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Détection par cytométrie en flux de protéines intracellulaires dans des cellules d'érythroleucémie humaine K562 à l'aide d'anticorps primaires non conjugués

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DOI :

10.3791/72500

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8 septembre 2026

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1Department of Basic Medical Sciences, College of Medicine-Phoenix, University of Arizona

Dans cet article

Résumé

Ce protocole décrit la détection par cytométrie en flux de protéines intracellulaires dans des cellules humaines d'érythroleucémie K562 à l'aide d'anticorps primaires polyclonaux non conjugués. La spécificité des anticorps est démontrée par une inhibition dépendante de la dose du marquage, obtenue par compétition peptidique.

Résumé

La cytométrie en flux est une technique puissante pour l'analyse quantitative de l'expression protéique à la résolution de la cellule unique. Ce protocole décrit un flux de travail permettant la détection de protéines intracellulaires dans les cellules K562, une lignée humaine d'érythroleucémie, à l'aide d'anticorps primaires polyclonaux non conjugués et d'anticorps secondaires marqués par un fluorochrome. Les cellules sont fixées, perméabilisées puis bloquées de manière séquentielle avant la coloration par anticorps. En modifiant l'ordre d'incubation des anticorps par rapport à la fixation et à la perméabilisation, ce protocole permet d'évaluer des protéines ayant une localisation membranaire ou intracellulaire, en utilisant des protocoles de coloration distincts. La coloration nucléaire du facteur d'épissage 3a, sous-unité 1 (SF3A1), est illustrée à l'aide d'un anticorps polyclonal de lapin anti-SF3A1 purifié par affinité, et la spécificité de l'anticorps est évaluée par inhibition dépendante de la dose de la coloration par le peptide antigénique correspondant. En outre, les conditions de coloration sont utilisées pour évaluer la réactivité d'un anticorps ciblant le domaine intracellulaire du récepteur de l'érythropoïétine. Ce protocole standardisé élargit l'utilisation d'anticorps primaires non conjugués en cytométrie en flux et fournit une approche pratique pour évaluer l'expression et la localisation des protéines, ainsi que la spécificité des anticorps dans les cellules K562, une lignée humaine d'érythroleucémie.

Introduction

La cytométrie en flux est un outil analytique puissant et largement utilisé qui permet d'évaluer quantitativement l'expression des protéines au niveau de la cellule unique, facilitant ainsi l'analyse des populations cellulaires hétérogènes et rares1,2,3. Bien que les approches conventionnelles de cytométrie en flux utilisent principalement des anticorps dirigés contre les antigènes de surface cellulaire, de nombreuses protéines fonctionnellement importantes, telles que les facteurs de transcription, les régulateurs du traitement de l'ARN et les récepteurs subissant une internalisation induite par un ligand, se localisent dans des compartiments intracellulaires. Par conséquent, ces protéines cytoplasmiques et nucléaires sont inaccessibles par les protocoles standards de marquage de surface. L'intégration de méthodes de marquage intracellulaire, qui impliquent la fixation et la perméabilisation des membranes cellulaires, a considérablement élargi l'utilité de la cytométrie en flux en permettant l'évaluation quantitative de protéines intracellulaires, de cytokines et d'intermédiaires de signalisation, tout en conservant les capacités haut débit et multiparamétriques de l'analyse classique par cytométrie en flux4,5,6,7.

Une limitation majeure dans la détection des protéines associées à la surface cellulaire et des protéines intracellulaires par cytométrie en flux réside dans la disponibilité d'anticorps appropriés et, dans de nombreux cas, dans la connaissance incomplète des séquences d'épitopes ou d'immunogènes8,9. Étant donné que les stratégies d'immunophénotypage reposent principalement sur des marqueurs de surface cellulaire, la plupart des anticorps disponibles commercialement et validés pour la cytométrie en flux sont monoclonaux, reconnaissent un seul épitope extracellulaire et sont préconjugués à des fluorochromes. En revanche, les anticorps polyclonaux sont capables de reconnaître plusieurs épitopes au sein d'une même protéine cible et sont couramment utilisés en immunobuvardage (western blot), en immunohistochimie ou en immunofluorescence. Toutefois, ces anticorps sont généralement non conjugués et ne sont donc pas directement compatibles avec les protocoles standards de cytométrie en flux. L'utilisation d'anticorps primaires non conjugués en combinaison avec des anticorps secondaires marqués par un fluorochrome offre une alternative souple qui élargit la gamme de cibles détectables et peut permettre une amplification du signal, avantage particulièrement utile pour les protéines peu abondantes.

Pour pallier ces limitations, nous avons optimisé un protocole de marquage des protéines dans des cellules d'érythroleucémie humaine K56210. Le marquage intracellulaire nécessite une fixation pour préserver la structure et l'état cellulaires, ainsi qu'une perméabilisation permettant aux anticorps d'accéder aux compartiments intracellulaires. Dans ce protocole, les cellules sont fixées au paraformaldéhyde (PFA), un fixateur de réticulation couramment utilisé qui maintient la morphologie cellulaire et peut augmenter la perméabilité de la membrane cellulaire dans certaines conditions11,12,13,14. La perméabilisation à l'éthanol (EtOH) permet aux anticorps d'entrer dans les compartiments intracellulaires, y compris d'accéder aux cibles nucléaires5,13,15. La perméabilisation est suivie d'un marquage à l'aide d'anticorps primaires polyclonaux non conjugués et d'anticorps secondaires conjugués à un fluorochrome. À l'aide de ce protocole, le traitement au PFA seul est utilisé pour la détection d'une immunoréactivité non membranaire, tandis qu'une étape supplémentaire de perméabilisation à l'EtOH est utilisée pour la détection de cibles nucléaires. L'évaluation de la spécificité du marquage nucléaire par compétition au peptide a montré une inhibition dépendante de la dose du lien anticorps par le peptide homologue, mais pas par un contrôle non spécifique. Dans l'ensemble, l'utilisation d'anticorps primaires polyclonaux non conjugués étend l'applicabilité de la cytométrie en flux au-delà de l'analyse conventionnelle des marqueurs de surface à l'aide d'anticorps conjugués à un fluorochrome, et offre une approche souple pour évaluer l'expression protéique intracellulaire à la résolution monocellulaire.

Protocole

Les cellules K562 ont été obtenues commercialement et ont été régulièrement authentifiées et testées pour les mycoplasmes par le centre de génétique de l'Université de l'Arizona. Aucun participant humain ni animal vertébré n'a été impliqué dans cette étude.

1. Préparer les réactifs

  1. Cultiver les cellules dans des conditions stériles. Utiliser la lignée cellulaire humaine de leucémie myéloïde K562 pour ce protocole.
    1. Décongeler et maintenir les cellules K562 dans un milieu Roswell Park Memorial Institute (RPMI) complété avec 10 % de sérum de veau fœtal et 1 % de pénicilline-streptomycine à 37 °C dans une atmosphère à 5 % de CO₂16. Pour la propagation, ensemencer les cellules à une densité d’environ 1 × 105 cellules/mL, récolter lorsque les cultures atteignent 75 % à 95 % de la densité cellulaire maximale recommandée, et ne pas cultiver au-delà de 20 passages. Pour la coloration, récolter les cellules à 50 % à 75 % de la densité cellulaire maximale recommandée.
  2. Préparer du tampon phosphate-saline (PBS) stérile 10× dans une cabine de sécurité biologique de classe II.
    1. Ajouter 80 g de chlorure de sodium (NaCl), 2 g de chlorure de potassium (KCl), 2,4 g de phosphate monobasique de potassium (KH₂PO₄) et 14,4 g de phosphate dibasique de sodium (Na₂HPO₄) à 800 mL d’eau autoclavée dans un cylindre gradué de 1 L.
    2. Ajouter une barre magnétique et agiter la solution sur un agitateur magnétique jusqu’à dissolution complète des poudres.
    3. Utiliser une sonde de pH pour ajuster le pH à 7,2–7,4. Compléter jusqu’au volume final de 1 L avec de l’eau autoclavée. Stériliser la solution par filtration à l’aide d’un filtre en bouteille équipé d’une membrane en nylon de 0,2 µm de porosité.
  3. Diluer le PBS 10× en PBS 1× en ajoutant 100 mL de PBS 10× stérile à 900 mL d’eau autoclavée dans une cabine de sécurité biologique de classe II.
  4. Préparer le colorant vital fixable selon les instructions du fabricant. Pour ce protocole, ajouter 50 µL de diméthylsulfoxyde (DMSO) à un tube contenant le colorant lyophilisé et vortexer jusqu’à dissolution complète du colorant.
    1. Conserver le colorant reconstitué à −20 °C, à l’abri de la lumière, pendant jusqu’à 1 an. Conserver le colorant en petits aliquots afin d’éviter les cycles répétés de congélation-décongélation.
  5. Préparer le tampon de tri cellulaire activé par fluorescence (FACS) en mélangeant 10 % de PBS 10×, 86 % d’eau et 4 % de sérum de veau fœtal (FBS). Par exemple, mélanger 10 mL de PBS 10×, 86 mL d’eau et 4 mL de FBS pour préparer 100 mL de tampon FACS.
    1. Préparer uniquement le volume de tampon FACS nécessaire pour environ 2 semaines.
    2. Conserver le tampon FACS à 4 °C.
  6. Préparer du paraformaldéhyde (PFA) à 1 %.
    ATTENTION : manipuler le PFA comme un cancérogène inflammable et réactif. Porter des équipements de protection individuelle appropriés et préparer le PFA à l’intérieur d’une hotte de sécurité chimique certifiée.
    1. Mélanger 350 mL d’eau et 50 mL de PBS 10×, placer la solution sur un agitateur chauffant et chauffer à 65 °C. Ajouter progressivement 20 g de poudre de PFA à la solution chauffée pour préparer du PFA à 4 % (poids/volume).
    2. Ajouter 1 à 3 gouttes de soude (NaOH) 5 M pour faciliter la dissolution du PFA. Agiter la solution sur un agitateur chauffant pendant environ 20 minutes. Utiliser un pH-mètre pour ajuster le pH à 7,4.
    3. Compléter le volume final à 500 mL avec de l’eau.
    4. Aliquoter le PFA 4 % en volumes de 50 mL et conserver à −20 °C pendant jusqu’à 1 an. Après décongélation, conserver le PFA 4 % à 4 °C pendant jusqu’à 2 mois. Jeter tout PFA 4 % décongelé restant après 2 mois.
    5. Diluer le PFA 4 % en PFA 1 % à l’aide de PBS 1× et conserver la solution diluée à 4 °C pendant jusqu’à 4 semaines17.
  7. Préparer de l’éthanol (EtOH) à 70 % froid en mélangeant 70 mL d’éthanol à 200 degrés avec 30 mL d’eau ultrapure de type I.
    1. Conserver l’EtOH 70 % à −20 °C pendant jusqu’à 1 an. Garder la solution immédiatement avant son ajout aux cellules pour la perméabilisation à une température proche de celle de la glace.

2. Recueillir et compter les cellules

  1. Transférer les cellules depuis une plaque de culture tissulaire de 10 cm vers un tube à centrifuger de 15 mL.
  2. Centrifuger les cellules à 600 × g pendant 5 min à 4 °C avec le frein activé afin d'obtenir un culot cellulaire.
  3. Retirer le milieu de culture et laver les cellules en les resuspendant dans 5 mL de PBS 1×. Centrifuger à nouveau à 600 × g pendant 5 min à 4 °C avec le frein activé, puis aspirer le surnageant en laissant le culot cellulaire.
  4. Resuspendre le culot cellulaire dans du PBS 1×. Compter les cellules à l’aide d’un hémocytomètre ou d’un compteur cellulaire automatisé en mélangeant 10 µL de suspension cellulaire avec 10 µL de bleu de trypan, charger l’échantillon sur une lame de comptage cellulaire, puis déterminer la concentration cellulaire.
    NOTE : Ne poursuivre que si la viabilité cellulaire est >90 % afin d’assurer des résultats fiables.
  5. Centrifuger la suspension cellulaire à 600 × g pendant 5 min à 4 °C avec le frein activé et aspirer le surnageant, en laissant le culot cellulaire. Resuspendre les cellules à une densité de 2 × 105 cellules viables/mL (minimum 0,5 × 105 cellules viables/mL).
  6. Distribuer 1 mL de suspension cellulaire dans le nombre requis de tubes d’échantillons et de témoins pour cytométrie en flux.
    1. Préparer des tubes d’échantillons séparés pour chaque protéine cible et chaque protocole de marquage. Les conditions de marquage en surface (avant-PFA), après-PFA, avant-EtOH et après-EtOH sont réalisées dans des tubes indépendants plutôt que par marquage séquentiel des mêmes cellules. Par exemple, lors de l’évaluation de deux protéines cibles, préparer huit tubes : Tube 1 (anticorps primaire A, avant-PFA), Tube 2 (anticorps primaire B, avant-PFA), Tube 3 (anticorps primaire A, après-PFA), Tube 4 (anticorps primaire B, après-PFA), Tube 5 (anticorps primaire A, avant-EtOH), Tube 6 (anticorps primaire B, avant-EtOH), Tube 7 (anticorps primaire A, après-EtOH) et Tube 8 (anticorps primaire B, après-EtOH).
      NOTE : Comme indiqué dans le schéma de marquage (Figure 1), effectuer le marquage aux anticorps primaires et secondaires des échantillons avant-PFA et avant-EtOH le jour 1. Effectuer le marquage aux anticorps primaires et secondaires des échantillons après-PFA et après-EtOH le jour 2.
    2. Préparer des tubes témoins non marqués et des tubes témoins avec marquage simple pour chaque condition de traitement. Si l’on évalue la viabilité et deux protéines cibles, préparer un témoin non marqué, un témoin avec uniquement le colorant de viabilité, et un témoin avec uniquement l’anticorps secondaire pour chaque condition de traitement.
      NOTE : Bien que l’anticorps primaire ne soit pas conjugué, un témoin avec uniquement l’anticorps primaire peut être inclus lors de la validation du test ou lors de l’évaluation d’une liaison non spécifique de l’anticorps primaire.
    3. Soumettre tous les tubes témoins non marqués et avec marquage simple aux mêmes traitements que les tubes d’échantillons. Si les échantillons sont fixés avec du PFA 1 % et perméabilisés avec de l’EtOH 70 %, traiter les tubes témoins de façon identique.
  7. Préparer des témoins de compensation avec marquage simple en utilisant des billes de compensation.
    NOTE : Les billes peuvent être utilisées à la place des cellules pour préparer les témoins de compensation.
    1. Étiqueter un tube de contrôle de compensation pour chaque fluorophore et un tube témoin non marqué. Si un colorant de viabilité et deux anticorps secondaires marqués avec des fluorophores différents sont utilisés, préparer quatre tubes : un témoin non marqué, un témoin colorant de viabilité (fluorophore 1), un témoin anticorps secondaire A (fluorophore 2) et un témoin anticorps secondaire B (fluorophore 3).
      NOTE : Si un colorant de viabilité réactif aux amines est utilisé, employer des billes de compensation réactives aux amines pour le témoin de colorant de viabilité.
    2. Ajouter un seul colorant ou un seul anticorps à chaque tube témoin de compensation afin que chaque témoin soit positif pour un seul fluorophore lors de la compensation en cytométrie en flux.

Schéma du protocole de coloration par anticorps avec étapes de pré- et post-fixation, décrivant les processus séquentiels.
Figure 1. Protocole optimisé de coloration pour la détection de cibles associées à la surface cellulaire et intracellulaires. Ce schéma illustre la séquence et le calendrier de la fixation, de la perméabilisation, du blocage, de la coloration par anticorps primaire et de la coloration par anticorps secondaire, après coloration avec un marqueur vital fixable. Des protocoles distincts sont présentés pour les conditions Pré-PFA, Post-PFA, Pré-EtOH et Post-EtOH. La coloration par anticorps primaire et secondaire est réalisée le jour 1 pour les protocoles Pré-PFA et Pré-EtOH, et le jour 2 pour les protocoles Post-PFA et Post-EtOH. PFA, paraformaldéhyde ; EtOH, éthanol. Veuillez cliquer ici pour visualiser une version agrandie de cette figure.

3. Colorer les cellules avec un colorant vital fixable

  1. Colorer les cellules avec un colorant vital fixable selon les instructions du fabricant. Ajouter 1 µL de solution mère de colorant vital (préparée à l'étape 1.4) directement dans chaque tube d'échantillon et dans le tube contrôle correspondant coloré uniquement avec le colorant vital contenant 1 × 106 cellules dans 1 mL de PBS 1×.
  2. Vortexer doucement pendant 3 s et incuber les échantillons à température ambiante pendant 30 min, à l'abri de la lumière.
    NOTE : Protéger les cellules de la lumière durant cette étape et toutes les étapes suivantes.
  3. Centrifuger la suspension cellulaire à 600 × g pendant 5 min à 4 °C avec le frein activé, puis aspirer le surnageant en laissant le culot cellulaire.
  4. Laver les cellules deux fois avec 1 mL de PBS 1× et resuspendre le culot cellulaire final dans 100 µL de PBS 1×.
    NOTE : Si l'on procède à la coloration de cibles membranaires avec des anticorps primaires conjugués à un fluorophore, réaliser la coloration de surface à ce stade selon les instructions du fabricant avant de passer à la fixation.

4. Traiter les cellules avec du PFA à 1 %

REMARQUE : Pour les échantillons pré-PFA (voir l'étape 2.6.1 et la Figure 1), effectuez les étapes 6, 7 et 8 avant de passer à cette section.

  1. Ajouter 1 mL de PFA à 1 % à chaque tube d'échantillon, y compris tous les tubes témoins monochromatiques, contenant les cellules remises en suspension dans 100 µL de PBS 1×. Vortexer doucement pendant 3 s et incuber les échantillons à température ambiante pendant 15 à 20 min, à l'abri de la lumière.
  2. Centrifuger la suspension cellulaire à 600 × g pendant 5 min à 4 °C avec le frein activé. Aspirer et jeter le surnageant, en conservant le culot cellulaire.
  3. Laver le culot cellulaire deux fois en le remettant en suspension dans 1 mL de tampon FACS, suivi d'une centrifugation à 600 × g pendant 5 min à 4 °C avec le frein activé.
  4. Remettre le culot cellulaire final en suspension dans 100 µL de tampon FACS.
    ​REMARQUE : Les cellules fixées (marquées ou non) peuvent être conservées dans 1 mL de tampon FACS à 4 °C pendant 12 à 48 h. Pour reprendre le protocole, centrifuger la suspension cellulaire à 600 × g pendant 5 min à 4 °C avec le frein activé, aspirer le surnageant et remettre le culot cellulaire en suspension dans 100 µL de tampon FACS.

5. Perméabiliser les cellules avec de l'EtOH

REMARQUE : Pour les échantillons pré-EtOH (voir l'étape 2.6.1 et la Figure 1), effectuez les étapes 6, 7 et 8 avant de poursuivre avec cette section.

  1. Ajouter délicatement 1 mL d'EtOH glacé à 70 % sur la paroi interne de chaque tube d'échantillon contenant 100 µL de suspension cellulaire, puis vortexer immédiatement à environ 50 % de puissance pendant 5 s. Répéter cette procédure pour tous les tubes d'échantillons restants et les tubes témoins monocolorés.
  2. Incuber les tubes à −20°C pendant au moins 2 h, à l'abri de la lumière.
    ​REMARQUE : Les cellules peuvent être conservées dans 1 mL d'EtOH à 70 % à −20°C pendant 12 à 48 h avant de poursuivre le protocole.
  3. Centrifuger la suspension cellulaire à 600 × g pendant 5 min à 4°C avec le frein activé, puis aspirer le surnageant en laissant le culot cellulaire.
  4. Laver les cellules trois fois avec 1 mL de tampon FACS, en centrifugeant à 600 × g pendant 5 min à 4°C avec le frein activé entre chaque lavage.
  5. Résuspendre le culot cellulaire final dans 100 µL de tampon FACS.

6. Bloquer les cellules

  1. Ajouter 820 µL de tampon FACS et 80 µL de sérum de chèvre normal (NGS) à chaque tube afin de préparer une solution de blocage finale contenant 92 % de tampon FACS et 8 % de NGS. Vortexer doucement pendant 3 s et incuber les échantillons à température ambiante pendant 30 min, sans agitation et à l’abri de la lumière.
  2. Centrifuger la suspension cellulaire à 600 × g pendant 5 min à 4 °C avec le frein activé, puis aspirer le surnageant en laissant le culot cellulaire.
  3. Laver les cellules deux fois en resuspendant le culot dans 1 mL de tampon FACS, puis en centrifugeant comme décrit à l’étape 6.2.
  4. Resuspendre le culot cellulaire final dans 100 µL de tampon FACS.

7. Colorer les cellules avec un anticorps primaire non conjugué

  1. Ajouter 0,5 µL d'anticorps primaire non conjugué à 100 µL de suspension cellulaire (dilution 1:200). Incuber les échantillons à température ambiante pendant 1 h, à l'abri de la lumière.
    REMARQUE : La dilution 1:200 est une concentration initiale recommandée et peut nécessiter une optimisation selon les anticorps.
    1. Si une compétition par peptide est réalisée, ajouter le peptide immédiatement avant d'ajouter l'anticorps primaire. Dans ce protocole, les peptides ont été titrés à des rapports molaires peptide/anticorps compris entre 50 et 0,625, calculés par rapport à la concentration d'anticorps (4,3 nM) dans le mélange réactionnel. Une optimisation peut être nécessaire pour chaque couple peptide–anticorps.
  2. Ajouter 1 mL de tampon FACS et centrifuger la suspension cellulaire à 600 × g pendant 5 min à 4 °C avec le frein activé. Aspirer le surnageant, en laissant le culot cellulaire.
  3. Laver les cellules deux fois supplémentaires avec 1 mL de tampon FACS, en centrifugeant comme décrit à l'étape 7.2.
  4. Resuspendre le culot cellulaire final dans 100 µL de tampon FACS.

8. Colorer les cellules avec un anticorps secondaire marqué par un fluorophore

  1. Ajouter une dilution au 1/200 de l'anticorps secondaire marqué par un fluorophore (0,5 µL d'anticorps dans 100 µL de suspension cellulaire) dans chaque tube d'échantillon et dans le tube contrôle correspondant.
    NOTE : Un anticorps secondaire DyLight 488 anti-lapin provenant de chèvre a été utilisé dans ce protocole.
  2. Incuber les échantillons à température ambiante pendant 1 h, à l'abri de la lumière.
  3. Ajouter 1 mL de tampon FACS. Centrifuger la suspension cellulaire à 600 × g pendant 5 min à 4 °C avec le frein activé, puis aspirer le surnageant en laissant le culot cellulaire.
  4. Laver les cellules deux fois avec 1 mL de tampon FACS en répétant la centrifugation décrite à l'étape 8.3.
  5. Resuspendre les cellules dans 300–500 µL de tampon FACS.
    NOTE : Les cellules peuvent être conservées dans le tampon FACS à 4 °C, à l'abri de la lumière, pendant 1 à 3 jours avant l'analyse par cytométrie en flux.

9. Analyser les échantillons par cytométrie en flux

  1. Effectuez la compensation de la fluorescence à l’aide des échantillons unicolorés appropriés. Acquérez les échantillons sur un cytomètre en flux et recueillez au moins 5 000 à 10 000 événements correspondant à des cellules uniques vivantes pour l’analyse. Dans ce protocole, le logiciel FACSDiva a été utilisé pour l’acquisition des données.
  2. Analysez les données en excluant d’abord les débris en utilisant la diffusion directe (FSC-A) par rapport à la diffusion latérale (SSC-A), puis en éliminant les doublests à l’aide de la hauteur de diffusion directe (FSC-H) par rapport à la largeur de diffusion directe (FSC-W) et de la hauteur de diffusion latérale (SSC-H) par rapport à la largeur de diffusion latérale (SSC-W). Excluez les cellules mortes à l’aide du canal du colorant d’analyse de viabilité.
  3. Analysez le pourcentage des cellules uniques vivantes restantes qui sont positives ou négatives pour les protéines cibles sélectionnées (voir Résultats représentatifs). Définissez les seuils de positivité à l’aide des témoins non colorés et des témoins avec anticorps secondaire uniquement, puis appliquez des critères d’analyse identiques à tous les échantillons comparables appartenant au même lot d’acquisition.

Résultats

Le protocole décrit ici permet la coloration intracellulaire de cibles protéiques pour lesquelles des anticorps commerciaux validés pour la cytométrie en flux ne sont pas disponibles. À titre d'exemple représentatif, la coloration du facteur d'épissage 3a, sous-unité 1 (SF3A1), une protéine d'épissage ubiquitaire localisée dans le noyau, a été évaluée à l'aide d'un anticorps polyclonal de lapin produit contre un peptide correspondant aux acides aminés 18 à 37 de SF3A1 (SF3A118–37; EPKQPTEEEASSKEDSAPSK)18,19.

Pour évaluer le protocole de coloration, les cellules ont été colorées avec l'anticorps primaire polyclonal anti-SF3A118–37 non conjugué soit avant soit après traitement au paraformaldéhyde (PFA) seul ou à une série de traitements PFA + EtOH (Figures 1 et 2). Comme prévu, aucune population positive pour SF3A1 n'a été détectée dans les échantillons colorés avant le traitement au PFA (pré-PFA) ou avant le traitement séquentiel PFA et EtOH (pré-EtOH) (Figure 2A). La coloration effectuée après traitement au PFA seul (post-PFA) a révélé une petite population positive pour SF3A1 (Figure 2B). En revanche, une population distincte positive pour SF3A1 a été observée uniquement lorsque la coloration a été réalisée après perméabilisation à l'EtOH (post-EtOH) (Figure 2B). Ces résultats indiquent que le protocole permet de détecter une coloration de SF3A1 nettement plus importante après perméabilisation à l'EtOH qu'après traitement au PFA seul.

Graphique de cytométrie en flux ; analyse des cellules SF3A1+ avant/après fixation ; comparaison EtOH/PFA ; DL488, SSC-A.
Figure 2. Évaluation de la coloration de SF3A1 après fixation par du paraformaldéhyde et perméabilisation à l'éthanol. Graphiques représentatifs de cytométrie en flux de cellules K562 vivantes, négatives pour le colorant de viabilité, montrant la fluorescence DyLight 488 (DL488) en fonction de l'aire de diffusion latérale (SSC-A). La zone encadrée indique la population positive pour SF3A1 (SF3A1⁺). SF3A1, facteur d'épissage 3a sous-unité 1 ; PFA, paraformaldéhyde ; EtOH, éthanol. (A) Coloration par l'anticorps anti-SF3A1 réalisée avant la fixation au PFA (pré-PFA ; gauche) ou avant la fixation au PFA suivie de la perméabilisation à l'EtOH (pré-EtOH ; droite). (B) Coloration par l'anticorps anti-SF3A1 réalisée après la fixation au PFA (post-PFA ; gauche) ou après la fixation au PFA suivie de la perméabilisation à l'EtOH (post-EtOH ; droite). (C) Comparaison de la coloration de SF3A1 après perméabilisation à l'EtOH pendant 2 h ou toute une nuit. Veuillez cliquer ici pour visualiser une version agrandie de cette figure.

Afin de déterminer si la durée d'exposition à l'EtOH influait sur la coloration ou l'intégrité cellulaire, les cellules ont été traitées avec de l'EtOH pendant 2 h ou toute une nuit. L'analyse par cytométrie en flux n'a révélé aucune différence notable de l'intensité de coloration ou d'intégrité cellulaire apparente entre les deux conditions (Figure 2C). Ces résultats indiquent qu'une perméabilisation de 2 h à l'EtOH produit une coloration comparable à celle obtenue après une incubation prolongée toute une nuit dans les conditions testées.

Après avoir confirmé que la perméabilisation par l'EtOH produisait une coloration détectable de SF3A1 (Figure 2B) et établi la coloration de base de SF3A1 en l'absence de peptide compétiteur (Figure 3A), la spécificité de l'anticorps a été évaluée par compétition avec des peptides. Les cellules ont été incubées avec soit le peptide SF3A118–37, soit un peptide contrôle non spécifique correspondant aux acides aminés 778–793 de SF3A1 (SF3A1778–793 ; GAVIHLALKERGGRKK). Les peptides ont été ajoutés conjointement avec l'anticorps primaire (Protocole, Étape 7). L'incubation avec un excès du peptide spécifique SF3A118–37 a réduit le pourcentage de cellules positives pour SF3A1 à un niveau comparable à celui du témoin non coloré, tandis que le peptide non spécifique SF3A1778–793 n'a pas modifié de façon mesurable le profil de coloration (Figure 3B,C). Des expériences de titration par peptides ont montré une inhibition dépendante de la dose du lien d'anticorps par le peptide homologue SF3A118–37 (CI50 = 21,6 nM), tandis qu'aucune inhibition n'a été observée avec jusqu'à un excès molaire 50 fois supérieur du peptide non spécifique SF3A1778–793 (Figure 3D). Ces résultats démontrent que le test de compétition par peptides peut être utilisé pour évaluer l'inhibition du lien d'anticorps par cytométrie en flux.

Analyse par cytométrie en flux de l'expression de SF3A1 à l'aide d'un anticorps anti-SF3A1, d'un peptide spécifique et d'une inhibition.
Figure 3. Inhibition compétitive, dépendante de la dose, de la coloration par l'anticorps anti-SF3A1 par un peptide cognate. Représentations typiques de cytométrie en flux de cellules K562 vivantes, négatives pour le colorant de viabilité, montrant la fluorescence DyLight 488 (DL488) en fonction de la surface du scatter latéral (SSC-A). La région encadrée indique la population positive pour SF3A1 (SF3A1⁺). SF3A1, facteur d'épissage 3a, sous-unité 1. (A) Témoin non coloré et coloration par l'anticorps anti-SF3A1. (B) Coloration de SF3A1 après ajout, dépendant de la dose, du peptide cognate SF3A1(18–37). (C) Coloration de SF3A1 après ajout, dépendant de la dose, du peptide non spécifique SF3A1(778–793). Les concentrations en peptide étaient de 216, 43,3, 21,7, 10,8, 5,4 et 2,7 nM ; les rapports molaires peptide/anticorps indiqués sur la figure ont été calculés par rapport à une concentration d'anticorps anti-SF3A1 de 4,33 nM. (D) Courbe d'inhibition compétitive montrant le pourcentage de cellules positives pour SF3A1 en fonction de la concentration en peptide. Le peptide cognate SF3A1(18–37) a inhibé la liaison de l'anticorps de manière dépendante de la dose, tandis que le peptide SF3A1(778–793) n'a pas eu d'effet. La concentration inhibitrice demi-maximale (IC₅₀) pour le peptide cognate était de 21,6 nM, déterminée à l'aide d'un modèle d'inhibiteur par rapport à la réponse normalisée ajusté de façon non linéaire avec une pente variable. Veuillez cliquer ici pour visualiser une version agrandie de cette figure.

Enfin, le protocole a été évalué pour la détection du récepteur de l'érythropoïétine (EpoR), un récepteur de surface cellulaire également présent dans la cellule lors de la biosynthèse du récepteur et après son internalisation induite par le ligand20,21. L’EpoR est une protéine de 508 acides aminés composée d’un domaine extracellulaire en N-terminal, d’une région transmembranaire unique s’étendant des acides aminés 251 à 273, et d’un domaine intracellulaire en C-terminal. Un anticorps polyclonal de lapin non conjugué anti-EpoR (BS-1424R), précédemment validé pour le western blot, l’immunohistochimie et l’immunofluorescence, mais pas pour la cytométrie en flux22,23,24,25,26, a été utilisé selon le protocole de marquage décrit ci-dessus. Selon le fabricant, l’anticorps BS-1424R a été produit contre les acides aminés 330 à 365 situés dans le domaine intracellulaire de l’EpoR.

Lorsque les cellules ont été colorées avant le traitement au PFA (pré-PFA), <10 % des cellules K562 étaient positives pour la coloration du récepteur à l'érythropoïétine (EpoR)Figure 4A). En revanche, environ 77 % et 84 % des cellules K562 étaient positives après un traitement uniquement au PFA (Post-PFA) et après un traitement séquentiel au PFA puis à l'ÉtOH (Post-ÉtOH), respectivement (Figure 4B–D). Contrairement à la coloration de SF3A1, une coloration accrue de l'EpoR a été observée après les deux protocoles, Post-PFA et Post-EtOH (comparer Figures 2B et 4D). Ces résultats sont compatibles avec la localisation de l'épitope BS-1424R au sein du domaine intracellulaire du récepteur de l'érythropoïétine (EpoR). La détection d'une immunoréactivité anti-EpoR dans les deux conditions de coloration indique que le traitement par le paraformaldéhyde (PFA) perméabilise suffisamment la membrane plasmique des cellules K562 pour permettre la liaison de l'anticorps à l'épitope intracellulaire. Dans ce protocole, l'utilisation d'un seul anticorps secondaire impose d'évaluer les pools d'EpoR membranaires et intracellulaires à l'aide d'échantillons traités et colorés séparément. Cette limitation peut être surmontée en utilisant des anticorps primaires issus d'espèces hôtes différentes, permettant ainsi une détection multiplexe à l'aide d'anticorps secondaires spécifiques de chaque espèce.

Graphiques de cytométrie en flux et graphique en barres montrant les pourcentages de cellules EpoR+ avant et après fixation.
Figure 4. Détection du récepteur de l'érythropoïétine (EpoR) dans les cellules K562 après différents traitements de fixation et de perméabilisation. Graphiques représentatifs de cytométrie en flux de cellules K562 vivantes, négatives pour le colorant de viabilité, montrant la fluorescence du DyLight 488 (DL488) en fonction de la surface du scatter latéral (SSC-A). La région encadrée indique la population positive pour EpoR (EpoR⁺). La coloration d’EpoR a été réalisée à l’aide de l’anticorps polyclonal BS-1424R dirigé contre les acides aminés 330–365 du domaine intracellulaire d’EpoR. (A) Coloration d’EpoR avant fixation au PFA (avant-PFA). (B) Coloration d’EpoR après fixation au PFA (après-PFA). (C) Coloration d’EpoR après fixation au PFA suivie de perméabilisation à l’EtOH (après-EtOH). (D) Quantification des cellules positives pour EpoR dans chaque condition de coloration. Les données sont exprimées comme moyenne ± erreur standard de la moyenne (ESM) à partir de trois expériences indépendantes (n = 3). La significativité statistique a été déterminée par le test t de Student. P < 0,01 est indiqué par **. Les comparaisons présentées sont avant-PFA versus après-PFA et avant-PFA versus après-EtOH. Ab, anticorps ; EpoR, récepteur de l’érythropoïétine ; PFA, paraformaldéhyde ; EtOH, éthanol. Veuillez cliquer ici pour visualiser une version agrandie de cette figure.

Discussion

Les résultats présentés ici mettent en évidence plusieurs paramètres critiques pour la détection de protéines par cytométrie en flux intracellulaire à l'aide d'anticorps primaires non conjugués. Une considération importante est la stratégie de perméabilisation, qui doit être choisie en fonction de la localisation intracellulaire de la protéine cible. Dans le protocole décrit ici, une fixation par le PFA suivie d'une perméabilisation à l'EtOH a permis la détection de la protéine nucléaire SF3A1, tandis que l'immunoréactivité de l'EpoR a été détectée à l'aide des deux protocoles Post-PFA et Post-EtOH. Lors de l'analyse de protéines de surface, la coloration doit être effectuée avant le traitement au PFA, alors que la coloration intracellulaire peut être réalisée après le traitement au PFA et, si nécessaire, suivie d'une perméabilisation supplémentaire à l'EtOH. Ce protocole permet d'évaluer les protéines associées à la surface et les protéines intracellulaires au sein de populations cellulaires définies immunophénotypiquement, en utilisant des conditions de coloration distinctes.

Bien que le PFA soit généralement utilisé comme fixateur cellulaire, un traitement avec 1 % de PFA a perméabilisé suffisamment la membrane plasmique des cellules K562 pour permettre la liaison de l'anticorps anti-EpoR à un épitope intracellulaire. La perméabilisation induite par le PFA a également été montrée permettre l'entrée d'anticorps dans d'autres lignées cellulaires, notamment les cellules HEK293T et HeLa ; toutefois, cela a été obtenu à l'aide d'une concentration plus élevée de PFA (4 %)11. Ces différences suggèrent des effets spécifiques au type cellulaire du PFA ; par conséquent, une optimisation des conditions de fixation peut être nécessaire pour maximiser la détection de l'épitope. Parmi les réactifs alternatifs de perméabilisation cellulaire figurent les détergents saponine, digitonine et Triton X-100, qui agissent selon des mécanismes différents. Alors que le Triton X-100 perméabilise de façon non spécifique les membranes cellulaires, la saponine et la digitonine perméabilisent les cellules en se liant au cholestérol et à d'autres stérols membranaires27. Des études ont démontré que de faibles concentrations de digitonine perméabilisent sélectivement la membrane plasmique tout en préservant l'intégrité des membranes mitochondriales et nucléaires28,29,30. Ainsi, des combinaisons appropriées de ces réactifs peuvent être utilisées pour distinguer la localisation des protéines au sein de différents compartiments subcellulaires, bien que l'une des limites de ces approches soit la perte potentielle d'antigènes intracellulaires et d'intégrité des épitopes13,31.

Le protocole est facilement adaptable et peut être modifié selon les besoins expérimentaux. Par exemple, la durée du traitement par l’EtOH peut être ajustée sans perte apparente de performance de coloration ou d’intégrité cellulaire, offrant ainsi une flexibilité pour les protocoles s’étendant sur plusieurs jours, en particulier lorsque les conditions de coloration avant et après la perméabilisation sont réalisées en parallèle (Figure 1). Ce protocole peut également être appliqué à d'autres types cellulaires, notamment les cellules hématopoïétiques primaires humaines ; toutefois, les conditions de fixation, de perméabilisation et de centrifugation peuvent nécessiter une optimisation, car ces traitements peuvent influencer l’accessibilité des épitopes, l’efficacité de liaison des anticorps, l’intégrité cellulaire et l’intensité du signal de fluorescence14,32,33. En outre, l’optimisation des durées d’exposition au PFA et à l’EtOH, ainsi que des conditions de centrifugation, peut contribuer à préserver la viabilité cellulaire et à minimiser la perte excessive de cellules. La détection de cibles protéiques supplémentaires est également possible après optimisation de la concentration en anticorps et des conditions d’incubation.

Les limites potentielles incluent une faible intensité du signal, qui peut être améliorée en augmentant la concentration de l'anticorps primaire ou en utilisant une amplification par anticorps secondaire. La coloration non spécifique peut être réduite par l'optimisation des conditions de blocage ou par compétition avec un peptide. L'utilisation d'anticorps polyclonaux peut également introduire une variabilité d'un lot à l'autre et augmenter le risque de liaison hors cible ; par conséquent, la spécificité de l'anticorps doit être soigneusement validée pour chaque application. En outre, la compétition par peptide démontre une dépendance vis-à-vis du peptide immunisant, mais n'établit pas de manière indépendante la spécificité de l'anticorps. Dans le cas de l'anticorps anti-SF3A1, des études de co-immunoprécipitation antérieures ont confirmé la spécificité de l'anticorps19. D'autres approches complémentaires pour valider la spécificité de l'anticorps incluent l'épuisement de l'antigène, l'extinction génique, la suppression génique ou l'utilisation de modèles cellulaires négatifs pour l'antigène. De plus, cette approche n'est pas intrinsèquement compatible avec tous les panneaux multicolores, car l'utilisation de plusieurs anticorps secondaires peut entraîner des réactions croisées et limiter la multiplexion, sauf si des contrôles appropriés sont mis en place. Une sélection rigoureuse des anticorps secondaires et des fluorochromes est donc essentielle pour minimiser la coloration de fond et maximiser la résolution du signal.

Le protocole décrit ici présente un flux de travail pour l'évaluation par cytométrie en flux de protéines intracellulaires dans les cellules d'érythroleucémie humaine K562. Il permet également d'évaluer la performance des anticorps par compétition au peptide et d'analyser l'immunoréactivité associée aux récepteurs dans différentes conditions de marquage. Cette approche peut s'avérer utile pour étudier les modifications de l'expression protéique au cours de la différenciation cellulaire ou en réponse à des stimuli extracellulaires, notamment dans les études portant sur les facteurs de transcription, les protéines de maturation de l'ARN et la biologie des récepteurs au sein de populations cellulaires définies par immunophénotype. Dans une étude distincte, ce protocole a été utilisé pour analyser les modifications induites par l'érythropoïétine dans les enzymes du métabolisme lipidique intracellulaire chez des cellules souches et progénitrices hématopoïétiques humaines en cours de différenciation érythroïde34, démontrant ainsi l'adaptabilité de cette méthode aux cellules primaires. Dans l'ensemble, ce protocole élargit l'utilisation d'anticorps primaires non conjugués en cytométrie en flux et offre un flux de travail souple pour l'évaluation de l'expression protéique dans des cellules en culture.

Déclarations de divulgation

Les auteurs n'ont rien à divulguer.

Remerciements

Les auteurs remercient le soutien financier de SS fourni par le National Institute of General Medical Sciences (R01GM127464) et le National Cancer Institute (P30CA023074), tous deux appartenant aux National Institutes of Health, le programme Valley Research Partnership Program (VRP P1-4009 et VRP77), ainsi que le Arizona Biomedical Research Center (ABRC : RFGA2022-010-30). Le contenu est uniquement sous la responsabilité des auteurs et ne représente pas nécessairement les points de vue officiels des National Institutes of Health. Les auteurs remercient également le soutien de la Dre Mrinalini Kala, directrice de la Plateforme de Cytométrie en Flux, Collège de Médecine–Phoenix, Université de l'Arizona.

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
10× Solution tamponnée au phosphate (PBS)InterneN/DAlternative : PBS disponible commercialement
Tubes de centrifugation de 15 mLVWR89039-664Alternative : Tout tube de centrifugation stérile de taille appropriée
Tubes ronds en polystyrène de 5 mLCorning352052Alternative : Tout tube de cytométrie en flux compatible avec le cytomètre disponible
Anticorps secondaire DyLight 488 anti-lapinThermo Fisher ScientificPI35553Alternative : Anticorps secondaire compatible avec l'espèce hôte de l'anticorps primaire
Compteur cellulaire automatiséThermo Fisher ScientificAMQAF2000Alternative au compteur hématologique
Kit de billes de compensation réactives aux amines ArCThermo Fisher ScientificA10628Alternative : cellules ; si des cellules sont utilisées comme témoins monochromatiques, traiter tous les tubes témoins de la même manière que les tubes d'échantillons
Filtre à bouteilleThermo Fisher Scientific595-4520Mémbane en nylon ; 0,2 µm
Plaques pour comptage cellulaireThermo Fisher ScientificC10228Requis uniquement lors de l'utilisation d'un compteur cellulaire automatisé
Diméthylsulfoxyde (DMSO)Fourni avec le kit de colorant de viabilitéN/DUtilisé pour reconstituer le colorant de viabilité lyophilisé
Éthanol, 200 preuvesThermo Fisher ScientificBP28184Qualité biologie moléculaire ; utilisé pour préparer de l'éthanol glacé à 70 %
Anticorps primaire polyclonal contre le récepteur de l'érythropoïétineBiossBS-1424R
Sérum bovin fœtal (FBS)Omega ScientificFB-12Alternative : tout FBS validé pour la lignée cellulaire cible
Cytomètre en fluxBD BiosciencesBD Canto II Alternative : tout cytomètre en flux approprié
Compteur hématologiqueHausser ScientificHS3200Alternative : compteur cellulaire automatisé
Agitateur magnétique chauffantThermo Fisher ScientificSP88857100Utilisé pour la préparation du PBS et du paraformaldéhyde
Cellules humaines de leucémie myéloïde K562ATCCCCL-243Peut être acheté auprès de toute autre source certifiée
Colorant de viabilité fixable Live-or-Dye (405/545)Biotium32009Alternative : tout colorant de viabilité fixable compatible. Les colorants non fixables (par ex. 7-AAD) ne conviennent pas
Sérum de chèvre normalThermo Fisher Scientific16210064Utilisé pour le blocage
Poudre de paraformaldéhydeSigma-AldrichP6148Alternative : solution de paraformaldéhyde disponible commercialement
Compteur/pH-mètreAccumetAB15Utilisé pour ajuster le pH du tampon
Chlorure de potassium (KCl)Thermo Fisher ScientificBP366-1
Phosphate monobasique de potassium (KH2PO4)Thermo Fisher ScientificBP362-1
Anticorps primaire polyclonal SF3A1 InterneN/D
Chlorure de sodium (NaCl)Thermo Fisher ScientificBP358-1
Solution d'hydroxyde de sodium (5 M)MilliporeSigmaS8263Alternative : préparer une solution 5 M à partir de pastilles d'hydroxyde de sodium
Phosphate dibasique de sodium (Na2HPO4)Thermo Fisher ScientificBP332-1
Barreau d'agitationVWR74950-286Utilisé avec la plaque d'agitation magnétique
Trypan bleu, 0,4 %Thermo Fisher Scientific15250061Utilisé pour le comptage de la viabilité cellulaire
Billes de compensation UltraComp eBeadsThermo Fisher Scientific01-2222-42Alternative : cellules ; si des cellules sont utilisées comme témoins monochromatiques, traiter tous les tubes témoins de la même manière que les tubes d'échantillons

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