracique et cutanée
Filet de suture en nylon, 6-0	Ningbo Medical Needle Co., Ltd.	-	Exposition et traction de la paroi thoracique
Poste d'inclusion en paraffine	Wuhan Junjie Electronics	JB-L5	Inclusion des tissus
Paraffine	NA	NA	Imprégnation et inclusion des tissus
Solution saline tamponnée au phosphate	Sigma-Aldrich	P3813	Lavage des tissus et dilution des réactifs
Acide phosphomolybdique	Tianjin Aopusheng Chemical Co., Ltd.	-	Différenciation trichrome de Masson
Ponceau 2R	Aladdin	P104989-25g	Préparation de la solution de Ponceau–fuchsine acide pour la coloration trichrome de Masson
Dichromate de potassium	Zhengzhou Paini Chemical Reagent Factory	7778-50-9	Mordant pour la trichrome de Masson
Povidone–iode	SingleLady	GB26368-2010	Antisepsie cutanée
Eau par osmose inverse	Purifiée en laboratoire	Non applicable	Préparation de solutions
Microtome rotatif	Leica Instruments (Shanghai)	RM2016	Coupes en paraffine
Adaptateur de support d'échantillon	Light Innovation Technology	Fourni avec LiToneXL	Montage des échantillons clarifiés pour l'imagerie à feuillet de lumière
Adhésif cutané	Qingdao Schultz Biotechnology Co., Ltd.	-	Fixation des membres et de la queue
Coverslips	Jiangsu Shitai	80340-1630	Recouvrement des lames
Séchoir à lames	Shaoxing Luyue	101-3B	Séchage des lames
Solution d'arrêt	Quanzhou Ruixin Biological Technology Co.	Incluse avec les kits ELISA	Arrêt de la réaction ELISA
Solutions substrat A et B	Quanzhou Ruixin Biological Technology Co.	Incluses avec les kits ELISA	Développement coloré ELISA
Bain flottant pour tissus	Wuhan Junjie Electronics	JK-5/6	Flottaison des sections
Appareil de traitement des tissus	Wuhan Junjie Electronics	JT-12S	Traitement automatisé des tissus
Kit de clarification des tissus, réactifs A–F	Jarvisbio	JA11012	Clarification des tissus par solvant
Plateforme d'intubation trachéale	RWD Life Science	Re20-M	Positionnement pour intubation orale
Logiciel d'analyse par ultrasons	Fujifilm VisualSonics	VevoLAB 3.2.6	Analyse des données d'échocardiographie
Gel pour ultrasons	Tianjin Jinya Electronics Co., Ltd.	TM-100	Couplage échocardiographique
Système d'imagerie par ultrasons	Fujifilm VisualSonics	Vevo 3100	Échocardiographie
Retracteur palpébral en forme de V	Suqian Shengshi Medical Equipment Co., Ltd.	SS5009G	Rétraction intercostale et costale
Solution de lavage	Quanzhou Ruixin Biological Technology Co.	Incluse avec les kits ELISA	Lavage des plaques ELISA
Système de purification d'eau	Sichuan ULUPURE Ultrapure Technology Co., Ltd.	UPT-II-20T	Production d'eau par osmose inverse
Xylène	Chengdu Kelong Chemical Co., Ltd.	05.001.0586A	Clarification des tissus et déparaffinage ; inflammable et neurotoxique