Article de méthode

Technique de contention manuelle axée sur le bien-être pour l'administration de substances et le prélèvement sanguin chez la souris

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DOI :

10.3791/72535

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25 août 2026

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1Department of Hematology, Oncology, and Tumor Immunology, Charité – Universitätsmedizin Berlin, 2Taskforce Refinement C3R, Charité – Universitätsmedizin Berlin, 3Department of Hepatology and Gastroenterology, Charité – Universitätsmedizin Berlin, 4Julius Wolff Institute for Biomechanics and Musculoskeletal Regeneration, Berlin Institute of Health at Charité – Universitätsmedizin Berlin, 5Research Facilities of Experimental Medicine, Charité – Universitätsmedizin Berlin

Dans cet article

Résumé

Ce protocole décrit une nouvelle méthode manuelle de contention permettant d'immobiliser des souris pendant des injections ou des prélèvements sanguins, réduisant ainsi le stress et améliorant le bien-être des animaux durant les procédures.

Résumé

Les tests sur les animaux restent essentiels en recherche biomédicale, contribuant de manière significative à la compréhension des mécanismes des maladies et à l'évaluation de l'efficacité et de la sécurité des médicaments et des substances chimiques, les rongeurs figurant parmi les animaux de laboratoire les plus fréquemment utilisés. Parmi les interventions les plus courantes en pratique de laboratoire figurent la manipulation et la contention lors de procédures telles que les injections et les prélèvements sanguins, qui sont couramment réalisées chez des souris conscientes sans sédation ni anesthésie. Une contention adéquate est nécessaire pour assurer la sécurité à la fois de l'animal et de l'expérimentateur. Toutefois, les méthodes traditionnelles de contention, comme la fixation manuelle ou l'utilisation de tubes de contention, sont connues pour induire des réponses de stress aigu chez la souris, affectant ainsi négativement le bien-être animal et pouvant potentiellement influencer les résultats expérimentaux. Afin de promouvoir le raffinement dans le cadre du principe des 3R et d'améliorer le bien-être animal, ce protocole décrit l'utilisation d'un tunnel nouvellement mis au point pour les injections et les prélèvements sanguins chez la souris. Ce tunnel offre une méthode de contention moins intrusive tout en restant sécurisée, comparée aux techniques conventionnelles. Cette méthode de contention axée sur le bien-être peut être facilement mise en œuvre pour des procédures standard, telles que les injections intrapéritonéales et intraveineuses ainsi que les prélèvements sanguins, tout en minimisant le stress et en améliorant les conditions de manipulation des souris de laboratoire.

Introduction

Les tests sur les animaux continuent de jouer un rôle central dans la recherche biomédicale, contribuant de manière significative à la compréhension des mécanismes des maladies ainsi qu'à l'évaluation de l'efficacité et de la sécurité des médicaments et des substances chimiques. Les rongeurs représentent les espèces animales de laboratoire les plus couramment utilisées ; dans l'Union européenne, environ 3,5 millions de souris et 0,5 million de rats ont été utilisés à des fins scientifiques en 20231. Une prise de conscience croissante de la souffrance causée par les procédures expérimentales a conduit à des exigences légales visant à améliorer le bien-être animal dans les études de recherche, conformément au principe des 3R2,3. Étant donné que le remplacement complet des tests sur les animaux par des méthodes alternatives n'est pas encore possible, l'optimisation des procédures expérimentales existantes est particulièrement importante pour atténuer la souffrance animale. La manipulation, y compris les immobilisations pendant des procédures telles que les injections, constitue l'une des interventions les plus fréquentes auxquelles les animaux de laboratoire sont soumis, tant dans les soins de routine que pendant les expériences.

Le maintien classique par contention pour les injections intrapéritonéales consiste à saisir fermement la peau et le pelage au niveau du cou avec le pouce et l'index, à immobiliser la queue et à retourner les animaux afin d'exposer l'abdomen pour les injections. Cette position est contraignante et peut entraîner des difficultés respiratoires, provoquant ainsi de la peur chez les animaux4. Diverses techniques de contention améliorées ont déjà été décrites, notamment, par exemple, la méthode dite à « trois doigts », dans laquelle la pression exercée sur la région du cou est réduite par rapport aux méthodes classiques de préhension du cou4. Une autre méthode évite largement l'immobilisation complète : ici, les animaux peuvent s'agripper à une grille métallique tandis que la queue et les membres postérieurs sont maintenus afin de permettre l'accès au bas-ventre pour les injections5. Néanmoins, ces deux procédures présentent des limites. Avec la méthode à trois doigts, les animaux doivent encore être soulevés et placés dans une position contraignante, ce qui peut potentiellement déclencher des réponses de stress. La technique alternative, quant à elle, ne procure pas une protection suffisante contre les morsures d'animaux stressés ou défensifs et peut limiter le temps disponible pour réaliser les injections. En plus des risques de blessures par morsure, il existe également un risque accru de contention inadéquate ou de piqûres accidentelles par aiguille. L'immobilisation pour les injections intraveineuses ou les prélèvements sanguins à partir de la veine de la queue nécessite l'utilisation de dispositifs de contention qui immobilisent les animaux sans les tenir manuellement, libérant ainsi les mains pour les interventions. Ces dispositifs sont généralement des tubes en acrylique transparent, dotés d'une extrémité fermée munie d'ouvertures ou de fentes permettant l'accès à la queue, et d'une extrémité ouverte pour insérer les souris, qui peut être fermée à l'aide de bouchons réglables. Cette méthode exige que les animaux soient saisis par la queue et introduits dans le dispositif de contention d'abord par l'arrière, afin que la queue puisse être passée par les ouvertures d'accès. Il s'agit d'une procédure stressante, aggravée par le diamètre relativement étroit des dispositifs de contention, nécessaire pour empêcher les souris de faire demi-tour pendant les interventions, ce qui pourrait entraîner des blessures6,7.

Ce protocole décrit l'utilisation d'un tunnel d'application récemment mis au point pour les injections et la collecte de sang chez la souris, qui permet une contention moins contraignante tout en restant sûre. Le tunnel se compose d'un cadre externe rigide et d'une doublure interne amovible en peluche, créant un espace doux et sombre semblable à un terrier. Conçu volontairement avec des dimensions plus grandes que celles des contenants classiques, le tunnel peut accueillir un insert en Vetbed Isobed découpé sur mesure, offrant une doublure intérieure souple et confortable qui renforce le sentiment de sécurité des animaux tout en assurant une contention adéquate (Figure 1A–B). Les deux extrémités du tunnel sont ouvertes, permettant aux souris d'entrer simplement par l'avant et de sortir par l'arrière. Une fois à l'intérieur, les animaux ne peuvent pas faire demi-tour, tandis que la queue reste accessible pour des injections intraveineuses ou des prélèvements sanguins (Figure 1C). Pour les injections intrapéritonéales, la région abdominale caudale peut être atteinte en plaçant le tunnel en biais (Figure 1D) et en maintenant la queue de l'animal à sa base, tout en exerçant une légère pression sur la région sacrée, ce qui fléchit la partie postérieure de la souris vers le haut (Figure 1C). Cette méthode est moins stressante tant pour les souris que pour les expérimentateurs, car elle ne nécessite aucune contention manuelle.

Une étude précédente a montré que l'utilisation du tunnel pour les injections intrapéritonéales réduit durablement les niveaux de stress et améliore le bien-être des souris, même dans les modèles expérimentaux nécessitant des injections intrapéritonéales fréquentes8. Dans cette étude, le tunnel a également été testé avec succès pour les injections intraveineuses et les prélèvements sanguins à partir de la veine de la queue chez des souris mâles et femelles.

Protocole

Toutes les procédures décrites dans ce protocole ont été examinées et approuvées par l'autorité locale compétente (Office d'État de la santé et des affaires sociales de Berlin (LAGeSo) ; numéro d'approbation 2022-077-G) et ont été réalisées conformément aux lignes directrices ARRIVE 2.0. Tous les matériaux utilisés dans cette étude sont énumérés dans le Tableau des matériaux.

1. Administration intraveineuse

REMARQUE : Cette méthode décrit une approche de contention manuelle respectueuse du bien-être animal pour l'administration intraveineuse chez la souris. Les injections intraveineuses doivent être réalisées uniquement par du personnel formé, conformément aux directives institutionnelles ainsi qu'aux procédures établies en matière de sécurité et d'hygiène.

  1. Préparation des animaux
    ATTENTION : Portez toujours les équipements de protection individuelle (EPI) nécessaires conformément aux exigences de biosécurité et d'hygiène de l'établissement (par exemple, blouses, gants, bonnets, masques) lors de la manipulation des animaux.
    1. Placer la cage d'habitat sous une lampe rouge pendant 10 à 15 minutes afin de favoriser la vasodilatation et d'améliorer la visibilité des veines de la queue.
  2. Préparation de la zone de travail
    1. Nettoyer le tunnel d'application avec de l'éthanol à 70 %. Laisser l'éthanol s'évaporer complètement pendant environ 5 minutes.
    2. Placer à l'intérieur du tunnel un morceau roulé de garnissage lavé et autoclavé (découper un Vetbed Isobed à la taille requise) (Figure 1B).
    3. À l’aide des doigts, comprimer doucement le garnissage à l’entrée du tunnel jusqu’à ce que l’ouverture restante mesure environ la largeur de deux doigts adjacents. Ne pas comprimer davantage le garnissage.
    4. Positionner le tunnel d'application sur la surface de travail et placer un morceau supplémentaire de garnissage plat devant l'entrée du tunnel.
    5. Préparer la seringue d'injection équipée d'une aiguille de 27G contenant la solution d'injection souhaitée, puis la placer à côté du tunnel. S'assurer que des compresses et un spray désinfectant sont facilement accessibles.
  3. Immobilisation axée sur le bien-être dans un tunnel
    1. Transférer la souris depuis sa cage d'habitat à l'aide d'un tube de manipulation.
    2. Laisser la souris pénétrer volontairement dans le tunnel d'application en positionnant le tunnel de manipulation directement devant l'ouverture du tunnel (Figure 1C).
      REMARQUE : Certaines souris préfèrent d'abord monter sur le garnissage placé devant le tunnel d'application avant d'entrer volontairement dans le tunnel. On peut empêcher les souris d'aller trop loin à l'intérieur du tunnel en tenant délicatement la base de la queue.
    3. Une fois à l'intérieur, la souris reste généralement positionnée dans le garnissage roulé sans faire demi-tour.
      REMARQUE : Si les souris n'entrent pas dans le tunnel, l'ouverture pourrait être trop petite ; comprimer légèrement le garnissage à l'entrée du tunnel. Si les souris sont trop petites et ont tendance à faire demi-tour, resserrer davantage le garnissage roulé ou ajouter une couche supplémentaire (Figure 1B).
  4. Injection intraveineuse
    REMARQUE : L'injection intraveineuse est réalisée selon des procédures conventionnelles bien établies d'injection dans la veine de la queue.
    1. Redresser doucement la queue en tenant la pointe, puis désinfecter le site d'injection prévu. Tourner la queue d'environ 90° pour positionner les veines latérales de la queue en position dorsale.
    2. Commencer l'injection à l'extrémité distale de la queue afin de permettre des tentatives supplémentaires sur des sites plus proximaux, si nécessaire.
      ÉTAPE CRITIQUE : Insérer l'aiguille selon un angle d'environ 15 à 20° par rapport à la queue, en gardant l'aiguille presque parallèle à celle-ci. Avancer l'aiguille légèrement au-delà du biseau, car les veines de la queue sont superficielles. Un positionnement correct de l'aiguille se manifeste par une résistance minimale pendant l'injection et par un écoulement visible de la solution injectée à travers la veine. Injecter le volume souhaité à un débit lent et régulier (≤5 mL/kg sur 13 s). Après le retrait de l'aiguille, appliquer une pression douce sur le site d'injection avec une compresse stérile pour éviter tout saignement.
      ATTENTION : Jeter immédiatement les aiguilles et seringues usagées dans des conteneurs résistants aux perforations et aux fuites. Ne jamais tenter de recouvrir les aiguilles afin d'éviter les piqûres accidentelles.
  5. Relâchement et renforcement positif
    1. Replacer le tunnel contenant la souris dans la cage d'habitat et permettre à l'animal de sortir volontairement par l'extrémité opposée du tunnel (Figure 1C).
    2. Donner des friandises dans la cage d'habitat pour favoriser le renforcement positif et l'habituation à la procédure.
  6. Nettoyage et entretien
    1. Retirer le garnissage intérieur du tunnel d'application. Nettoyer le tunnel d'application avec de l'éthanol à 70 %.
    2. Si le garnissage reste propre, il peut être réutilisé pour des expériences ultérieures. S’il est contaminé ou visiblement sale, le laver et l’autoclaver avant réutilisation.
      REMARQUE : Utiliser un garnissage par groupe expérimental. Remplacer le garnissage entre différentes expériences, entre animaux mâles et femelles, et chaque fois que requis par les directives institutionnelles d’hygiène.

2. Administration intrapéritonéale

REMARQUE : Cette méthode décrit une approche de contention manuelle respectueuse du bien-être animal pour l'administration intrapéritonéale chez la souris. Les injections intrapéritonéales doivent être réalisées uniquement par du personnel formé, en conformité avec les directives institutionnelles et selon des procédures établies en matière de sécurité et d'hygiène. Pour faciliter un meilleur accès à la zone d'injection, un tunnel d'application est utilisé en combinaison avec une plateforme inclinée (cunéiforme), qui élève la partie postérieure des souris vers le haut.

  1. Préparation de la zone de travail
    1. Nettoyer le tunnel d'application et le coin avec de l'éthanol à 70 %. Laisser l'éthanol s'évaporer complètement pendant environ 5 minutes.
    2. Placer un morceau roulé de revêtement lavé et autoclavé (découper un Vetbed Isobed à la taille requise) à l'intérieur du tunnel (Figure 1B).
    3. À l’aide des doigts, comprimer doucement le revêtement à l’entrée du tunnel jusqu’à ce que l’ouverture restante mesure environ la largeur de deux doigts adjacents. Ne pas comprimer davantage le revêtement.
    4. Positionner le tunnel d'application sur le dessus du coin (Figure 1D) sur la surface de travail et placer un revêtement plat supplémentaire devant l'entrée du tunnel.
    5. Préparer la seringue d'injection équipée d'une aiguille de 27G contenant la solution d'injection souhaitée et la placer à côté du tunnel.
  2. Immobilisation axée sur le bien-être dans un tunnel
    ATTENTION : Porter toujours les équipements de protection individuelle (EPI) nécessaires conformément aux exigences de biosécurité et d'hygiène de l'établissement (par exemple, blouses, gants, bonnets, masques) lorsqu'on travaille avec des animaux.
    1. Transférer la souris depuis sa cage d'origine à l'aide d'un tube de manipulation. Permettre à la souris d'entrer volontairement dans le tunnel d'application en plaçant le tunnel de manipulation directement devant l'ouverture du tunnel (Figure 1C).
      REMARQUE : Certaines souris préfèrent d'abord monter sur le revêtement placé devant le tunnel d'application avant d'entrer volontairement dans le tunnel. Dans ce cas, laisser la souris entrer dans le tunnel avant de placer celui-ci sur le coin.
    2. Une fois à l'intérieur, maintenir délicatement la base de la queue entre le pouce et l'index pour empêcher la souris d'aller trop loin dans le tunnel. La souris reste généralement positionnée dans le revêtement roulé sans faire demi-tour.
      REMARQUE : Si les souris n'entrent pas dans le tunnel, l'ouverture peut être trop petite ; comprimer légèrement le revêtement à l'entrée du tunnel. Si les souris sont trop petites et ont tendance à faire demi-tour, resserrer davantage le revêtement roulé ou ajouter une couche supplémentaire (Figure 1B).
  3. Injection intrapéritonéale
    1. Tenir la base de la queue entre le pouce et l'index d'une main (Figure 1C). Appliquer une pression douce sur la région sacrée à l'aide du majeur de la même main et tourner légèrement la queue vers le haut. Cela stabilise l'animal et permet un accès clair à la région abdominale caudale.
    2. ÉTAPE CRITIQUE : Réaliser l'injection en tenant la seringue parallèlement à la surface de travail et en l'insérant dans la région abdominale caudale clairement visible.
    3. Après l'injection, relâcher doucement la pression et lâcher la queue.
      ATTENTION : Jeter immédiatement les aiguilles et seringues usagées dans des conteneurs étanches aux perforations et résistants aux fuites. Ne pas tenter de recouvrir les seringues afin d'éviter les piqûres par aiguille.
  4. Relâcher et renforcement positif
    1. Replacer le tunnel contenant la souris dans la cage d'origine et permettre à l'animal de sortir volontairement par l'extrémité opposée du tunnel (Figure 1C).
    2. Donner des friandises dans la cage d'origine pour favoriser le renforcement positif et l'habituement à la procédure.
  5. Nettoyage et entretien
    1. Retirer le revêtement intérieur du tunnel d'application. Nettoyer le tunnel d'application et le coin avec de l'éthanol à 70 %.
    2. Si le revêtement reste propre, il peut être réutilisé pour des expériences ultérieures. S’il est contaminé ou visiblement sale, le laver et l'autoclaver avant réutilisation.
      REMARQUE : Utiliser un revêtement par groupe expérimental. Remplacer le revêtement entre différentes expériences, entre animaux mâles et femelles, et chaque fois que requis par les directives d'hygiène de l'établissement.

3. Prélèvement sanguin à partir de la veine caudale

REMARQUE : Cette méthode décrit une approche de contention manuelle respectueuse du bien-être animal pour le prélèvement sanguin à partir de la veine caudale chez la souris. Toutes les procédures doivent être effectuées par du personnel formé, en conformité avec les directives institutionnelles ainsi qu'avec les protocoles établis en matière de sécurité et d'hygiène.

  1. Préparation de la zone de travail
    1. Nettoyer le tunnel d'application avec de l'éthanol à 70 %. Laisser l'éthanol s'évaporer complètement pendant environ 5 minutes.
    2. Placer un morceau roulé de revêtement lavé et autoclavé (découper un Vetbed Isobed à la taille requise) à l'intérieur du tunnel (Figure 1B).
    3. À l’aide des doigts, comprimer doucement le revêtement à l’entrée du tunnel jusqu’à ce que l’ouverture restante mesure environ la largeur de deux doigts adjacents. Ne pas comprimer davantage le revêtement.
    4. Positionner le tunnel d'application sur la surface de travail et placer un revêtement plat supplémentaire devant l'entrée du tunnel.
    5. S'assurer que les lancettes, les microtubes de prélèvement sanguin, les compresses et le spray désinfectant sont facilement accessibles.
  2. Maîtrise respectueuse du bien-être dans un tunnel
    ATTENTION : Porter toujours les équipements de protection individuelle (EPI) requis conformément aux exigences de biosécurité et d'hygiène de l'établissement (par exemple, blouses, gants, bonnets, masques) lorsqu'on travaille avec des animaux.
    1. Transférer la souris depuis sa cage d'origine à l'aide d'un tube de manipulation. Permettre à la souris d'entrer volontairement dans le tunnel d'application en plaçant le tube de manipulation directement devant l'ouverture du tunnel (Figure 1C).
      REMARQUE : Certaines souris préfèrent d'abord monter sur le revêtement placé devant le tunnel d'application avant d'y entrer volontairement. On peut empêcher les souris d'aller trop profondément dans le tunnel en tenant doucement la base de la queue.
    2. Une fois à l'intérieur, la souris reste généralement positionnée dans le revêtement roulé sans faire demi-tour.
      REMARQUE : Si les souris n'entrent pas dans le tunnel, l'ouverture pourrait être trop petite ; comprimer légèrement le revêtement à l'entrée du tunnel. Si les souris sont trop petites et ont tendance à faire demi-tour, resserrer le revêtement roulé ou ajouter une couche supplémentaire (Figure 1B).
  3. Prélèvement sanguin
    1. Redresser doucement la queue en tenant la pointe, puis désinfecter le site de prélèvement prévu. Tourner la queue d’environ 90° pour positionner les veines latérales de la queue en position dorsale.
    2. ÉTAPE CRITIQUE : Perforer la veine latérale à l’aide d’une lancette. Recueillir les gouttes de sang à l’aide d’un microtube ou d’une pipette capillaire.
      ATTENTION : Jeter immédiatement les lancettes usagées dans des conteneurs résistants aux perforations et étanches aux liquides. Ne jamais tenter de recouvrir les lancettes afin d’éviter les piqûres par objet tranchant.
    3. Après le prélèvement, appliquer une pression douce sur le site de ponction avec une compresse stérile pour contrôler l’hémorragie.
  4. Relâchement et renforcement positif
    1. Replacer le tunnel contenant la souris dans la cage d'origine et permettre à l'animal de sortir volontairement par l'extrémité opposée du tunnel (Figure 1C).
    2. Donner des friandises dans la cage d'origine pour favoriser le renforcement positif et l'habituation à la procédure.
  5. Nettoyage et entretien
    1. Retirer le revêtement intérieur du tunnel d'application. Nettoyer le tunnel d'application avec de l'éthanol à 70 %.
    2. Si le revêtement reste propre, il peut être réutilisé pour des expériences ultérieures. S’il est contaminé ou visiblement sale, le laver et l’autoclaver avant réutilisation.
      REMARQUE : Utiliser un revêtement par groupe expérimental. Remplacer le revêtement entre différentes expériences, entre animaux mâles et femelles, et chaque fois que requis par les directives d’hygiène de l’établissement.

Résultats

Pour évaluer l'influence de la nouvelle technique de contention sur le bien-être des souris, des prélèvements sanguins à partir de la veine de la queue et des injections intraveineuses ont été réalisés selon le protocole décrit. Des souris mâles et femelles de type sauvage C57BL/6 ont subi les procédures soit dans le tunnel d'application, soit dans un dispositif de contention conventionnel, puis ont été examinées pour détecter des signes de douleur et de stress. L'échelle douloureuse faciale chez la souris (MGS) a été utilisée pour déterminer le niveau de stress des animaux après le prélèvement sanguin à partir de la veine de la queue. Le MGS est un système d'évaluation largement utilisé, qui analyse l'expression des muscles faciaux en réaction à une douleur ou à des procédures stressantes9,10. Pour déterminer les scores, des photographies ont été prises immédiatement après avoir relâché les souris du dispositif de contention ou du tunnel (des images représentatives sont présentées dans Figure 2). Deux observateurs expérimentés dans l'évaluation du comportement des souris ont analysé trois paramètres d'expression faciale (représentés sur des schémas dans Figure 2C) : le resserrement orbital (fermeture de la paupière et rétrécissement de la zone orbitaire ; une ride peut être visible autour de l'œil), le bombement du nez (renflement au niveau de l'arête du nez et rides verticales sur les côtés du nez peuvent apparaître) et la position des oreilles (les oreilles tournent vers l'extérieur et/ou vers l'arrière, s'éloignant du visage, et peuvent se plier pour former une forme « pointue » ; l'espace entre les oreilles augmente). La position des vibrisses et le bombement des joues n'ont pas été évalués car la couleur foncée du pelage des souris rendait une évaluation fiable difficile. Chaque paramètre a été noté selon une échelle à trois points allant de 0 à 2 (0 = absent, 1 = modérément présent, 2 = clairement présent), et les trois paramètres faciaux ont été moyennés pour obtenir un score MGS moyen par animal. Afin d'assurer la fiabilité, chaque animal a été noté indépendamment et en aveugle par les deux observateurs, puis les deux scores MGS ont été moyennés pour produire un score MGS final pour chaque animal. Les souris femelles et mâles ont montré une réduction significative du score MGS lorsque le prélèvement sanguin a été effectué dans le tunnel d'application par rapport au dispositif de contention conventionnel (Figure 2A–B).

Un groupe distinct de souris a reçu une injection intraveineuse de 100 µL de chlorure de sodium (NaCl) à 0,9 %, et les vocalisations audibles ainsi que les tentatives de faire demi-tour dans le dispositif de contention ont été enregistrées. Les souris émettent des cris audibles en signe de détresse sévère, notamment lorsqu'elles ressentent de la douleur ou de la peur, et pendant un comportement défensif11,12,13. En outre, les souris réagissent naturellement à la contention physique par une panique entraînant une réponse d'évasion visant à fuir l'espace confiné. Par conséquent, les tentatives de faire un demi-tour de 180 degrés dans le dispositif de contention ont été considérées comme des signes de peur. Chez les souris femelles comme mâles, une fréquence plus élevée de vocalisations audibles et de tentatives de faire demi-tour a été observée lorsque les injections intraveineuses étaient réalisées à l'intérieur d'un dispositif de contention par rapport au tunnel d'application (Figure 3).

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Figure 1 : Tunnel d'application novateur. (A) Images représentatives illustrant la différence de taille entre un dispositif de contention classique et le tunnel d'application novateur. (B) La doublure intérieure du tunnel est constituée d'un morceau de tapis Vetbed roulé, découpé sur mesure, offrant un environnement doux, souple et sombre. Si les souris sont trop petites et ont tendance à faire demi-tour, la doublure roulée peut être resserrée afin de réduire l'espace disponible. (C) Différentes étapes de manipulation dans le tunnel d'application, incluant l'entrée et la sortie, la fixation en toute sécurité et confort, ainsi que l'accès à l'abdomen et à la queue. (D) Un cales supplémentaire permettant d'effectuer des injections intrapéritonéales à l'intérieur du tunnel. La cale augmente l'angle du tunnel par rapport à l'expérimentateur, facilitant ainsi l'accès à la région abdominale. Veuillez cliquer ici pour visualiser une version agrandie de cette figure.

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Figure 2 : Échelle de grimace chez la souris après prélèvement sanguin par la veine de la queue. Des souris mâles ou femelles ont subi un prélèvement sanguin soit à l’intérieur d’un tunnel d’application, soit à l’aide d’un dispositif de contention conventionnel. Des photographies destinées à évaluer l’échelle de grimace ont été prises immédiatement après que les animaux aient quitté le dispositif de contention ou le tunnel, puis ont été notées indépendamment par deux expérimentateurs expérimentés, aveugles à l’affectation des groupes des souris, qui ont évalué le resserrement orbital, le bombement du nez et la position des oreilles. Une note moyenne a été calculée pour chaque animal à partir des deux notes. (A) Souris femelles (tunnel n = 5 ; dispositif de contention n = 8). (B) Souris mâles (tunnel n = 11 ; dispositif de contention n = 11). Ce graphique a été adapté de Schlutt et al., 2026, PLOS ONE. Les données originales, publiées sous forme de graphique à barres selon une licence CC BY 4.0, ont été modifiées et représentées ici sous forme de boîtes à moustaches. (C) Illustration schématique des unités d’action faciales générées à partir d’une consigne textuelle élaborée par les auteurs à l’aide de ChatGPT Image 2 (OpenAI ; disponible sur https://chatgpt.com/) ; l’image finale a été revue et approuvée par les auteurs quant à son exactitude scientifique. Les données sont présentées sous forme de boîtes à moustaches (minimum à maximum) ; la ligne indique la moyenne. Test de Mann-Whitney, valeurs de p < 0,05 considérées comme significatives. Veuillez cliquer ici pour visualiser une version agrandie de cette figure.

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Figure 3 : Vocalisations audibles et tentatives de demi-tour après injection intraveineuse. Des souris mâles ou femelles ont reçu une injection intraveineuse de 100 µL de NaCl à 0,9 % soit dans le tunnel d'application, soit dans un dispositif de contention classique. Les épisodes de vocalisation audible et les tentatives de demi-tour à l'intérieur du dispositif de contention ont été enregistrés pendant la procédure (oui/non). Tous les groupes, n = 10. Les données sont présentées sous forme de graphiques en barres empilées représentant des tableaux de contingence. Le test exact de Fisher a été utilisé ; les valeurs de p < 0,05 ont été considérées comme significatives. Veuillez cliquer ici pour visualiser une version agrandie de cette figure.

Figure supplémentaire 1 : Injection intrapéritonéale chez le rat à l’aide d’une version agrandie du tunnel d’application. Un tunnel d’application de 15 cm de diamètre a été utilisé pour l’injection intrapéritonéale chez le rat. La procédure a été réalisée selon le même protocole que celui décrit pour les souris. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.

Discussion

Cette technique de contention a été mise au point pour l'administration de substances et le prélèvement sanguin, afin d'encourager une approche conforme aux meilleures pratiques en matière de bien-être animal. Certaines communautés scientifiques restent encore réticentes à adopter des méthodes de manipulation et de contention améliorées qui s'écartent des procédures standardisées de longue date, notamment lorsqu'elles exigent un temps et un effort supplémentaires. Toutefois, réduire le stress chez les animaux de laboratoire n'est pas seulement souhaitable d'un point de vue éthique, mais contribue également de manière significative au succès expérimental en diminuant la variabilité des données, en limitant les modifications physiologiques induites par le stress et en réduisant les échecs et les abandons d'animaux. Ce protocole décrit une méthode facile à mettre en œuvre qui améliore considérablement le bien-être animal tout en assurant une contention sécurisée et un accès mains libres pour des procédures d'application et de prélèvement sûres.

Une étape cruciale du protocole consiste à garantir une entrée réussie et une position stable à l'intérieur du tunnel d'application. Pour l'entrée volontaire, deux approches possibles sont recommandées : soit une entrée directe depuis le tube de transfert vers le tunnel, soit le placement préalable des souris depuis le tube de transfert sur le revêtement souple pré-positionné, à partir duquel elles peuvent pénétrer dans le tunnel. L'approche optimale dépend du comportement des animaux, et les deux méthodes doivent être évaluées. La variante préférée est celle dans laquelle les souris entrent le plus rapidement et avec le moins de réticence. Si les souris hésitent à entrer dans le tunnel, plusieurs facteurs doivent être pris en compte : (1) l'ouverture d'entrée peut être trop étroite ; dans ce cas, le revêtement peut être légèrement comprimé pour agrandir l'ouverture ; (2) les indices olfactifs provenant du revêtement intérieur peuvent influencer l'acceptation ; par conséquent, les revêtements devraient idéalement conserver une odeur familière de cage, tout en assurant la séparation entre les groupes expérimentaux, les cages et les sexes, et en remplaçant les matériaux souillés afin d'éviter des odeurs interférentes ; (3) il a été démontré que les souris se sentent plus en sécurité sur des surfaces dont la couleur est similaire à celle de leur pelage14, donc adapter la couleur du revêtement à celle du pelage des animaux pourrait être bénéfique ; et (4) orienter l'ouverture du tunnel vers le mur de la cage peut encourager l'entrée, car les souris peuvent encore voir leur cage d'origine et leurs congénères. Une limitation potentielle du tunnel d'application est qu'il repose sur l'entrée volontaire de l'animal, ce qui pourrait être perçu comme introduisant un court délai avant le traitement ou l'échantillonnage. Toutefois, dans cette étude, les souris sont entrées rapidement et de manière constante dans le tunnel, généralement en 2 à 10 secondes, permettant ainsi de réaliser les procédures dans une fenêtre temporelle étroite et reproductible. Bien que cette approche puisse nécessiter un peu plus de temps que la contention classique par la nuque, l'augmentation modeste de la durée de manipulation doit être pesée contre l'amélioration substantielle du bien-être animal obtenue grâce à la réduction du stress lié à la manipulation. De plus, l'insertion dans des dispositifs de contention classiques est également associée à une durée de manipulation, car les souris résistent fréquemment au placement, ce qui n'entraîne aucune différence significative. Dans moins de 5 % des cas, les souris n'entraient pas volontairement dans le tunnel. Bien que les mesures décrites ci-dessus aient généralement suffi à encourager l'entrée, les animaux pouvaient également être doucement aidés à pénétrer dans le tunnel si nécessaire. Même dans ces cas, le revêtement intérieur souple offre un avantage en matière de bien-être par rapport aux dispositifs de contention classiques.

Une fois à l'intérieur du tunnel, les souris peuvent s'agripper fermement à la doublure interne. Cela est très favorable du point de vue du bien-être animal, car il a été démontré que les souris maintenues présentent des niveaux de stress plus faibles lorsqu'elles peuvent s'agripper à une surface pendant la manipulation4. Parallèlement, l'expérimentateur peut tenir fermement la base de la queue sans que la souris tente de se retourner. Il est essentiel que la doublure interne entoure étroitement l'animal. Si les souris sont trop petites et ont tendance à pivoter à l'intérieur du tunnel, des ajustements rapides peuvent être effectués en resserrant la doublure roulée ou en ajoutant une couche supplémentaire. Pour les expériences impliquant des animaux de tailles différentes (par exemple, en raison de l'âge, du sexe ou du régime alimentaire), des tunnels de diamètres variables peuvent également être utilisés (voir les modèles d'impression8).

Les injections et les prélèvements sanguins doivent toujours être effectués par du personnel formé. Néanmoins, le tunnel d'application s'est révélé efficace tant pour le personnel très expérimenté que pour les utilisateurs moins expérimentés. En particulier, le personnel peu expérimenté a signalé moins de tentatives infructueuses, réduisant ainsi les manipulations répétées et les procédures prolongées. Les utilisateurs ont également indiqué se sentir plus à l'aise et en sécurité lorsqu'ils immobilisaient les souris dans le tunnel, par comparaison avec l'apprentissage des techniques classiques de contention manuelle. Cela représente un avantage considérable pour les laboratoires connaissant un roulement fréquent du personnel, car la méthode est facile à adopter et bénéficie à la fois aux animaux et à l'expérimentateur. Ces observations sont en accord avec les améliorations précédemment rapportées en matière de confort de manipulation et de confiance des techniciens associées à des techniques de manipulation raffinées telles que la manipulation par tunnel ou par cup15.

Il est important de noter que la méthode décrite ici est efficace même chez des souris non entraînées, et tous les résultats présentés ont été obtenus avec des animaux n'ayant pas subi d'habituation préalable. Des études antérieures ont montré que l'habituation et la formation médicale des animaux peuvent réduire les réponses au stress chez la souris en les familiarisant avec les procédures prévues16,17. Un protocole d'entraînement intégrant l'utilisation du tunnel pourrait donc réduire davantage les niveaux de stress, en particulier lorsque des interventions fréquentes sont nécessaires, ce qui pourrait sinon induire des associations négatives avec le tunnel. Un tel programme d'entraînement a déjà été appliqué avec succès dans une étude précédente, nous permettant d'utiliser le tunnel pour des injections intrapéritonéales répétées sur plusieurs semaines8. En particulier dans les études nécessitant des injections répétées, le tunnel peut représenter une amélioration majeure. Des techniques de manipulation améliorées utilisant des tubes de transfert et une contention réduite ont démontré qu'elles maintiennent des effets positifs même après des contenions par la nuque répétées ou des injections intrapéritonéales, notamment une volonté accrue d'interagir avec les manipulateurs et une diminution des comportements analogues à l'anxiété dans les tests comportementaux standards18,19. De même, des injections répétées effectuées à l'intérieur du tunnel n'ont pas augmenté les paramètres liés au stress chez la souris8.

En effet, il a été démontré que les récompenses alimentaires facilitent l'habituation par renforcement positif, un principe bien établi dans la formation animale. Par conséquent, il est recommandé d'offrir une petite friandise à la fin de chaque séance de manipulation comme récompense. Lors des tests avec le tunnel, de très petites quantités, comme un seul grain d'avoine, se sont révélées suffisantes et sont peu susceptibles d'interférer avec l'alimentation normale des animaux. Si la prise alimentaire constitue un enjeu, par exemple dans les études métaboliques, des friandises aromatisées compatibles avec des régimes spécialisés (par exemple, les régimes cétogènes) sont également disponibles. Il est important de considérer que les friandises doivent être perçues comme une mesure complémentaire d'affinement améliorant l'habituation, et non comme une condition préalable indispensable à l'utilisation réussie du tunnel d'application. Une fois habituées au système, les souris entrent volontairement à plusieurs reprises dans le tunnel d'application sans recevoir de récompense alimentaire.

La méthode décrite ici présente certaines limites quant à l'accès à des régions corporelles spécifiques. Bien que la queue puisse être facilement et sûrement utilisée pour des injections intraveineuses et des prélèvements sanguins, et que la région abdominale caudale convienne aux injections intrapéritonéales, l'accès aux régions latérales du corps pour des applications sous-cutanées est limité. L'administration orale doit également être envisagée avec précaution. La gavage oral classique n'est pas compatible avec ce système, car l'extension nécessaire du cou ne peut être obtenue. Toutefois, des méthodes d'administration orale plus raffinées, dans lesquelles les souris consomment volontairement des substances au bout d'une pipette (par exemple, mélangées à du lait concentré)20, pourraient être réalisables par le côté ouvert du tunnel. Dans de tels cas, il est essentiel de s'assurer que la tête reste clairement visible et que la souris ne soit pas positionnée trop profondément à l'intérieur du revêtement ou du tunnel afin de confirmer l'ingestion complète de la substance.

Par rapport aux tunnels de contention existants, le tunnel d'application décrit ici présente des avantages évidents pour le bien-être animal. Bien que la contention soit souvent nécessaire pour des procédures d'application et de prélèvement sécuritaires, elle est également reconnue comme l'un des facteurs de stress les plus importants que les rongeurs subissent durant les procédures expérimentales7,21,22. Des études antérieures ont déjà démontré que le remplacement de la manipulation par la queue et de la contention traditionnelle par des méthodes améliorées, telles que la manipulation par tunnel ou en coupe, améliore significativement le bien-être animal. Les souris manipulées selon ces approches raffinées montrent une anxiété moindre et une plus grande disposition à interagir avec les manipulateurs comparées aux souris saisies par la queue23,24. L'utilisation du tunnel d'application, que les souris pénètrent volontairement, constitue une extension cohérente de la manipulation par tunnel. L'échelle des grimaces des souris sortant du tunnel d'application indique que les animaux ne ressentent pas de sensation de contention ou d'emprisonnement. Bien que la méthode d'injection intrapéritonéale, où les souris s'agrippent à la grille de la cage, ressemble à la prise décrite soulevant la région pelvienne5, la première repose sur la tentative de fuite des animaux. Sur une grille, les souris s'agrippent avec leurs pattes et tirent vers l'avant, s'éloignant de la prise du manipulateur, ce qui entraîne une contention et donc un malaise. De plus, ce type de contention augmente le tonus musculaire abdominal, favorisant ainsi la douleur provoquée par la piqûre de l'aiguille. En revanche, le tunnel d'application représente une méthode de contention raffinée, et les résultats indiquent une réduction des paramètres associés au stress, notamment des scores de grimaces plus faibles, moins de vocalisations audibles et une disposition maintenue à interagir avec les manipulateurs811,12,13. Bien que les vocalisations ultrasonores (USVs) soient de plus en plus reconnues comme des signaux de communication éthologiquement pertinents, leur utilisation comme marqueurs de stress chez les souris adultes reste en cours d'investigation, car les USVs sont fortement dépendantes du contexte et apparaissent également lors de comportements physiologiques normaux25.

Néanmoins, des preuves récentes suggèrent que l'enregistrement des USV pourrait représenter une approche prometteuse, non invasive et reproductible pour évaluer les réponses comportementales à la contention26. L'incorporation d'enregistrements d'USV dans des études futures pourrait donc fournir une mesure objective supplémentaire afin de mieux caractériser le stress et les réponses émotionnelles. Pris ensemble, ces résultats indiquent que le tunnel d'application permet une procédure de contention plus sûre et moins stressante pour les applications et prélèvements de routine, comparée aux contenants conventionnels. De manière importante, contrairement aux contenants acryliques transparents, la doublure intérieure souple permet aux souris d'adhérer fermement à la surface, ce qui est considéré comme une amélioration essentielle du bien-être selon les recommandations du NC3Rs27. Un nombre nettement inférieur de tentatives de demi-tour a été observé à l'intérieur du tunnel, améliorant ainsi à la fois le bien-être et la sécurité lors de la manipulation. Dans les contenants plastiques conventionnels, les tentatives de demi-tour sont souvent associées à l'urination, et le pelage mouillé qui en résulte compromet davantage le confort. Ce problème a été largement éliminé avec le tunnel d'application.

Les applications potentielles de cette méthode sont vastes. Notamment, la méthode de contention améliorée n'est pas limitée aux souris, mais peut également être appliquée aux rats en utilisant un tunnel de diamètre plus grand (Supplementary Figure 1). Les rongeurs constituent l'espèce animale de laboratoire la plus utilisée dans toutes les disciplines scientifiques, et la contention pour l'administration de substances et le prélèvement d'échantillons est une procédure courante dans de nombreux laboratoires. Toutefois, il a été démontré que le stress induit par la contention nuit non seulement au bien-être animal, mais influence également de manière significative les résultats scientifiques, notamment les réponses comportementales28,29 et les mécanismes physiologiques tels que la fonction immunitaire30. Par conséquent, réduire la variabilité liée au stress est essentiel tant pour la validité scientifique que pour les considérations éthiques en matière d'expérimentation animale. En diminuant le stress associé à la contention tout en assurant une manipulation sûre et pratique, le tunnel d'application pourrait améliorer considérablement la qualité et la reproductibilité des expériences, tout en renforçant simultanément le bien-être animal.

Déclarations de divulgation

A.S., J.K.U. et L.H. sont titulaires d'un modèle d'utilité pour le tunnel d'injection en Allemagne (numéro d'enregistrement 20 2024 100 448). Tous les autres auteurs déclarent ne pas avoir de conflits d'intérêts.

Remerciements

Nous remercions le personnel de l'établissement animalier de la Charité et les responsables du bien-être animal, en particulier le Dr. André Dülsner, pour leur soutien ; Charité 3R pour le soutien financier destiné à diffuser le tunnel d'application ; ainsi que tous les membres du groupe de travail Charité 3R sur l'amélioration des pratiques pour leurs discussions utiles.

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
Lancettes stériles pour test d'allergieHeinz Herenz Medizinalbedarf GmbH, Hamburg, Allemagne1110106
Tunnel d'application avec coin optionnelTunnel imprimé en 3D en internemodèles d'impression disponibles sur https://osf.io/vsjnb.
Tubes de prélèvement sanguin : Microvette 100 EDTA K3E, 100 µL SARSTEDT AG & Co. KG, Nümbrecht, Allemagne20.1278.100
Tube de manipulation transparentDatesand Group, Stockport, Royaume-UniGZCHTUBE-100taille : 50 x 3 x 100 mm
Éthanol, ≥70 %Carl Roth GmbH + Co. KG, Karlsruhe, AllemagneT913.1
Seringue monodose fine Inject-F, 1 mL B.Braun Deutschland GmbH & Co. KG, Melsungen, Allemagne9166017V
AvoineSchapfen Mühle GmbH Co.KG, Ulm, AllemagneW100197autoclavée
Lampe infrarouge Sanitas SIL 06Beurer Europe GmbH, Ulm, Allemagne61424
Garniture intérieure souple : Original Vetbed Isobed SLVetbed Deutschland, Mudersbach, Allemagne1999981à découper aux dimensions requises
Spray désinfectant Softasept ISO 70 %B.Braun Deutschland GmbH & Co. KG, Melsungen, Allemagne19905
Aiguilles hypodermiques stériles à usage unique Sterican 27 G x ¾B.Braun Deutschland GmbH & Co. KG, Melsungen, Allemagne4657705Btaille : 0,40 mm x 20 mm
Compresse : applicateurs médicaux FIWA appFink & Walter GmbH, Merchweiler, Allemagne329012

Références

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