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Rapport rapide
Cette étude suggère que le diméthylsulfoxyde (DMSO) pourrait atténuer l'inflammation pulmonaire et la fibrose induites par la silice chez la souris. Des analyses transcriptomiques et expérimentales indiquent que ses effets protecteurs pourraient impliquer la suppression de la voie de signalisation IL-6/STAT3 et la régulation à la baisse de l'expression de MMP12, offrant ainsi des pistes thérapeutiques potentielles pour le traitement de la silicose.
Cette étude vise à examiner les effets anti-inflammatoires et anti-fibrotiques du diméthylsulfoxyde (DMSO) dans un modèle murin de silicose, afin d'explorer sa valeur thérapeutique potentielle.
Un modèle murin de silicose a été établi par instillation intranasale, et le traitement par DMSO a été administré par injection intrapéritonéale. L'expérience a été menée sur une période d'un mois. Des tissus pulmonaires ont été prélevés chez toutes les souris ; un sous-ensemble a fait l'objet d'une analyse transcriptomique, et les gènes différentiellement exprimés ont été identifiés à l'aide du package limma. Des analyses d'enrichissement en ontologie génique (GO) et dans l'encyclopédie de Kyoto des gènes et des génomes (KEGG) ont été réalisées à l'aide de ClusterProfiler afin d'étudier les fonctions des gènes et les voies associées. Les échantillons restants ont été évalués histopathologiquement par coloration à l'hématoxyline-éosine (HE) et coloration trichrome de Masson, tandis qu'une analyse par immunoblotting a été effectuée pour valider les résultats transcriptomiques.
Cette étude suggère que le DMSO pourrait atténuer le processus fibrotique dans la silicose en modulant l'axe de signalisation IL-6/STAT3-MMP12. Dans le modèle murin de silicose induite par la silice, le DMSO a atténué la perte de poids associée à la maladie et réduit le dépôt de collagène. Une analyse transcriptomique a indiqué que le DMSO supprimait l'activité de plusieurs voies liées à la fibrose et a identifié 51 gènes clés, dont MMP12, qui était fortement régulé à la baisse. Une analyse par immunoblotting a confirmé une expression réduite de MMP12, accompagnée d'une diminution marquée des niveaux d'IL-6 et de p-STAT3, suggérant que la voie IL-6/STAT3 pourrait jouer un rôle crucial dans la régulation de l'expression de MMP12.
Le DMSO pourrait atténuer les réponses inflammatoires et la fibrose pulmonaire dans la silicose en inhibant l'activation de la voie de signalisation IL-6/STAT3, réduisant ainsi l'expression de la MMP12.
La silicose est l'une des principales formes de pneumoconiose professionnelle1, caractérisée par une inflammation pulmonaire persistante et une fibrose pulmonaire irréversible résultant d'une exposition prolongée à la poussière de silice2,3. La pathogenèse de cette silicose est hautement complexe. Bien que des études antérieures aient démontré qu'une activation anormale des macrophages4, la prolifération excessive des fibroblastes, la transition épithélio-mésenchymateuse et le dépôt anormal de composants de la matrice extracellulaire (ECM) sont des facteurs critiques dans le développement de la fibrose5,6Les mécanismes moléculaires fondamentaux à l'origine du cercle vicieux inflammation-fibrose restent incomplètement élucidés. Notamment, la famille des métalloprotéinases matricielles (MMP) joue un rôle crucial dans le remodelage de la matrice extracellulaire (ECM) et dans la progression de la fibrose pathologique.7Parmi celles-ci, la métalloprotéinase matricielle 12 (MMP12), spécifiquement sécrétée par les macrophages, dégrade des composants clés de la matrice extracellulaire tels que l'élastine, la fibronectine et le collagène de type IV, et joue un rôle important dans la pathogenèse des maladies fibrosantes, notamment la maladie pulmonaire obstructive chronique.8Des études récentes suggèrent en outre que la MMP12 dérivée des macrophages pourrait favoriser davantage la fibrose en endommageant les cellules endothéliales au cours du processus de fibrose pulmonaire.9.
Le diméthylsulfoxyde (DMSO), un composé de faible masse moléculaire doté de diverses activités biologiques10, a démontré des effets anti-inflammatoires dans plusieurs maladies inflammatoires, notamment la cystite, et a été approuvé par la Food and Drug Administration américaine pour le traitement de la cystite interstitielle11. Des études récentes suggèrent que le DMSO pourrait ralentir dans une certaine mesure la progression de la fibrose en inhibant la libération de facteurs inflammatoires et en réduisant les réponses au stress oxydatif12. Des recherches menées par Ingrid Elisia et al. ont montré que le DMSO inhibe spécifiquement l'activation des voies de signalisation ERK1/2, p38 MAPK, JNK et PI3K/Akt dans les monocytes humains dans des modèles de sang total, exerçant ainsi ses effets anti-inflammatoires13.
Bien que la famille des MMP ait été reconnue comme jouant un rôle essentiel dans le processus de fibrose de la silicose, aucune étude n'a démontré de façon concluante si le DMSO peut influencer l'évolution pathologique de la silicose par la régulation de l'expression des MMP. Cette étude a donc pour objectif d'explorer les effets anti-inflammatoires et anti-fibrotiques du DMSO dans un modèle murin de silicose, afin de révéler le réseau génique régulateur clé et le mécanisme moléculaire sous-jacent à l'intervention par le DMSO, et d'apporter un soutien théorique à de nouvelles stratégies thérapeutiques innovantes basées sur les MMP.
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Toutes les expériences animales menées dans cette étude ont été approuvées par le Comité d'éthique des sciences et technologies de l'Université des sciences et technologies d'Anhui (numéro d'approbation : GZ2025-048) et ont strictement respecté les normes nationales chinoises en matière de bien-être des animaux de laboratoire (GB/T 35892-2018). Figure 1 présente le schéma de l'étude.
Préparation des solutions
Préparation de la suspension de silice :
La silice cristalline (SiO₂, 80 %, taille des particules de 1 à 5 µm) a été stérilisée par autoclavage. La poudre de silice stérile a ensuite été dispersée dans du sérum physiologique stérile pour obtenir une concentration finale de 10 mg/mL, et la suspension a été soigneusement homogénéisée à l’aide d’un homogénéisateur à ultrasons immédiatement avant l’administration, afin de garantir une suspension uniforme des particules.
Préparation de la solution de DMSO :
En conditions aseptiques, le DMSO (≥99,9 %) a été dilué avec du sérum physiologique stérile afin de préparer une solution de DMSO d'environ 10 % (v/v), homogénéisée par agitation ultrasonique. Chaque souris a reçu la solution de DMSO à une dose de 0,9 g/kg, comme décrit précédemment14,15.
Animaux expérimentaux
Trente-deux souris mâles C57BL/6J en bonne santé âgées de 8 à 12 semaines ont été utilisées dans cette étude et ont été acclimatées pendant 1 semaine avant l'expérimentation. Les souris ont été réparties aléatoirement en quatre groupes expérimentaux (n = 8 par groupe) à l'aide d'une méthode de randomisation générée par ordinateur : groupes témoin, DMSO, silice et silice+DMSO. La taille de l'échantillon a été déterminée d'après des études antérieures utilisant le même modèle murin de silicose et notre expérience expérimentale préliminaire, qui indiquait que 8 animaux par groupe suffisaient pour détecter des différences histopathologiques et moléculaires entre les groupes. Les animaux ont été logés dans des conditions standard de laboratoire, avec une température contrôlée, un cycle lumineux de 12 h, et un accès libre à la nourriture et à l'eau. Des critères d'intervention éthique ont été établis avant le début de l'étude, et aucun animal n'a atteint les critères prédéfinis justifiant une euthanasie précoce.
Établissement du modèle de silicose et intervention médicamenteuse
La silicose a été induite par une instillation intranasale unique de 60 µL de suspension stérile de silice cristalline (10 mg/mL). Après induction de l'anesthésie, les souris ont été placées en position supine. Une fois une respiration profonde et lente observée, 60 µL de la suspension de silice ont été instillés goutte à goutte dans les narines, permettant une inhalation spontanée de la suspension dans les poumons.16Les souris du groupe recevant du DMSO ont reçu des injections intrapéritonéales de solution de DMSO à dose fixe deux fois par semaine, avec un intervalle de 3 à 4 jours entre les injections, pendant un mois consécutif. Les souris des autres groupes ont été traitées de manière identique avec un volume équivalent de sérum physiologique stérile. Un suivi quotidien du poids corporel a été effectué tout au long de l'expérience. Le 30e jour suivant la mise en place du modèle, toutes les souris ont été euthanasiées et les tissus pulmonaires ont été prélevés en conditions stériles. L’euthanasie a été réalisée par dislocation cervicale après administration intrapéritonéale de tribromoéthanol (0,2 mL/10 g) afin d’induire l’anesthésie. Des échantillons partiels de tissus pulmonaires ont été conservés dans l’azote liquide en vue d’un séquençage du transcriptome. Une portion des tissus a été fixée dans du paraformaldéhyde à 4 % pendant 48 h avant la coloration histopathologique, et les tissus restants ont été stockés à -80 °C en prévision d’analyses moléculaires ultérieures. Toutes les manipulations animales ont été réalisées conformément aux lignes directrices institutionnelles en matière d’éthique animale.
L'évaluation histopathologique, incluant le score de fibrose d'Ashcroft, a été réalisée indépendamment par deux investigateurs en aveugle quant à l'affectation aux groupes expérimentaux.
Examen pathologique pulmonaire
Les tissus pulmonaires fixés ont été déshydratés, rendus transparents et inclus dans des blocs de paraffine, puis découpés en sections de 5 µm d'épaisseur.
Coloration par l'hématoxyline et l'éosine (HE) : les sections ont été colorées à l'hématoxyline pendant 3 à 5 minutes, différenciées dans une solution acide, bleuies sous eau courante, puis contre-colorées à l'éosine pendant 5 minutes. Après déshydratation par des concentrations croissantes d'éthanol, les sections ont été clarifiées dans le xylène et montées avec une résine neutre17.
Coloration au trichrome de Masson : les sections ont été colorées successivement à l'hématoxyline, au rouge de Lichun-fuchsine acide, à l'acide phosphomolybdique, puis au vert brillant. Après une différenciation acide, les sections ont été déshydratées, clarifiées dans le xylène et montées avec une résine neutre18,19.
Séquençage du transcriptome
Des tissus pulmonaires de souris provenant des quatre groupes expérimentaux ont été prélevés immédiatement après l'euthanasie et congelés rapidement dans de l'azote liquide. L'ARN total a été extrait à l'aide du réactif TRIzol selon les instructions du fabricant. La concentration et la pureté de l'ARN ont été évaluées, et l'intégrité de l'ARN a été analysée à l'aide d'un Bioanalyzer avec un logiciel intégré. Les échantillons présentant des valeurs de RIN supérieures à 8,0 ont été considérés comme acceptables. La préparation des bibliothèques a inclus l'enrichissement en ARN messager poly(A) à l'aide de billes Oligo(dT), la fragmentation de l'ARN, la synthèse d'ADN complémentaire, la ligature d'adaptateurs et l'amplification par PCR. Le séquençage a été réalisé sur une plateforme Illumina, produisant environ 6,2 à 6,4 Go de données brutes par échantillon. Toutes les données brutes de séquençage générées dans cette étude ont été déposées dans la base de données Gene Expression Omnibus (GEO) sous le numéro d'accès GSE311671.
Les lectures nettoyées ont été alignées sur le génome de référence de Mus musculus (mm8) à l'aide de l'aligneur STAR. Les niveaux d'expression génique ont été quantifiés sous forme de décomptes bruts de lectures. L'analyse d'expression différentielle a été réalisée à l'aide du package limma dans R. Avant la modélisation linéaire, les données brutes de décomptes ont été transformées à l'aide de la fonction voom afin d'estimer la relation moyenne-variance et de générer des poids de précision. Les valeurs P brutes ont été ajustées pour les tests multiples selon la méthode de Benjamini-Hochberg (BH), et les gènes présentant un |log₂Rapport d'expression| > 1,5 et un taux de fausses découvertes (FDR) < 0,05 ont été considérés comme différentiellement exprimés. Des analyses d'enrichissement fonctionnel ont été réalisées à l'aide du package clusterProfiler dans R. Une analyse d'enrichissement de l'ontologie génique (GO) a été menée afin d'identifier les catégories significativement enrichies de processus biologique (BP), composant cellulaire (CC) et fonction moléculaire (MF), tandis qu'une analyse d'enrichissement des voies métaboliques de l'encyclopédie de Kyoto des gènes et des génomes (KEGG) a été effectuée pour identifier les voies de signalisation significativement enrichies. La significativité de l'enrichissement a été évaluée à l'aide d'un test hypergéométrique, et les valeurs P ont été ajustées pour les comparaisons multiples selon la méthode de Benjamini-Hochberg. Les termes GO et les voies KEGG présentant une valeur P ajustée (padj) < 0,05 ont été considérés comme significativement enrichis20,21,22,23.
Détection par immunotransfert
Des tissus pulmonaires frais de souris ont été collectés et homogénéisés avec un volume approprié de tampon de lyse RIPA (radioimmunoprécipitation assay). Après centrifugation, le surnageant a été récupéré et la concentration en protéines a été déterminée à l’aide d’un kit d’analyse protéique BCA. Les échantillons ont ensuite été mélangés avec du tampon d’application et chauffés à 100 °C pendant 10 min. La séparation des protéines a été réalisée sur des gels de polyacrylamide à 10 % en présence de dodécylsulfate de sodium (SDS-PAGE) sous un courant de 200 V pendant 30 min. Ensuite, les protéines ont été transférées électrophorétiquement sur des membranes de fluorure de polyvinylidène (PVDF) avec un courant constant de 300 mA pendant 30 min. La membrane a été bloquée avec 5 % de lait écrémé, puis incubée toute la nuit à 4 °C avec des anticorps primaires dirigés contre β-Actin (1:1500), IL-6 (1:1000), STAT3 (1:800), p-STAT3 (1:1500) et MMP12 (1:800). Le jour suivant, la membrane a été lavée avec du TBST et incubée avec l’anticorps secondaire pendant 1 h à température ambiante, puis soumise à des lavages supplémentaires avec du TBST. Les bandes protéiques ont été visualisées à l’aide d’un substrat chimiluminescent, et la quantification des protéines a été effectuée à l’aide du logiciel ImageJ.
Une analyse par immunotransfert a été réalisée à l'aide de trois réplicats biologiques indépendants provenant de chaque groupe expérimental. Des échantillons protéiques ont été préparés à partir de tissus pulmonaires individuels de souris, et chaque réplicat biologique représentait un animal indépendant.
Analyse statistique
Toutes les données expérimentales ont été analysées à l'aide de GraphPad Prism 9.5. Des tests de normalité et d'homogénéité des variances ont été réalisés au préalable. Le test t de Student a été utilisé pour la comparaison entre deux groupes, et une ANOVA à un facteur combinée au test post-hoc de Tukey a été appliquée pour les comparaisons entre plusieurs groupes. Une valeur de P ≤ 0,05 a été considérée comme statistiquement significative.
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Le DMSO atténue la fibrose pulmonaire induite par la silice chez la souris (Figure 2)
Afin d'évaluer les effets du DMSO sur les processus pathologiques et les altérations du tissu pulmonaire dans un modèle de silicose, quatre groupes expérimentaux ont été établis (Figure 2A). Les variations de poids corporel ont été surveillées pendant une période d'un mois.
Les résultats o...
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La silicose reste l'une des maladies pulmonaires professionnelles les plus graves dans le monde, caractérisée par une inflammation persistante et une fibrose pulmonaire progressive, qui altèrent considérablement la fonction pulmonaire et la qualité de vie des patients25. Dans cette étude, en utilisant un modèle murin induit par la silice, nous examinons systématiquement les effets protecteurs potentiels du diméthylsulfoxyde (DMSO) au stade précoce. Les résultats obtenus suggèrent que le traitement...
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Les auteurs n'ont rien à divulguer.
Les auteurs remercient sincèrement la plateforme de la société Anhui Shendong Biotechnology Development Co., Ltd., ainsi que le professeur Deyong Ge et Lei Xu pour leur soutien technique.
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| Nom | Entreprise | Numéro de catalogue | Commentaires |
|---|---|---|---|
| Électrophorèse SDS-PAGE à 10 % | Servicebio | G2177 | |
| Kit d'analyse des protéines BCA | Servicebio | G2026 | |
| Souris C57BL/6J | Changzhou Cavens Laboratory Animal Co., Ltd. | No: SCXY(Su)2011-0003 | |
| Silice cristalline | Sigma Aldrich | No.S5631 | |
| DMSO | Servicebio | GC203006 | |
| IL-6 | Affinity Biosciences | DF6087 | |
| tampon de chargement | Bioteke | P0015L | |
| MMP12 | Servicebio | GB115475 | |
| p-STAT3 | Servicebio | GB150001 | |
| tampon de lyse RIPA | Servicebio | G2002 | |
| anticorps secondaire | Servicebio | GB23303 | |
| lait écrémé | Servicebio | GC310001 | |
| STAT3 | Servicebio | GB11176 | |
| β-Actine | Servicebio | GB11001 |
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