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Article de méthode

Modèle murin de co-colonisation vaginale par Candida albicans et Streptococcus agalactiae

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DOI :

10.3791/72557

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21 août 2026

Dans cet article

Résumé

Ce protocole décrit une méthode pour co-coloniser par voie vaginale des souris avec Candida albicans et Streptococcus agalactiae. Il peut être utilisé pour étudier les interactions polymicrobiennes, les interactions hôte-microorganisme, ainsi que les réponses de l'hôte à ces organismes.

Résumé

De nombreux microbes sont isolés du tractus vaginal humain, et plusieurs des organismes qui colonisent cet environnement peuvent passer d'un mode de vie commensal à un mode de vie pathogène. Des facteurs tels que la composition de la communauté microbienne et l'environnement de l'hôte influencent les issues de la maladie ; toutefois, les mécanismes déterminant ces issues ne sont pas bien compris. Dans cet article, nous décrivons un modèle murin permettant d'étudier les interactions interrègnes et la réponse de l'hôte à Candida albicans et Streptococcus agalactiae (Groupe B Streptococcus, GBS), des pathobiontes qui colonisent le tractus génital féminin (TGF). Des données récentes suggèrent que C. albicans le colonisation est un facteur de risque de portage du SGB en raison de leur isolement fréquent en association. Pendant la grossesse, la colonisation par le SGB peut entraîner des complications y compris la chorioamniotite et le décès fœtal. Le SGB peut également être transmis à un fœtus in utero ou un nouveau-né pendant l'accouchement et constitue une cause majeure de méningite néonatale. La colonisation du tractus vaginal est un préalable essentiel à la maladie à SGB, et cet écosystème exerce de nombreuses pressions sélectives, dont certaines pourraient être influencées par C. albicans colonisation. Ce protocole décrit un modèle de simultanéité C. albicans- Co-colonisation vaginale par le SGB utilisant un traitement antibiotique et une dose unique de 17β-estradiol pour établir C. albicans colonisation, suivie de l'élimination des antibiotiques et d'une inoculation avec le GBS. La charge microbienne dans la lumière vaginale est quantifiée au cours de l'expérience par lavage, et les charges dans l'ensemble du tractus génital féminin (FGT) sont quantifiées par dissection, homogénéisation et ensemencement du vagin, du col de l'utérus et de l'utérus. Cette méthode permettra d'étudier les mécanismes par lesquels les interactions polymicrobiennes directes et indirectes influencent le mode de vie et la pathogenèse de ces deux organismes, ainsi que le paysage immunitaire de l'hôte dans le FGT.

Introduction

Streptococcus agalactiae (Streptococcus du groupe B, GBS) est un pathobionte bactérien à Gram positif qui colonise plusieurs sites polymicrobiens, notamment les voies gastro-intestinales et vaginales. Bien que la colonisation vaginale soit généralement asymptomatique, pendant la grossesse, le GBS peut remonter du tractus vaginal vers l'utérus et traverser des membranes intactes, provoquant une infection du liquide amniotique et du placenta. Il constitue donc un facteur de risque majeur d'événements indésirables pendant la grossesse, d'infection fœtale et de maladie néonatale1,2. En tant que cause principale d'infection invasive chez les nouveau-nés, il est essentiel de caractériser les facteurs influençant le risque de transmission et d'infection. La prophylaxie antibiotique intrapartum peut réduire la transmission verticale et la maladie à GBS précoce chez les nouveau-nés3,4 ; toutefois, elle a été associée à une augmentation des taux de résistance aux antibiotiques ainsi qu'à des effets potentiellement à long terme liés à l'administration prénatale ou précoce d'antibiotiques5,6,7,8. Ces facteurs rendent nécessaire le développement d'interventions préventives et thérapeutiques plus ciblées.

Des preuves émergentes ont démontré que la composition du microbiome et les interactions polymicrobiennes influencent l'homéostasie et la probabilité de développer une maladie9. La dominance du SGB dans le microbiome vaginal humain a été associée à une diminution de l'abondance de Lactobacillus, et des interactions spécifiques au niveau des espèces et des souches ont été observées , pouvant avoir divers effets sur la colonisation in vitro et in vivo10,11. Précédemment, notre groupe de recherche a mis au point un modèle murin de colonisation vaginale par le SGB afin d'étudier les corrélats bactériens et de l'hôte liés à la capacité d'adaptation du SGB12. Ce modèle consiste à traiter les souris par une dose unique de 17β-estradiol, suivie d'une inoculation intravaginale de SGB le jour suivant. Ce modèle a été utilisé pour caractériser l'importance des protéines de surface du SGB, des réseaux de signalisation régulateurs et de la sécrétion de toxines dans le maintien de la colonisation et l'invasion des tissus du tractus génital féminin. De plus, nous avons constaté que le SGB présente des interactions complexes avec d'autres bactéries du tractus vaginal, notamment Akkermansia muciniphila et Enterococcus faecalis13,14,15, illustrant ainsi la manière dont le mode de vie et la persistance du SGB sont influencés par la présence de microbes voisins.

Bien que ce modèle existant ait été adapté pour étudier les interactions interbactériennes, des modifications supplémentaires ont été nécessaires pour étudier d'autres micro-organismes. Les champignons constituent une composante peu étudiée du microbiome vaginal, et grâce au modèle présenté ici, nous avons cherché à développer un outil permettant d'étudier la colonisation fongique ainsi que les interactions fongi-bactériennes in vivo. Le champignon le plus fréquemment isolé du tractus vaginal humain est Candida albicans, qui colonise plus de 70 % des individus16. C. albicans est polymorphe et peut subir une morphogenèse en passant d'une forme levurienne bourgeonnante à des morphotypes filamenteux. La filamentation est associée à un répertoire particulier d'expression génique17,18. Certaines de ces gènes spécifiques aux hyphes ont récemment été signalées comme conférant un avantage de fitness dans le contexte d'une colonisation polymicrobienne19,20,21.

Plusieurs études ont signalé l'isolement simultané de C. albicans et GBS dans des prélèvements vaginaux humains, et notre groupe de recherche a récemment découvert que les individus colonisés par C. albicans présentent des taux de portage de GBS significativement plus élevés22. Nous avons développé un in vivo système permettant d'étudier les interactions tripartites entre les champignons commensaux, les bactéries et l'hôte. Les études sur les champignons chez des souris conventionnelles nécessitent généralement un traitement antibiotique afin de surmonter la résistance à la colonisation médiée par les bactéries et d'établir une colonisation persistante23. Pour y parvenir sans perturber la capacité de colonisation du GBS, nous traitons les souris avec un cocktail d'antibiotiques, puis nous les inoculons avec C. albicans, et une fois la colonisation établie, nous supprimons l'exposition à l'antibiotique afin de permettre à GBS de coloniser ultérieurement. Ce protocole a été optimisé de manière à ce que les deux C. albicans et le SGB colonisent le tractus vaginal avec des charges similaires et selon des chronologies comparables, permettant des interactions directes dans le tractus vaginal. Ce protocole décrit une méthode pour préparer des souris à l’aide d’antibiotiques, puis administrer 17β-estradiol, établir une colonisation avec les champignons et les bactéries, puis prélever des échantillons de lavage et de tissus pour des analyses ultérieures.

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Protocole

Les travaux expérimentaux sur les animaux présentés dans cet article ont été approuvés par le comité institutionnel de soins et d'utilisation des animaux (IACUC) de l'Université du Colorado Anschutz et réalisés conformément à ses directives, sous le protocole n° 00316. Dans le déroulement ci-dessous, le jour 0 correspond au jour de l'inoculation par S. agalactiae.

1. Administrer des antibiotiques avant l'inoculation.

  1. Préparer une solution concentrée contenant 50 mg/mL d'ampicilline, de néomycine et de gentamicine, dissous dans l'eau de boisson pour souris. Stériliser la solution d'antibiotiques à l'aide d'un filtre de 0,22 µm.
  2. Ajouter la solution d'antibiotiques à l'eau de boisson des souris selon un facteur de dilution de 1:100, en ajoutant 1 mL de solution pour chaque 99 g d'eau.
  3. Au bout de 7 jours, remplacer l'eau en répétant les étapes 1.1 et 1.2.
  4. Maintenir le traitement antibiotique pendant au moins 7 à 10 jours avant le début de l'expérience, sans toutefois dépasser un total de 14 jours de traitement.

2. Synchroniser les cycles œstraux de la souris (jour -3).

  1. Ajouter 0,5 mg par souris de 17β-estradiol, ainsi qu'un léger excès pour compenser l'adhérence de la suspension aux parois des tubes, dans un tube conique stérile de 50 mL. Bien refermer le tube conique et faire tourbillonner brièvement pour disperser les agrégats.
    ATTENTION : Comme le 17β-estradiol peut pénétrer dans l'organisme par contact cutané ou muqueux, manipuler ce réactif avec précaution et utiliser des équipements de protection individuelle adaptés.
  2. Utiliser un filtre de 0,45 µm pour stériliser 100 µL d'huile de sésame par 0,5 mg de 17β-estradiol directement dans le tube conique contenant le 17β-estradiol. La concentration finale est de 5 mg/mL. Bien refermer le tube et faire tourbillonner vigoureusement pour obtenir une suspension homogène.
  3. Préparer des seringues stériles de 1 mL (une par souris) en tirant le piston jusqu'au repère de 0,15 mL, puis les maintenir en position verticale, l'embout luer lock orienté vers le haut et le piston vers le bas.
  4. Aspirer la suspension de 17β-estradiol dans une nouvelle seringue stérile de 10 mL munie d'une aiguille stérile 18G 1,5” et utiliser celle-ci pour remplir les seringues de 1 mL préparées avec 100 µL de la suspension.
  5. Équiper chaque seringue de 1 mL d'une aiguille stérile 26G 0,5”.
  6. Préparer une suspension de 100 µL d'huile de sésame contenant 0,5 mg de 17β-estradiol, puis administrer une dose à chaque souris par injection intrapéritonéale un jour avant l'inoculation par C. albicans.

3. Inoculer les souris avec C. albicans (jour -2).

  1. Un jour avant l'inoculation (le même jour que l'administration de 17β-estradiol), cultiver une culture de 5 mL de C. albicans en bouillon Yeast Peptone Dextrose dans un incubateur à 30 °C en agitant à 250 tr/min pendant la nuit.
  2. Le jour de l'inoculation, transférer un aliquot de la culture de nuit dans un tube stérile de microcentrifugeuse et centrifuger à ≤10 000 × g pendant 7 à 8 s ou jusqu'à formation d'un culot.
  3. Éliminer le surnageant et resuspendre le culot dans une solution saline tamponnée au phosphate stérile (PBS).
  4. Utiliser un hématimètre pour calculer la concentration de la suspension.
  5. Transférer un aliquot de la suspension dans un nouveau tube de microcentrifugeuse stérile, reformer le culot par centrifugation, puis resuspendre dans du PBS stérile frais afin d'obtenir une concentration finale de 109 cellules de C. albicans/mL, dans un volume final d'au moins 10 µL par souris. Par exemple, si la concentration est de 2 × 108 cellules/mL et que l'on dispose de 10 souris, centrifuger 500 µL et resuspendre dans 100 µL.
  6. Inoculer chaque souris par voie intravaginale avec 10 µL de C. albicans en suspension dans du PBS à une concentration de 109 cellules/mL (107 cellules/souris).
    1. Immobiliser chaque souris en pinçant la peau à la nuque entre le pouce et l'index de la main non dominante, puis en tournant le poignet de manière à ce que le dos de la souris repose dans la paume de la main. Utiliser les doigts annulaire et auriculaire pour maintenir la queue en place.
    2. Aspirer 10 µL de la suspension de C. albicans dans une pointe de pipette stérile. Insérer la pointe à environ 5 à 10 mm dans la lumière vaginale, en ajustant la profondeur en fonction de l'anatomie de la souris.
    3. Délivrer l'inoculum de C. albicans dans le vagin puis retirer la pointe de pipette.
    4. Après avoir relâché la peau de la nuque, tenir la souris par la queue afin d'élever ses membres postérieurs. Faire marcher la souris sur ses deux pattes antérieures pendant environ 1 minute ou jusqu'à ce que l'inoculum de C. albicans ne soit plus visible.

4. Remplacer l'eau de boisson (jour -1).

  1. Un jour après l'inoculation par C. albicans, ce qui correspond au jour précédant l'inoculation par S. agalactiae, transférer les souris dans des cages propres.
  2. S'assurer que les souris reçoivent de l'eau fraîche sans antibiotiques.

5. Quantifier la charge de C. albicans dans la lumière vaginale (jour -1).

  1. Au jour -1, préparez un tube microcentrifuge stérile et 100 µL de PBS stérile par souris.
  2. Immobilisez chaque souris comme décrit à l'étape 3.6.1.
  3. Aspirez 50 µL de PBS dans une pointe de pipette stérile. Insérez la pointe d’environ 1 à 5 mm dans la lumière vaginale et pipetez tout le volume de PBS vers le haut et vers le bas 3 à 5 fois. Déposez le PBS dans un tube microcentrifuge stérile.
  4. Répétez l’étape 5.3 afin d’obtenir un volume total de 100 µL de liquide de lavage.
  5. Vortexez le tube microcentrifuge, puis effectuez des dilutions sérielles d’un facteur 10 jusqu’à une dilution 1:10 000 dans du PBS stérile.
  6. Ensemencez 10 µL des suspensions diluées et 25 µL du liquide de lavage non dilué sur des boîtes de gélose chromogène sélective pour Candida.
  7. Incubez les boîtes à 30 °C pendant 48 h. Les colonies de C. albicans apparaîtront lisses et de couleur turquin ou verte.

6. Inoculer des souris avec S. agalactiae (jour 0).

  1. Un jour avant l'inoculation (le même jour que le remplacement de l'eau de boisson), cultiver une culture de 3 mL de S. agalactiae en bouillon Todd Hewitt (THB) dans un incubateur statique à 37 °C pendant la nuit.
  2. Le jour de l'inoculation, diluer la culture de nuit au ratio 1:10 dans 4 mL de THB et incuber dans un incubateur statique à 37 °C jusqu'à ce qu'elle atteigne la phase exponentielle moyenne (densité optique à 600 nm [OD600] de 0,4 à 0,5), en environ 1,5 à 2 h.
  3. Transférer la culture en phase exponentielle moyenne dans un tube conique stérile de 15 mL et centrifuger à 3 000 × g pendant 5 min ou jusqu'à formation d'un culot.
  4. Éliminer le surnageant par aspiration, puis resuspendre le culot dans 300 µL de PBS stérile.
  5. Utiliser le culot resuspendu pour préparer au moins 100 µL de suspension de S. agalactiae par souris, plus un supplément de 500 µL, dans du PBS stérile à une OD600 de 0,4 (environ 108 unités formant colonies [UFC]/mL ; au moins 1,5 mL au total pour 10 souris).
    REMARQUE : Certains souches de S. agalactiae peuvent présenter des rapports OD600/UFC/mL différents. Déterminer à l'avance quelle OD600 correspond à 108 UFC/mL.
  6. Transférer la suspension dans un nouveau tube conique stérile de 15 mL et centrifuger à 3 000 × g pendant 5 min ou jusqu'à formation d'un culot.
  7. Aspirer le surnageant et resuspendre le culot dans 1/10e du volume initial de PBS stérile (si 1,5 mL de suspension ont été centrifugés, resuspendre dans 150 µL). Cette suspension aura une concentration de 109 UFC/mL et servira d'inoculum bactérien.
  8. Diluer en série et ensemencer 50 µL de l'inoculum sur gélose Todd Hewitt, puis incuber les boîtes à 37 °C pendant 24 h afin de déterminer la concentration exacte de l'inoculum.
  9. Inoculer chaque souris par voie intravaginale avec 10 µL de S. agalactiae en suspension dans du PBS à 109 UFC/mL (107 UFC/souris), en utilisant la même technique que dans les étapes 3.6.1 à 3.6.4.

7. Quantifier les charges de C. albicans et de S. agalactiae dans la lumière vaginale (à partir du jour +1).

  1. À partir d'un jour après l'inoculation par S. agalactiae, prélevez 100 µL de liquide de lavage vaginal et diluez-les successivement en utilisant la même technique que dans les étapes 5.1 à 5.5.
  2. Effectuez en double le prélèvement de 10 µL des suspensions diluées et de 25 µL du liquide de lavage non dilué sur des boîtes de gélose chromogène sélective pour Candida et sélective pour StrepB.
  3. Incubez les boîtes de gélose pour Candida à 30 °C pendant 48 h. Les colonies de C. albicans apparaîtront lisses et de couleur turquoise ou verte.
  4. Incubez les boîtes de gélose pour StrepB à 37 °C pendant 24 h. Les colonies de S. agalactiae apparaîtront lisses et de couleur rose ou mauve.
  5. Répétez les étapes 7.1 à 7.4 quotidiennement, ou à un intervalle de temps approprié, afin de surveiller la charge microbienne dans la lumière vaginale.

8. Quantifier les charges de C. albicans et de S. agalactiae dans les tissus du tractus génital féminin (point final de l'expérience).

  1. Préparer trois tubes filetés de 2 mL contenant environ 0,4–0,5 g de billes en zircone de 1 mm et 500 µL de PBS stérile par souris pour recueillir les tissus (vagin, col de l'utérus et utérus). Préparer également un tube stérile de microcentrifugation et 100 µL de PBS stérile par souris pour recueillir la lavée. Noter la masse de chaque tube fileté afin de l'utiliser comme référence pour le calcul des masses tissulaires.
  2. Endormir la souris selon une méthode approuvée par l'institution, telle que l'asphyxie par CO2 suivie d'une dislocation cervicale. Utiliser de l'éthanol à 70 % pour stériliser les ciseaux et la pince.
  3. Soulever l'arrière de la souris par la queue et recueillir la lavée vaginale en utilisant la technique décrite aux étapes 5.3–5.4.
  4. Asperger l'abdomen de la souris avec de l'éthanol à 70 % et utiliser les ciseaux stériles pour ouvrir la cavité abdominale. Utiliser la pince pour soulever la peau vers l'arrière et déplacer le tractus gastro-intestinal afin d'exposer les tissus du tractus génital.
  5. Utiliser les ciseaux stériles pour retirer la vessie ainsi que la graisse viscérale et les membranes qui masquent l'utérus. Séparer les cornes utérines des ovaires en coupant entre le corps utérin et chaque ovaire.
  6. À l’aide de la pince stérile, saisir le tractus vaginal au niveau inférieur au col de l’utérus. Soulever jusqu’à ce que tout le tractus vaginal soit visible, puis effectuer une incision transversale aussi près que possible de la vulve, en évitant tout tissu cutané. Retirer l’ensemble du tractus génital et le placer dans une boîte de Petri stérile de 10 cm.
  7. Utiliser une lame de rasoir stérile pour effectuer deux incisions transversales, l’une inférieure et l’autre supérieure au col de l’utérus, afin de séparer le vagin, le col et l’utérus. Hacher chaque tissu en réalisant 2 à 5 incisions supplémentaires sagittales et transversales. Placer chaque tissu dans son tube fileté préparé respectif.
  8. Peser chaque tube fileté et calculer la masse de chaque tissu en soustrayant la valeur obtenue à l’étape 8.1. Refermer hermétiquement chaque tube, puis procéder à la fragmentation mécanique (bead-beating) à 3 450 tr/min pendant 1 minute, placer les tubes sur de la glace pendant 1 minute, puis répéter la fragmentation mécanique à 3 450 tr/min pendant 1 minute supplémentaire.
  9. Diluer en série et ensemencer chaque homogénat tissulaire et chaque échantillon de lavée selon la méthode décrite aux étapes 5.5–5.6. Incuber les boîtes selon les instructions des étapes 7.3–7.4.

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Résultats

Pour caractériser la colonisation vaginale par le GBS et C. albicans, des souris ont été inoculées par voie intravaginale avec la souche SC5314 de C. albicans ou un témoin véhicule constitué de PBS, puis inoculées avec la souche COH1 de GBS. Cette souche représente les isolats hypervirulents du sérotype capsulaire III, de type de séquence 17, qui sont le plus fréquemment associés aux maladies invasives néonatales et à la méningite1. Les souris non colonisées par le GBS un jour ap...

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Discussion

La colonisation vaginale par le SGB représente un risque critique pour la santé materno-fœtale et néonatale. Les modèles in vivo sont indispensables pour comprendre les facteurs de colonisation et pour développer des thérapeutiques préventives. Dans cet article, nous décrivons un modèle murin permettant de co-coloniser les souris par voie vaginale avec le SGB et C. albicans, d'évaluer la charge microbienne dans la lumière vaginale et dans l'appareil génital féminin (AGF), ainsi que de recueillir les tis...

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Déclarations de divulgation

Les auteurs n'ont aucun conflit d'intérêts à déclarer.

Remerciements

Nous remercions le Bureau des ressources pour les animaux de laboratoire de l'Université du Colorado Anschutz, notamment le responsable des installations et le personnel dévoué du vivarium. Ce travail est financé par les subventions NIH R01AI153332 et R21AI188719 attribuées à K.S.D.

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
Filtre de 0,22 µmSigma-AldrichSLGSR33SB
Filtre de 0,45 µmSigma-AldrichSLHAR33SB
Seringue de 1 mL avec embout luer verrouillableMcKesson16-S1C
Billes de zircone de 1,0 mmResearch Products International9835
Seringue de 10 mL avec embout luer verrouillableMcKesson16-S10C
17β-estradiolSigma-AldrichE8875ATTENTION : Le 17β-estradiol peut être absorbé par la peau et les surfaces muqueuses. Porter des équipements de protection individuelle (EPI) appropriés et manipuler avec précaution.
Aiguille 18G, 1,5"BD305196
Tubes filetés de 2 mLFisher Scientific02-681-374
Aiguille 26G, 0,5"McKesson16-N2605
AgarAlpha BiosciencesA01-102
AmpicillineResearch Products InternationalA40040
CHROMagar CandidaCHROMagarCA222
CHROMagar StrepBCHROMagarSB282
GentamicineVWR Life Science0304
NéomycineResearch Products InternationalN20040
Solution saline tamponnée au phosphateFisher ScientificBP2944
Huile de sésameSigma-AldrichS3547
Bouillon Todd HewittResearch Products InternationalT47500
Bouillon YPD (extrait de levure, peptone, dextrose)BD242810

Références

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