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Article de recherche

La ruscogénine inhibe la progression du carcinome nasopharyngé en régulant à la baisse KDM1A pour co-induire la ferroptose et l'apoptose

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DOI :

10.3791/72523

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3 septembre 2026

1School of Stomatology and Optometry, Hubei University of Science and Technology

Dans cet article

Résumé

Ce protocole vise à évaluer l'efficacité anti-tumorale de la ruscogénine dans des cellules de carcinome nasopharyngé. Il décrit des méthodologies complètes — notamment des tests de viabilité, de migration, d'apoptose et de férroptose — afin d'élucider systématiquement comment ce composé induit une mort cellulaire double en ciblant et en réprimant KDM1A.

Résumé

Le carcinome du nasopharynx (NPC) est une tumeur hautement agressive. Le composé naturel ruscogénine (Rus) présente un potentiel anticancéreux. Cette étude élucide le mécanisme d'action spécifique de ce composé dans le carcinome du nasopharynx (NPC) en examinant ses effets sur les cellules de NPC et la voie moléculaire sous-jacente. La lignée cellulaire humaine de carcinome du nasopharynx (NPC), C666-1, a été traitée avec différentes concentrations de Rus. Une série de tests in vitro a été réalisée pour évaluer la viabilité cellulaire, la prolifération, la migration, l'invasion, l'apoptose et la ferroptose. Le rôle de la lysine-déméthylase spécifique des lysines 1A (KDM1A) a été étudié par immunoblotting et par docking moléculaire, et son rôle médiateur a été validé au moyen d'expériences de sauvetage par surexpression. La ruscogénine a réduit de manière dépendante de la dose les capacités prolifératives, clonogéniques, migratoires et invasives des cellules C666-1. Sur le plan mécanistique, le traitement par Rus a induit à la fois l'apoptose, attestée par l'activation de la caspase-3 exécutoire et un basculement vers une signalisation pro-apoptotique via l'équilibre Bax/Bcl-2, et la ferroptose, marquée par une peroxydation lipidique accrue et un excès de fer intracellulaire. Ces effets antitumoraux étaient fortement corrélés à la répression de l'expression de KDM1A. De manière cruciale, la surexpression forcée de KDM1A a atténué de façon significative l'apoptose et la ferroptose induites par Rus, et inversé la suppression des phénotypes malins, confirmant ainsi le rôle médiateur essentiel de KDM1A. La ruscogénine inhibe la progression maligne du carcinome du nasopharynx en réprimant l'expression de KDM1A, favorisant ainsi l'apoptose et la ferroptose. Ces résultats identifient l'axe Rus-KDM1A comme une cible thérapeutique prometteuse pour le traitement du NPC.

Introduction

Le carcinome du nasopharynx (NPC) est un type de cancer provoqué par la coopération de facteurs génétiques et environnementaux1. Bien que la radiothérapie ait réalisé des progrès remarquables dans le traitement, la survie globale des patients atteints de NPC reste insatisfaisante. Cela s'explique probablement par la capacité des cellules de NPC à se multiplier rapidement et à métastaser fréquemment vers les ganglions lymphatiques régionaux et des organes éloignés2. Par conséquent, il est essentiel d'explorer les mécanismes moléculaires favorisant la progression du NPC. Récemment, la ferroptose, une nouvelle modalité de mort cellulaire, régulée de manière dépendante du fer par les ions Fe2⁺ et les peroxydes lipidiques, a été identifiée comme jouant un rôle crucial dans le NPC3. Les données actuelles montrent que la ferroptose joue un rôle important dans le NPC, et que son induction peut améliorer l'efficacité de la radiothérapie anticancéreuse4,5.

En raison de leur toxicité minimale et de leurs effets secondaires limités, les formules à base de plantes chinoises sont utilisées depuis des milliers d'années pour traiter le cancer6,7. En tant que médicaments à composants multiples, ciblant plusieurs voies et produisant des effets synergiques, les prescriptions de médecine traditionnelle chinoise (MTC) sont employées comme thérapie complémentaire efficace dans la prévention et le traitement du cancer, y compris le carcinome nasopharyngé (NPC)8,9,10. La Radix ophiopogonis (RO), racine de la plante herbacée vivace Ophiopogon japonicus, a été signalée comme un traitement adjuvant efficace pour atténuer le NPC11,12. La ruscogénine (Rus), principal composant de la RO, possède selon les rapports des effets anti-cancéreux puissants13. Dans des modèles murins de cancer colorectal, la Rus améliore les lésions des jonctions serrées et inhibe la migration tumorale14. De manière importante, la Rus peut également réduire la viabilité des cellules de cancer du pancréas en induisant une ferroptose. Toutefois, l'effet de la Rus sur le NPC reste encore mal compris.

L'épigénétique est le domaine principal de recherche sur la pathogenèse du cancer et offre de nombreux traitements efficaces15. En tant que l'une des modifications épigénétiques les mieux étudiées, la méthylation des histones participe au développement du cancer et constitue également une cible importante pour la conception de médicaments16. La modulation dynamique de la méthylation des histones est assurée par des méthyltransférases et des déméthylases17. KDM1A est une lysine déméthylase des histones qui s'est révélée essentielle dans la cancérogenèse en raison de son implication dans la modulation épigénétique18. De plus, KDM1A est considéré comme une oncoprotéine surexprimée dans plusieurs types de cancer, tels que le cancer du poumon et le cancer du pancréas19. Guo et al. ont rapporté qu'une élévation de KDM1A pouvait supprimer l'expression de la phosphatase et de l'homologue de la tensine (PTEN), augmenter la prolifération et la migration des cellules de carcinome nasopharyngé tout en inhibant l'apoptose20. Par ailleurs, on a également observé qu'une surexpression de KDM1A pouvait réprimer la ferroptose dans le cancer du poumon21. Une analyse effectuée à l'aide de la base de données Super-PRED a indiqué que KDM1A est une cible potentielle de Rus.

Malgré le potentiel anti-tumoral reconnu de la Rus dans d'autres cancers, son rôle spécifique et ses mécanismes moléculaires dans le carcinome nasopharyngé restent totalement inconnus, ce qui constitue un important manque dans la recherche. De plus, bien que des études antérieures aient lié séparément la KDM1A à la prolifération tumorale et à la résistance à la ferroptose, aucune recherche n'a encore exploré si le ciblage de la KDM1A peut simultanément activer plusieurs voies de mort cellulaire dans le CNP. Cette étude fournit donc une solide justification pour émettre l'hypothèse que la Rus pourrait supprimer la progression maligne des cellules de CNP en régulant directement à la baisse la KDM1A.

Cette étude visait à combler cette lacune en évaluant systématiquement l'effet du Rus sur la prolifération, la migration et l'invasion des cellules de CEP. La principale nouveauté de cette recherche réside dans la découverte d'une stratégie à mécanisme double. L'accent a été mis sur la capacité du Rus à induire simultanément l'apoptose classique et la ferroptose dépendante du fer. En validant la nouvelle voie de signalisation Rus-KDM1A, cette étude fait progresser de manière significative les connaissances actuelles en démontrant comment un composé naturel unique peut surmonter la résilience tumorale par un blocage simultané de plusieurs voies, offrant ainsi un fondement préclinique prometteur pour une thérapie ciblée du CEP.

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Protocole

Culture cellulaire, traitement et transfection

La lignée cellulaire de carcinome nasopharyngé humain, C666-1 (RRID : CVCL_M597), et la lignée cellulaire épithéliale nasopharyngée humaine non maligne, NP69 (RRID : CVCL_F755), ont été achetées auprès d'un fournisseur commercial. Les deux lignées cellulaires ont été authentifiées par profilage des répétitions courtes en tandem (STR) et ont été confirmées exemptes de contamination par les mycoplasmes avant utilisation. Pour la culture courante, les cellules C666-1 ont été cultivées dans un milieu RPMI 1640 complété avec 10 % de sérum bovin fœtal (FBS) et 1 % de pénicilline-streptomycine. Les cellules NP69 ont été cultivées dans un milieu sans sérum pour kératinocytes complété avec 10 % de FBS, 10 ng/mL de facteur de croissance épidermique recombinant et 1 % de pénicilline-streptomycine. La ruscogénine (Rus ; pureté ≥ 98 %) a été achetée auprès d'un fournisseur commercial. Les deux lignées cellulaires ont été maintenues dans un incubateur humidifié à 37 °C sous 5 % de CO₂. Pour les traitements, les cellules ont été exposées à la ruscogénine (Rus) à des concentrations variables (10, 20, 50 µM) pendant 24 h22. Pour la transfection, des plasmides codant pour la lysine-déméthylase spécifique 1A en sur-expression (oe-KDM1A) et un vecteur vide contrôle négatif correspondant (oe-NC), obtenus auprès d'un fournisseur commercial, ont été transférés dans les cellules C666-1 lorsque la confluence cellulaire a atteint 70–80 %. Plus précisément, 2,5 µg d'ADN plasmidique et 5 µL d'un réactif de transfection à base de lipides ont été chacun dilués dans 150 µL d'un milieu à faible teneur en sérum, doucement mélangés, incubés pendant 20 min à température ambiante, puis ajoutés à chaque puits d'une plaque de 6 puits selon le protocole du fabricant. Les cellules ont été incubées pendant 48 h à 37 °C, et l'efficacité de la transfection a ensuite été confirmée.

Dosage au kit de comptage cellulaire-8 (CCK-8)

La viabilité cellulaire après traitement par Rus a été quantifiée à l'aide du test CCK-8. Pour cette procédure, les cellules ont d'abord été semées dans des plaques de 96 puits et cultivées pendant une nuit. Le test a été amorcé par l'ajout de 10 µL de solution CCK-8, et après 2 h d'incubation, le changement colorimétrique obtenu a été mesuré sous forme de densité optique (OD) à 450 nm à l'aide d'un lecteur de plaques.

Essai de formation de colonies

Pour évaluer la survie clonogène, les cellules C666-1 ont été ensemencées dans des plaques de 6 puits et cultivées pendant 14 jours. Après la période d'incubation, les colonies obtenues ont été fixées avec du méthanol à 100 % pendant 10 minutes, puis visualisées avec du violet de crésyl à 0,5 % pendant 30 minutes. Le nombre de colonies colorées a ensuite été quantifié par imagerie microscopique et décompte.

Immunotransfert

Pour l'analyse par immunoblot, les protéines totales ont d'abord été extraites des cellules à l'aide d'un tampon RIPA, puis les lysats obtenus ont été centrifugés (12 000 × g) afin de récupérer le surnageant. Un dosage BCA a été utilisé pour quantifier les concentrations en protéines. Des quantités équivalentes de protéines totales (30 µg par piste) ont été chargées et séparées par électrophorèse sur gel de polyacrylamide en présence de dodécylsulfate de sodium à 10 % (SDS-PAGE). Après séparation, les protéines ont été transférées sur des membranes de fluorure de polyvinylidène (PVDF) sous une tension constante de 100 V pendant 90 min sur glace. Les membranes ont ensuite été bloquées pendant 2 h à température ambiante avec de l'albumine sérique de bovin (BSA) à 5 % préparée dans une solution saline tamponnée au Tris contenant 0,1 % de Tween 20 (TBST). Par la suite, les membranes ont été incubées toute la nuit à 4 °C avec les anticorps primaires suivants dilués dans le tampon de blocage (tous à 1/1000) : Ki67, PCNA, MMP2, MMP9, Bcl-2, Bax, KDM1A, SLC7A11, GPX4, ACSL4, TFR1 et β-actin. Enfin, après une incubation de 2 h avec des anticorps secondaires marqués à la peroxydase de raifort (HRP), les bandes immunoréactives ont été révélées à l'aide d'un réactif de détection par chimiluminescence amplifiée (ECL), et une analyse densitométrique a été réalisée à l'aide d'un logiciel d'analyse d'images.

Dosage par rayure de plaie

Pour le test de cicatrisation des plaies, les cellules C666-1 ont été cultivées jusqu'à une confluence de 80 % dans des plaques de 6 puits. Une blessure uniforme a été créée dans la monocouche en raclant avec une pointe de pipette de 200 µL. Les cellules détachées ont été éliminées par un lavage au PBS, puis le milieu de culture a été remplacé par un milieu sans sérum pour une incubation de 24 h. Des images de la zone de la plaie ont été prises à 0 h et 24 h à l'aide d'un microscope optique afin d'évaluer la migration cellulaire.

Dosage en chambre de Transwell

L'invasion cellulaire a été évaluée à l'aide de chambres de type transwell (pore de 8 µm) prérecouvertes de 50 µL de matrice de membrane basale. La capacité invasive des cellules C666-1 a été évaluée à l'aide de chambres Transwell. Les inserts supérieurs ont été ensemencés avec des cellules en suspension dans un milieu dépourvu de sérum, tandis que les puits inférieurs contenaient du DMEM complété avec 10 % de FBS. Après une incubation de 24 h, les cellules restantes sur la face apicale de la membrane ont été soigneusement éliminées. Pour la quantification, les cellules situées sur la surface basolatérale ont été fixées dans du méthanol, colorées avec du violet de crésyl à 0,1 %, puis dénombrées à partir d'images capturées par microscopie optique.

Cytométrie en flux

L'apoptose a été quantifiée par cytométrie en flux. Pour préparer les échantillons, les cellules C666-1 ont été recueillies, rincées avec du PBS glacé, puis resuspendues dans 100 µL de tampon de liaison. Les cellules ont ensuite été doublement marquées avec l'Annexine-V-FITC (20 µg/mL) et l'iodure de propidium (PI). Cette coloration a été effectuée pendant 15 min sur de la glace, à l'abri de la lumière. Les données ont été acquises immédiatement sur un cytomètre en flux afin de déterminer le pourcentage de cellules apoptotiques.

Détection de l'activité de la caspase-3

L'activité de la caspase-3 a été mesurée à l'aide d'un kit d'essai commercial, conformément aux instructions du fabricant. Brièvement, les cellules C666-1 ont été lysées et les surnageants ont été recueillis après une centrifugation à 14 000 × g. Après une incubation de 2 h avec le réactif fourni, l'absorbance de chaque surnageant a été quantifiée à 405 nm.

RT-qPCR

L'ARN total a été purifié à partir de cellules C666-1 à l'aide d'un réactif commercial d'extraction d'ARN. L'ARN obtenu a été transcrit en ADN complémentaire de premier brin à l'aide d'un kit commercial, selon le protocole du fabricant. Une analyse de l'expression génique a ensuite été réalisée par PCR quantitative (qPCR) sur un système de PCR en temps réel, en utilisant un mélange maître à base de SYBR Green. La méthode comparative du seuil de cycle (Ct) (2⁻△△Ct) a été utilisée pour déterminer les niveaux relatifs de transcrits. Les séquences des amorces utilisées pour l'amplification étaient : β-actin (Sens : 5'-CATGTACGTTGCTATCCAGGC-3' ; Antisens : 5'-CTCCTTAATGTCACGCACGAT-3') et KDM1A (Sens : 5'-TGACCGGATGACTTCTCAAGA-3' ; Antisens : 5'-GTTGGAGAGTAGCCTC AAATGTC-3').

Dosage des substances réactives à l'acide thiobarbiturique (TBARS)

Pour mesurer la peroxydation lipidique, des surnageants ont d'abord été préparés à partir de cellules C666-1 par précipitation (15 % d'acide trichloroacétique, 500 mM de BHA) et centrifugation pendant 10 min à 10 000 × g. Ces surnageants ont ensuite été mis à réagir avec de l'acide thiobarbiturique à 0,375 %, puis chauffés à 100 °C pendant 10 min afin de générer l'adduit MDA-TBA. Le niveau de cet adduit, indicateur de la peroxydation lipidique, a été déterminé en mesurant l'absorbance à 532 nm à l'aide d'un lecteur de microplaques23.

Détection des espèces réactives de l'oxygène lipidiques (ROS)

La peroxydation lipidique a été détectée à l'aide d'une sonde fluorescente de peroxydation lipidique. Les cellules C666-1 ont été semées dans des plaques de 6 puits, cultivées pendant une nuit, puis exposées à la sonde fluorescente (2 µM). Cette sonde présente un décalage de fluorescence du rouge au vert lors de l'oxydation. Le rapport de fluorescence vert/rouge a été analysé à l'aide d'un microscope confocal à balayage laser et d'un logiciel d'analyse d'images. Le rapport de fluorescence vert/rouge tracé était clairement défini et a été utilisé comme indicateur quantitatif des niveaux de peroxydation lipidique24.

Détection du Fe2+

Le taux intracellulaire de fer ferreux (Fe2⁺) a été mesuré à l'aide d'une sonde fluorescente intracellulaire pour le fer. Les cellules C666-1 ont été incubées avec une sonde fluorescente à 10 µM pendant 10 min. Après un lavage au PBS pour éliminer l'excès de sonde, les cellules ont été analysées par microscopie de fluorescence.

Analyse de docking moléculaire

La modélisation moléculaire par docking est une méthode computationnelle essentielle qui facilite la conception de nouveaux médicaments en prédisant l'affinité de liaison et les interactions entre un ligand et sa protéine cible, grâce à l'évaluation de leurs modes de liaison25. À partir de la page web RCSB PDB (https://www.rcsb.org/), la structure tridimensionnelle de la KDM1A (ID PDB : 6NQU) a été obtenue. Pour la préparation de la structure protéique de la KDM1A, l'eau a été supprimée et les petits ligands non pertinents ont été éliminés. La simulation de docking moléculaire a été réalisée à l'aide d'un logiciel de docking moléculaire utilisant l'algorithme génétique lamarkien, et la visualisation a été effectuée à l'aide d'un logiciel de visualisation moléculaire26.

Analyse statistique

Toutes les expériences ont été réalisées en utilisant au moins trois réplicats biologiques indépendants, et les résultats sont présentés sous forme de moyenne ± écart type (SD). L'analyse statistique a été effectuée à l'aide d'un logiciel d'analyse statistique. Les différences entre plusieurs groupes ont été évaluées par une analyse de la variance à un facteur (ANOVA) suivie du test a posteriori de comparaisons multiples de Tukey. Une valeur P inférieure à 0,05 a été considérée comme indiquant une différence statistiquement significative.

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Résultats

La ruscogénine inhibe de manière sélective la viabilité et la prolifération des cellules de carcinome nasopharyngé

L'étude a d'abord examiné l'effet de la ruscogénine (Rus) sur la viabilité des cellules épithéliales nasopharyngées normales (NP69) et des cellules de carcinome du nasopharynx (CNP) (C666-1). Selon les résultats du test CCK-8, un traitement par Rus aux concentrations de 10, 20 et 50 µM n'a montré aucune toxicité significative sur les cellules normales NP69. En rev...

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Discussion

Le carcinome du nasopharynx (NPC) est une tumeur maligne grave qui présente une forte prévalence métastatique, ce qui explique l'urgence d'avoir de meilleures interventions27. Ici, on montre que la ruscogénine (Rus), un produit naturel dérivé de Radix ophiopogonis, exerce de puissants effets anti-tumoraux sur les cellules de NPC. On conclut également que la Rus empêche la progression du NPC en supprimant la déméthylase d'histone KDM1A, ce qui induit par la suite deux types différents de m...

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Déclarations de divulgation

Les auteurs déclarent ne pas avoir d'intérêts financiers concurrents. Les auteurs déclarent qu'aucun outil d'intelligence artificielle générative n'a été utilisé lors de la conception de l'étude, de la collecte des données, de l'analyse des données ou de la création des figures. Les technologies assistées par l'intelligence artificielle ont été utilisées uniquement pour des corrections linguistiques mineures et la correction grammaticale lors de la rédaction du manuscrit. Les auteurs assument l'entière responsabilité du contenu et de l'intégrité du travail publié.

Remerciements

Non applicable.

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
Système 7500 Fast Real-Time PCRApplied Biosystems4351106Analyse RT-PCR quantitative
Kit d'apoptose Annexine-V-FITC/PIBD Biosciences556547Détection de l'apoptose par cytométrie en flux
Anticorps anti-ACSL4Abcamab155282Anticorps primaire pour immunotransfert
Anticorps anti-BaxCell Signaling Technology (CST)5023Anticorps primaire pour immunotransfert
Anticorps anti-Bcl-2Cell Signaling Technology (CST)15071Anticorps primaire pour immunotransfert
Anticorps
Anticorps anti-GPX4Abcamab125066Anticorps primaire pour immunotransfert
Anticorps anti-KDM1A (LSD1)Cell Signaling Technology (CST)2139Anticorps primaire pour immunotransfert
Anticorps anti-Ki67Abcamab16667Anticorps primaire pour immunotransfert
Anticorps anti-MMP2Abcamab92536Anticorps primaire pour immunotransfert
Anticorps anti-MMP9Abcamab76003Anticorps primaire pour immunotransfert
Anticorps anti-PCNACell Signaling Technology (CST)13110Anticorps primaire pour immunotransfert
IgG anti-lapin, liée à la peroxydaseCell Signaling Technology (CST)7074Anticorps secondaire
Anticorps anti-SLC7A11 (xCT)Abcamab175186Anticorps primaire pour immunotransfert
anticorps anti-TFR1Abcamab84036Anticorps primaire pour immunotransfert
Anti-βanticorps anti-actineCell Signaling Technology (CST)4970Anticorps primaire de contrôle de chargement
Kits de dosage
Autodock 4.2Scripps Research InstituteN/ASimulation de docking moléculaire
Kit d'analyse des protéines BCABeyotime BiotechnologyP0012Quantification des protéines
sonde BODIPY 581/591 C11Invitrogen (Thermo Fisher Scientific)D3861Détection des ROS lipidiques (2 μM)
Ligne cellulaire C666-1iCell Bioscience Inc.iCell-h378Ligne cellulaire humaine de carcinome nasopharyngé
Kit d'essai d'activité de la caspase-3Beyotime BiotechnologyC1115Évaluation de l'apoptose
Kit d'essai CCK-8Dojindo Molecular TechnologiesCK04Mesure de la viabilité cellulaire
Produits chimiques & Réactifs
CytoFLEX cytomètre en fluxBeckman CoulterCytoFLEXAnalyse de l'apoptose
Réactif de détection ECLMilliporeSigmaWBKLS0500Visualisation par immunotransfert (Immobilon)
Équipement
Sérum de veau fœtal (SVF)Gibco (Thermo Fisher Scientific)10099141Supplément pour culture cellulaire
GraphPad Prism 8.0GraphPad SoftwareN/AAnalyse statistique et représentation graphique
logiciel ImageJNIHN/AAnalyse par densitométrie d'image
Milieu sans sérum pour kératinocytesiCell Bioscience Inc.iCell-019Pour la culture cellulaire de NP69
Microscope confocal à balayage laserCarl ZeissLSM 880Imagerie de la fluorescence de BODIPY C11
Microscope optique / à fluorescenceOlympusIX73Griffure de plaie, Transwell & Imagerie du Fe2+
LightCycler 480 SYBR Green I MasterRoche Diagnostics4887352001PCR quantitative en temps réel
réactif Lipofectamine 2000Invitrogen (Thermo Fisher Scientific)11668019Réactif de transfection cellulaire
MatrigelCorning356234Matrice de membrane basale pour le test d'envahissement
Lecteur de microplaquesMolecular DevicesSpectraMax M5Mesure de l'absorbance (405, 450, 532 nm)
Ligne cellulaire NP69iCell Bioscience Inc.iCell-h431Ligne cellulaire normale d'épithélium nasopharyngé humain
oe-KDM1A & plasmides oe-NCShanghai GenePharma Co., Ltd.Synthèse sur mesurePlasmides pour la surexpression de KDM1A
sonde Phen Green SK (PGSK)Invitrogen (Thermo Fisher Scientific)P14312Détection du Fe2+ intracellulaire (10 μM)
Pymol 3.0SchrödingerN/AVisualisation du docking moléculaire
Kit de transcription inverseRoche Diagnostics4379012001Transcriptor First Strand cDNA Synthesis Kit
tampon de lyse RIPASolarbio (Pékin, Chine)R0010Extraction totale des protéines
Milieu RPMI 1640iCell Bioscience Inc.iCell-0002Pour la culture cellulaire de C666-1
Ruscogénine (Rus)MedChemExpress (MCE)HY-N0193Traitement médicamenteux, pureté ≥ 98%
Logiciel
Kit d'essai TBARSCayman Chemical10009055Mesure de la peroxydation lipidique
réactif TRizolInvitrogen (Thermo Fisher Scientific)*15596026Extraction d'ARN total

Références

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