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Une méthode basée sur l'impédance en temps réel et sans marquage pour le criblage antiviral à haut débit

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DOI :

10.3791/72539

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3 septembre 2026

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1Vanderbilt Center for Antibody Therapeutics, Vanderbilt University Medical Center, 2Agilent Technologies, Inc., 11011 N Torry Pines, 3Department of Pathology, Microbiology and Immunology, 4Department of Pediatrics, Vanderbilt University Medical Center

Dans cet article

Résumé

L'approche d'analyse cellulaire en temps réel (RTCA) basée sur l'impédance permet une quantification en temps réel et sans marquage des effets cytopathogènes induits par les virus, offrant une méthode rapide pour évaluer les composés antiviraux et les anticorps monoclonaux grâce à un flux de travail d'essai intégré et piloté par logiciel.

Résumé

Les technologies basées sur l'impédance offrent un moyen robuste et objectif de quantifier les effets cytopathogènes (CPE) dans les monocouches cellulaires en culture, permettant de surmonter les limites des dosages traditionnels effectués à un point final ou reposant sur des observations subjectives. Les virus cytolytiques induisent généralement des changements morphologiques marqués et la mort cellulaire dans les cultures infectées, ce qui fait des mesures d'impédance — reflétant les modifications de l'adhérence, de la morphologie et de la viabilité cellulaires — un indicateur sensible et dynamique de l'infection virale et de sa progression. En conséquence, les mesures fondées sur l'impédance constituent une approche puissante et efficace pour évaluer les effets protecteurs des interventions antivirales. Cette étude présente une plateforme de criblage en temps réel et sans marquage, qui exploite des systèmes avancés de mesure de l'impédance afin de surveiller de façon continue les CPE induits par les virus. Cette approche permet une évaluation rapide et quantitative de l'efficacité antivirale, tant pour les médicaments de petite taille que pour les anticorps monoclonaux, sans nécessiter d'étapes supplémentaires de marquage ou de coloration. Le protocole décrit intégralement le déroulement du test, de l'ensemencement cellulaire et de l'infection virale jusqu'à l'acquisition et l'analyse des données. De plus, le logiciel intégré au système, spécifiquement conçu pour les applications en virologie, simplifie le traitement et l'interprétation des données, facilitant ainsi la détermination du pouvoir neutralisant des anticorps monoclonaux et de l'activité des composés antiviraux.

Introduction

Face à la menace d'une épidémie virale, les vaccins et les traitements antiviraux constituent les principales stratégies pour limiter la transmission virale et traiter les patients infectés1. Les vaccins préviennent l'infection en préparant le système immunitaire à reconnaître les agents pathogènes et offrent une protection proactive et à long terme. Les traitements antiviraux ont diverses utilisations selon la modalité et la conception du médicament. Comme les vaccins, les anticorps monoclonaux peuvent assurer une protection proactive et durable (semaines à plusieurs mois) et peuvent également être utilisés comme outil de contrôle post-exposition. À la fois les anticorps monoclonaux et les traitements antiviraux de petite molécule sont utilisés pour traiter les infections installées en ciblant directement ou en inhibant des composants viraux, réduisant ainsi la gravité de la maladie et servant d'intervention réactive à court terme.

L'approche conventionnelle pour évaluer fonctionnellement l'activité antivirale dans les systèmes biologiques est le test de neutralisation par réduction du virus (VRNT), qui quantifie la diminution de la formation de plaques dans les tests de neutralisation par réduction de plaques (PRNT), de foyers via immunomarquage dans le test de neutralisation par réduction de foyers (FRNT), ou des effets cytopathogènes (CPE) à l'aide de tests basés sur la viabilité cellulaire. Le PRNT est considéré comme la méthode phénotypique de référence pour déterminer l'activité inhibitrice d'agents antiviraux contre un large éventail d'infections virales2. Toutefois, le PRNT est long et laborieux, et l'interprétation des résultats peut être subjective, notamment en cas de surcroissance ou de fusion des plaques pendant une incubation prolongée. L'objectivité des lectures de test peut être améliorée grâce au FRNT, qui repose sur la détection d'antigènes spécifiques du virus ou de l'expression d'un gène rapporteur. Cette approche peut toutefois être limitée par la disponibilité et les performances d'anticorps de haute qualité ou d'enzymes de détection. Plusieurs réactifs et protocoles de test sont bien établis et largement utilisés pour l'évaluation de la viabilité cellulaire, mesurant certains aspects des CPE. La réduction enzymatique du sel colorimétrique mono-tétrazolium MTT (bromure de 3-(4,5-diméthylthiazol-2-yl)-2,5-diphényl-2H-tétrazolium) par les déshydrogénases mitochondriales des cellules vivantes produit un signal colorimétrique quantifiable dû au produit formazan coloré. Le réactif de test de viabilité (qui lyse les cellules et libère l'ATP intracellulaire, activant une réaction catalysée par la luciférase qui convertit le substrat luciférine en oxyluciférine) constitue un test homogène luminescent. De tels tests de viabilité cellulaire peuvent être utilisés pour quantifier la diminution des CPE lors du criblage d'agents antiviraux3. Toutefois, ces méthodes nécessitent également plusieurs étapes de lavage et de coloration et, comme les tests PRNT et FRNT, sont des tests en point final. Par conséquent, des agents antiviraux partiellement efficaces dont l'effet sur l'infection virale est retardé peuvent être négligés si le test antiviral est arrêté à un moment sous-optimal. Il existe donc un besoin important d'un test automatisé, à débit moyen ou élevé, permettant une surveillance en temps réel des réponses cellulaires aux infections virales.

Les systèmes d'analyse cellulaire en temps réel (RTCA) permettent une surveillance continue du développement des effets cytopathogènes (CPE) et des réponses antivirales dans des modèles cellulaires perméables, grâce à une détection sans étiquette et non invasive basée sur l'impédance. Les CPE induits par les virus comprennent non seulement la mort cellulaire, mais aussi des altérations de la morphologie et de l'adhésion cellulaires, toutes deux détectables de façon sensible par des variations de l'impédance électrique4,5. Ces mesures d'impédance sont obtenues à l'aide de capteurs microélectrodes en or intégrés dans une plaque spéciale de culture cellulaire à 96 puits, permettant une évaluation quantitative des réponses cellulaires dynamiques sans nécessiter l'utilisation d'étiquettes ou d'expression de gènes rapporteurs. La technologie RTCA a été largement utilisée pour la détection des CPE dans divers modèles cellulaires infectés par des virus appartenant à plusieurs familles, ainsi que pour l'évaluation de l'activité neutralisante des anticorps6–10.

Voici les étapes critiques de cette méthode d'impédance en temps réel et sans marquage in vitro les tests antiviraux ont été définis. Cette approche s'appuie sur des études antérieures portant sur le criblage de composés antiviraux dans des cellules HEK293A infectées par l'adénovirus 5 et sur l'évaluation d'anticorps neutralisants à l'aide d'un virus de la stomatite vésiculaire recombinant réplicatif exprimant la glycoprotéine de Lassa (rVSV-LASV(Lin IV)) dans des cellules Vero CCL-8111. Toutes ces expériences ont été réalisées sur un système RTCA MP, qui permet d'effectuer jusqu'à 6× des plaques de 96 puits simultanément. L'objectif de ce travail était d'établir une base pour le criblage antiviral fondé sur l'impédance. La méthode peut être facilement étendue à un large éventail de modèles virus-cellules une fois que les conditions optimales de dosage auront été définies à l'aide du protocole décrit ici.

Protocole

Les réactifs et l'équipement utilisés sont listés dans le Tableau des matériaux.

1. Culture cellulaire permissif et repiquage

REMARQUE : Dans ce protocole, les cellules Vero CCL-81 sont utilisées pour la neutralisation par anticorps, tandis que les cellules HEK293A sont utilisées pour le criblage de composés antiviraux. Afin de réduire les variations entre les expériences, il est fortement recommandé de constituer une banque de cellules perméables au même passage pour le test.

  1. Préchauffer le milieu de culture cellulaire — le milieu de Eagle modifié de Dulbecco (DMEM) complété avec 10 % de sérum bovin fœtal (SBF) et 1 % de pénicilline–streptomycine — dans un 37°C bain-marie avant utilisation.
  2. Décongeler un flacon de cellules perméables cryoconservées dans un 37°C bain-marie jusqu'à ce qu'il ne reste qu'un petit cristal de glace ; ne pas plonger le bouchon dans le bain-marie. 
  3. Placer le flacon contenant les cellules revivifiées dans la cabine de sécurité biologique (CSB) après avoir essuyé l'extérieur avec de l'éthanol à 70 %.
  4. Transférez délicatement les cellules dans un nouveau tube conique de 50 mL et ajoutez goutte à goutte 9 mL de milieu de croissance préchauffé aux cellules. Mélangez doucement.
  5. Centrifuger la suspension cellulaire à 200 × g pendant 5 min à température ambiante (TA).
  6. Transférez les cellules en suspension dans 5 mL de milieu de croissance préchauffé vers un nouveau flacon T-25.
  7. Faire croître les cellules jusqu'à une confluence de 80 % à 90 % dans un 37°C incubateur avec 5 % de CO₂2 avant la prochaine sous-culture cellulaire. 
  8. Passez les cellules.
    1. Aspirer le milieu et laver doucement la monocouche cellulaire deux fois avec 3 mL de 1× phosphate-buffered saline (PBS) sans calcium ni magnésium pour éliminer le milieu de croissance résiduel
    2. Ajouter 2 mL de trypsine-EDTA 0,25 % dans le flacon pour recouvrir les cellules.
    3. Après 2 à 5 min d'incubation à 37°C, neutraliser la trypsine en ajoutant un volume égal à 5 fois celui de milieu de croissance préchauffé.
    4. Resuspendre les cellules en pipettant doucement la suspension cellulaire de haut en bas contre la paroi du flacon.
    5. Ensemencer les cellules à la densité d'ensemencement souhaitée ou selon le ratio de fractionnement avec du milieu frais. 
      REMARQUE : La densité de semis cellulaire souhaitée est déterminée empiriquement en fonction de la vitesse de croissance des cellules, de la fréquence des passages et de la confluence cible au moment du passage. Par exemple, semer les cellules Vero CCL-81 à un minimum de 0,4 × 104 cellules/cm2 permet de repiquer les cellules tous les 3 jours avant qu'elles n'atteignent une confluence de 90 %.

2. Dépistage d'agents antiviraux

REMARQUE : Figure 1 illustre le déroulement du test de dépistage antiviral basé sur l'impédance. Brièvement, des cellules perméables sont ensemencées dans des microplaques de 96 puits intégrant des microélectrodes, et la performance cellulaire est surveillée pendant environ 24 h avant le test. Pour les tests de neutralisation par anticorps, les virus à une multiplicité d'infection (MOI) fixe sont mélangés avec des anticorps et préincubés pendant 1 h avant d'être ajoutés aux cellules. En revanche, pour le dépistage de composés antiviraux, les virus à un MOI fixe et les composés sont ajoutés simultanément aux cellules. Le CPE induit par le virus est surveillé en continu à l'aide de lectures basées sur l'impédance, et l'analyse des données peut être effectuée soit pendant le test, soit après son achèvement.

  1. Jour 0 : Mesurer le fond de la plaque et semer les cellules perméables
    1. Pour commencer une expérience, ouvrez le logiciel de l'appareil (RTCA Pro) et sélectionnez le berceau souhaité pour le test. Ensuite, choisissez le Virologie module avant de commencer l'expérience.
    2. Saisissez toutes les notes pertinentes dans le Notes expérimentales onglet (par ex., Nom de l'expérience, Numéro de série du dispositif, Type d'appareil, ou d'autres détails pertinents). Ces champs sont facultatifs et peuvent être laissés vides s'ils ne s'appliquent pas.
    3. Accéder à la Mise en page onglet et définir les puits utilisés dans l'expérience. Si certains puits ne doivent pas être utilisés, sélectionner les puits inutilisés, cliquer avec le bouton droit dans l'interface de disposition de la plaque, puis choisir Désactiver le(s) puits du menu déroulant pour les exclure du test.
    4. Mesure du bruit de fond de la microplaque de 96 puits intégrant des microélectrodes
      1. Distribuer 50 µL du milieu de dosage dans chaque puits de la plaque à l'aide d'une pipette multicanal en mode pipetage inverse pour minimiser la formation de bulles.
        REMARQUE : Le choix du milieu d'essai doit être optimisé avant le criblage afin de minimiser les interférences avec la sensibilité de l'essai et de garantir une évaluation précise de l'efficacité du traitement. Par exemple, les essais de neutralisation par des anticorps ont été réalisés dans un milieu DMEM contenant 2 % de SFB et 1 % de pénicilline-streptomycine, tandis que les essais de criblage de composés antiviraux ont utilisé le milieu de croissance cellulaire, c'est-à-dire le DMEM contenant 10 % de SFB et 1 % de pénicilline-streptomycine.
      2. Placer la plaque dans le berceau de l'appareil situé à l'intérieur d'un 37 °C incubateur avec 5 % de CO₂2Veillez à ce que la plaque soit correctement orientée, avec le puits A1 positionné comme indiqué. Ensuite, vérifiez l'onglet Message pour repérer d'éventuelles notifications d'erreur.
        REMARQUE : À chaque fois que la plaque est placée dans le berceau, vérifier que le message « Plaque scannée. Connexions correctes » s'affiche. En cas d'erreur, retirer la plaque et la repositionner dans le berceau.
      3. Accéder à la Programme onglet ; l'étape 1 apparaît par défaut, car elle est requise pour la mesure du fond de la plaque. Cliquez sur le Démarrer bouton pour lancer l'enregistrement à partir des puits. L'étape se termine automatiquement après l'acquisition d'une seule mesure d'impédance de fond.
        REMARQUE : Cette étape préalable doit être effectuée avant chaque expérience. Tous les puits utilisés dans l'expérience doivent contenir uniquement le milieu de dosage (c'est-à-dire avant la mise en culture des cellules).
    5. Ensemencement permissif de cellules sur la plaque de 96 puits intégrant des microélectrodes
      1. Faire trypsiner les cellules perméables dans le flacon T25 en suivant les étapes décrites dans la section de passage des cellules perméables.
      2. Compter les cellules remises en suspension dans le milieu d'essai et effectuer les calculs suivants :
        1. Calculer le nombre total de cellules viables dans la suspension à l'aide de la densité de cellules viables : Nombre total de cellules viables = densité de cellules viables × volume de la suspension
        2. Ajuster la suspension cellulaire à une densité finale (par exemple, 0,30–0,35) × 106 cellules/mL pour Vero CCL-81, équivalent à environ 15 000–18 000 cellules par 50 µL, ou 0,12 × 106 cellules/mL pour HEK293A, équivalent à 6 000 cellules par 50 µL).
          REMARQUE : Ces densités de semis ont été précédemment déterminées comme optimales pour chaque modèle virus-cellule. Une densité de semis cellulaire appropriée est essentielle, car l'utilisation de trop nombreuses ou trop peu de cellules pourrait affecter la sensibilité du test.
      3. Retirer la microplaque contenant 50 µL du milieu de dosage à partir de l'appareil et transférez-le dans l'enceinte stérile pour l'ensemencement cellulaire.
      4. Distribuer 50 µL de la suspension cellulaire dans chaque puits de la plaque à l'aide d'une pipette multicanal en mode de pipetage inverse pour minimiser la formation de bulles, portant ainsi le volume final de chaque puits à 100 µL.
    6. Après l'ajout des cellules, laisser la plaque en enceinte de sécurité biologique à température ambiante pendant 30 minutes afin de permettre une répartition uniforme des cellules au fond de chaque puits.
    7. Replacer la plaque dans le berceau de l'appareil situé à l'intérieur d'un 37 °C incubateur avec 5 % de CO₂2.
      REMARQUE : Si plusieurs plaques sont utilisées, étiquetez chaque plaque clairement et assurez-vous de la replacer dans le même berceau que celui utilisé lors de la mesure du fond.
    8. Accédez à la Mise en page onglet et ouvrez le Cellule sous-onglet. Sélectionner les puits appropriés, saisir la cellule perméable Nom et Nombre, puis cliquez sur Appliquer pour enregistrer les informations. Les données cellulaires peuvent également être saisies ou mises à jour à tout moment pendant l'expérience.
    9. Ajouter l'étape 2 sur le Programme onglet en utilisant les paramètres d'enregistrement par défaut (100 balayages et un intervalle de 15 minutes), puis cliquez sur Démarrer afin d'initier une surveillance continue pendant la nuit de l'attachement et de la prolifération cellulaires.
      REMARQUE : Cette étape constitue une mesure de contrôle qualité (CQ) des cellules avant l'inoculation virale. Étant donné que l'indice cellulaire (IC) reflète l'attachement et la prolifération cellulaires, les valeurs d'IC obtenues au cours de la période de 18 à 24 heures suivant le semis sont utilisées comme critère principal de CQ. Un comportement cellulaire reproductible entre les expériences est essentiel pour assurer une reproductibilité optimale du test. Il convient de noter que l'amplitude de l'IC ainsi que les profils cinétiques sont spécifiques au type cellulaire. Par exemple, après une culture nocturne, des cellules Vero CCL-81 saines semées à raison de 18 000 cellules par puits présentent généralement un indice cellulaire compris entre 6 et 8, tandis que des cellules HEK293A saines semées à raison de 6 000 cellules par puits affichent en général un indice cellulaire compris entre 0,8 et 1,2.
  2. Jour 1 : Dépistage d'agents antiviraux par mesure de l'impédance
    REMARQUE : Avant d'effectuer le test de criblage, le virus doit être correctement titré afin de déterminer la dilution optimale de travail. Cette étape permet d'établir une concentration virale qui assure une performance robuste et reproductible du test, tout en répondant aux exigences définies par l'utilisateur, telles que la durée souhaitée du test. Par exemple, dans le protocole de neutralisation par anticorps11, une multiplicité d'infection (MOI) de 0,01 a été choisie pour le dosage de neutralisation, car elle produisait un effet cytopathogène complet (100 %) dans les 40 heures suivant l'inoculation. Dans le dosage fondé sur l'impédance, un effet cytopathogène complet est indiqué par une réduction de l'indice cellulaire ou de l'indice cellulaire normalisé à zéro. Lors du criblage de composés antiviraux, une MOI de 1 a été utilisée, et un effet cytopathogène de 100 % a été observé dans les 70 heures suivant l'inoculation. Le protocole de titrage viral a suivi les procédures établies décrites dans un rapport antérieur12. Si des virus infectieux sont utilisés dans le test, veiller à respecter toutes les précautions de sécurité applicables. Se référer à la section sur les consignes de sécurité pour la manipulation des virus infectieux.
    1. Préparez le virus à la concentration prédéterminée et effectuez des dilutions en série de l'anticorps ou du composé antiviral dans le milieu d'essai.
    2. Pour les dosages de neutralisation par anticorps monoclonaux, mélanger 60 µL de virus à 4× la concentration finale dans le test avec 60 µL d'anticorps à 4× la concentration finale dans le test et incuber à 37 °C pendant 1 h avant l'ajout aux cellules perméables. Après mélange, le virus et l'anticorps sont présents à 2× leurs concentrations finales dans le test. En revanche, aucune préincubation virus-composé n'est requise pour les tests de criblage de composés antiviraux.
    3. Accéder à la Disposition onglet et sélectionnez le Traitement sous-onglet pour saisir les informations sur le traitement par des agents antiviraux dans les puits appropriés.
    4. Sélectionnez les puits correspondant au même traitement, puis saisissez les Nom des agents et indiquer le départ Dilution ou Concentration. Par exemple, si la concentration initiale est 10 µg/mL, entrer 10 et sélectionner µg/mL comme le «Unité». Entrer 3 comme le Facteur de dilution et préciser le Direction de dilution (par exemple, du haut vers le bas).
      REMARQUE : Après avoir cliqué sur Appliquer, les concentrations ou dilutions des agents antiviraux seront automatiquement calculées et enregistrées en fonction de la disposition des puits saisie, puis affichées dans les puits correspondants. Les valeurs calculées sont également sauvegardées pour des analyses ultérieures des données. Saisie des informations sur le virus (par exemple, Nom et Dilution) est facultatif, car le test utilise un MOI fixe unique pour tous les puits traités au virus.
    5. Attribuer les puits traités uniquement au virus comme témoins positifs en sélectionnant les puits appropriés et en choisissant Témoin positif sous Type de puits.
    6. Attribuer aux puits non infectés le rôle de témoins négatifs en suivant l'étape décrite ci-dessus et en vérifiant Témoin négatif sous Type de puits.
      REMARQUE : L'attribution correcte des puits contenant uniquement le virus et des puits non infectés en tant que Témoin positif et Contrôle négatif, respectivement, en utilisant le Type de puits le réglage est essentiel, car les valeurs CI provenant de ces puits sont utilisées dans tous les calculs liés à la neutralisation (par exemple, % de neutralisation). Pour les calculs liés au CPE (par exemple, %CPE), des puits témoins négatifs explicitement désignés sont requis. Dans les dosages de neutralisation par anticorps, il est fortement recommandé d'inclure sur la même plaque des anticorps témoins positifs et négatifs afin d'assurer une interprétation précise des données. Toutefois, ces anticorps témoins doivent être désignés comme Échantillons sous Type de puits.
    7. Lorsque le test est prêt pour l'ajout de l'agent antiviral, appuyez sur le Abandonner l'étape en cours bouton pour ignorer les balayages restants à l'étape 2 et passer à l'étape suivante.
    8. Cliquez sur le Déverrouiller la plaque bouton, puis retirez la plaque du berceau et placez-la dans l'enceinte de sécurité biologique.
    9. Distribuez délicatement 100 µL du mélange virus–anticorps ou du mélange virus–composé antiviral dans chaque puits à l’aide d’une pipette multicanal, afin d’obtenir un volume final par puits de 200 µL. L'inoculum contient le virus et l'anticorps ou le composé antiviral à 2× leurs concentrations finales dans le test, qui sont diluées à la concentration working finale lors de l'ajout aux cellules.
    10. Après avoir remis la plaque dans le berceau, accédez à la Programme onglet et ajouter l'étape 3. Spécifier le nombre de Balayages et le Intervallel entre les balayages. Veiller à ce que la durée totale du balayage (nombre de balayages × intervalle) dépasse la durée de traitement prévue. Cliquez sur Démarrer reprendre l'acquisition des données et poursuivre le test.
      REMARQUE : L'attribution d'une étape distincte (par exemple, Étape 3) après l'ajout de l'agent antiviral facilite l'identification claire de la période de suivi post-traitement. Programmer systématiquement chaque étape (sauf l'Étape 1) pour qu'elle dure plus longtemps que la durée prévue du test. Si la durée de fonctionnement programmée est atteinte, l'appareil cessera d'acquérir des mesures, ce qui entraînera une perte de points de données.
  3. Jour 1 et au-delà : Analyse des données
    1. Pour consulter l'enregistrement en temps réel et/ou l'analyse des réponses cellulaires pendant l'acquisition des données, accédez à l'onglet Analyse des données onglet, sélectionnez un point temporel ou un intervalle de temps spécifique, puis sélectionnez et ajoutez les puits à inclure dans l'analyse pour affichage sur le graphique.
    2. Sélectionner les paramètres parmi les axe des ordonnées menu déroulant. Lorsque Indice cellulaire normalisé (INS) est sélectionné, préciser le Temps de normalisation, le point temporel immédiatement avant le traitement, dans la liste déroulante de temps. %CPE ou %Neutralisation peut également être affiché en sélectionnant l'option correspondante dans le menu déroulant de l'axe Y.
      REMARQUE : L'appareil utilise un paramètre sans unité, l'indice cellulaire (IC), pour représenter l'impédance. L'indice cellulaire normalisé (ICN) est recommandé pour évaluer les différences liées au traitement tout en minimisant l'impact de la variabilité intrinsèque entre puits.
    3. Accédez au Paramètre section sur le Analyse des données onglet permettant de calculer et de générer différents types de graphiques, tels qu'un histogramme et des courbes de régression dose-réponse logistiques à quatre paramètres (4PL, pente variable) à un point temporel précis (par exemple, au point médian ou au point final du test). En alternative, la CI₅₀ dérivé de la surface sous la courbe (AUC) de l'indice cellulaire ou de l'indice cellulaire normalisé après traitement, fournit une mesure de la réponse globale dose-dépendante des agents antiviraux tout au long de la période de traitement.
    4. À la fin du test, cliquez sur Pause, puis appuyez sur le Déverrouiller la plaque bouton. Retirer la plaque du berceau et électroniquement Libération il via le Plaque menu.

3. Consignes de sécurité pour la manipulation de virus infectieux

  1. Portez des EPI appropriés, y compris une double paire de gants, une protection faciale et une blouse de laboratoire. Cette pratique est fortement recommandée lors de la manipulation de virus.
  2. Manipulez les matériaux contenant des virus et ajoutez-les aux plaques exclusivement à l’intérieur d’une hotte de sécurité biologique en fonctionnement.
  3. Transportez les flacons de virus et toutes les plaques contenant des virus vers et depuis la hotte à l’aide d’un récipient hermétique de biosécurité.
  4. Avant et après la manipulation de matériaux contenant des virus dans la hotte, vaporisez soigneusement toutes les surfaces intérieures avec un désinfectant et laissez agir pendant 5 minutes afin d’assurer une inactivation complète des virus. Nettoyez ensuite les surfaces en les essuyant, puis désinfectez-les avec de l’éthanol à 70 % pour éliminer tout résidu de désinfectant.
  5. À la fin du test de dépistage antiviral basé sur l’impédance, retirez toutes les plaques de l’appareil et transportez-les dans un récipient hermétique de biosécurité directement vers une hotte propre.
  6. Préparez une solution fraîche d’eau de Javel à 20 % et ajoutez-la dans chaque puits des plaques de test. Laissez agir pendant 10 minutes avant d’aspirer le contenu de tous les puits et de jeter les plaques.
  7. Décontaminez toutes les plaques de test, les pipettes serologiques, les embouts de pipette, les tubes et autres plastiques jetables ayant pu entrer en contact avec le virus à l’aide d’eau de Javel, puis jetez-les dans des sacs désignés pour les déchets biologiques dangereux.
  8. Vaporisez les plastiques non jetables, tels que les porte-tubes et les pipettes, avec un désinfectant et essuyez-les.

Résultats

Lecture en continu, sans marquage, par impédancemétrie en temps réel révélant les effets cytopathogènes viraux et la protection antivirale
Comme illustré dans la figure 2A, les cellules hôtes HEK293A ont été ensemencées dans une plaque de 96 puits intégrant des microélectrodes, à une densité de 6 000 cellules par puits13. Après une incubation de 24 h, l'adénovirus de type 5 a été ajouté à un MOI de 1, en présence ou en l'absence de composés antiviraux. Les réponses cellulaires à l'infection virale et au traitement antiviral ont été surveillées en continu par des mesures d'impédance en temps réel et sans marquage. En l'absence de virus, les cellules se sont multipliées de manière continue pendant la période de suivi de 80 h, atteignant la confluence, comme en témoigne l'augmentation régulière de l'impédance suivie d'un plateau. L'infection par l'adénovirus a permis initialement une croissance cellulaire d'environ 20 h, après quoi un effet cytopathogène marqué a été observé, entraînant une chute rapide du signal d'impédance jusqu'au niveau de base vers environ 65 h post-infection. Le traitement par la stavudine (50 µM) ou la ribavirine (20 µM) a eu un impact minime sur l'effet cytopathogène induit par le virus, les courbes d'impédance étant très proches de celles des cellules infectées uniquement par le virus. La ganciclovir (50 µM) a montré une activité antivirale modeste, traduite par une récupération partielle de l'indice cellulaire normalisé. En revanche, la cidofovir (50 µM) et la brincidofovir (1 µM) ont fortement atténué l'effet cytopathogène, produisant des profils d'impédance comparables à ceux observés dans les cellules contrôles négatives non infectées. À noter que, dans des études préliminaires, aucun des composés n'a significativement affecté l'indice cellulaire par rapport aux contrôles traités au véhicule, aux concentrations testées (données non montrées).

Dans un dosage d'immunoneutralisation basé sur l'impédance, des cellules Vero CCL-81 ont été ensemencées à une densité de 18 000 cellules par puits dans une plaque de 96 puits intégrant des microélectrodes et cultivées pendant 24 h avant l'infection. Le jour du dosage, des anticorps monoclonaux ont été préincubés avec le rVSV–LASV à un MOI de 0,01 pendant 1 h avant leur ajout aux cellules. Des profils de neutralisation distincts ont été observés parmi les anticorps monoclonaux testés (AcM). À des fins de clarté, la figure 2B présente des résultats représentatifs d'anticorps présentant une activité neutralisante forte, partielle ou nulle. Les anticorps non neutralisants ont induit une CPE complète, les courbes d'impédance se superposant à celles des témoins virus seul. Les anticorps présentant une activité neutralisante intermédiaire ont partiellement réduit la cytotoxicité induite par le virus, entraînant une CPE atténuée mais détectable. En revanche, les anticorps entièrement neutralisants ont complètement inhibé la CPE, en maintenant des signaux d'impédance comparables à ceux des témoins de cellules non infectées. Dans leur ensemble, ces profils d'impédance ont permis de distinguer clairement les anticorps monoclonaux non neutralisants, partiellement neutralisants et entièrement neutralisants.

Quantification et caractérisation de l'activité antivirale
Après avoir démontré la capacité du test RTCA basé sur l'impédance à identifier des « hits » parmi une bibliothèque de médicaments et d'AcM, l'étude s'est ensuite attachée à caractériser l'efficacité des composés et des anticorps principaux. L'augmentation progressive de la concentration du médicament antiviral brincidofovir, de 15,6 nM à 1 000 nM, entraîne une augmentation progressive du signal d'impédance ; plus la concentration du médicament est élevée, plus le comportement des cellules se rapproche de celui du témoin non infecté (Figure 3A). De plus, le traitement au brincidofovir seul a entraîné une légère augmentation de l'ICN uniquement à la concentration la plus élevée testée (1100 nM). Toutefois, à des concentrations inférieures à 1100 nM, l'ICN a modérément diminué, bien que cet effet ne soit pas dépendant de la dose. Ce résultat indique que le rétablissement de l'indice cellulaire est uniquement attribuable à l'activité antivirale du médicament, et non à un effet direct d'amélioration de la prolifération ou de l'attachement cellulaire (Figure 3B). Le tracé de la surface sous la courbe de l'indice cellulaire normalisé (AUC) en fonction de la concentration de brincidofovir fournit la courbe dose-réponse, qui présente un excellent ajustement (R2 de 0,99) et indique une CI50 de 265 nM (Figure 3C). Dans le test de neutralisation par anticorps, à la fin du test (environ 50 h après le traitement), le logiciel du système a automatiquement calculé les pourcentages de neutralisation à chaque concentration d'AcM, et les valeurs de CI50 ont ensuite été déterminées. Comme le montre la Figure 3D, contrairement à l'anticorps témoin négatif rANDV-5, les trois autres AcM, r37.2D, r25.1C et r12.1F, ont démontré une forte puissance antivirale, avec des valeurs de CI₅₀ de 4 315 ng/mL, 83 ng/mL et 232 ng/mL, respectivement14,15.

figure-results-1
Figure 1 : Schéma du flux de travail pour le test de dépistage antiviral fondé sur l'impédance. Jour 0, Étape 1 : les cellules perméables ont été ensemencées dans des microplaques, et la croissance cellulaire a été surveillée à l’aide du berceau de l’appareil placé dans une étuve à 37 °C avec 5 % de CO2, pendant environ 24 heures. Jour 1, Étape 2 : le virus a été préparé à une MOI fixe, ainsi que des dilutions sérielles d'agents antiviraux. Pour les tests de neutralisation par anticorps, le virus a été préincubé avec les anticorps à 37 °C pendant 1 heure avant d'ajouter le mélange aux cellules. Étape 3 : les mélanges virus-agent antiviral ont été ajoutés aux cellules. Jour 1 et suivants, Étape 4 : l'effet cytopathogène induit par le virus a été surveillé en continu par des mesures fondées sur l'impédance pendant plusieurs jours. Étape 5 : les données ont été analysées en temps réel ou après la fin du test. Veuillez cliquer ici pour visualiser une version agrandie de cette figure.

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Figure 2 : Surveillance en temps réel de l'activité antivirale par mesure de l'indice cellulaire basée sur l'impédance. (A) Évaluation du criblage de médicaments antiviraux par analyse d'impédance. Tous les composés ont été testés à 50 µM, sauf la ribavirine (20 µM) et le brincidofovir (1 µM), en présence d'adénovirus de type 5 à un MOI de 1. Les données sont présentées sous forme de moyenne ± écart-type provenant de trois puits réplicats. La figure est adaptée de Zhang et al.13. (B) Essai de neutralisation d'anticorps monoclonaux basé sur l'impédance. Des profils représentatifs d'indice cellulaire sont montrés pour des anticorps monoclonaux présentant aucune neutralisation (CPE complète, rouge), une neutralisation partielle (CPE partielle, orange) ou une neutralisation puissante (aucune CPE détectable, noir). Veuillez cliquer ici pour visualiser une version agrandie de cette figure.

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Figure 3 : Quantification de l'activité antivirale à l'aide de l'impédance. (A) Évolution dynamique de l'indice cellulaire normalisé en temps réel après traitement par des concentrations croissantes de brincidofovir en combinaison avec une infection par l'adénovirus de type 5 à un MOI de 1. (B) Évolution dynamique de l'indice cellulaire normalisé en temps réel après traitement par des concentrations croissantes de brincidofovir seul. (C) La surface sous les courbes d'impédance a été tracée en fonction de la concentration de brincidofovir afin d'obtenir une courbe dose-réponse. (A) et (C) sont adaptées de Zhang et al.13. (D) Courbes représentatives de neutralisation du rVSV–LASV lignée IV (Josiah) pour les anticorps monoclonaux r37.2D, r25.1C, r12.1F et rANDV-5 inclus comme contrôle négatif. Les anticorps monoclonaux 37.2D, 25.1C, 12.1F et ANDV-5 ont été produits de façon recombinante selon la littérature existante (voir la section Résultats). Les données présentées sont des courbes représentatives issues de deux expériences indépendantes et sont exprimées comme la moyenne ± écart-type provenant de trois puits en réplication. Veuillez cliquer ici pour consulter une version agrandie de cette figure.

Discussion

Comme tous les tests basés sur des cellules, le test de dépistage antiviral RTCA nécessite une optimisation pour chaque système virus-cellule. Étant donné que ce test détecte les effets cytopathogènes induits par le virus par des changements d'impédance, il dépend d'un modèle cellulaire perméable qui permet la réplication virale et l'apparition d'effets cytopathogènes mesurables. Les virus qui ne produisent pas d'effets cytopathogènes détectables par impédance peuvent ne pas convenir à cette approche ; dans de tels cas, des méthodes alternatives telles que le FRNT peuvent être utilisées lorsque des anticorps spécifiques au virus sont disponibles. Une autre considération importante est que les variations de l'indice cellulaire ne sont pas exclusivement causées par la cytolyse induite par le virus. Des modifications de la morphologie cellulaire, de l'adhésion, de la prolifération et de l'attachement peuvent également influencer les signaux d'impédance et potentiellement fausser l'évaluation de l'activité antivirale. Par conséquent, les effets des agents antiviraux sur l'indice cellulaire doivent être évalués lors d'études préliminaires ou au moyen de contrôles appropriés contenant uniquement l'agent. Dans la présente étude, afin de maximiser le nombre d'agents évalués par plaque, les contrôles contenant uniquement l'agent antiviral ont été testés avant le test de dépistage afin d'établir les effets de base de chaque candidat en l'absence d'infection virale. Les performances du test sont également influencées par des facteurs tels que la densité d'ensemencement des cellules, le moment de l'inoculation virale et les conditions du milieu, qui peuvent affecter la croissance cellulaire, la réplication virale, le développement des effets cytopathogènes et la reproductibilité du test7,10,16. Par conséquent, une optimisation systématique est essentielle pour un dépistage antiviral fiable et robuste fondé sur la RTCA.

Une fois les conditions optimales de dosage établies, la mise en œuvre réussie de dosages antiviraux en temps réel basés sur l'impédance exige un ensemencement cellulaire reproductible, des cellules en bonne santé et des conditions de dosage stables. Une forte variabilité entre puits est souvent due à une répartition inégale des cellules ou à un pipetage inexact ; par conséquent, les suspensions cellulaires doivent être soigneusement homogénéisées avant l'ensemencement, et les plaques doivent être laissées à température ambiante pendant 30 min après l'ensemencement afin de favoriser un dépôt uniforme des cellules et de réduire les effets de bord. Un minimum de trois réplicats par traitement est recommandé, tandis que des réplicats supplémentaires pour les contrôles négatifs (non infectés) et positifs (virus uniquement) sont fortement conseillés, car ces valeurs servent de points de référence pour les calculs de % de CPE et de % de neutralisation dans toutes les conditions de traitement. Si le CPE induit par le virus est faible ou irrégulier, vérifiez la qualité de la souche virale et l'état de santé de la lignée cellulaire perméable. Pour préserver l'infectiosité virale, évitez les cycles répétés de congélation-décongélation en préparant des aliquots de virus à usage unique pour chaque expérience. Enfin, l'utilisation d'une banque cellulaire contenant des cellules perméables à un nombre de passages constant est fortement recommandée afin de minimiser la variabilité expérimentale et d'améliorer la reproductibilité du dosage. Si l'indice cellulaire mesuré juste avant l'infection (généralement environ 24 h après l'ensemencement) est inférieur au seuil établi pour la lignée cellulaire perméable, ce qui indique une santé ou une croissance cellulaire sous-optimale, l'expérience doit être interrompue. Dans de tels cas, un nouveau flacon de cellules cryopréservées doit être décongelé et le dosage de criblage antiviral doit être répété.

Lorsque le test de criblage antiviral est effectué dans des conditions rigoureusement contrôlées et optimisées, comme le montrent les données de criblage présentées ici, le test fondé sur l'impédance permet de quantifier avec précision en temps réel la réduction du CPE induite par les agents antiviraux. Contrairement aux approches traditionnelles qui reposent sur des mesures ponctuelles laborieuses, la détection continue et non invasive de l'impédance permet un suivi longitudinal de l'ensemble du spectre des lésions cellulaires induites par le virus ainsi que des profils cinétiques des réponses antivirales. Cette capacité de mesure en temps réel facilite l'identification des fenêtres temporelles optimales pour détecter non seulement les effets antiviraux précoces, mais aussi ceux à action retardée, que pourraient manquer les tests conventionnels à point final.

En outre, le protocole RTCA décrit ici offre un flux de travail plus rapide et considérablement simplifié pour le criblage antiviral par rapport aux méthodes traditionnelles. Le test nécessite uniquement une étape initiale de semis cellulaire suivie de l'ajout de virus en présence ou en l'absence d'agents antiviraux. Aucune manipulation supplémentaire ni traitement post-test n'est requis. La configuration expérimentale et l'analyse des données sont encore simplifiées par le module logiciel spécialisé en virologie du système, qui permet le calcul automatisé de paramètres couramment utilisés dans les tests de neutralisation des virus (VRNT), notamment le % de CPE, le % de neutralisation, ainsi que la dilution la plus élevée ou la concentration la plus faible d'un agent antiviral permettant d'atteindre un niveau de neutralisation défini par l'utilisateur. Dans leur ensemble, ces avantages permettent un criblage rapide et parallèle d'un nombre beaucoup plus élevé de conditions expérimentales (comparaisons de médicaments, dilutions étendues, etc.) que ce qui est généralement possible avec les méthodes traditionnelles.

Bien que le test décrit ici ait été mis au point dans un format de plaque de 96 puits, avec les conditions de test décrites ci-dessus, il peut être adapté à un format de plaque de 384 puits. Pour soutenir ce test à débit plus élevé basé sur l'impédance, un système automatisé de RTCA basé sur l'impédance peut être utilisé, permettant le traitement simultané de jusqu'à quatre plaques de 384 puits.

Outre le dépistage antiviral, cette méthode RTCA peut être appliquée à des études de thérapie combinée, à la sérologie et à l'analyse de l'échappement immunitaire viral. En mesurant la capacité des anticorps thérapeutiques ou des séra immuns à prévenir les effets cytopathogènes induits par le virus, ce test permet une évaluation sans marqueur et en temps réel de l'activité neutralisante et des réponses immunitaires protectrices après une infection ou une vaccination. En outre, la comparaison des profils de neutralisation entre différents variants viraux peut révéler des modifications de la sensibilité associées à l'échappement immunitaire. Associée au séquençage génomique, cette approche pourrait faciliter l'identification de variants résistants aux anticorps et soutenir le développement de vaccins, d'anticorps thérapeutiques et de stratégies antivirales de nouvelle génération.

Déclarations de divulgation

J.E.C. a été consultant pour Moderna et Merck, est fondateur d'IDBiologics et perçoit des redevances de UpToDate. Le laboratoire de J.E.C. a reçu des accords de recherche sponsorisée non liés d'IDBiologics pendant la conduite de l'étude.

Remerciements

Ce travail a été soutenu en partie par les subventions U19 AI181979 et U19AI181930 provenant de l'Institut national des allergies et des maladies infectieuses (NIAID) des Instituts nationaux de la santé des États-Unis.

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
Adénovirus-GFPVector Biolabs 1060
Brincidofovir (CMX001)AdooQA13326
CaviCideMetrex13-5024désinfectant 
CidofovirSelleck S1516
Milieu de Dulbecco modifié (DMEM)ATCC30-2002
Plaque E-Plate 96Agilent5232368001plaque de 96 puits intégrée à des microélectrodes
Sérum bovin fœtalAvantor97068-085
Ganciclovir Sodium Selleck S5065
Cellule HEK293AThermo Fisher Scientific  R70507
Viaflo multicanalINTEGRAVIAFLO 96
Solution de pénicilline-streptomycineGibco10378016
Solution tampon phosphate (1x)HyCloneSH30256.01
AcM recombinantsCrowe LabN/A
RibavirineSelleck S2504
rVSV-LASV (Lin IV)Crowe LabN/A
Stavudine Selleck S1398
Tripsine 0,25 %, EDTA 0,53 mM  (1x)ATCC30-2101
Réservoirs réactifs 12 canauxVistaLab Technologies3054-1011
Vero CCL-81ATCCCCL-81
Module virologieAgilentS2807-90089
Système xCELLigence RTCA MPAgilent380601040

Références

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