Article de méthode

Modèle murin de co-colonisation vaginale par Candida albicans et Streptococcus agalactiae

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DOI :

10.3791/72557

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21 août 2026

 , 
1Department of Immunology and Microbiology, University of Colorado Anschutz Medical Campus

Dans cet article

Résumé

Ce protocole décrit une méthode pour co-coloniser par voie vaginale des souris avec Candida albicans et Streptococcus agalactiae. Il peut être utilisé pour étudier les interactions polymicrobiennes, les interactions hôte-microorganisme, ainsi que les réponses de l'hôte à ces organismes.

Résumé

De nombreux microbes sont isolés du tractus vaginal humain, et plusieurs des organismes qui colonisent cet environnement peuvent passer d'un mode de vie commensal à un mode de vie pathogène. Des facteurs tels que la composition de la communauté microbienne et l'environnement de l'hôte influencent les issues de la maladie ; toutefois, les mécanismes déterminant ces issues ne sont pas bien compris. Dans cet article, nous décrivons un modèle murin permettant d'étudier les interactions interrègnes et la réponse de l'hôte à Candida albicans et Streptococcus agalactiae (Groupe B Streptococcus, GBS), des pathobiontes qui colonisent le tractus génital féminin (TGF). Des données récentes suggèrent que C. albicans le colonisation est un facteur de risque de portage du SGB en raison de leur isolement fréquent en association. Pendant la grossesse, la colonisation par le SGB peut entraîner des complications y compris la chorioamniotite et le décès fœtal. Le SGB peut également être transmis à un fœtus in utero ou un nouveau-né pendant l'accouchement et constitue une cause majeure de méningite néonatale. La colonisation du tractus vaginal est un préalable essentiel à la maladie à SGB, et cet écosystème exerce de nombreuses pressions sélectives, dont certaines pourraient être influencées par C. albicans colonisation. Ce protocole décrit un modèle de simultanéité C. albicans- Co-colonisation vaginale par le SGB utilisant un traitement antibiotique et une dose unique de 17β-estradiol pour établir C. albicans colonisation, suivie de l'élimination des antibiotiques et d'une inoculation avec le GBS. La charge microbienne dans la lumière vaginale est quantifiée au cours de l'expérience par lavage, et les charges dans l'ensemble du tractus génital féminin (FGT) sont quantifiées par dissection, homogénéisation et ensemencement du vagin, du col de l'utérus et de l'utérus. Cette méthode permettra d'étudier les mécanismes par lesquels les interactions polymicrobiennes directes et indirectes influencent le mode de vie et la pathogenèse de ces deux organismes, ainsi que le paysage immunitaire de l'hôte dans le FGT.

Introduction

Streptococcus agalactiae (Streptococcus du groupe B, GBS) est un pathobionte bactérien à Gram positif qui colonise plusieurs sites polymicrobiens, notamment les voies gastro-intestinales et vaginales. Bien que la colonisation vaginale soit généralement asymptomatique, pendant la grossesse, le GBS peut remonter du tractus vaginal vers l'utérus et traverser des membranes intactes, provoquant une infection du liquide amniotique et du placenta. Il constitue donc un facteur de risque majeur d'événements indésirables pendant la grossesse, d'infection fœtale et de maladie néonatale1,2. En tant que cause principale d'infection invasive chez les nouveau-nés, il est essentiel de caractériser les facteurs influençant le risque de transmission et d'infection. La prophylaxie antibiotique intrapartum peut réduire la transmission verticale et la maladie à GBS précoce chez les nouveau-nés3,4 ; toutefois, elle a été associée à une augmentation des taux de résistance aux antibiotiques ainsi qu'à des effets potentiellement à long terme liés à l'administration prénatale ou précoce d'antibiotiques5,6,7,8. Ces facteurs rendent nécessaire le développement d'interventions préventives et thérapeutiques plus ciblées.

Des preuves émergentes ont démontré que la composition du microbiome et les interactions polymicrobiennes influencent l'homéostasie et la probabilité de développer une maladie9. La dominance du SGB dans le microbiome vaginal humain a été associée à une diminution de l'abondance de Lactobacillus, et des interactions spécifiques au niveau des espèces et des souches ont été observées , pouvant avoir divers effets sur la colonisation in vitro et in vivo10,11. Précédemment, notre groupe de recherche a mis au point un modèle murin de colonisation vaginale par le SGB afin d'étudier les corrélats bactériens et de l'hôte liés à la capacité d'adaptation du SGB12. Ce modèle consiste à traiter les souris par une dose unique de 17β-estradiol, suivie d'une inoculation intravaginale de SGB le jour suivant. Ce modèle a été utilisé pour caractériser l'importance des protéines de surface du SGB, des réseaux de signalisation régulateurs et de la sécrétion de toxines dans le maintien de la colonisation et l'invasion des tissus du tractus génital féminin. De plus, nous avons constaté que le SGB présente des interactions complexes avec d'autres bactéries du tractus vaginal, notamment Akkermansia muciniphila et Enterococcus faecalis13,14,15, illustrant ainsi la manière dont le mode de vie et la persistance du SGB sont influencés par la présence de microbes voisins.

Bien que ce modèle existant ait été adapté pour étudier les interactions interbactériennes, des modifications supplémentaires ont été nécessaires pour étudier d'autres micro-organismes. Les champignons constituent une composante peu étudiée du microbiome vaginal, et grâce au modèle présenté ici, nous avons cherché à développer un outil permettant d'étudier la colonisation fongique ainsi que les interactions fongi-bactériennes in vivo. Le champignon le plus fréquemment isolé du tractus vaginal humain est Candida albicans, qui colonise plus de 70 % des individus16. C. albicans est polymorphe et peut subir une morphogenèse en passant d'une forme levurienne bourgeonnante à des morphotypes filamenteux. La filamentation est associée à un répertoire particulier d'expression génique17,18. Certaines de ces gènes spécifiques aux hyphes ont récemment été signalées comme conférant un avantage de fitness dans le contexte d'une colonisation polymicrobienne19,20,21.

Plusieurs études ont signalé l'isolement simultané de C. albicans et GBS dans des prélèvements vaginaux humains, et notre groupe de recherche a récemment découvert que les individus colonisés par C. albicans présentent des taux de portage de GBS significativement plus élevés22. Nous avons développé un in vivo système permettant d'étudier les interactions tripartites entre les champignons commensaux, les bactéries et l'hôte. Les études sur les champignons chez des souris conventionnelles nécessitent généralement un traitement antibiotique afin de surmonter la résistance à la colonisation médiée par les bactéries et d'établir une colonisation persistante23. Pour y parvenir sans perturber la capacité de colonisation du GBS, nous traitons les souris avec un cocktail d'antibiotiques, puis nous les inoculons avec C. albicans, et une fois la colonisation établie, nous supprimons l'exposition à l'antibiotique afin de permettre à GBS de coloniser ultérieurement. Ce protocole a été optimisé de manière à ce que les deux C. albicans et le SGB colonisent le tractus vaginal avec des charges similaires et selon des chronologies comparables, permettant des interactions directes dans le tractus vaginal. Ce protocole décrit une méthode pour préparer des souris à l’aide d’antibiotiques, puis administrer 17β-estradiol, établir une colonisation avec les champignons et les bactéries, puis prélever des échantillons de lavage et de tissus pour des analyses ultérieures.

Protocole

Les travaux expérimentaux sur les animaux présentés dans cet article ont été approuvés par le comité institutionnel de soins et d'utilisation des animaux (IACUC) de l'Université du Colorado Anschutz et réalisés conformément à ses directives, sous le protocole n° 00316. Dans le déroulement ci-dessous, le jour 0 correspond au jour de l'inoculation par S. agalactiae.

1. Administrer des antibiotiques avant l'inoculation.

  1. Préparer une solution concentrée contenant 50 mg/mL d'ampicilline, de néomycine et de gentamicine, dissous dans l'eau de boisson pour souris. Stériliser la solution d'antibiotiques à l'aide d'un filtre de 0,22 µm.
  2. Ajouter la solution d'antibiotiques à l'eau de boisson des souris selon un facteur de dilution de 1:100, en ajoutant 1 mL de solution pour chaque 99 g d'eau.
  3. Au bout de 7 jours, remplacer l'eau en répétant les étapes 1.1 et 1.2.
  4. Maintenir le traitement antibiotique pendant au moins 7 à 10 jours avant le début de l'expérience, sans toutefois dépasser un total de 14 jours de traitement.

2. Synchroniser les cycles œstraux de la souris (jour -3).

  1. Ajouter 0,5 mg par souris de 17β-estradiol, ainsi qu'un léger excès pour compenser l'adhérence de la suspension aux parois des tubes, dans un tube conique stérile de 50 mL. Bien refermer le tube conique et faire tourbillonner brièvement pour disperser les agrégats.
    ATTENTION : Comme le 17β-estradiol peut pénétrer dans l'organisme par contact cutané ou muqueux, manipuler ce réactif avec précaution et utiliser des équipements de protection individuelle adaptés.
  2. Utiliser un filtre de 0,45 µm pour stériliser 100 µL d'huile de sésame par 0,5 mg de 17β-estradiol directement dans le tube conique contenant le 17β-estradiol. La concentration finale est de 5 mg/mL. Bien refermer le tube et faire tourbillonner vigoureusement pour obtenir une suspension homogène.
  3. Préparer des seringues stériles de 1 mL (une par souris) en tirant le piston jusqu'au repère de 0,15 mL, puis les maintenir en position verticale, l'embout luer lock orienté vers le haut et le piston vers le bas.
  4. Aspirer la suspension de 17β-estradiol dans une nouvelle seringue stérile de 10 mL munie d'une aiguille stérile 18G 1,5” et utiliser celle-ci pour remplir les seringues de 1 mL préparées avec 100 µL de la suspension.
  5. Équiper chaque seringue de 1 mL d'une aiguille stérile 26G 0,5”.
  6. Préparer une suspension de 100 µL d'huile de sésame contenant 0,5 mg de 17β-estradiol, puis administrer une dose à chaque souris par injection intrapéritonéale un jour avant l'inoculation par C. albicans.

3. Inoculer les souris avec C. albicans (jour -2).

  1. Un jour avant l'inoculation (le même jour que l'administration de 17β-estradiol), cultiver une culture de 5 mL de C. albicans en bouillon Yeast Peptone Dextrose dans un incubateur à 30 °C en agitant à 250 tr/min pendant la nuit.
  2. Le jour de l'inoculation, transférer un aliquot de la culture de nuit dans un tube stérile de microcentrifugeuse et centrifuger à ≤10 000 × g pendant 7 à 8 s ou jusqu'à formation d'un culot.
  3. Éliminer le surnageant et resuspendre le culot dans une solution saline tamponnée au phosphate stérile (PBS).
  4. Utiliser un hématimètre pour calculer la concentration de la suspension.
  5. Transférer un aliquot de la suspension dans un nouveau tube de microcentrifugeuse stérile, reformer le culot par centrifugation, puis resuspendre dans du PBS stérile frais afin d'obtenir une concentration finale de 109 cellules de C. albicans/mL, dans un volume final d'au moins 10 µL par souris. Par exemple, si la concentration est de 2 × 108 cellules/mL et que l'on dispose de 10 souris, centrifuger 500 µL et resuspendre dans 100 µL.
  6. Inoculer chaque souris par voie intravaginale avec 10 µL de C. albicans en suspension dans du PBS à une concentration de 109 cellules/mL (107 cellules/souris).
    1. Immobiliser chaque souris en pinçant la peau à la nuque entre le pouce et l'index de la main non dominante, puis en tournant le poignet de manière à ce que le dos de la souris repose dans la paume de la main. Utiliser les doigts annulaire et auriculaire pour maintenir la queue en place.
    2. Aspirer 10 µL de la suspension de C. albicans dans une pointe de pipette stérile. Insérer la pointe à environ 5 à 10 mm dans la lumière vaginale, en ajustant la profondeur en fonction de l'anatomie de la souris.
    3. Délivrer l'inoculum de C. albicans dans le vagin puis retirer la pointe de pipette.
    4. Après avoir relâché la peau de la nuque, tenir la souris par la queue afin d'élever ses membres postérieurs. Faire marcher la souris sur ses deux pattes antérieures pendant environ 1 minute ou jusqu'à ce que l'inoculum de C. albicans ne soit plus visible.

4. Remplacer l'eau de boisson (jour -1).

  1. Un jour après l'inoculation par C. albicans, ce qui correspond au jour précédant l'inoculation par S. agalactiae, transférer les souris dans des cages propres.
  2. S'assurer que les souris reçoivent de l'eau fraîche sans antibiotiques.

5. Quantifier la charge de C. albicans dans la lumière vaginale (jour -1).

  1. Au jour -1, préparez un tube microcentrifuge stérile et 100 µL de PBS stérile par souris.
  2. Immobilisez chaque souris comme décrit à l'étape 3.6.1.
  3. Aspirez 50 µL de PBS dans une pointe de pipette stérile. Insérez la pointe d’environ 1 à 5 mm dans la lumière vaginale et pipetez tout le volume de PBS vers le haut et vers le bas 3 à 5 fois. Déposez le PBS dans un tube microcentrifuge stérile.
  4. Répétez l’étape 5.3 afin d’obtenir un volume total de 100 µL de liquide de lavage.
  5. Vortexez le tube microcentrifuge, puis effectuez des dilutions sérielles d’un facteur 10 jusqu’à une dilution 1:10 000 dans du PBS stérile.
  6. Ensemencez 10 µL des suspensions diluées et 25 µL du liquide de lavage non dilué sur des boîtes de gélose chromogène sélective pour Candida.
  7. Incubez les boîtes à 30 °C pendant 48 h. Les colonies de C. albicans apparaîtront lisses et de couleur turquin ou verte.

6. Inoculer des souris avec S. agalactiae (jour 0).

  1. Un jour avant l'inoculation (le même jour que le remplacement de l'eau de boisson), cultiver une culture de 3 mL de S. agalactiae en bouillon Todd Hewitt (THB) dans un incubateur statique à 37 °C pendant la nuit.
  2. Le jour de l'inoculation, diluer la culture de nuit au ratio 1:10 dans 4 mL de THB et incuber dans un incubateur statique à 37 °C jusqu'à ce qu'elle atteigne la phase exponentielle moyenne (densité optique à 600 nm [OD600] de 0,4 à 0,5), en environ 1,5 à 2 h.
  3. Transférer la culture en phase exponentielle moyenne dans un tube conique stérile de 15 mL et centrifuger à 3 000 × g pendant 5 min ou jusqu'à formation d'un culot.
  4. Éliminer le surnageant par aspiration, puis resuspendre le culot dans 300 µL de PBS stérile.
  5. Utiliser le culot resuspendu pour préparer au moins 100 µL de suspension de S. agalactiae par souris, plus un supplément de 500 µL, dans du PBS stérile à une OD600 de 0,4 (environ 108 unités formant colonies [UFC]/mL ; au moins 1,5 mL au total pour 10 souris).
    REMARQUE : Certains souches de S. agalactiae peuvent présenter des rapports OD600/UFC/mL différents. Déterminer à l'avance quelle OD600 correspond à 108 UFC/mL.
  6. Transférer la suspension dans un nouveau tube conique stérile de 15 mL et centrifuger à 3 000 × g pendant 5 min ou jusqu'à formation d'un culot.
  7. Aspirer le surnageant et resuspendre le culot dans 1/10e du volume initial de PBS stérile (si 1,5 mL de suspension ont été centrifugés, resuspendre dans 150 µL). Cette suspension aura une concentration de 109 UFC/mL et servira d'inoculum bactérien.
  8. Diluer en série et ensemencer 50 µL de l'inoculum sur gélose Todd Hewitt, puis incuber les boîtes à 37 °C pendant 24 h afin de déterminer la concentration exacte de l'inoculum.
  9. Inoculer chaque souris par voie intravaginale avec 10 µL de S. agalactiae en suspension dans du PBS à 109 UFC/mL (107 UFC/souris), en utilisant la même technique que dans les étapes 3.6.1 à 3.6.4.

7. Quantifier les charges de C. albicans et de S. agalactiae dans la lumière vaginale (à partir du jour +1).

  1. À partir d'un jour après l'inoculation par S. agalactiae, prélevez 100 µL de liquide de lavage vaginal et diluez-les successivement en utilisant la même technique que dans les étapes 5.1 à 5.5.
  2. Effectuez en double le prélèvement de 10 µL des suspensions diluées et de 25 µL du liquide de lavage non dilué sur des boîtes de gélose chromogène sélective pour Candida et sélective pour StrepB.
  3. Incubez les boîtes de gélose pour Candida à 30 °C pendant 48 h. Les colonies de C. albicans apparaîtront lisses et de couleur turquoise ou verte.
  4. Incubez les boîtes de gélose pour StrepB à 37 °C pendant 24 h. Les colonies de S. agalactiae apparaîtront lisses et de couleur rose ou mauve.
  5. Répétez les étapes 7.1 à 7.4 quotidiennement, ou à un intervalle de temps approprié, afin de surveiller la charge microbienne dans la lumière vaginale.

8. Quantifier les charges de C. albicans et de S. agalactiae dans les tissus du tractus génital féminin (point final de l'expérience).

  1. Préparer trois tubes filetés de 2 mL contenant environ 0,4–0,5 g de billes en zircone de 1 mm et 500 µL de PBS stérile par souris pour recueillir les tissus (vagin, col de l'utérus et utérus). Préparer également un tube stérile de microcentrifugation et 100 µL de PBS stérile par souris pour recueillir la lavée. Noter la masse de chaque tube fileté afin de l'utiliser comme référence pour le calcul des masses tissulaires.
  2. Endormir la souris selon une méthode approuvée par l'institution, telle que l'asphyxie par CO2 suivie d'une dislocation cervicale. Utiliser de l'éthanol à 70 % pour stériliser les ciseaux et la pince.
  3. Soulever l'arrière de la souris par la queue et recueillir la lavée vaginale en utilisant la technique décrite aux étapes 5.3–5.4.
  4. Asperger l'abdomen de la souris avec de l'éthanol à 70 % et utiliser les ciseaux stériles pour ouvrir la cavité abdominale. Utiliser la pince pour soulever la peau vers l'arrière et déplacer le tractus gastro-intestinal afin d'exposer les tissus du tractus génital.
  5. Utiliser les ciseaux stériles pour retirer la vessie ainsi que la graisse viscérale et les membranes qui masquent l'utérus. Séparer les cornes utérines des ovaires en coupant entre le corps utérin et chaque ovaire.
  6. À l’aide de la pince stérile, saisir le tractus vaginal au niveau inférieur au col de l’utérus. Soulever jusqu’à ce que tout le tractus vaginal soit visible, puis effectuer une incision transversale aussi près que possible de la vulve, en évitant tout tissu cutané. Retirer l’ensemble du tractus génital et le placer dans une boîte de Petri stérile de 10 cm.
  7. Utiliser une lame de rasoir stérile pour effectuer deux incisions transversales, l’une inférieure et l’autre supérieure au col de l’utérus, afin de séparer le vagin, le col et l’utérus. Hacher chaque tissu en réalisant 2 à 5 incisions supplémentaires sagittales et transversales. Placer chaque tissu dans son tube fileté préparé respectif.
  8. Peser chaque tube fileté et calculer la masse de chaque tissu en soustrayant la valeur obtenue à l’étape 8.1. Refermer hermétiquement chaque tube, puis procéder à la fragmentation mécanique (bead-beating) à 3 450 tr/min pendant 1 minute, placer les tubes sur de la glace pendant 1 minute, puis répéter la fragmentation mécanique à 3 450 tr/min pendant 1 minute supplémentaire.
  9. Diluer en série et ensemencer chaque homogénat tissulaire et chaque échantillon de lavée selon la méthode décrite aux étapes 5.5–5.6. Incuber les boîtes selon les instructions des étapes 7.3–7.4.

Résultats

Pour caractériser la colonisation vaginale par le GBS et C. albicans, des souris ont été inoculées par voie intravaginale avec la souche SC5314 de C. albicans ou un témoin véhicule constitué de PBS, puis inoculées avec la souche COH1 de GBS. Cette souche représente les isolats hypervirulents du sérotype capsulaire III, de type de séquence 17, qui sont le plus fréquemment associés aux maladies invasives néonatales et à la méningite1. Les souris non colonisées par le GBS un jour après l'inoculation ont été exclues de l'analyse. Au cours d'un protocole expérimental de quatre jours, les souris colonisées uniquement par le GBS éliminent progressivement le GBS de la lumière vaginale. La majorité des souris co-colonisées par C. albicans conservent des charges élevées de GBS (Figure 1A,B). C. albicans colonise également la lumière vaginale de la souris pendant environ quatre jours avant d'être éliminé (Figure 1C). Des travaux antérieurs utilisant ce modèle ont montré que les charges de GBS dans les tissus du tractus génital féminin, y compris le vagin, le col de l'utérus et l'utérus, sont également plus élevées chez les souris co-colonisées par rapport aux animaux mono-colonisés22.

Graphiques de colonisation par le SGB ; comparaison statistique, courbe de survie, analyse des données en échelle logarithmique d'unités formant des colonies/mL.
Figure 1. Quantification du groupe B Streptococcus colonisation Des souris CD-1 ont été colonisées par C. albicans (SC5314) ou traité avec une solution saline tamponnée au phosphate comme témoin, suivi d'une inoculation vaginale avec le GBS (COH1).ACharges de SGB dans le liquide de lavage vaginal, médianes indiquées.B) Pourcentage de souris colonisées au cours du temps, évalué par la détection de GBS dans le liquide de lavage vaginal.C) C. albicans charges dans le liquide de lavage vaginal, médianes indiquées. Trois expériences indépendantes. n = 26-27 souris par groupe. * p < 0,05 ; ** p ≤ 0,01 ; *** p ≤ 0,001 par tests multiples t-tests avec le test de comparaisons multiples de Holm-SidakA) ou test de log-rank (B). Abréviations : GBS = streptocoque du groupe B Streptococcus, Ca = Candida albicans, UFC = unités formant des colonies. Veuillez cliquer ici pour visualiser une version agrandie de cette figure.

Discussion

La colonisation vaginale par le SGB représente un risque critique pour la santé materno-fœtale et néonatale. Les modèles in vivo sont indispensables pour comprendre les facteurs de colonisation et pour développer des thérapeutiques préventives. Dans cet article, nous décrivons un modèle murin permettant de co-coloniser les souris par voie vaginale avec le SGB et C. albicans, d'évaluer la charge microbienne dans la lumière vaginale et dans l'appareil génital féminin (AGF), ainsi que de recueillir les tissus pertinents pour des analyses complémentaires. Ce modèle a été mis au point afin d'étudier les interactions entre champignons et bactéries ainsi que celles entre l'hôte et les micro-organismes dans le contexte d'une colonisation vaginale polymicrobienne. Notre équipe de recherche a utilisé ce modèle pour élucider les mécanismes par lesquels C. albicans favorise la colonisation vaginale par le SGB et l'infection ascendante22.

Les modèles animaux ont été utilisés avec succès pour comprendre les interactions hôte-microbe ; toutefois, l'incorporation de communautés polymicrobiennes dans ces modèles peut poser plusieurs défis spécifiques. Les objectifs principaux dans le développement de ce modèle étaient d'établir une colonisation fongique, d'accorder un délai suffisant pour C. albicans pour former des hyphes, puis ensemencer avec des GBS afin de surveiller la dynamique de colonisation avant que l'un ou l'autre microbe ne soit éliminé par l'hôte. En tant que champignon polymorphe, C. albicans peut répondre à plusieurs signaux environnementaux liés à l'hôte en initiant la morphogenèse des hyphes17. Filamentation in vivo a été priorisé dans ce modèle en raison de l'accumulation de données indiquant que les interactions spécifiques aux hyphes avec le SGB favorisent la symbiose dans le tractus génital féminin. En utilisant un C. albicans souche exprimant NRG1 sous le contrôle du promoteur répressible TetO, notre groupe de recherche a précédemment montré que le SGB présente une co-agrégation plus élevée et une adhérence épithéliale accrue avec la forme verrouillée en hyphes par rapport à la forme verrouillée en levure C. albicans22. Co-agrégation avec C. albicans et l'association avec les cellules épithéliales vaginales humaines sont des déterminants importants de la capacité d'adaptation du SGB dans cet environnement hôte. Bactéries supplémentaires y compris Staphylococcus aureus, Pseudomonas aeruginosa, et divers Streptococcus espèce ont été montrés moduler l'expression des gènes associés à la morphogenèse dans C. albicans ainsi qu'interagir de préférence avec les hyphes24. À l'avenir, étudier les implications de la filamentation in vivo peuvent être abordées en utilisant ce modèle pour coloniser des souris avec des formes verrouillées en hyphes ou en levures C. albicans souches.

Les modèles murins existants impliquant une inoculation intravaginale de C. albicans se sont principalement concentrés sur la candidose vulvovaginale (CVV)25 et ont été utilisés pour caractériser l'état hyperinflammatoire associé à l'infection symptomatique26. Notre modèle, décrit dans cet article, représente davantage un état de colonisation. Des travaux antérieurs de notre groupe de recherche ont démontré que, dans ce modèle, une co-colonisation avec C. albicans réduit l'abondance des cytokines pro-inflammatoires IL-6, CXCL1, CXCL2 et TNFα par rapport à la colonisation par le GBS seul, et que les taux de ces protéines chez les souris co-colonisées sont comparables à ceux des animaux naïfs22. Cela indique que nous n'observons pas l'environnement hyperinflammatoire caractéristique de la CVV, malgré la filamentation fongique dans la lumière vaginale. On a signalé que les souris CD-1 non consanguines sont résistantes à la CVV, probablement en raison d'un contrôle immunitaire adéquat de la prolifération fongique27. De plus, les souris CD-1 déclenchent une signalisation immunitaire robuste en réponse à l'inoculation intravaginale de GBS, suffisante pour contrôler la population bactérienne en environ une semaine en l'absence de C. albicans28,29,30, bien que nous ayons précédemment étudié la colonisation vaginale par le GBS dans d'autres souches de souris12. Le modèle décrit dans cet article reflète le caractère transitoire de la colonisation par C. albicans et par le GBS observé chez l'humain. En outre, il existe une grande variabilité interindividuelle chez l'humain en ce qui concerne le pH et la composition du microbiote. Ce modèle présente des conditions de pH quasi neutre (~6,5)31. Le microbiote vaginal des souris CD-1 est dominé par des espèces d'Enterobacteriaceae et de Proteus13, qui sont associées aux mêmes types d'états communautaires microbiens vaginaux que le GBS9,32.

En traitant les souris avec des antibiotiques et une dose unique de 17β-estradiol avant l'inoculation fongique, nous préparons l'environnement pour qu'il devienne réceptif à C. albicans, facilitant ainsi la colonisation. Le traitement par l'estradiol améliore également la reproductibilité entre les expériences en synchronisant le stade d'œstrus, et donc l'environnement immunitaire local, au moment de l'inoculation. Nous synchronisons les souris au stade de proestrus lors de l'inoculation par C. albicans, stade qui coïncide avec une diminution de l'abondance des neutrophiles et qui a été montré favoriser la charge fongique dans le tractus génital féminin (FGT)33,34. La suppression des antibiotiques et leur remplacement par de l'eau potable fraîche en début de protocole expérimental facilitent non seulement la colonisation par le streptocoque du groupe B (GBS), mais permettent également aux micro-organismes natifs de repeupler le tractus vaginal. De plus, en limitant le traitement par l'estradiol à une seule dose précoce, nous permettons aux souris de reprendre une dynamique normale du cycle d'œstrus, bien que l'administration continue d'estradiol ait été montrée favoriser la colonisation12. La composition des cellules immunitaires dans le FGT murin varie tout au long du cycle d'œstrus, et les réponses immunitaires muqueuses sont très sensibles aux hormones stéroïdes sexuelles35,36,37. Ainsi, nous contournons la variable perturbante qu'implique une administration répétée d'estradiol afin d'analyser spécifiquement les effets de la colonisation microbienne sur l'environnement hôte.

Les données présentées dans cette étude concernent la souche C. albicans SC5314 et la souche GBS COH1. Nous avons choisi la souche SC5314 pour établir le modèle en raison de son utilisation fréquente en mycologie, de la grande disponibilité d'outils génétiques dans ce contexte, ainsi que d'un corpus établi de connaissances sur sa biologie et ses dynamiques in vitro et in vivo. Notre groupe de recherche a également démontré que la souche C. albicans 529L peut augmenter la charge de GBS dans le tractus génital féminin22. La souche GBS COH1 a été utilisée comme représentante de la lignée de sérotype III, type de séquence 17, associée à la résistance aux antimicrobiens et aux infections invasives néonatales1,2. Ce modèle utilise des milieux sélectifs et différentiels pour quantifier l'abondance de GBS et de C. albicans dans les lavages vaginaux et les tissus. Pour adapter ce modèle à d'autres espèces bactériennes et fongiques, il serait nécessaire d'optimiser des conditions de croissance sélectives appropriées.

Les interactions fongiques-bactériennes émergent comme des médiateurs importants des modes de vie microbiens38,39. Plusieurs études ont démontré que ces interactions peuvent fortement influencer le commensalisme et le potentiel de virulence. De plus, l'environnement de l'hôte exerce des pressions spécifiques et peut affecter des facteurs tels que la programmation métabolique, les régulons de facteurs de transcription et les profils de résistance aux antimicrobiens. Il est donc essentiel d'utiliser des modèles in vivo représentatifs pour caractériser la manière dont les micro-organismes interagissent entre eux. Le modèle murin décrit dans cet article peut être utilisé pour étudier comment la colonisation vaginale par des bactéries et des champignons d'intérêt peut influencer la charge microbienne, l'expression génique et la réponse de l'hôte.

Déclarations de divulgation

Les auteurs n'ont aucun conflit d'intérêts à déclarer.

Remerciements

Nous remercions le Bureau des ressources pour les animaux de laboratoire de l'Université du Colorado Anschutz, notamment le responsable des installations et le personnel dévoué du vivarium. Ce travail est financé par les subventions NIH R01AI153332 et R21AI188719 attribuées à K.S.D.

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
Filtre de 0,22 µmSigma-AldrichSLGSR33SB
Filtre de 0,45 µmSigma-AldrichSLHAR33SB
Seringue de 1 mL avec embout luer verrouillableMcKesson16-S1C
Billes de zircone de 1,0 mmResearch Products International9835
Seringue de 10 mL avec embout luer verrouillableMcKesson16-S10C
17β-estradiolSigma-AldrichE8875ATTENTION : Le 17β-estradiol peut être absorbé par la peau et les surfaces muqueuses. Porter des équipements de protection individuelle (EPI) appropriés et manipuler avec précaution.
Aiguille 18G, 1,5"BD305196
Tubes filetés de 2 mLFisher Scientific02-681-374
Aiguille 26G, 0,5"McKesson16-N2605
AgarAlpha BiosciencesA01-102
AmpicillineResearch Products InternationalA40040
CHROMagar CandidaCHROMagarCA222
CHROMagar StrepBCHROMagarSB282
GentamicineVWR Life Science0304
NéomycineResearch Products InternationalN20040
Solution saline tamponnée au phosphateFisher ScientificBP2944
Huile de sésameSigma-AldrichS3547
Bouillon Todd HewittResearch Products InternationalT47500
Bouillon YPD (extrait de levure, peptone, dextrose)BD242810

Références

  1. Megli CJ et al. Virulence and pathogenicity of group B Streptococcus.: virulence factors and their roles in perinatal infection. Virulence. 2025;16(1):2451173.
  2. Manuel G et al. Group B streptococcal infections in pregnancy and early life. Clin Microbiol Rev. 2025;38(1):e00154-22.
  3. Verani JR, McGee L, Schrag SJ. Prevention of perinatal group B streptococcal disease: revised guidelines from CDC, 2010. MMWR Recomm Rep. 2010;59(RR-10):1-36.
  4. Prevention of group B streptococcal early-onset disease in newborns: ACOG Committee Opinion Summary, Number 797. Obstet Gynecol. 2020;135(2):489-92.
  5. Hsu CY et al. Global patterns of antibiotic resistance in group B Streptococcu.s: a systematic review and meta-analysis. Front Microbiol. 2025;16:1541524.
  6. Sabroske EM et al. Evolving antibiotic resistance in group B Streptococci. causing invasive infant disease: 1970-2021. Pediatr Res. 2023;93(6):2067-71.
  7. Azad MB et al. Impact of maternal intrapartum antibiotics, method of birth and breastfeeding on gut microbiota during the first year of life: a prospective cohort study. BJOG. 2016;123(6):983-93.
  8. Duong QA, Curtis N, Zimmermann P. The association between prenatal antibiotic exposure and adverse long-term health outcomes in children: a systematic review and meta-analysis. J Infect. 2025;90(1):106377.
  9. Mejia ME, Robertson CM, Patras KA. Interspecies interactions within the host: the social network of group B Streptococcus. Infect Immun. 2023;91(4):e00440-22.
  10. De Gregorio PR, Juárez Tomás MS, Leccese Terraf MC, Nader-Macías MEF. Preventive effect of Lactobacillus reuteri .CRL1324 on group B Streptococcus vaginal colonization in an experimental mouse model. J Appl Microbiol. 2015;118(4):1034-47.
  11. Shiroda M, Aronoff DM, Gaddy JA, Manning SD. The impact of Lactobacillus. on group B streptococcal interactions with cells of the extraplacental membranes. Microb Pathog. 2020;148:104463.
  12. Patras KA, Doran KS. A murine model of group B Streptococcus .vaginal colonization. J Vis Exp. 2016;(117):e54708.
  13. Burcham LR et al. Interrelated effects of zinc deficiency and the microbiome on group B streptococcal vaginal colonization. mSphere. 2022;7(4):e00264-22.
  14. Marroquin SM, Cohen S, Neely MN, Doran KS. Akkermansia muciniphila impacts group B Streptococcus. vaginal colonization. mBio. 2026;17(6):e02868-25.
  15. Job AM, Doran KS, Spencer BL. A group B streptococcal type VII-secreted LXG toxin mediates interbacterial competition and colonization of the murine female genital tract. mBio. 2024;15(10):e02088-24.
  16. Beigi RH et al. Vaginal yeast colonization in nonpregnant women: a longitudinal study. Obstet Gynecol. 2004;104(5 Pt 1):926-30.
  17. Noble SM, Gianetti BA, Witchley JN. Candida albicans cell-type switching and functional plasticity in the mammalian host. Nat Rev Microbiol. 2017;15(2):96-108.
  18. Schille TB et al. Commensalism and pathogenesis of Candida albicans .at the mucosal interface. Nat Rev Microbiol. 2025;23(8):525-40.
  19. Liang SH et al. The hyphal-specific toxin candidalysin promotes fungal gut commensalism. Nature. 2024;627(8004):620-7.
  20. Fróis-Martins R et al. Dynamic expression of candidalysin facilitates oral colonization of Candida albicans. in mice. Nat Microbiol. 2025;10(10):2472-85.
  21. Mauk KE et al. Commensal colonization of Candida albicans. in the mouse gastrointestinal tract is mediated via expression of candidalysin and adhesins. Microbiol Spectr. 2025;13(9):e00567-25.
  22. Cohen S et al. A fungal pathobiont promotes Streptococcus .vaginal persistence and pathogenesis through physical and metabolic interactions. Cell Host Microbe. 2026;34(6):1118-34.e7.
  23. Koh AY. Murine models of Candida .gastrointestinal colonization and dissemination. Eukaryot Cell. 2013;12(11):1416-22.
  24. Allison DL et al. Candida.-bacteria interactions: their impact on human disease. Microbiol Spectr. 2016;4(3):VMBF-0030-2016.
  25. Yano J, Fidel PL Jr. Protocols for vaginal inoculation and sample collection in the experimental mouse model of Candida .vaginitis. J Vis Exp. 2011;(58):e3382.
  26. Ardizzoni A, Wheeler RT, Pericolini E. It takes two to tango: how a dysregulation of the innate immunity, coupled with Candida. virulence, triggers VVC onset. Front Microbiol. 2021;12:692491.
  27. Yano J, Noverr MC, Fidel PL Jr. Vaginal heparan sulfate linked to neutrophil dysfunction in the acute inflammatory response associated with experimental vulvovaginal candidiasis. mBio. 2017;8(2):e00211-17.
  28. Patras KA et al. Group B Streptococcus. CovR regulation modulates host immune signaling pathways to promote vaginal colonization. Cell Microbiol. 2013;15(7):1154-67.
  29. Patras KA, Rösler B, Thoman ML, Doran KS. Characterization of host immunity during persistent vaginal colonization by group B Streptococcus. Mucosal Immunol. 2015;8(6):1339-48.
  30. Spencer BL et al. Characterization of the cellular immune response to group B streptococcal vaginal colonization. J Innate Immun. 2025;17(1):566-78.
  31. Miao J, Willems HME, Peters BM. Exogenous reproductive hormones nor Candida albicans. colonization alter the near neutral mouse vaginal pH. Infect Immun. 2021;89(2):e00550-20.
  32. Rosen GH et al. Group B Streptococcus. and the vaginal microbiota. J Infect Dis. 2017;216(6):744-51.
  33. Latorre MC et al. Vaginal neutrophil infiltration is contingent on ovarian cycle phase and independent of pathogen infection. Front Immunol. 2022;13:1031941.
  34. Gómez-Oro C et al. Progesterone promotes CXCL2-dependent vaginal neutrophil killing by activating cervical resident macrophage-neutrophil crosstalk. JCI Insight. 2024;9(20):e177899.
  35. Winkler I et al. The cycling and aging mouse female reproductive tract at single-cell resolution. Cell. 2024;187(4):981-998.e25.
  36. Seavey MM, Mosmann TR. Estradiol-induced vaginal mucus inhibits antigen penetration and CD8+ T cell priming in response to intravaginal immunization. Vaccine. 2009;27(17):2342-9.
  37. Li S et al. Estrogen action in the epithelial cells of the mouse vagina regulates neutrophil infiltration and vaginal tissue integrity. Sci Rep. 2018;8(1):11247.
  38. Cohen S, Ost KS, Doran KS. Impact of interkingdom microbial interactions in the vaginal tract. PLoS Pathog. 2024;20(3):e1012018.
  39. MacAlpine J, Robbins N, Cowen LE. Bacterial-fungal interactions and their impact on microbial pathogenesis. Mol Ecol. 2023;32(10):2565-81.

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