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Préparation d'échantillons de moelle osseuse fixés au formol et inclus en paraffine pour la transcriptomique spatiale utilisant une décalcification à base d'EDTA

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DOI :

10.3791/72474

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28 août 2026

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1Hematology and Oncology Program, Center for Applied Medical Research (CIMA), Instituto de Investigaciones Sanitarias de Navarra (IdiSNA), Cancer Center Clínica Universidad de Navarra (CCUN), 2Centro de Investigación Biomédica en Red de Cáncer (CIBERONC), 3Hematology and Cell Therapy Department, Cancer Center Clínica Universidad de Navarra (CCUN), Instituto de Investigaciones Sanitarias de Navarra (IdiSNA), 4Bioscience Program, Biological and Environmental Sciences and Engineering Division (BESE), King Abdullah University of Science and Technology (KAUST)

Dans cet article

Résumé

Un protocole normalisé pour la préparation d'échantillons osseux fixés au formol et inclus en paraffine destinés à la transcriptomique spatiale comprend une étape de décalcification par l'EDTA d'une durée de 10 jours afin de préserver l'intégrité de l'ARN. Des points de contrôle de qualité essentiels permettent de déterminer si les échantillons répondent aux critères requis pour les analyses ultérieures d'expression génique spatiale.

Résumé

La moelle osseuse (MO) est une structure complexe et dynamique dans laquelle les relations spatiales influencent le comportement cellulaire, la signalisation et la fonction. Pour cette raison, la compréhension complète des dynamiques des interactions cellulaires nécessite des techniques spatiales complémentaires qui préservent et cartographient l'architecture des populations cellulaires in situ. Malgré des progrès importants dans les technologies à l'échelle de la cellule unique qui ont contribué à comprendre l'hétérogénéité transcriptionnelle des tissus de MO sains et pathologiques, l'organisation spatiale des différents types cellulaires, les programmes régulateurs spécifiques aux niches et leurs interactions nécessitent encore des études approfondies. Les récents développements en transcriptomique spatiale ont permis une analyse sans biais de l'expression génique avec un contexte spatial dans divers tissus, rendant ces technologies complémentaires des méthodes à l'échelle de la cellule unique qui manquent de résolution spatiale. Bien que la transcriptomique spatiale ait été largement utilisée dans les tissus mous, son application dans les tissus minéralisés tels que la MO reste limitée en raison des difficultés liées au traitement du tissu osseux. Le protocole présenté ici a été utilisé pour préparer des échantillons fixés au formol et inclus en paraffine (FFPE) provenant de tissus murins et humains sains et pathologiques. Une étape de décalcification basée sur l'acide éthylènediaminotétraacétique (EDTA) d'une durée de 10 jours est incluse afin de préserver l'intégrité de l'ARN et de permettre l'utilisation de la transcriptomique spatiale sur des échantillons d'os longs. Ce protocole décrit la préparation des échantillons de MO pour l'analyse transcriptomique spatiale, y compris le traitement, la préservation et la sectionnement des tissus, ainsi que des étapes essentielles d'évaluation de la qualité, telles que l'évaluation de l'intégrité des sections, de la morphologie tissulaire et de la qualité de l'ARN. Le flux de travail permet également l'identification des types cellulaires et l'intégration avec des données transcriptomiques à l'échelle de la cellule unique afin de caractériser la composition cellulaire, définir les interactions entre cellules et visualiser la distribution spatiale des cellules transcriptionnellement hétérogènes dans les états sains et pathologiques. Dans l'ensemble, ce flux de travail permet de préparer des tissus sains et malins complètement minéralisés pour une analyse transcriptomique spatiale tout en préservant l'architecture de la MO.

Introduction

La moelle osseuse (BM) est un organe hautement complexe et compartimenté qui sert de site principal pour l'hématopoïèse et la maturation des cellules immunitaires1,2. Ce tissu hétérogène comprend une grande variété de lignées cellulaires hématopoïétiques, mésenchymateuses, endothéliales et immunitaires qui coexistent dans un microenvironnement tridimensionnel hautement spécialisé et organisé3,4. Dans ce microenvironnement, chaque population cellulaire occupe des territoires anatomiques distincts, et le contexte spatial joue un rôle fondamental dans la régulation du comportement, de la signalisation et de la fonction cellulaires4,5. La proximité physique avec des structures spécifiques, telles que l'os trabéculaire ou les réseaux vasculaires, régule des processus physiologiques essentiels, notamment le maintien de la quiescence des cellules souches hématopoïétiques (HSC) et le remodelage osseux6,7. Par conséquent, ce microenvironnement dynamique et les interactions étroitement régulées entre ses composants cellulaires et stromaux façonnent les réseaux régulateurs qui maintiennent l'homéostasie et influencent la progression des malignités hématologiques8,9,10,11,12,13.

Les progrès réalisés dans le séquençage de l'ARN au niveau de la cellule unique (scRNA-seq) ont révolutionné notre compréhension de la diversité cellulaire de la moelle osseuse (BM), permettant la découverte de sous-types cellulaires auparavant non reconnus ainsi que leurs interactions prédites au sein du compartiment niche3,10,11,12,14,15,16. Toutefois, la transcriptomique à une cellule unique, bien qu'elle fournisse des informations haute résolution sur les composants individuels du compartiment hématopoïétique, présente des limites inhérentes liées au processus de digestion tissulaire, qui dissocie les cellules de leur environnement natif et peut modifier leur état physiologique17, ainsi qu'à l'absence de contexte spatial qui définit l'organisation du tissu osseux4,18. Cette perte de contexte positionnel rend impossible la cartographie définitive de l'emplacement des populations transcriptionnellement distinctes ou de leurs interactions avec les cellules voisines19. De plus, le tissu osseux dense est souvent partiellement dissocié, ce qui conduit à une sous-représentation de populations cellulaires clés, telles que les ostéocytes et les adipocytes, dans les jeux de données de scRNA-seq, et à une représentation biaisée de l'hétérogénéité tissulaire20,21. La transcriptomique spatiale permet l'étude de l'expression génique in situ, dans des sections tissulaires dont l'architecture spatiale est préservée, permettant ainsi de récupérer des informations contextuelles et de pallier les limites des technologies de type cellule unique8,19,22,23,24,25,26. Cette technologie constitue une avancée essentielle dans le domaine, car elle permet de localiser précisément et de reconstruire l'organisation structurelle des différentes populations cellulaires composant la moelle osseuse, ce qui est indispensable pour comprendre leurs interactions et leurs rôles fonctionnels au sein de leur microenvironnement natif8,26. En outre, dans le contexte des maladies, la transcriptomique spatiale permet aux chercheurs et cliniciens de combler l'écart entre la pathologie traditionnelle et la génomique à haut débit, en superposant des données moléculaires à des images morphologiques1,8. Les technologies de transcriptomique spatiale peuvent être classées en deux grandes catégories : les méthodes basées sur le séquençage et les méthodes basées sur l'imagerie17,24. Les plateformes fondées sur le séquençage, telles que Visium, Curio Seeker, GeoMx Digital Spatial Profiler (GeoMx DSP), Stereo-seq, Deterministic Barcoding in Tissue sequencing (DBiT-seq) et l'outil open source Open-ST, capturent les ARNm sur des réseaux ou des billes spatialement codés avant un séquençage de nouvelle génération. Les méthodes basées sur l'imagerie, incluant la Multiplexed Error-Robust Fluorescence in Situ Hybridization (MERFISH), la Molecular Cartography, RNAscope, CosMX et Xenium, visualisent directement les transcrits in situ par hybridation multiplexée ou par chimie de sondes en boucle (padlock probes)27,28. Alternativement, les plateformes peuvent être classées comme ciblées ou non ciblées, selon qu'elles nécessitent ou non une détection par sondes17,24.

Les méthodes de transcriptomique spatiale ont été largement appliquées aux tissus mous, tels que le cerveau, le cœur et le foie, où la production de sections histologiques intactes est simple29,30,31. En revanche, la mise en œuvre de la transcriptomique spatiale dans l'os est nettement plus difficile en raison de sa nature minéralisée, qui nécessite un processus de décalcification32,33, soit le retrait contrôlé du phosphate de calcium, rendant le tissu suffisamment souple pour la sectionnement et les analyses histologiques ou moléculaires ultérieures8,20,23,34. Les méthodes traditionnelles de décalcification couramment utilisées en pratique clinique reposent généralement sur des solutions acides fortes telles que l'acide chlorhydrique, nitrique, formique ou phosphorique, qui dégradent gravement l'intégrité de l'ARN et perturbent la morphologie cellulaire35,36. Cette dégradation moléculaire réduit le rapport signal/bruit dans les tests spatiaux, entraînant souvent des taux de détection des gènes inacceptables par rapport aux tissus mous8,10. Cette limitation souligne le besoin de protocoles standardisés de décalcification capables de préserver de façon fiable l'intégrité des ARNm dans les échantillons minéralisés destinés aux analyses spatiales basées sur le séquençage8,20.

Ce protocole présente un flux de travail standardisé pour la préparation d'échantillons de moelle osseuse fixés au formol et inclus en paraffine (FFPE) destinés à la transcriptomique spatiale, précédemment appliqué par Muiños-Lopez et al.8. Le flux de travail comprend une étape de décalcification de 10 jours utilisant l'acide éthylènediaminetétraacétique (EDTA) à un pH contrôlé. Contrairement aux acides agressifs, l'EDTA agit comme un chélateur doux qui préserve la structure microscopique et maintient la qualité des acides nucléiques, justifiant son utilisation dans les applications moléculaires8,20,33,36,37. À titre de preuve de concept, ce protocole a été mis en œuvre sur des échantillons de tissu osseux provenant de modèles murins sains et atteints de myélome multiple (MM), ainsi que sur des prélèvements de moelle osseuse humaine provenant d'individus sains et malades, puis les échantillons ont été séquencés sur la plateforme Visium Spatial Gene Expression38. Le flux de travail inclut des procédures standardisées pour la collecte de tissus à partir d'échantillons osseux humains et murins, la fixation, la décalcification, la déshydratation, l'inclusion en paraffine et la coupe, suivies d'un pipeline complet de contrôle qualité comprenant l'évaluation de l'intégrité des coupes, la coloration par hématoxyline et éosine (H&E), l'analyse de la qualité de l'ARN (DV200) et, facultativement, une immunofluorescence (IF) pour la vérification des types cellulaires. Ces étapes préparatoires garantissent que seules les coupes de haute qualité passent aux étapes ultérieures du flux de travail de transcriptomique spatiale, incluant le prétraitement des coupes de tissu, la construction de bibliothèques, le séquençage, ainsi que le contrôle qualité et l'analyse des données subséquents.

Cette procédure standardisée permet la préparation et l'évaluation de la qualité d'échantillons de MO humaine et murine pour l'analyse transcriptomique spatiale. Elle vise à faciliter l'étude des programmes régulateurs spécifiques aux niches dans les troubles hématologiques et squelettiques.

Protocole

Toutes les expériences animales ont été réalisées conformément à la directive européenne 2010/63/UE relative à la protection des animaux utilisés à des fins scientifiques et ont été approuvées par le Comité d'éthique animal de l'Université de Navarre (Comité de Ética para la Experimentación Animal ; protocoles CEEA082-20 et CEEA039-20). Les soins aux animaux, leur manipulation et leur euthanasie ont été effectués conformément à la législation espagnole afin de minimiser la douleur et la souffrance.

L'étude sur l'humain a été approuvée par le Comité d'éthique de la recherche de la Faculté de médecine de l'Université de Navarre (Comisión de Ética de Investigación, CEI ; projets 2022.100mod1 et 2023.172) et par le Comité d'éthique de la recherche du Service de santé de Navarre (CEIm–Departamento de Salud de Navarra ; PI_2022/92 MS-1). Toutes les procédures impliquant des participants humains ont été menées conformément aux principes éthiques de la Déclaration d'Helsinki. Les données personnelles ont été traitées de manière confidentielle, en conformité avec la loi organique espagnole 3/2018 relative à la protection des données à caractère personnel et à la garantie des droits numériques, ainsi qu'avec la loi espagnole 14/2007 relative à la recherche biomédicale.

REMARQUE : Une liste détaillée des réactifs et équipements utilisés dans cette étude est fournie dans le Tableau des matériaux. Le protocole expérimental complet pour la mise en œuvre de la transcriptomique spatiale dans les tissus osseux est illustré schématiquement dans Figure 1 et organisé en trois phases opérationnelles : acquisition des échantillons, contrôle de qualité (CQ) et profilage transcriptomique spatial. L'acquisition des échantillons comprend la collecte de fragments osseux humains ou murins, suivie de la fixation, de la décalcification par l'EDTA, de la déshydratation, de l'inclusion en paraffine, de la coupe et de la préparation des lames. La phase de CQ évalue l'intégrité histologique et la préservation de l'ARN. Les coupes osseuses validées subissent ensuite une perméabilisation tissulaire sur lame, la préparation de la banque, le séquençage et l'analyse des données.

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Figure 1 : Schéma de collecte des échantillons et de préparation basé sur l'EDTA pour les tissus osseux murins et humains. Les fémurs de souris et les échantillons osseux humains sont collectés, fixés, décalcifiés à l'EDTA, déshydratés, inclus en paraffine et sectionnés. La qualité des échantillons est évaluée par coloration H&E et analyse de l'intégrité de l'ARN (évaluation DV200), suivies du prétraitement tissulaire pour la transcriptomique spatiale, de la préparation de la bibliothèque, du séquençage et du contrôle qualité des données. Abréviations : BM = moelle osseuse ; DV200 = pourcentage de fragments d'ARN plus longs que 200 nucléotides ; EDTA = acide éthylènediaminotétraacétique ; H&E = hématoxyline-éosine ; QC = contrôle qualité. Veuillez cliquer ici pour visualiser une version agrandie de cette figure.

1. Acquisition et traitement des échantillons de tissu osseux

  1. Prélèvement osseux chez la souris
    1. Anesthésier les animaux avec 5 % d'isoflurane et confirmer la perte des réflexes.
    2. Une fois l'anesthésie complète, procéder à l'euthanasie par dislocation cervicale conformément aux directives institutionnelles et réglementaires.
      ​REMARQUE : L'euthanasie doit être réalisée par du personnel formé, et la mort doit être confirmée avant de procéder au prélèvement des tissus.
    3. Assainir la peau en pulvérisant de l'éthanol à 70 % sur la face dorsale de la souris, puis pratiquer une petite incision à l’aide de ciseaux chirurgicaux afin de retirer soigneusement la peau et exposer les membres postérieurs.
    4. Dissecter les membres postérieurs en coupant au-dessus de l'articulation de la hanche et les transférer dans un tube de 50 mL contenant 10 mL de solution saline tamponnée au phosphate de Dulbecco (DPBS) froide. Placer le tube sur de la glace.
    5. Retirer les muscles et tissus conjonctifs attachés à l’aide de pinces stériles et d’un scalpel.
    6. Transférer les os dans un récipient stérile de 50 mL prérempli de DPBS froide et propre, puis placer le récipient sur de la glace.
    7. Procéder immédiatement à la fixation de l’échantillon pour préserver l’intégrité tissulaire.
  2. Manipulation des échantillons osseux humains
    1. Recevoir des biopsies de noyau osseux ou des fragments osseux chirurgicaux dans des récipients stériles de 100 mL.
    2. Transférer les fragments osseux dans un récipient propre et stérile de 100 mL prérempli de DPBS froide, puis le placer sur de la glace.
    3. Procéder immédiatement à la fixation de l’échantillon pour préserver l’intégrité tissulaire.
      ATTENTION : Les échantillons humains doivent être manipulés en conditions BSL 2.
  3. Fixation du tissu osseux
    1. Prendre le récipient de 50 mL ou 100 mL contenant l’échantillon osseux et jeter la DPBS.
    2. Étiqueter des cassettes en plastique et introduire les échantillons osseux dans des cassettes individuelles. Fermer soigneusement les couvercles afin d’éviter toute perte de tissu lors des étapes suivantes.
      ​REMARQUE : Pour les échantillons de souris, placer un os par cassette. Pour les échantillons osseux humains, si nécessaire, utiliser un scalpel stérile pour découper le tissu en fragments suffisamment petits pour tenir dans des cassettes standard, et placer un fragment par cassette. Si les échantillons osseux humains sont trop durs pour être sectionnés à ce stade, ils peuvent être laissés intacts et transférés dans la solution de décalcification ; une fois décalcifiés, le tissu ramolli peut alors être découpé en fragments de taille appropriée et placés dans des cassettes étiquetées.
    3. Ajouter une solution de formaldéhyde tamponnée à 4 % selon un rapport échantillon-fixateur de 1:20 et incuber l’échantillon pendant 24 h à 4 °C.
      ATTENTION : Manipuler le fixateur sous une hotte chimique en raison de sa toxicité et de ses vapeurs volatiles.
      NOTE : Éviter une sur-fixation (>48 h), qui réduit l’intégrité de l’ARN dans les protocoles FFPE39.
  4. Décalcification du tissu osseux minéralisé
    1. Jeter le formol et laver l’échantillon osseux avec de l’eau ultrapure. Rincer à l’eau, agiter brièvement, puis jeter afin d’éliminer tout résidu de formol restant.
    2. Préparer une solution d’EDTA à 0,25 M dans de l’eau ultrapure et ajuster le pH à 6,95.
      REMARQUE : Bien que l’EDTA soit souvent ajusté à un pH de 8,0 dans les protocoles traditionnels de décalcification, ce protocole utilise l’EDTA à environ pH 6,95 afin de favoriser une chélation efficace tout en préservant la morphologie tissulaire et la qualité de l’ARN8.
    3. Ajouter la solution d’EDTA au récipient contenant l’échantillon osseux et incuber pendant 10 jours à 4 °C avec agitation douce.
      ​REMARQUE : Pour les échantillons de souris, environ 50 mL de solution d’EDTA sont généralement suffisants. Pour les échantillons osseux humains, environ 100 mL sont généralement utilisés. Toutefois, ce volume peut être ajusté en fonction de la taille de l’os afin de garantir une immersion complète et une décalcification efficace.
    4. Après 5 jours de décalcification, jeter la solution d’EDTA et la remplacer par le même volume de solution d’EDTA fraîche, car la capacité chélatante sature avec le temps. Poursuivre l’incubation dans les mêmes conditions.
    5. Après 10 jours d’incubation, jeter la solution d’EDTA et évaluer si la décalcification est complète.
      1. Effectuer une petite incision avec un scalpel stérile ou insérer une aiguille stérile fine dans un coin ou une région périphérique du tissu, en choisissant toujours une zone de faible intérêt analytique afin d’éviter d’altérer les régions d’intérêt. Placer l’os sur une boîte de Pétri stérile pour stabiliser l’échantillon pendant l’incision ou l’insertion de l’aiguille. Si le tissu peut être coupé facilement ou si l’aiguille traverse avec une résistance minimale, l’échantillon est suffisamment décalcifié.
      2. Dans le cas des fémurs de souris, plier doucement l’os avec des pinces pour évaluer sa flexibilité, un indicateur fiable d’élimination complète du minéral.
        REMARQUE : La durée de l’étape de décalcification dépend de la taille et de l’épaisseur de l’échantillon osseux, ainsi que du volume d’EDTA utilisé. Si l’os reste rigide après la période initiale d’incubation, poursuivre la décalcification jusqu’à ce que le tissu soit suffisamment mou pour être coupé facilement. Un allongement excessif peut compromettre la qualité du tissu et l’intégrité de l’ARN ; l’extension doit donc être limitée au temps minimum nécessaire pour obtenir un ramollissement adéquat20.
  5. Déshydratation
    1. Laver en ajoutant de l’eau ultrapure dans le récipient contenant l’échantillon osseux, puis incuber pendant 5 min à 4 °C avec agitation.
    2. Jeter l’eau et la remplacer par une solution d’éthanol à 70 %. Incuber pendant 1 h à 4 °C.
      REMARQUE : Cette étape peut servir de point d’arrêt. Les échantillons peuvent être conservés dans de l’éthanol à 70 % à 4 °C avant de passer aux étapes suivantes. La durée maximale de conservation n’a pas été validée expérimentalement dans ce protocole ; les utilisateurs doivent donc procéder conformément aux pratiques standards de leur laboratoire.
    3. Déshydrater progressivement l’échantillon dans des concentrations croissantes d’éthanol (70 %, 80 %, 96 % ; 1 h chacune à 4 °C), suivies d’éthanol à 100 % pendant la nuit à 4 °C.
    4. Jeter l’éthanol à 100 % et le remplacer par du xylène. Incuber pendant 4 h à température ambiante (TA).
    5. Jeter le xylène et placer la cassette contenant l’échantillon dans un récipient contenant du paraffine fondue et propre. Incuber dans la paraffine fondue toute la nuit à 60 °C.
      REMARQUE : Des durées d’infiltration plus courtes peuvent être utilisées lorsqu’un système de traitement assisté par vide est disponible, car ces dispositifs facilitent une pénétration plus efficace de la paraffine40,41,42.
      ATTENTION : Toutes les étapes impliquant du xylène et des solutions d’éthanol à concentrations croissantes doivent être réalisées sous une hotte chimique afin d’assurer une ventilation adéquate et de minimiser l’exposition aux vapeurs toxiques et inflammables.
  6. Inclusion en paraffine
    ​REMARQUE : Nettoyer les surfaces de la station d’inclusion avec une solution de décontamination anti-RNase afin d’éviter la dégradation de l’ARN.
    1. Allumer la station d’inclusion et préchauffer le réservoir de paraffine, le bain de paraffine pour cassettes, le bain de paraffine pour moules et la plaque de réchauffage des moules à 60 °C. Activer la plaque froide pour la laisser refroidir avant l’inclusion.
    2. Laisser la paraffine fondre complètement, puis seulement à ce moment-là placer les cassettes contenant les échantillons infiltrés de paraffine dans le bain de paraffine pour cassettes. Incuber pendant 2 h afin de garantir l’élimination complète du xylène avant l’inclusion.
    3. Placer tous les moules nécessaires dans le bain de paraffine pour moules.
      REMARQUE : Pour les échantillons humains, utiliser des moules métalliques standard pour inclusion. Pour les échantillons de souris, utiliser des moules en plastique compatibles avec la plateforme Visium, comportant une cavité carrée aux dimensions adaptées au bon positionnement des sections sur les lames Visium. Comme les os entiers de souris ne tiennent pas entièrement dans la cavité carrée de ces moules, découper les os immédiatement avant l’inclusion à l’aide d’un scalpel stérile pour obtenir des fragments de taille appropriée. Un ou deux fragments osseux peuvent être inclus par moule, selon leurs dimensions.
    4. Ajouter une fine couche de base de paraffine fraîche en dispensant de la paraffine fondue depuis l’orifice central de la station d’inclusion.
    5. Ouvrir la cassette et transférer délicatement le tissu de la cassette vers le moule à l’aide de pinces tièdes.
    6. Placer le moule rempli de paraffine sur la plaque de réchauffage des moules et, tant que la paraffine reste liquide, orienter le tissu dans le plan de coupe souhaité à l’aide de pinces tièdes.
    7. Placer le moule sur la surface froide de la station d’inclusion pour fixer brièvement la position du fragment osseux.
    8. Remplir complètement le moule avec de la paraffine fondue provenant du distributeur, en veillant à ce que le tissu soit entièrement recouvert et qu’aucune grande bulle ne subsiste.
    9. Placer la cassette étiquetée au-dessus du moule afin qu’elle forme la base du bloc de paraffine.
    10. Transférer le moule avec la cassette attachée sur la plaque froide de la station d’inclusion. Laisser la paraffine durcir complètement pendant 10 min, jusqu’à ce que le bloc soit opaque et ferme.
    11. Une fois durci, retirer le bloc de paraffine du moule et le conserver à 4 °C jusqu’à la sectionnement.
      REMARQUE : Cette étape peut servir de point d’arrêt. Le bloc de paraffine peut être conservé à 4 °C ; toutefois, dans la mesure du possible, le sectionnement des tissus et les analyses transcriptomiques spatiales ultérieures doivent être réalisés dès que possible après l’inclusion afin de minimiser la dégradation de l’ARN pendant le stockage43,44.
  7. Sectionnement et préparation des lames
    REMARQUE : Nettoyer le microtome et le bain d’eau avec une solution de décontamination anti-RNase afin d’éviter la dégradation de l’ARN.
    1. Remplir le bain d’eau avec de l’eau distillée et le préchauffer à 42 °C. Allumer le microtome et installer une nouvelle lame. Étiqueter les lames de microscope au crayon.
    2. Monter le bloc de paraffine dans le porte-échantillon, en veillant à orienter la cassette selon le plan de coupe longitudinal souhaité.
      ​REMARQUE : Préparer un sac en plastique rempli de glace, et lorsque le sectionnement devient difficile en raison d’une paraffine trop molle, placer le sac de glace directement sur le bloc pendant qu’il reste fixé au microtome, en le maintenant avec un élastique pendant plusieurs minutes afin de raffermir la paraffine et améliorer la qualité des sections.
    3. Régler l’épaisseur du microtome à 20 µm et effectuer les coupes de dégrossissage.
    4. Changer le réglage du microtome à 5 µm. Collecter quatre sections de 5 µm dans un tube microcentrifuge de 1,5 mL étiqueté et exempt de RNase. Garder le tube sur de la glace sèche et le stocker à -80 °C.
    5. Poursuivre le sectionnement à 5 µm et faire flotter les rubans dans le bain d’eau. Une fois la section complètement étalée et sans plis, la prélever avec la lame étiquetée.
      1. À chaque série de sections (par exemple, tous les 5 à 10 rubans, selon la taille du tissu), collecter quatre sections supplémentaires de 5 µm dans un nouveau tube de 1,5 mL étiqueté. Répéter ce processus jusqu’à obtenir un total de trois tubes de 1,5 mL contenant des sections de 5 µm.
        REMARQUE : Si le tissu se fissure, se brise ou ne peut pas être obtenu en section continue, l’échantillon n’est pas suffisamment décalcifié et nécessite un temps de décalcification supplémentaire. Récupérer l’échantillon en inversant les étapes du protocole jusqu’à la phase de décalcification. Pour cela, faire fondre le bloc de paraffine à 60 °C pendant environ 2 h, puis transférer l’échantillon dans du xylène (2 h). Réhydrater l’échantillon à travers des solutions d’éthanol à concentrations croissantes (100 %, 96 %, 80 %, 70 %), suivies d’eau distillée. Retourner l’échantillon réhydraté dans de l’EDTA 0,25 M frais (pH 6,95) et prolonger la période de décalcification selon les besoins avant de reprendre la déshydratation, l’inclusion et le sectionnement. Cette procédure de récupération doit être utilisée strictement en dernier recours, car l’inversion du traitement FFPE peut compromettre l’intégrité de l’ARN.
    6. Placer les lames dans une étuve à 37 °C pendant la nuit pour évaporer toute eau résiduelle, puis les conserver à 4 °C.
    7. Pour améliorer l’adhérence du tissu, chauffer éventuellement les lames pendant 3 h à 42 °C avant de les incuber toute la nuit à 37 °C.
      REMARQUE : Cette étape n’est généralement pas nécessaire lorsqu’on utilise les lames en verre indiquées dans le Tableau des matériaux, car ces lames offrent une forte adhérence et le tissu reste généralement fermement attaché tout au long du traitement. Cette étape peut servir de point d’arrêt. Les lames peuvent être conservées à 4 °C ; toutefois, dans la mesure du possible, les analyses transcriptomiques spatiales ultérieures doivent être réalisées dès que possible après l’inclusion afin de minimiser la dégradation de l’ARN pendant le stockage43,44.

2. Évaluation de la qualité de l'échantillon

  1. Évaluation de la qualité des sections
    1. Examiner toutes les sections une par une au microscope optique standard (4×–10×). Inspecter chaque lame pour s'assurer que les sections ne sont pas fragmentées et enregistrer la qualité de chaque section.
      ​REMARQUE : Vérifier la présence de plis, de rides, de compressions ou de marques de vibration, qui peuvent indiquer des problèmes liés à la dureté du paraffin, au tranchant de la lame ou à une décalcification incomplète. S'assurer qu'aucune zone de tissu ne manque en raison d'un détachement pendant la coupe ou le transfert vers le bain d'eau.
    2. Sélectionner les sections les mieux préservées pour la transcriptomique spatiale (les plus complètes, avec la meilleure morphologie).
    3. Identifier les sections consécutives adjacentes à celles sélectionnées et les réserver pour la coloration H&E et l'IF, afin que l'image colorée corresponde le plus fidèlement possible au tissu qui sera séquencé.
  2. Coloration H&E pour l'intégrité du tissu
    1. Placer les lames dans un porte-lames en verre et les incuber 15 min à 60 °C.
    2. Transférer le porte-lames dans des bocaux de coloration en verre contenant du xylène pendant 15 min.
    3. Hydrater les sections en déplaçant le porte-lames à travers des bocaux contenant de l'éthanol à 100 %, 96 %, 80 % et 70 %, en incubant 5 min dans chaque solution.
      ​PRÉCAUTION : Toutes les étapes impliquant du xylène et des solutions d'éthanol à concentration décroissante doivent être effectuées dans une hotte chimique afin d'assurer une ventilation adéquate et de minimiser l'exposition aux vapeurs toxiques et inflammables.
    4. Rincer les lames pendant 5 min dans un bocal de coloration rempli d'eau.
    5. Immerger le porte-lames dans l'hématoxyline pendant 10 min, puis rincer à l'eau courante jusqu'à ce que l'eau de rinçage devienne claire.
    6. Immerger le porte-lames dans de l'eau contenant cinq gouttes d'acide chlorhydrique concentré, en agitant doucement jusqu'à l'apparition d'une teinte rougeâtre.
    7. Transférer le porte-lames dans de l'eau saturée en carbonate de lithium jusqu'à l'obtention d'une coloration bleue stable, puis rincer brièvement à l'eau.
    8. Colorer les sections avec de l'éosine à 1 % (p/v) pendant 5 min, puis rincer à nouveau à l'eau.
    9. Déshydrater les lames en déplaçant le porte-lames à travers des bocaux contenant de l'eau, de l'éthanol à 70 %, 80 %, 96 % et 100 %, en incubant 5 min dans chaque solution.
    10. Clarifier les lames dans du xylène pendant 15 min.
    11. Sécher doucement l'arrière de chaque lame, appliquer un milieu de montage sur une lamelle et monter les sections. Laisser les lames sécher à RT pendant 24 h avant l'acquisition d'images.
    12. Réaliser l'imagerie tissulaire à l'aide d'un microscope à haute résolution avec un grossissement de 20x.
      REMARQUE : Effectuer d'abord la coloration H&E sur des sections adjacentes comme étape de contrôle qualité afin d'évaluer l'adéquation de l'échantillon à la transcriptomique spatiale. Après sélection, réaliser une deuxième coloration H&E directement sur la section destinée à la transcriptomique spatiale, en suivant les recommandations du fabricant concernant la préparation des tissus pour la plateforme d'expression génique spatiale indiquée dans le Tableau des Matériaux.
  3. Évaluation de l'intégrité de l'ARN (DV200)
    ​REMARQUE : Pour le protocole d'expression génique spatiale, le nombre d'intégrité de l'ARN (RIN) traditionnel n'est pas pertinent car les pics d'ARN ribosomique 18S et 28S sont généralement absents dans les tissus fixés. Par conséquent, le paramètre DV200, défini comme le pourcentage de fragments d'ARN supérieurs à 200 nucléotides, est couramment utilisé comme indicateur de qualité plus informatif que le RIN pour les échantillons cliniques dégradés. Pour Visium v2, 10x Genomics recommande d'utiliser des blocs FFPE avec une valeur DV200 ≥ 30 % afin d'assurer une hybridation efficace des sondes et des performances optimales du test. Le choix de blocs tissulaires présentant les valeurs DV200 les plus élevées disponibles permet d'éviter les pertes de séquençage et de maximiser la sensibilité des spots.
    1. Récupérer les tubes de 1,5 mL contenant les sections de 5 µm prélevées lors de l'étape de microtomie et les placer sur de la glace pour extraire l'ARN.
    2. Extraire l'ARN total. Cette procédure normalisée comprend la déparaffinisation de l'échantillon, une digestion par la protéinase K pour inverser les pontages croisés du formol, l'élimination de l'ADN génomique par traitement à la DNase I, et l'élution finale de l'ARN purifié dans de l'eau sans RNase.
    3. Évaluer l'intégrité de l'ARN à l'aide d'un système basé sur l'électrophorèse capillaire avec un test ARN haute sensibilité. Un résumé du flux de travail est fourni dans le Fichier Supplémentaire 142,45,46,47,48.
  4. IF facultative pour la vérification du type cellulaire
    1. Placer la lame FFPE dans un porte-lames en verre et l'incuber 15 min à 60 °C.
    2. Transférer le porte-lames dans des bocaux de coloration en verre contenant du xylène pendant 15 min.
    3. Hydrater la section en déplaçant le porte-lames à travers de l'éthanol à 100 %, 96 %, 80 % et 70 % pendant 2 min chacun, puis 5 min dans l'eau et 5 min dans du PBS-Tween (PBS 1x supplémenté avec 0,1 % de Tween-20).
      PRÉCAUTION : Toutes les étapes impliquant du xylène et de l'éthanol doivent être effectuées dans une hotte chimique.
    4. Réaliser la récupération d'antigène selon les recommandations du fabricant pour l'anticorps primaire, en veillant à ce que le tampon de récupération, le pH et les conditions de chauffage correspondent à la fiche technique de l'anticorps. REMARQUE : Dans ce flux de travail, la récupération d'antigène est réalisée à l'aide d'une solution de Tris 10 mM et d'EDTA 1 mM, pH 9,0, dans un système de chauffage type cocotte pendant 30 min à 95 °C, puis refroidie pendant 20 min à RT.
    5. Laver la lame deux fois pendant 10 min chacune dans du PBS-Tween.
    6. Tracer une barrière hydrophobe autour du tissu à l'aide d'un stylo hydrophobe et bloquer les liaisons non spécifiques en appliquant une solution de BSA à 5 % dans du DPBS 1x sur les sections de tissu pendant au moins 40 min à RT dans une chambre humide.
      REMARQUE : La chambre humide est préparée en plaçant une feuille de papier filtre dans une boîte de coloration en plastique et en l'humidifiant complètement avec de l'eau distillée afin de maintenir un environnement humide stable pendant l'incubation des anticorps.
    7. Préparer la solution d'anticorps primaire dans du DPBS 1x à la dilution recommandée pour chaque anticorps.
      REMARQUE : Dans ce flux de travail, des anticorps primaires dirigés contre Emcn (V.7C7) et Cd271 (ME20.4) ont été utilisés pour identifier respectivement les EC et les MSC murins, tandis que des anticorps dirigés contre CD31 (JC70A) ou PRRX1 (polyclonal) ont été utilisés pour identifier leurs homologues humains, conformément au protocole du fabricant.
    8. Éliminer la solution de blocage en tapotant doucement le bord de la lame sur du papier absorbant pour enlever les gouttelettes résiduelles, puis appliquer le mélange d'anticorps primaires et incuber la lame toute la nuit à 4 °C dans une chambre humide.
    9. Laver la lame deux fois pendant 5 min dans du PBS-Tween et préparer la solution d'anticorps secondaire à la dilution recommandée par le fabricant, en veillant à ce que les fluorophores soient spectralement compatibles et ne se chevauchent pas.
      REMARQUE : Dans ce flux de travail, un anticorps secondaire conjugué à l'Alexa Fluor à une dilution de 1:200 a été utilisé.
    10. Appliquer le mélange d'anticorps secondaires et incuber pendant 30 min à RT, à l'abri de la lumière dans une chambre humide.
    11. Laver la lame deux fois pendant 5 min dans du PBS-Tween.
    12. Appliquer une dilution 1:10 du milieu de montage contenant du DAPI (voir Tableau des Matériaux), préparée dans une solution PBS–glycérol 1:1, et incuber l'échantillon pendant 5 min.
    13. Monter la section avec une lamelle et sceller les bords avec du vernis à ongles pour éviter le dessèchement.
    14. Visualiser le tissu coloré à l'aide d'une plateforme d'imagerie multispectrale.

Fichier supplémentaire 1 : Résumé des étapes du protocole pour l'évaluation de l'intégrité de l'ARN et du flux de travail Visium de transcriptomique spatiale. Ce fichier supplémentaire fournit un résumé détaillé des étapes procédurales réalisées conformément aux instructions du fabricant. Il comprend : (i) le test High Sensitivity RNA ScreenTape utilisé pour évaluer l'intégrité de l'ARN (DV200), tel que décrit à l'étape 2.3.3 du protocole principal, et (ii) un aperçu du flux de travail Visium CytAssist d'expression génique spatiale couvrant le prétraitement des tissus, la préparation des bibliothèques et le séquençage (étapes 3.1–3.3 du protocole principal).Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.

3. Transcriptomique spatiale

REMARQUE : Effectuer le protocole de transcriptomique spatiale à l'aide de la plateforme et des réactifs énumérés dans le Tableau des matériaux, en suivant les guides utilisateur correspondants42,45,46. Le Fichier supplémentaire 1 résume les principales étapes de prétraitement des tissus, de préparation des bibliothèques et de séquençage.

  1. Contrôle de qualité des données de transcriptomique spatiale
    1. Démultiplexer les données de transcriptomique spatiale à l'aide du pipeline standard pour les jeux de données Visium (voir Tableau du matériel).
    2. Cartographier les lectures sur le génome de référence Ensembl 105 approprié.
      NOTE : GRCh38 a été utilisé pour les échantillons humains et mm10 pour les échantillons murins.
    3. Générer les matrices filtrées de caractéristiques-barcode à l'aide du même pipeline et les importer dans l'environnement d'analyse unique-cellule/spatial en aval (voir Tableau du matériel).
    4. Examiner les images H&E dans l'interface de visualisation fournie par le pipeline de transcriptomique spatiale (voir Tableau du matériel) et supprimer manuellement les spots qui chevauchent la région de l'os cortical ou du tissu osseux, selon le jeu de données.
    5. Normaliser les jeux de données à l'aide d'une méthode de transformation stabilisant la variance couramment utilisée dans les flux de travail d'analyse unique-cellule (voir Tableau du matériel).

Résultats

Afin d'évaluer l'applicabilité de ce protocole basé sur l'EDTA à différentes espèces et contextes pathologiques, le protocole a été appliqué à quatre échantillons de moelle osseuse : deux fémurs de souris et deux prélèvements osseux humains représentant des conditions saines et des cas de myélome multiple (MM) (Tableau 1 et Figure 1).

Identification de l'échantillonEspèceSexeÂgeMaladie
YFPcγ1MouseFemelle210 daysSain
mMMMouseMâle314 daysMM
hHBMHumanMâle76 yearsSain
hMMHumanFemelle50 yearsMM

Tableau 1 : Échantillons d'os murins et humains inclus dans l'étude. L'espèce, le sexe, l'âge et l'état de santé sont indiqués pour chaque échantillon. Abréviations : hHBM = moelle osseuse humaine saine ; hMM = myélome multiple humain ; mMM = myélome multiple murin ; MM = myélome multiple ; YFPcγ1 = souris témoin saine.

Les échantillons utilisés dans cette étude ont été précédemment caractérisés et décrits dans des publications antérieures du groupe de recherche, notamment dans les travaux de Muiños-Lopez et al. et de Cenzano et al., à l'exception de l'échantillon de souris MM. Pour les spécimens déjà rapportés, les données et résultats de transcriptomique spatiale sont présentés dans ces études8,10. Par conséquent, le matériel inclus ici sert à évaluer l'adéquation technique du protocole pour la transcriptomique spatiale, plutôt que de présenter des découvertes biologiques nouvelles.

Des échantillons d'os de fémur de souris ont été obtenus à partir du modèle murin de myélome multiple génétiquement modifié BIC (BIcγ1), qui reproduit les caractéristiques cliniques et immunologiques des patients atteints de myélome multiple, ainsi que de souris contrôles saines correspondantes (YFPcγ1)8,49. Un fémur unique provenant de chaque animal a été prélevé, nettoyé et traité selon un protocole standardisé (Figure 2A). Les fémurs ont été spécifiquement utilisés pour ces analyses car ils offrent une moelle abondante, une qualité supérieure du niché et une facilité de traitement reproductible, ce qui les rend particulièrement adaptés à une plateforme de transcriptomique spatiale basée sur le séquençage8,10. La décalcification réussie du fémur de la souris témoin a été confirmée macroscopiquement par une augmentation notable de la flexibilité du tissu lors de la manipulation manuelle avec une pince (Figure 2B). Par la suite, ce fragment osseux a été correctement inclus dans de la paraffine à l’aide d’un moule spécialisé, compatible avec la transcriptomique spatiale, afin de préserver l’intégrité de l’ARN et l’architecture tissulaire pour les analyses moléculaires ultérieures (Figure 2C).

Deux échantillons de MO humaine aux historiques de traitement contrastés ont également été analysés8,10. Un échantillon frais de MO humaine hématologiquement saine a été obtenu à partir de déchets chirurgicaux lors d’un remplacement articulaire de la hanche à l’Hôpital Universitario de Navarra (Figure 2D–F). Afin de démontrer l'utilité translationnelle du protocole, cet échantillon a été traité comme les échantillons murins. Conformément aux résultats observés dans les tissus de souris, la décalcification réussie de l'os humain par l'EDTA a été confirmée macroscopiquement par l'adoucissement complet du tissu, comme en témoigne la pénétration aisée d'une aiguille (Figure 2E). Le fragment d'os humain décalcifié a été correctement inclus dans la paraffine à l'aide d'un moule métallique standard pour un traitement ultérieur (Figure 2F). Le deuxième échantillon humain était constitué de biopsies de MO en inclusion paraffine fixée au formaldéhyde (FFPE) archivées, provenant de la crête iliaque d’un patient atteint de MM, conservées au Département d’Anatomie Pathologique de la Clínica Universidad de Navarra (CUN). Notamment, cet échantillon archivé de MM avait déjà été décalcifié selon un protocole clinique standard utilisant des acides forts36. Cet échantillon offre un contraste qualitatif avec les spécimens traités à l'EDTA ; toutefois, les différences concernant la source tissulaire, l'historique de fixation, le stockage et la décalcification impliquent que les différences observées ne peuvent pas être attribuées uniquement à l'agent décalcifiant.

figure-results-1
Figure 2 : Échantillons osseux de souris et humains durant la préparation à base d'EDTA. (A) Fémurs de souris contrôles intacts avant la décalcification. (B) Fémur de souris contrôle décalcifié montrant une flexibilité accrue. (C) Fragments osseux de souris contrôles inclus dans la paraffine. (D) Fragments osseux humains sains provenant d'une chirurgie de la hanche avant décalcification. (E) Le même fragment après décalcification à l'EDTA, montrant la pénétration d'une aiguille. (F) Os humain sain décalcifié à l'EDTA inclus dans la paraffine. Échelles : (A, B) 5 mm ; (C–F) 1 cm. Abréviation : EDTA = acide éthylènediaminetétraacétique. Veuillez cliquer ici pour visualiser une version agrandie de cette figure.

Pour analyser l'architecture tissulaire générale, une coloration H&E a été réalisée (Figure 3). La meilleure préservation morphologique observée dans les coupes murines pourrait refléter des différences dans la manipulation et le traitement des échantillons plutôt que des caractéristiques intrinsèques propres à l'espèce. Les fémurs de souris ont été prélevés spécifiquement pour la transcriptomique spatiale et traités immédiatement sous forme d'os entiers, préservant ainsi leur architecture (Figure 3A, B). En revanche, les échantillons humains proviennent soit de matériel résiduel obtenu lors d'une chirurgie de remplacement de la hanche (Figure 3C), soit de biopsies osseuses diagnostiques de myélome multiple (Figure 3D), dont la qualité tissulaire pré-analytique peut varier. Par conséquent, les différences morphologiques entre l'échantillon humain décalcifié à l'EDTA et la biopsie de MM décalcifiée à l'acide sont subtiles, car les deux spécimens humains présentent déjà des limites structurelles de base introduites non seulement par la décalcification, mais aussi par le traitement tissulaire global (Figure 3C, D). En conséquence, l'évaluation complète de la qualité des échantillons pour la transcriptomique spatiale nécessite l'analyse de plusieurs paramètres distincts. Premièrement, l'intégrité tissulaire doit être soigneusement surveillée, car la préservation structurelle peut varier considérablement selon le type d'échantillon spécifique, et non uniquement selon l'acide décalcifiant utilisé. Deuxièmement, la qualité de l'ARN doit également être évaluée, car les conditions de décalcification peuvent l'affecter20,35,36.

figure-results-2
Figure 3 : coupes colorées à l'H&E utilisées pour l'évaluation de la qualité du tissu. Des coupes consécutives en inclusion paraffine après fixation formolée (FFPE) correspondent à (A) une souris contrôle saine10, (B) une souris atteinte de MM, (C) un os humain sain8,10 et (D) une biopsie humaine de MM8. Les barres d'échelle = 500 µm. Abréviations : FFPE = fixé au formol, inclus en paraffine ; H&E = hématoxyline et éosine ; MM = myélome multiple. Veuillez cliquer ici pour visualiser une version agrandie de cette figure.

Pour compléter l'analyse histologique, la qualité de l'ARN a été évaluée. Alors que la coloration H&E donnait des différences ambiguës, l'intégrité de l'ARN permettait clairement de distinguer les effets des deux méthodes de décalcification (Tableau 2). Les valeurs de DV200 provenant à la fois des échantillons murins et de l'échantillon osseux humain sain dépassaient le seuil recommandé pour les tests Visium FFPE, indiquant une distribution suffisante de la longueur des fragments d'ARN pour l'hybridation des sondes et la construction de la banque. L'échantillon de souris saine exprimant la protéine fluorescente jaune (YFP) présente un DV200 de 82,55 %, et l'échantillon d'os humain sain (hHBM) atteint 58 %, les deux étant nettement supérieurs au seuil d'acceptabilité de 30 % défini par 10x Genomics. L'échantillon de souris atteinte de myélome (mMM) affiche un DV200 de 31,3 %, proche de la limite inférieure d'acceptabilité, ce qui pourrait refléter un stockage prolongé du bloc de paraffine à 4 °C avant la coupe, entre autres facteurs spécifiques à l'échantillon. En revanche, la biopsie humaine de myélome décalcifiée par l'acide (hMM) présente un DV200 de seulement 8 %, ce qui est associé à une intégrité de l'ARN nettement plus faible, même lorsque la détérioration morphologique est moins marquée. En résumé, il est important de réaliser des évaluations structurales et moléculaires conjointes afin d'apprécier l'adéquation de l'échantillon pour des analyses spatiales ultérieures.

Identification de l'échantillonDV200 (%)1
YFPcγ182.55
mMM31.3
hHBM58
hMM28
1DV200 : Pourcentage de fragments d'ARN total > 200 nucléotides.
2Cet échantillon a été décalcifié à l'aide d'un protocole clinique standard utilisant des acides forts.

Tableau 2 : Qualité de l'ARN des échantillons de l'étude. Le DV200 correspond au pourcentage de fragments d'ARN plus longs que 200 nucléotides ; des valeurs d'au moins 30 % ont été considérées comme appropriées pour les analyses spatiales de transcriptomique en aval. Abréviations : hHBM = moelle osseuse humaine saine ; hMM = myélome multiple humain ; mMM = myélome multiple murin.

Des évaluations de qualité supplémentaires peuvent également être réalisées. Afin de valider davantage l'intégrité tissulaire et de confirmer la préservation de compartiments cellulaires spécifiques après la décalcification par l'EDTA, une coloration en immunofluorescence (IF) facultative a été effectuée sur des sections FFPE adjacentes de tissus murins et humains. Les anticorps dirigés contre l'endomucine (Emcn) et Cd271 ont été utilisés pour visualiser respectivement les cellules endothéliales (EC) et les cellules mésenchymateuses (MSC) dans l'échantillon murin de myélome multiple (Figure 4A). Cette coloration a montré que les tissus traités à l'EDTA présentaient des structures vasculaires bien définies, avec une coloration continue pour Emcn et des réseaux stromaux préservés, indiquant que les marqueurs testés restaient détectables après traitement. De plus, l'imagerie haute résolution réalisée à l'aide d'un système d'imagerie multispectrale automatisé a fourni des preuves supplémentaires que les antigènes testés restaient détectables pour la vérification des types cellulaires, offrant ainsi une couche supplémentaire de contrôle qualité avant l'analyse transcriptomique spatiale. En outre, ces résultats ont également été observés sur des échantillons humains sains de personnes âgées, dans lesquels l'expression des EC a été détectée par les anticorps anti-CD31 et celle des MSC par l'anticorps anti-PRRX1 (Paired Related Homeobox 1), démontrant que les marqueurs de niche testés restaient identifiables après décalcification à l'EDTA (Figure 4B). En revanche, ces résultats n'ont pas pu être reproduits sur des biopsies humaines de myélome multiple ayant subi divers protocoles de décalcification acide. Comme mentionné précédemment, l'intégrité de l'ARN dans ces échantillons était faible, limitant l'analyse transcriptomique en aval. En raison de la dégradation de ces échantillons humains, leur utilisation en aval s'est limitée au profilage transcriptomique de base8 et à l'évaluation immunohistochimique (IHC) des plasmocytes malins (PC) (Figure 4C).

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Figure 4 : Immunofluorescence et immunohistochimie facultatives pour la vérification des types cellulaires. (A) Tissu de MM murin montrant les noyaux marqués au DAPI (bleu), les MSC positifs pour CD271 (vert) et les EC positifs pour EMCN (rouge). (B) Os humain sain montrant les noyaux marqués au DAPI (bleu), les MSC positifs pour PRRX1 (vert) et les EC positifs pour CD31 (rouge)10. (C) Biopsie de MM humain montrant les plasmocytes malins positifs pour CD1388. Échelles : (A) 250 µm (vue d'ensemble), 20 µm (agrandissement fusionné) et 50 µm (images monocanales) ; (B) 500 µm (vue d'ensemble) et 20 µm (agrandissements fusionnés et monocanaux) ; (C) 500 µm. Abréviations : DAPI = 4′,6-diamidino-2-phénylindole ; EC = cellule endothéliale ; MM = myélome multiple ; MSC = cellule stromale mésenchymateuse ; PC = cellule plasmocytaire. Veuillez cliquer ici pour visualiser une version agrandie de cette figure.

Ensemble, les résultats concernant la morphologie tissulaire et le DV200 soutiennent l'adéquation des échantillons traités à l'EDTA pour des analyses ultérieures de transcriptomique spatiale. Des applications en transcriptomique spatiale de ce protocole de préparation ont déjà été rapportées précédemment8,10.

Discussion

En intégrant une décalcification contrôlée à base de EDTA, un traitement standardisé des échantillons inclus en paraffine (FFPE) et des points de contrôle qualité rigoureux, ce protocole surmonte de nombreuses limitations traditionnellement associées à la préparation des tissus osseux pour la transcriptomique spatiale, en particulier celles liées à la dégradation de l'ARN et aux dommages morphologiques causés par les méthodes de décalcification à base d'acides forts8,10,20,33,36. L'étape la plus critique dans le traitement des échantillons minéralisés pour la transcriptomique spatiale est la décalcification. Une décalcification insuffisante entraîne un os qui reste trop rigide pour être sectionné, rendant physiquement impossible l'obtention de sections de haute qualité destinées à la transcriptomique spatiale8,20,23,37,50. Lorsque le tissu osseux reste trop dur, il se brise ou vibre contre la lame du microtome, produisant des sections effilochées ou perforées qui ne représentent pas fidèlement l'architecture native de la moelle osseuse (BM). Il est important de noter que la réussite de la décalcification ne peut être pleinement confirmée qu'au stade de la microtomie : même des échantillons qui semblent superficiellement ramollis peuvent encore contenir des minéraux résiduels, dont la présence ne devient évidente qu'au moment de couper des sections minces en FFPE. Pour cette raison, une surveillance attentive de l'avancement de la décalcification est essentielle afin d'assurer des résultats reproductibles.

Le protocole utilise du EDTA 0,25 M à pH 6,95 pendant 10 jours avec agitation constante et remplacement de la solution au cinquième jour8,10. Lors du développement du protocole, le EDTA seul, le EDTA supplémenté en polyvinylpyrrolidone et l'acide formique à 10 % ont été évalués, ainsi que différentes durées de décalcification et différents calendriers de remplacement de la solution ; les données comparatives ne sont pas présentées ici. Des durées inférieures à 10 jours ont fréquemment entraîné une rupture des tissus lors de la coupe d'échantillons de souris, tandis que les échantillons humains ont montré un comportement dépendant de l'échantillon. La durée de 10 jours est donc utilisée pour les fémurs de souris, alors que les échantillons humains peuvent nécessiter une décalcification plus longue selon leur densité et leur teneur en trabécules. Des points de contrôle qualité physiques doivent être appliqués avant l'inclusion en paraffine. Si une décalcification insuffisante apparaît lors de la microtomie, utilisez la procédure de reprocessement uniquement comme étape de sauvetage de dernier recours, car une exposition supplémentaire à la chaleur, aux solvants et à la réhydratation pourrait compromettre la qualité de l'ARN.

La principale limitation de cette méthode est la durée prolongée du traitement, qui contraste fortement avec les protocoles acides rapides couramment utilisés en anatomie pathologique20,36. Bien que des temps de traitement plus longs soient généralement acceptables en milieu de recherche, des études récentes, comme le protocole décrit par Miao et al., qui utilise la solution de Morse (acide formique à 22,5 % et citrate de sodium à 10 %) pour décalcifier en moins de 24 heures, mettent en évidence un intérêt croissant pour l'accélération de la préparation osseuse destinée aux tests spatiaux20. Toutefois, les méthodes à base d'acide comportent historiquement un risque beaucoup plus élevé de dégradation de l'ARN, réduisant les valeurs DV200 et limitant ainsi leur compatibilité avec la transcriptomique spatiale1,8,35,36. Cette approche basée sur l'EDTA privilégie la préservation de l'ARN au détriment de la rapidité, garantissant ainsi la compatibilité avec les plateformes spatiales fondées sur le séquençage, telles que Visium.

Une limitation potentielle de la transcriptomique spatiale de la MO réside dans l'abondance élevée de transcrits d'immunoglobulines provenant des CP, ce qui peut réduire la détection des gènes peu abondants. Comme pour les stratégies de contrôle qualité et de filtrage appliquées dans une étude précédente du groupe de recherche, incluant l'élimination des spots de faible qualité (<200 UMIs et <150 gènes détectés), le filtrage des types cellulaires ayant une faible contribution (<20 % par spot) lors des analyses de déconvolution, et la sélection des gènes marqueurs détectés dans les jeux de données transcriptomiques spatiaux, les transcrits d'immunoglobulines peuvent également être filtrés par voie informatique lors de l'analyse en aval afin de minimiser leur impact le cas échéant8. Des approches ciblées de transcriptomique spatiale pourraient en outre améliorer la détection des transcrits peu abondants dans des applications spécifiques.

Les applications potentielles de cette méthode sont vastes. L'intégration récente de données spatiales et de données à l'échelle de la cellule unique a révélé des niches ostéogéniques humaines spécialisées ainsi que des gradients de signalisation complexes émanant de l'os trabéculaire3,26. Par ailleurs, la transcriptomique spatiale a montré que le vieillissement remodèle le microenvironnement de la MO en modifiant l'organisation spatiale et la communication des CE, entraînant un soutien ostéogénique altéré et l'émergence de réseaux de signalisation inflammatoires au sein de la niche âgée10. Le profilage multiomique a également identifié des compartiments microenvironnementaux distincts, tels que les régions artério-endothéliales qui favorisent la myélopoïèse précoce et les zones péri-adipocytaires enrichies en cellules souches hématopoïétiques et en cellules progénitrices3. Dans le contexte du MM, ce protocole permet l'intégration de cadres transcriptomiques spatiaux et unicellulaires afin de caractériser la composition de la MO murine malade ainsi que les interactions entre cellules. Des travaux antérieurs ont mis en évidence des distributions spatialement distinctes des CP malignes et identifié des programmes immunitaires et inflammatoires, tels que la NETose et la signalisation IL-17, qui étaient inversement associés aux régions enrichies en tumeur. En outre, une augmentation de la densité des CP malignes était corrélée à un passage de l'état effecteur à l'état d'épuisement des lymphocytes T. Ces résultats ont également été validés sur des échantillons de MO humains en inclusion dans la paraffine (FFPE), démontrant leur pertinence translationnelle dans divers fardeaux pathologiques8. En définitive, ce protocole de préparation constitue la base technique nécessaire à l'exploration des interactions cellulaires complexes au sein de l'architecture minéralisée de la MO.

Les plateformes d'expression génique spatiale haute définition peuvent fournir un profilage de tout le transcriptome avec une résolution proche de la cellule unique38,51,52. Ces approches pourraient étendre l'utilisation du protocole de préparation à des analyses à plus haute résolution des malignités médullaires et hématologiques organisées spatialement. Ce protocole fournit donc une base technique pour les études futures de l'hématopoïèse physiologique et maligne.

Déclarations de divulgation

Les auteurs déclarent ne pas avoir d'intérêts concurrents. Un brevet portant sur les savoir-faire et utilisations expérimentales des modèles murins MIcγ1 de myélome multiple a été concédé à MIMO Biosciences (numéro de demande : PCT/EP2023/071025).

Remerciements

Ce travail a été soutenu par l'Instituto de Salud Carlos III et cofinancé par le FEDER, une manière de faire l'Europe (PI22/00983) ; CIBERONC (CB16/12/00489), RICORS TERAV (RD21/0017/0009) et RICORS TERAV Plus (RD24/0014/0010) ; AGATA 0011-1411-2020- 000010/0011-1411-2020-000011 ; le Departamento de Salud du Gouvernement de Navarre (GN2024/04) ; Cancer Research UK [C355/A26819] ; FC AECC et AIRC dans le cadre du programme Accelerator Award ; la Fondation internationale du myélome (Brian van Novis) et la Fondation Paula et Rodger Riney pour FP. IAC a bénéficié d'une bourse Marie Curie (H2020-MSCA-IF-837491) de la Commission européenne, d'une bourse Talent AECC (INVES258003CALV) et du Departamento de Salud, Gouvernement de Navarre (GN2023/03). MC a bénéficié d'une bourse FPU (FPU22/03283) du Ministère de la Science, de l'Innovation et des Universités. Nous tenons à remercier le personnel du Laboratoire de génomique avancée et de l'animalerie du CIMA de l'Université de Navarre pour leur assistance technique et intellectuelle inestimable. Nous reconnaissons également les départements d'anatomie pathologique de la Clínica Universidad de Navarra (CUN) et de l'Hôpital universitaire de Navarre pour avoir fourni les échantillons de MO et pour leur collaboration remarquable. Nous remercions particulièrement José Ángel Martínez-Climent et Marta Larrayoz pour leurs modèles murins de MM. Nous remercions Patxi San Martín-Uriz, Tania López et Eduardo Larequi pour leur excellent soutien dans l'optimisation des technologies, le développement de protocoles et la résolution des problèmes liés au traitement des échantillons de MO de souris et d'humains pour la transcriptomique spatiale. Nous remercions également Beñat Ariceta et Asier Ullate pour l'ensemble de leurs travaux informatiques sur la transcriptomique spatiale. Enfin, nous sommes profondément reconnaissants aux patients et aux donneurs sains qui ont généreusement participé à cette étude.

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
Tubes de 1,5 mLEppendorf15625367
Contenant stérile de 100 mL deltalab723-510
4200 TapeStationAgilentG2991Aélectrophorèse capillaire–système basé sur l'évaluation de l'intégrité de l'ARN
Contenant stérile de 50 mL IberoMedREOR001
tube de 50 mL FALCON352070
Stylo PAP avancéTed Pella 22309Z377821-1EAStylo-barrière hydrophobe 
Anticorps anti-PRRX1 produit chez le lapinSigma-AldrichHPA051084
BSA (albumine sérique bovine)Sigma-AldrichA9418-50G
Cassettes KartellLABWARE2921
Anticorps monoclonal CD271 (récepteur de la NGF) (ME20.4)Invitrogen14-9400-82
CD31, cellule endothéliale (concentré), clone JC70AAgilent DakoM0823
CoverslipsFisher Scientific12-544-EP50 mm x 24 mm
DAPI (milieu de montage antifade VECTASHIELD avec DAPI)Vector LaboratoriesH-1200-10
Solution de déparaffinageQiagen19093
DPBSThermo Scientific AAJ67802APThermo Scientific Chemicals Solution saline tamponnée au phosphate (DPBS, 1×), formule de Dulbecco, sans calcium, sans magnésium
Milieu de montage DPX pour histologieSigma-Aldrich06522-500ML
EDTAThermo Scientific 15748687Acide éthylènediaminotétraacétique (EDTA), solution 0,5 M, qualité biologie moléculaire, ultrapure
Poste d'inclusion Leica Biosystems14 0388 81101Leica EG1150H
Anticorps Emcn (V.7C7)Santa Cruz Biotechnologysc-65495
Génome de référence Ensembl (GRCh38 / mm10, version 105)EMBL-EBIN/AGénome de référence utilisé pour l'alignement des lectures.
ÉosineMillipore SigmaHT110116
ÉthanolMillipore SigmaE7023-500MLCiseaux chirurgicaux
Bain-marie d'histologie Falc Instruments B-IFalc610.1030.00
Formol 4 % PanReac AppliChem2524311315Formaldéhyde 3,7 %–4,0 % p/v tamponné à pH = 7 et stabilisé avec du méthanol (CE-IVD) pour diagnostics cliniques
Rack de coloration pour lame en verre WHEATONZ710970-3EA
Bocaux de coloration en verre MARQUEBR472200-10EAMastercycler  X50
GlycérolSigma-AldrichC3H803
Anticorps secondaire anti-IgG de chèvre anti-souris (H+L), adsorbé en croix, Alexa Fluor 568InvitrogenA11004
Anticorps secondaire chèvre anti-souris IgG (H+L), adsorbé très spécifiquement, Alexa Fluor Plus 488InvitrogenA32723
Anticorps secondaire chèvre anti-lapin IgG (H+L), hautement adsorbé par croisement, Alexa Fluor 488InvitrogenA11034
Hématoxyline Millipore SigmaMHS16
Bandelette d'analyse RNA à haute sensibilitéAgilent5067-5579Évaluation de l'intégrité de l'ARN
Échelle de taille RNA High Sensitivity RNA ScreenTapeAgilent5067-5581Évaluation de l'intégrité de l'ARN
Tampon pour échantillon High Sensitivity RNA ScreenTapeAgilent5067-5580Évaluation de l'intégrité de l'ARN
Microscope haute résolution Leica BiosystemsN/AAperio CS2 Scanner
Acide chlorhydrique (HCl 0,1 N)Fisher ChemicalSA54-1
plateforme Illumina NextSeq 2000Illumina20038897
Invitrogen, anticorps secondaire anti-IgG de chèvre anti-rat (H+L), adsorbé en croix, Alexa Fluor 568InvitrogenA11077
Ciseaux à iris - ToughCutF.S.T 14058-11
IsovetBRAUNBR3009Isoflurane
carbonate de lithium Merck554-13-2
Loupe Browser (v6.0.0) 10x GenomicsN/ALogiciel utilisé pour visualiser les images HE et annoter les spots Visium ; ouvre les fichiers .cloupe générés par le pipeline d'analyse.
Moules d'encastrement métalliquesBio-Optica07-BM24256
Lames à microscopeavantor631-0108Lames de microscope Superfrost Plus
Lames de microtomeFEATHERFEAT207500006_U
Microtome HM 340EEprediaN/Amodèle HM 340E
AiguilleBD301156BD Microlanc 3 Aiguille 21 G 1 po (25 mm)
Nikon Optiphot-2Nikon71052Microscope optique en champ clair
Paraffine PanReac AppliChem256993Paraffine P.F. 55–58°C granulés plastifiés + DMSO (CE-IVD) pour diagnostics cliniques
boîte de Pétri CorningCLS430167-100EA
Moules d'inclusion en plastique Bio-Optica07-MP7070
Pince de Potts-SmithF.S.T 11012-18Forceps
Fluoromètre Qubit 3.0Invotrogen Q33216
Tubes pour dosage QubitInvotrogen Q32856
Kit d'essai Qubit RNA HSInvotrogen Q32855
Tube microcentrifuge de 1,5 mL sans RNaseThermo Scientific AM12400
Eau sans RNase MerkW4502
RNaseZap RNaseInvotrogen AM9780Solution de décontamination
Kit RNeasy FFPE (50)Qiagen73504Extraction d'ARN total
SCTransform (v0.3.5)Satija LabN/AMéthode de normalisation stabilisant la variance mise en œuvre dans Seurat.
Seurat (v4.3.0.1) Satija LabN/APackage R utilisé pour l'analyse de la transcriptomique unicellulaire et spatiale.
Space Ranger (v2.0.1)10x GenomicsN/ALogiciel utilisé pour le démultiplexage, l'alignement et la génération de matrices caractéristique-code à barres pour les jeux de données Visium.
Stlime Scalpel Schreiber GmbH 51-11-030
STutility (v1.1.1)Laboratoire BergenN/APackage R utilisé pour la visualisation et l'intégration des données de transcriptomique spatiale.
Lame de scalpel chirurgical n°23Swann-Morton210Lames de scalpel chirurgical
Thermostat de PCR Eppendorf6313000018
Tween-200Sigma-AldrichP2287-500ML
Vectra Polaris PerkinElmerCLS143455Plateforme d'imagerie multispectrale pour la visualisation de l'IF
Visium Accessory Kit 10X Genomics 10x GenomicsPN-1000194
Visium CytAssist10x GenomicsPN-1000441
Visium Human Transcriptome Probe Kit Small 10X Genomics 10x GenomicsPN-1000363
Visium Kit de sondes pour transcritome de souris, petit 10X Genomics 10x GenomicsPN-1000365
Kit de lame Visium pour l'expression génique spatiale, 4 réactions, 10X Genomics 10x GenomicsPN-1000188
XylènePanreac214736Xylène, mélange d'isomères pour analyse, ACS, ISO

Références

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