Flux de travail optimisé d’affichage de surface de levure pour l’évolution dirigée des protéases

Résumé

Ce protocole offre un flux de travail optimisé pour l’évolution dirigée des protéases virales chez Saccharomyces cerevisiae en utilisant un système de sélection basé sur l’affichage de surface. Il décrit la conception de la bibliothèque d’inserts d’ADN et de la cassette de substrat, l’électroporation optimisée pour une haute efficacité de transformation, la sélection par tri cellulaire activée par fluorescence pour le clivage des protéases, et le séquençage des variantes enrichies.

Résumé

L’évolution dirigée imite le processus évolutif naturel dans un environnement de laboratoire rapide et contrôlé pour faire évoluer des protéines ayant des fonctions ou des traits souhaitables. Le dépistage d’un large pool de gènes mutants codant pour les protéines permet de sélectionner fonctionnellement les variantes souhaitées pour des applications en biotechnologie, médecine et biologie synthétique. En utilisant ce protocole, nous réalisons une évolution dirigée dans Saccharomyces cerevisiae pour concevoir des variantes de protéase à haute spécificité pour une séquence de substrat non native. Nous présentons ces variantes de protéases à la surface des cellules de levure afin de faciliter la sélection des variantes souhaitées via le tri cellulaire activé par fluorescence (FACS) sur plusieurs cycles d’enrichissement. Quatre éléments clés de la cassette substrat sont co-exprimés avec la bibliothèque de protéases : une protéine de fusion composée de (i) la sous-unité du récepteur d’adhésion de la levure Aga2, (ii) les séquences de substrat de sélection et (iii) de contre-sélection, (iv) les séquences de marqueurs épitopiques, et une séquence optionnelle de réticulum endoplasmique (RE) de signal. Les cellules de levure dans lesquelles seule la séquence du substrat de sélection est clivée sont isolées à l’aide de FACS multicolore via des anticorps anti-épitopes fluorescents (marqués par phycoérythrine/fluorescéine isothiocyanate). Nous fournissons ici des détails du protocole optimisé, étape par étape, pour mener une campagne d’évolution de protéase, incluant la conception de la bibliothèque d’inserts d’ADN et la conception de cassettes de substrat, l’électroporation des cellules de levure avec une haute efficacité de transformation (jusqu’à^{10 9} transformants par microgramme d’ADN), la sélection, l’enrichissement et le séquençage des variantes évoluées basées sur FACS. Nous démontrons notre protocole d’évolution dirigée en faisant évoluer la protéase d’inclusion nucléaire A (TEVp) du virus de la gravure du tabac, passant de la séquence naturelle de substrat, ENLYFQ↓S, à la fendure d’une nouvelle séquence, ENLYFE↓S.

Introduction

Les protéases cystéines de la famille des Potyviridae, en particulier les protéases d’inclusion nucléaire A (NIa), représentent une source largement inexploitée d’endopeptidases spécifiques à la séquence. Avec plus de 3 800 membres de la famille caractérisée, les protéases NIa clivent une séquence distincte de substrat composé de sept acides aminés. La famille des potyviraux offre un ensemble diversifié de protéases pour l’ingénierie de systèmes de contrôle des protéines programmables, la construction de circuits génétiques orthogonaux basés sur des protéases, et le développement d’outils biotechnologiques spécifiques à chaque^{séquence 1,2}. Malgré cette diversité naturelle, seules deux protéases NIa, TEVp et la protéase du virus tacheté de veine du tabac (TVMVp), ont été minutieusement caractérisées et conçues pour un usage large en laboratoire et^{biotechnologique 3,4}. Cette boîte à outils limitée des protéases limite l’espace de conception pour les circuits multicomposants nécessitant des activités orthogonales^{de protéases 5}, ce qui motive les efforts pour étendre et caractériser davantage les protéases NIa par une évolution dirigée ^6,7.

L’affichage de surface de la levure s’est imposé comme l’une des plateformes les plus puissantes pour l’évolution dirigée, permettant un criblage à haut débit de bibliothèque protéique via le tri cellulaire activé par fluorescence (FACS^)6,7. Par exemple, le système de dépistage du réticulum endoplasmique de la levure (YESS) associe l’activité de la protéase à l’affichage de surface via la voie sécrétoire de S. cerevisiae ^6,7. Le système YESS a été appliqué à l’ingénierie de nouvelles spécificités protéase-substrat et a démontré son utilité pour des campagnes d’évolution dirigée sur plusieurs tours. Dans ce système, les variantes de protéase sont co-exprimées avec une protéine de fusion contenant une cassette de substrat de clivage avec des marqueurs épitopiques, et l’ancre de surface Aga1p est exprimée dans la souche de levure EBY100. Le marquage différentiel avec des anticorps fluorescents distingue les cassettes de substrat non clivé affichées à la surface cellulaire. Ce mécanisme d’affichage dépendant de l’activité est directement compatible avec la sélection itérative basée sur FACS pour des bibliothèques de 10,⁷ ou plus^{variantes 6,7}.

Un prérequis fondamental pour l’évolution dirigée est la capacité d’introduire des bibliothèques variantes à une échelle suffisante pour assurer une couverture adéquate de l’espace de séquence ciblé. Pour les bibliothèques de mutagenèse à saturation du site couvrant plusieurs positions d’acides aminés, des rendements de transformation de 10⁸ à 10 transformants^uniques sont nécessaires pour garantir que la diversité introduite dans la bibliothèque soit bien représentée dans la population triée. Plusieurs méthodes existent pour introduire de l’ADN exogène dans S. cerevisiae, chacune avec des plafonds de débit distincts. La méthode de transformation chimique conventionnelle utilise de l’acétate de lithium/ADN porteur simple brin/polyéthylène glycol (LiAc/ssDNA/PEG) en raison de sa simplicité et de son accessibilité. Cependant, il atteint généralement des efficacités de transformation de seulement 10^{unités de formation de colonies (CFU) de 4} à^{10 6} par microgramme d’ADN, ce qui ne correspond pas à la variation de séquence nécessaire pour les campagnes de grande bibliothèque⁸. En revanche, la méthode d’électroporation applique un champ électrique à haute tension pour perméabiliser transitoirement la membrane cellulaire et faciliter l’absorption de l’ADN. L’électroporation atteint systématiquement les plus grandes efficacités de transformation parmi les méthodes disponibles, avec des protocoles optimisés rapportant des rendements de 10⁸–10^{9 CFU 9}. Il a été observé que l’efficacité de l’électroporation chez S. cerevisiae est critiquement sensible à la phase de croissance cellulaire, à la masse d’ADN et à la composition tampon, fournissant un cadre largement adapté pour l’évolution dirigée^{à l’échelle des bibliothèques 9}.

Le protocole décrit ici utilise la souche S. cerevisiae EBY100, une souche hôte largement adoptée pour l’affichage de surface de levure. EBY100 a été conçu par Boder et Wittrup en intégrant une cassette d’expression AGA1 sous le contrôle du promoteur GAL1 induit par le galactose dans le locus chromosomique AGA1 de la souche mère déficiente en protéase BJ5465¹⁰. La souche est commercialisée via l’ATCC (numéro de catalogue MYA-4941 ; déposant K.D. Wittrup), porteur du génotype MATa AGA1 ::GAL1-AGA1 ::URA3 ura3-52 trp1 leu2-Δ1 his3-Δ200 pep4 ::HIS3 prb1Δ1.6R can1 GAL (URA+, leu−, trp−). En conséquence, Aga1p et la fusion cassette Aga2p sur substrat sont exprimées à partir du même promoteur inducible au galactose, garantissant que les deux sous-unités sont co-induites et s’assemblent dans le complexe Aga1p–Aga2p lié au disulfure qui ancre la fusion affichée à la paroi cellulaire.

Malgré l’utilisation généralisée d’EBY100 dans les applications d’affichage de levures, aucun protocole publié n’a été optimisé de manière systématique pour électroporer cette souche à des rendements à l’échelle de la bibliothèque. Les paramètres spécifiques à EBY100, tels que la phase optimale de croissance à la récolte, la composition du milieu pendant la sous-culture et la relation quantitative entre la densité optique initiale à 600 nm (OD₆₀₀) et l’efficacité de transformation, restent à caractériser et optimiser rigoureusement. Ici, nous rapportons que l’efficacité de transformation dans EBY100 augmente de manière monotone avec le TD₆₀₀ de la culture lors de la récolte, les cellules en phase terminale de logarithme produisant des taux de transformation nettement plus élevés que celles récoltées au début de la phase de log. Nous avons évalué des paramètres critiques du protocole, notamment les valeurs initiales de_{OD 600} lors de l’inoculation, l’utilisation d’un milieu de 2 × extrait de levure Peptone Dextrose (YPD) pour les sous-cultures, les formulations de tampons d’électroporation et les conditions de croissance post-électroporation. Le protocole présenté ici fournit un flux de travail optimisé étape par étape (Figure 1A–C, Figure 2, Figure 3A–D, Figure 4A–E) pour préparer des cellules EBY100 électrocompétentes et effectuer une électroporation à haute efficacité de bibliothèque d’ADN, donnant des taux de transformation constamment supérieurs à 10⁹ CFU. Pour valider ce protocole, nous avons mené une campagne complète d’évolution dirigée pour concevoir TEVp avec une spécificité de clivage modifiée à travers quatre cycles de sélection et d’enrichissement basés sur FACS. Le séquençage de variantes enrichies de protéase a confirmé une diversification substantielle dans les résidus ciblés dans la poche de liaison au substrat de la protéase, démontrant que le protocole offre une couverture suffisante de l’espace de séquence pour soutenir des campagnes d’évolution productives. Ce protocole sera d’une grande utilité pour les chercheurs utilisant EBY100 pour l’évolution dirigée basée sur l’affichage de surface de la levure et le criblage à haut débit compatible FACS des protéases, anticorps⁹, kinases¹¹ et récepteurs¹², entre autres protéines.

Protocole

Toutes les expériences impliquant S. cerevisiae recombinant ont été menées conformément aux politiques et procédures du Comité institutionnel de biosécurité et de sécurité chimique de l’Université du Texas à Dallas. Les souches de levure recombinantes ont été manipulées sous le contrôle de biosécurité de niveau 1 (BSL-1) conformément aux pratiques microbiologiques institutionnelles établies. L’électroporation, la culture et le tri cellulaire activé par fluorescence (FACS) ont été réalisés conformément aux procédures institutionnelles de biosécurité approuvées. Les cultures de levures et les consommables contaminés ont été décontaminés et éliminés comme déchets bio-dangereux conformément aux directives institutionnelles.

1. Préparation du vecteur et de l’insert

1. Génération de bibliothèques de protéases potyvirales via la mutagenèse par saturation de site
   1. La conception utilise des logiciels de conception de séquences qui chevauchent des oligonucléotides directs et inverses de 30 à 50 mers pour générer une bibliothèque mutante de protéases. Remplacer le codon de type sauvage dans l’oligonucléotide correspondant par un codon dégénéré NNS, où N représente A, T, G ou C, et S représente G ou C, pour les positions ciblées pour la mutagenèse.
   2. Concevoir le chevauchement de 3′ entre chaque paire d’oligonucléotides avant et arrière avec une température de fusion (Tm) de 55 à 60 °C. Concevez les premier et dernier oligonucléotides pour contenir un chevauchement de 50 nt avec le vecteur d’affichage de surface de la levure au-delà des sites de restriction.
   3. Assurez-vous qu’au moins une extrémité de l’insert chevauche exactement une extrémité du vecteur linéarisé pour faciliter la recombinaison^{homologue 13}. Éviter les espaces entre les oligonucléotides^{adjacents 14}.
   4. Resuspendez les oligos à 100 μM avec un H_2Odéionisé. Dans un tube stérile de 1,5 mL, combinez 0,5 μL de chaque oligo pour obtenir un volume final de 200 μL (concentration finale de 250 nM pour chaque oligo).
   5. Installer une réaction PCR avec les composants listés dans le Tableau 1 pour assembler la bibliothèque de protéases, en utilisant les conditions de thermocyclage du Tableau 2.
   6. Installer une seconde réaction PCR en utilisant les oligos les plus externes avant et arrière (Tableau 3) en utilisant le premier produit PCR assemblé comme modèle. Amplifiez le produit comme indiqué dans le tableau 4.
   7. Faites passer le deuxième produit PCR sur un gel d’agarose à 1 % avec du bromure d’ethidium (0,5 μg/mL) à 240 V pendant 30 minutes. Retirez la bande correspondant à la longueur d’ADN attendue.
      REMARQUE : ATTENTION : Le bromure d’ethidium est un mutagène et doit être manipulé à l’aide d’un équipement de protection individuelle (EPI) approprié, incluant une blouse de laboratoire, des gants en nitrile et des lunettes de sécurité. Évitez le contact cutané et l’inhalation. Éliminer les gels, tampons et consommables contenant du bromure d’ethidium comme déchets chimiques dangereux conformément aux directives de sécurité institutionnelles.
   8. Purifiez avec un kit d’extraction en gel. Éluvez 50 μL de_H2Odéionisé.
   9. Mesurez la concentration d’ADN à l’aide d’un spectrophotomètre. Stockez l’ADN à −20 °C.
      REMARQUE : Chaque réaction de 50 μL de la^2e PCR produirait environ 0,5 à 1,0 μg d’ADN total. Puisque chaque électroporation nécessite 12 μg de la bibliothèque de protéases (c’est-à-dire l’insertion), il faut augmenter les réactions en conséquence.
2. Assemblage de cassette de substrat
   1. Préparez les plaques LB-agar et les milieux liquides LB-chloramphénicol. Voir les recettes au tableau 5.
   2. Concevez un ensemble d’oligonucléotides de 30 mérigènes qui se chevauchent dans les directions avant et arrière pour l’assemblage des cassettes de substrat. Concevez les extrémités 5′ de chaque oligonucléotide inverse et l’oligonucléotide avant du fragment suivant pour qu’elles correspondent de 4 nucléotides.
   3. Resuspendez les oligos lyophilisés à 100 μM à l’aide de H_2Odéionisé.
   4. Mélangez les réactifs comme dans le tableau 6.
   5. Utilisez le programme de cyclage du tableau 7 pour recuit et phosphoryler le mélange oligo.
   6. Diluez les oligos recuit 4 fois dans de_l’H2Odéionisé pour atteindre une concentration finale de 1,25 μM.
   7. Combinez le mélange d’oligos recuit avec le vecteur (par exemple, pDD1523), en suivant le tableau 8.
   8. Effectuez l’assemblage Golden Gate, en suivant le programme de cyclisme du tableau 9.
      REMARQUE : Par exemple, le plasmide pDD1523 possède un site de restriction de type IIS (BsmBI) en aval du promoteur GAL1/10. Un assemblage réussi permet l’induction au galactose de la cassette^{substrat 7}.
   9. Transformez le plasmide résultant en E. coli.
   10. Cellules de plaque sur agar LB avec l’antibiotique correspondant. Incuber pendant 16 à 18 heures à 37 °C.
   11. Choisissez des colonies isolées et inoculez-les dans 5 mL de milieux LB. Incuber toute la nuit (16–18 h) à 37 °C avec secouage (220 tr/min).
   12. Extraire les plasmides de cultures nocturnes à l’aide d’un kit de mini-préparation de plasmides.
   13. Mesurez la concentration plasmidique à l’aide d’un spectrophotomètre, puis envoyez pour un séquençage.
3. Linéarisation du vecteur d’affichage de la levure
   1. Linéariser le plasmide d’affichage de la levure, par exemple digère pDD1524 avec des enzymes de restriction SphI et PstI pour préparer le vecteur d’affichage de la levure contenant la cassette substrat pour l’électroporation. Mélangez les réactifs listés dans le tableau 10 et incubez à 37 °C pendant 1 heure.
   2. Faites passer le produit de digestion par restriction sur un gel d’agarose à 1 % à 240 V pendant 30 minutes. Retirez la bande correspondant à la longueur d’ADN attendue et purifiez à l’aide d’un kit d’extraction en gel.
      REMARQUE : Chaque digestion de restriction de 50 μL produirait environ 0,5 à 1,0 μg d’ADN total. Puisque chaque électroporation nécessite 4 μg de vecteur linéarisé, il faut augmenter en conséquence les réactions de digestion.

2. Électroporation

Note : Suivez les procédures de sécurité institutionnelles pour la manipulation des matériaux biologiques et des réactifs, portez des EPI appropriés et éliminez les déchets biologiques et chimiques conformément aux directives institutionnelles.

1. Préparation des tampons, plaques et milieux (2 jours avant l’électroporation)
   1. Préparer des milieux de croissance (1 × YPD ; 2 × YPD ; Acides casminés synthétiques dextrose, SDCAA+ ; et acides casminés de galactose synthétique, SGCAA+), plaques (YPD et SDCAA), tampon d’électroporation et eau stérile suivant les recettes du Tableau 5. Conserver à 4 °C.
2. Préparation d’une plaque striée d’EBY100.
   1. Faites sortir de la levure EBY100 sur l’agar YPD à partir d’un stock de glycérol. Faites pousser à 30 °C pendant 2 jours.
   2. Conservez l’assiette à 4 °C après la croissance.
      REMARQUE : Une plaque striée reste utilisable jusqu’à 1 mois ; Marquez la date de la série sur la plaque.
3. Préparation de la pré-culture de l’EBY100 (1 jour avant l’électroporation)
   1. Préparez 125 mL de 1 × YPD dans une fiole Erlenmeyer de 500 mL.
   2. Préparez 25 mL de 1 × YPD dans un tube conique de 50 mL. À l’aide d’une pointe de micropipette, prélevez les cellules EBY100 de la plaque cultivée pendant 2 jours. Ensuite, transférez les cellules de levure de la pointe de la pipette dans le tube conique contenant 1 × YPD.
      REMARQUE : La traînée de cellules doit former une tache d’environ 1 à 2 mm de long.
   3. Retirez la pointe de la micropipette et faites un vortex sur le tube conique pour garantir un mélange adéquat.
   4. Préparez une pré-culture de 150 mL en transférant 25 mL de 1 × YPD contenant les cellules de levure dans la fiole de 500 mL contenant 125 mL de 1 × YPD. Tourbillonnez pour mélanger.
   5. À l’aide d’un spectrophotomètre, mesurez le OD₆₀₀ en préparant deux microcuvettes d’un trajet de 1 cm : l’une avec 1 mL de 1 × YPD comme témoin blanc et l’autre avec 1 mL de pré-culture
   6. Cultivez 150 mL de pré-culture toute la nuit (16–20 h) à 30 °C avec un mouvement orbital à 270 tr/min.
4. Préparation de la sous-culture au niveau initial_{souhaité de 600} (le jour de l’électroporation)
   1. Préparez le tampon de conditionnement et le milieu de prolifaction, comme décrit dans le tableau 5.
   2. Mesurez le OD₆₀₀ de la préculture nocturne (OD₆₀₀ attendu est de 17–22). Pour être dans la plage linéaire du spectrophotomètre, mesurez une dilution 1:20 de la pré-culture.
   3. Calculez le volume de pré-culture nécessaire pour inoculer une sous-culture de 100 mL. Une sous-culture initiale OD₆₀₀ de 3,0 à 4,0 est recommandée.
   4. Diluez la culture jusqu’à l’OD initial_{souhaité de 600} dans 100 mL de 2 × YPD dans une flasque Erlenmeyer de 500 mL.
   5. Incubez la sous-culture de 100 mL à 30 °C avec des vibrations orbitales à 270 tr/min pendant 4 heures.
5. Préparation des milieux pendant une incubation de 4 heures
   1. Gardez le tampon d’électroporation glacé et l’eau stérile prêts (depuis l’étape 2.1.1).
   2. Préparez le tampon de conditionnement (100 mL), en suivant la recette du Tableau 5. Utilisez 20 mL de tampon de conditionnement par transformation ; Augmentez l’échelle en conséquence. Conserver à température ambiante (20–23 °C).
      REMARQUE : ATTENTION : Le tampon conditionneur contient du dithiothréitol (DTT) et de l’acétate de lithium (LiAc), qui sont des irritants chimiques pouvant provoquer des irritations de la peau et des yeux. Portez des EPI appropriés, y compris une blouse de laboratoire, des gants en nitrile et des lunettes de sécurité, et manipulez ces réactifs conformément aux procédures institutionnelles de sécurité chimique. Éliminer les solutions inutilisées et les tampons usagés comme déchets chimiques conformément aux directives institutionnelles.
   3. Préparez un milieu de croissance (50 mL) : mélangez ensemble 25 mL de 2 × YPD et 25 mL de sorbitol de 1 M. Utilisez 8 mL de milieu de croissance par transformation. Conserver à température ambiante (20–23 °C).
6. Préparation des cellules de levure électrocompétentes après incubation de 4 heures.
   1. Divisez la sous-culture de 100 mL en deux tubes coniques de 50 mL. Collectez les cellules par centrifugation à 4 °C et 1 500 × g pendant 3 minutes, puis décantez le milieu. Gardez les cellules sur la glace jusqu’à la fin de l’étape 2.6.4.
   2. Resuspendez doucement chaque pellet cellulaire avec 25 mL d’eau stérile glacée. Centrifugez à 4 °C et 1 500 × g pendant 3 minutes, puis décantez le milieu.
   3. Répétez l’étape 2.6.2.
   4. Resuspendez doucement chaque pellet cellulaire avec 25 mL de tampon d’électroporation glacé. Centrifugez à 4 °C et 1 500 × g pendant 3 minutes, puis décantez le milieu.
   5. Retirez les cellules de la glace et resuspendez doucement chaque pellet cellulaire avec 10 mL de tampon de conditionnement à température ambiante (20–23 °C). Ensuite, concentrez-vous dans une seule flasque Erlenmeyer de 125 mL et incubez à 30 °C avec un mouvement orbital à 270 tr/min pendant 30 minutes.
   6. Versez les cellules dans un tube de 50 mL. Centrifugez à 4 °C et 1 500 × g pendant 3 minutes. Découper les médias.
   7. Resuspendez doucement la pellete cellulaire avec 50 mL de tampon d’électroporation glacé. Centrifugez à 4 °C et 1 500 × g pendant 3 minutes, puis décantez le milieu.
   8. Resuspendez la pellete cellulaire à un volume final de 1 mL en ajoutant environ 100 à 200 μL de tampon d’électroporation. Gardez les cellules sur la glace jusqu’à l’électroporation.
      REMARQUE : Les cellules électrocompétentes peuvent être congelées (c’est-à-dire placées dans un congélateur à –80 °C) et utilisées plus tard sans perte significative d’efficacité d’électroporation.
7. Électroporation, excroissance et plaque
   1. Pré-refroidissement des cuvettes d’électroporation avec un espace de 0,2 cm sur la glace.
   2. Transférez 380 μL du projectile en suspension dans un tube stérile de 1,5 mL. Mélangez avec 4 μg d’ADN plasmidique ou 4 μg de vecteur plasmidique linéarisé et 12 μg d’insert. Mélangez doucement en pipettant.
      REMARQUE : Pour maximiser le nombre de cellules électroporées, les concentrations d’ADN vectoriel et d’insertion devraient idéalement être de 700 à 800 ng/μL. Si les concentrations sont inférieures, utilisez un concentrateur à vide.
   3. Transférez la suspension dans la ou les cuvettes d’électroporation pré-refroidies. Gardez sur la glace pendant 5 minutes.
   4. Essuyez les côtés de la cuvette après 5 minutes avec une lingette de laboratoire sans peluches pour éliminer l’humidité résiduelle, qui peut provoquer des arcs lors de l’électroporation. Évitez toute bulle ou cellule au-dessus des plaques métalliques dans la cuvette, car elles peuvent aussi provoquer des arcs. Pour maintenir la température froide de la cuvette, ne touchez pas aux électrodes de la plaque.
   5. Préparez 8 mL de milieu de croissance dans un tube conique de 50 mL.
   6. Électroporez les cellules avec les réglages suivants : une tension de 2,5 kV, une capacité de 25 μF, et une résistance de 200 Ω⁹. La plage de constantes de temps acceptable est de 2,8 à 4,5 ms.
      REMARQUE : ATTENTION : L’électroporation implique des impulsions électriques à haute tension. Assurez-vous que les cuvettes sont bien bien placées et respectez les instructions de fonctionnement du fabricant. Éliminer les cuvettes d’électroporation usagées comme déchets bio-dangereux conformément aux directives institutionnelles.
   7. Inondez immédiatement la cuvette avec environ 200 μL de milieu de croissance provenant du tube conique et transférez les cellules électroporées dans le tube conique de 50 mL. Ajoutez 200 à 350 μL supplémentaires de milieu de croissance jusqu’à ce qu’il ne reste plus de liquide visible dans la cuvette.
   8. Incubez le tube conique de 50 mL de cellules électroporées dans 8 mL de milieu de croissance à 30 °C sans secousser pendant 1 heure. Inversez le tube toutes les 15 minutes pour mélanger.
   9. Collectez les cellules par centrifugation à 1 500 × g, 25 °C pendant 3 minutes. Ensuite, décantis le média.
   10. Resuspendre les cellules dans un milieu de perte de levure approprié pour maintenir la sélection des cellules transformées. Pour les plasmides contenant le marqueur de sélection TRP1, il faut resuspendre les cellules dans 250 mL de SDCAA+ (qui ne contient pas de tryptophane) afin de récupérer sélectivement la levure qui a conservé le plasmide.
   11. Incubez toute la nuit (16–20 h) à 30 °C avec un mouvement orbital à 270 tr/min.

3. Induction, coloration et tri cytométrique en flux des cellules de levure

1. Induction de la bibliothèque de protéases et de la cassette substrat (1 jour avant le tri)
   1. Mesurez OD₆₀₀ comme à l’étape 2.4.2 après la croissance immédiate des transformants dans les milieux de déglutissement.
   2. Aliquote 12 mL de transformants de levure et centrifugeuse à 3 200 × g pendant 5 minutes.
   3. Retirez le surnageant et remettez la pellete cellulaire en milieu d’induction SGCAA+ à un OD₆₀₀ de 0,5. Calculez le volume de resuspension requis à l’aide de l’équation de dilution, C₁V₁ = C₂V₂.
   4. Transférer dans une flasque Erlenmeyer de 125 mL et faire pousser toute la nuit pendant 18 à 24 heures à 30 °C avec un mouvement orbital à 270 tr/min.
2. Coloration par anticorps fluorescents (le jour du tri)
   1. Mesurez_{le OD 600} des cellules après l’induction. Utilisez deux cuvettes : l’une avec 1 mL de SGCAA+, et l’autre avec 950 μL de SGCAA+ mélangés à 50 μL de cellules. Multipliez la valeur mesurée_{de 600} de l’OD par 20 pour obtenir le véritable OD₆₀₀ des cellules post-induction.
   2. Normaliser chaque échantillon à 3 × 10⁷ cellules pour la coloration des anticorps et le tri FACS. Utilisez C₁V₁ = C₂V₂ pour calculer le volume de cellules à transférer depuis la fiole d’induction.
      REMARQUE : Pour la mutagenèse de saturation NNS à quatre sites, la taille théorique de la bibliothèque est de 10⁶ variantes. Pour échantillonner suffisamment la bibliothèque, criblez au moins 10 fois la taille de la bibliothèque, soit 10^{cellules 7} . Exemple : si désiré_{C 1}V₁ = 3 × 10⁷ cellules et C₂ = post-induction OD₆₀₀ de 6 (c’est-à-dire 6 × 10⁷ cellules/mL), alors aliquote 500 μL de cellules induites (c’est-à-dire V₂ = 3 × 10⁷ cellules / 6 × 10⁷ cellules/mL = 500 μL).
   3. Transférez le volume calculé des cellules dans un tube de 1,5 mL et centrifugez à 5 000 × g pendant 5 minutes.
   4. Retirez le surnageant et résuspendez dans 500 μL de solution physiologique tamponnée phosphate (PBS) + 0,5 % d’albumine sérique bovine (BSA).
   5. Centrifugez à 5 000 × g pendant 5 minutes et répétez l’étape 3.2.4.
   6. Centrifugez à 5 000 × g pendant 5 minutes, puis complétez l’étape 3.2.7.
   7. Préparez un mélange de coloration anticorps dans un tube de 1,5 mL contenant de l’isothiocyanate anti-HA fluorescéine (FITC) (0,5 μg/10⁷ cellules), l’anti-FLAG phycoérythrine (PE) (0,05 μg/^{10 7} cellules) et PBS + 0,5 % de BSA (100 μL/^{10 7} cellules). Garde le tube sur la glace.
   8. Retirez le surnageant et resuspendez avec le mélange de teinture. Utilisez 300 μL de mélange de coloration par 3 × 10⁷ cellules. Ne faites pas de vortex dans le tube ; Seulement inverser ou faire un flick.
   9. Gardez les cellules sur la glace dans le noir pendant 1 heure après la resuspension.
3. Lavage post-tache
   1. Centrifugez les cellules colorées à 5 000 × g pendant 5 minutes. Retirez le surnageant et remettez la pellete en suspension dans un PBS contenant 0,5 % de BSA en utilisant 0,5 mL par 1 × 10⁷ cellules (par exemple, 500 μL pour 1 × 10^{7 cellules} ou 1,5 mL pour 3 × 10⁷ cellules).
   2. Centrifugeuse à 5 000 × g, 5 min. Retirez le surnageant, resuspendez dans 750 μL de PBS + 0,5 % de BSA.
   3. Transférez 750 μL supplémentaires de PBS + 0,5 % de BSA dans un tube de collecte de 10 mL.
4. FACS
   1. Effectuer le démarrage et la préparation nécessaires du cytomètre pour une nouvelle expérience.
   2. Créez trois diagrammes de points. Sur le premier diagramme de points, sélectionnez le nom de l’axe X pour afficher le canal de la zone de diffusion directe (FSC-A) et le nom de l’axe Y pour afficher le canal de la zone de diffusion latérale (SSC-A).
      REMARQUE : Cela facilitera la sélection des cellules vivantes.
   3. Gardez le nom de l’axe X pour afficher le canal FSC-A tout en changeant le canal de l’axe Y pour afficher la hauteur de diffusion directe (FSC-H) sur le second point-plot.
      REMARQUE : Cela facilitera le choix des chansons.
   4. Sélectionnez le nom de l’axe X pour afficher le canal PE et celui de l’axe Y pour afficher le canal FITC sur le troisième diagramme de points.
   5. Effectuez un contrôle négatif sur le cytomètre en utilisant les canaux 530/30 nm (FITC) et 585/42 nm (PE). Effectuer le tri à l’aide d’une buse de 70 μm à une pression de gaine de 70 psi. Prélever des échantillons à une vitesse de 4000 à 5000 événements/s.
   6. Tracez une porte polygonale autour de la population principale de cellules de levure intactes pour exclure les débris et les petites particules présentant des signaux faibles de FSC-A et SSC-A sur le premier diagramme de points (FSC-A contre SSC-A).
   7. Des singlets de porte sur un graphique FSC-H versus FSC-A à l’intérieur de cette porte, en sélectionnant la population linéaire présentant une relation proportionnelle entre FSC-H et FSC-A. Excluez les événements qui s’écartent de la distribution linéaire et correspondent aux doublets et aux agrégats de cellules.
      REMARQUE : Le troisième diagramme de points pour PE versus FITC affichera un groupe diagonal de points pour le contrôle négatif (c’est-à-dire les cellules de levure exprimant la cassette du substrat intact).
   8. Prélever des échantillons et trier les cellules de levure selon les valeurs de PE/FITC souhaitées dans un ou plusieurs tubes de collecte. Analyser un nombre total de cellules correspondant à au moins 10 fois la taille théorique de la bibliothèque afin d’assurer une représentation adéquate de toutes les variantes (par exemple, analyser ~1 × 10⁷ cellules pour une bibliothèque avec une diversité théorique de ~1 × 10⁶ variantes).
   9. Positionnez la porte de tri sous la diagonale PE/FITC de la population témoin négative.
      REMARQUE : Des portes plus strictes améliorent l’enrichissement des variantes souhaitées mais réduisent la récupération cellulaire.
5. Après le FACS
   1. Tube(s) de collecte centrifugeuse à 3 200 × g pendant 5 minutes. Retirez soigneusement le surnageant, en laissant 1 mL, puis resuspendez dans 5 mL de PBS.
      REMARQUE : Laissez 1 mL de surnageant, car la granule cellulaire au fond ne sera pas visible après centrifugation.
   2. Centrifuge à nouveau à 3 200 × g pendant 5 minutes. Retirez le surnageant, il ne reste que 1 mL. Resuspendez avec 4 mL de SDCAA+.
   3. Dans une fiole Erlenmeyer de 250 mL, ajoutez 15 mL de SDCAA+. Transférez les cellules en suspension de l’étape 3.5.2 dans cette fiole.
   4. Incuber toute la nuit pendant 18 à 24 heures à 30 °C avec un mouvement orbital à 270 tr/min.
   5. Répétez les étapes 3.1, 3.2, 3.3 et 3.4 pour chaque cycle d’évolution dirigée.

4. Récupération et séquençage des plasmides individuels

1. Développer des colonies individuelles
   1. Fabriquez un stock de glycérol en mélangeant 500 μL de la culture liquide après l’étape 3,5.4 et 500 μL de glycérol stérile à 50 %, obtenant ainsi une solution de bouillon de glycérol à 25 %. Vortex pour mélanger soigneusement les cellules.
   2. Conservez au congélateur à –80 °C toute la nuit. Pour un stockage à long terme, transférez dans de l’azote liquide.
   3. Grattez la base de glycérol à l’aide d’une pointe stérile de 1000 μL et mélangez-la à 100 μL de SDCAA+. Placez ce mélange sur une plaque SDCAA et évadez-le à l’envers à 30 °C.
   4. Choisissez les colonies après 3 jours, et cultivez-les toute la nuit dans 1,5 mL de SDCAA+ dans des tubes de 14 mL.
2. Effectuer un mini-prep de levure pour extraire les plasmides
   1. Pelletez la culture toute la nuit en centrifugant à 16 000 × g pendant 1 minute puis en resuspendant 200 μL de la solution 1 à partir d’un kit de purification de plasmides de levure.
   2. Ajoutez 5 μL de solution enzymatique lytique (5 U/μL).
   3. Incubez dans un incubateur à 37 °C pendant 4 heures sur un mélangeur de bout en bout.
   4. Effectuez un cycle de congélation-dégel en congelant à -80 °C pendant 20 minutes et en décongelant à 42 °C pendant 10 minutes dans un bain-marie.
   5. Ajoutez 200 μL de la solution 2 d’un kit de purification de plasmides de levure, mélangez en inversant 2 à 3 fois, puis laissez reposer 5 minutes.
   6. Ajoutez 400 μL de solution 3 provenant d’un kit de purification de plasmides de levure et mélangez en inversant 2 à 3 fois. Centrifugeuse à 16 000 × g pendant 5 minutes.
   7. Purifiez l’ADN plasmidique à l’aide d’un kit de purification avec une colonne de forte capacité de liaison à l’ADN.
      REMARQUE : En raison de la grande quantité d’ADN génomique de levure cisaillé provenant des cellules lysées, une colonne à base de silice avec une capacité de liaison à l’ADN plus élevée (35 μg) doit être utilisée au lieu d’une colonne de purification de l’ADN plasmidique de levure à capacité plus faible (5 μg⁾¹⁵.
   8. Mesurez la concentration d’ADN à l’aide d’un spectrophotomètre. Les rendements d’ADN sont de 10 à 30 ng/μL.
3. Transformer les plasmides purifiés en cellules d’E. coli chimiquement compétentes
   1. Préparez les milieux SOC, en suivant la recette du tableau 5, ainsi que les plaques de LB-chloramphénicol. Préchauffez également un bain-marie à 42 °C.
   2. Réchauffez une plaque LB-chloramphénicole pour chaque plasmide à 37 °C pendant 20 minutes.
   3. Sortez un tube de cellules chimiquement compétentes du congélateur à –80 °C et décongelez-les sur de la glace.
   4. Aliquote 30 μL de cellules compétentes pour chaque plasmide dans un tube de 1,5 mL sur glace.
   5. Pipeter 3 μL de plasmide dans des cellules compétentes. Faites un coup pour mélanger et laissez reposer 5 minutes sur de la glace.
   6. Effectuez un choc thermique en incubant brièvement les cellules dans le bain-marie à 42 °C pendant 40 secondes.
   7. Incubez sur glace pendant 2 minutes.
   8. Ajoutez 300 μL de milieu SOC aux cellules et incubez pendant 15 minutes à 37 °C à 220 tr/min.
   9. Placez 50–100 μL de cellules compétentes transformées sur des plaques préchauffées.
   10. Incubez les plaques à 37 °C à l’envers pendant 18 heures.
4. Récolte de colonies
   1. Ajoutez 5 mL de milieu liquide LB-chloramphénicole à des tubes de culture à fond rond de 14 mL.
   2. Choisissez une colonie avec une pointe stérile de 1000 μL, puis plongez-la dans un tube de culture.
   3. Placez les tubes dans un vibrateur (220 tr/min, angle 30°–45° pour maximiser l’aération) à 37 °C pendant 18 heures.
5. Extraction de plasmides à partir de culture liquide bactérienne
   1. Centrifugez les cultures liquides à 3 200 × g pendant 4 minutes. Décante le surnageant.
   2. Extraire les plasmides des cultures nocturnes à l’aide d’un kit de purification des plasmides.
   3. Mesurer la concentration des plasmides purifiés à l’aide d’un spectrophotomètre.
6. Soumettre les plasmides pour séquençage
   REMARQUE : Utilisez des services tels que le séquençage des nanopores à plasmides entiers, ou, alternativement, le séquençage Sanger avec une amorce flanquant la région mutagenisée.

Résultats

Une construction efficace de la bibliothèque est essentielle pour assurer une couverture suffisante de l’espace mutationnel. Pour éviter la perte de variantes fonctionnelles rares, le nombre de transformants doit atteindre au moins 10× à 100× la taille théorique de la bibliothèque. Parce que l’efficacité de transformation chez S. cerevisiae est influencée par la concentration cellulaire et est la plus élevée dans les cellules¹⁶ en phase logarithmique précoce à moyenne, nous avons optimisé la densité initiale des cellules avant l’électroporation. Les cultures de levure ont été sous-cultivées à des valeurs initiales de_{DO 600} allant de 1,0 à 4,0 et incubées pendant 4 h (n = 2–4 expériences biologiques indépendantes), après quoi les valeurs finales de_{DO 600} ont été cartographiées sur la courbe de croissance de S. cerevisiae afin de confirmer que les cellules restaient dans la phase de croissance du logarithmicycle (Figure 5A, Figure supplémentaire 1).

L’électroporation de ces cultures avec de 4 μg d’ADN plasmidique (n = 2 expériences biologiques indépendantes) a montré que l’efficacité de transformation différait significativement dans les conditions initiales de OD₆₀₀ (ANOVA unidirectionnelle, p = 8,92 × 10⁻⁷). Par rapport aux cultures initiées à_{OD 600} = 1,0, toutes les densités cellulaires de départ plus élevées produisaient des efficacités de transformation significativement supérieures (test de comparaison multiple de Dunnett ; OD₆₀₀ = 1,5, ajusté p = 0,0020 ; OD₆₀₀ ≥ 2,0, ajusté p < 0,0001), avec la plus haute efficacité de transformation observée à un OD_{initial de 600} de 4,0. Pour tirer parti de la capacité naturelle des cellules de levure à effectuer la recombinaison homologue, nous avons également électroporé 4 μg du vecteur plasmique linéarisé et 12 μg de l’insert (c’est-à-dire la bibliothèque de protéases) dans des cellules de levure (n = 2 expériences biologiques indépendantes). L’efficacité de transformation différait significativement entre les conditions initiales testées du OD₆₀₀ (ANOVA unidirectionnelle, p = 0,0023). Par rapport aux cultures initiées à₆₀₀ = 1,0, les efficacités de transformation étaient significativement plus élevées à₆₀₀ = 3,0 (p = 0,0018 ajusté), 3,5 ( p = 0,0062 ajusté) et 4,0 ( p = 0,0024 ajusté) (test de comparaisons multiples de Dunnett). Nous avons observé la plus grande efficacité de transformation à une densité de sous-culture initiale modérée (_{DO 600} = 3,0), indiquant un équilibre optimal entre la compétence cellulaire et l’efficacité de recombinaison dans ces conditions (Figure 5B). Comparée à la transformation uniquement par plasmides, la co-électroporation d’un vecteur linéarisé et d’un insert de bibliothèque de protéase (n = 2 réplications biologiques indépendantes) a donné des efficacités de transformation significativement plus élevées dans les conditions initiales testées OD₆₀₀ (ANOVA bidirectionnelle sur les efficacités de transformation transformées log10, p = 9,40 × 10⁻¹²). En moyenne, la co-électroporation a produit une augmentation moyenne de 121 fois de l’efficacité de transformation (IC 95 %, 63–233 fois) par rapport à la transformation uniquement par plasmide (Figure 5B).

Lors d’une série FACS de cellules de levure contenant la bibliothèque de protéases mutantes et la cassette de sélection du substrat (Figure 6A), les cellules afficheront soit une cassette tronquée, soit une protéase qui clivage encore le substrat de contre-sélection (Q1), exprimeront des variantes de protéases non fonctionnelles (Q2), ou exprimeront des variantes de protéases qui ne coupent avec succès que le substrat de sélection (Q3). Les cellules de levure exprimant des variants non fonctionnels sont apparues comme une population dominante répartie le long de la diagonale dans les graphiques PE versus FITC, reflétant la co-rétention des deux signaux (Figure 6A, Q2). En revanche, les variantes fonctionnelles qui clivagaient le substrat de sélection tout en épargnant le substrat natif (contre-sélection) formaient une population distincte hors diagonale, caractérisée par une intensité de signal FITC élevée et moyenne à faible (Figure 6A, Q3). L’application d’une stratégie de gating stricte pour isoler cette population hors diagonale a entraîné un enrichissement progressif des variantes fonctionnelles sur les cycles successifs de tri¹⁰. Cet enrichissement est observé visuellement comme un groupe de cellules de plus en plus défini, séparé du groupe diagonal (Figure 6B, de gauche à droite). Si aucune population distincte hors diagonale n’est observée, cela peut indiquer une faible qualité de bibliothèque, une expression insuffisante ou des conditions de coloration sous-optimales. En témoin négatif, la figure 6C,D montre les cellules de levure électroporées, induites et non colorées, ainsi que les histogrammes de fluorescence FITC et PE correspondants.

Au sein de la population enrichie hors diagonale, les sous-populations peuvent être ensuite déterminées en fonction de l’intensité du FITC. Les cellules présentant un signal FITC moyen peuvent être triées séparément de celles avec un signal FITC faible. Le séquençage de ces populations distinctes a révélé des profils de mutations uniques (Tableau 11), indiquant que des efficacités de clivage variables sont associées à différentes variantes de protéase.

Figure 1 : Préparation au vecteur et à l’insert. (A) Génération de bibliothèques de protéases potyvirales via la mutagenèse saturée des sites. (B) Assemblage et intégration de la cassette de substrat dans le vecteur d’affichage de la levure (pDD1523). (C) Linéarisation du vecteur d’affichage de la levure (pDD1524) via la digestion par restriction. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figurine.

Figure 2 : Électroporation de la cassette substrat et de la bibliothèque de protéases mutantes amplifiée par PCR en cellules EBY100 compétentes. (Boîte pointillée) Circularisation in vivo du plasmide contenant à la fois la protéase et la cassette substrat. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figurine.

Figure 3 : Induction, coloration et tri cytométrique en flux des cellules de levure. (A) Induction de la bibliothèque de protéases et de la cassette substrat. (B) Coloration par anticorps fluorescents : coloration avec anti-HA fluorescéine isothiocyanate (FITC) et anti-FLAG phycoythrine (PE). (C) Les cellules colorées sont triées à l’aide du tri cellulaire activé par fluorescence (FACS). (D) Récupération de cellules triées par FACS dans des milieux de sélection. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figurine.

Figure 4 : Récupération des plasmides et séquençage des cellules de levure triées. (A) Plaque des cellules de levure triées. (B) Extraction de plasmides à partir de colonies de levures individuelles. (C) Transformation d’E. coli des plasmides extraits. (D) Extraction de plasmides à partir de colonies individuelles d’E. coli. (E) Séquençage nanopore des plasmides extraits. Icônes de flasques et de tubes adaptées respectivement de DBCLS et Helicase 11, via Bioicons (https://bioicons.com) et adaptées selon les termes de la licence Creative Commons Attribution 4.0 International (CC BY 4.0). Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figurine.

Figure 5 : Courbes de croissance de la levure dans différents milieux de croissance et influence de la densité optique initiale à 600 nm (OD₆₀₀) de sous-culture sur l’efficacité de l’électroporation de la levure. (A) Courbes de croissance de la levure en 1 × extrait de levure Peptone Dextrose (YPD), 2 × YPD, Agar dextrose Synthétique des acides casminés sans antibiotiques (SDCAA-), et Agar dextrose Synthétique des acides casminés avec antibiotiques (SDCAA+). (B) Efficacité de transformation de levure électroporée avec un vecteur plasmidique de 4 μg à divers OD initiale_{de sous-culture 600}, et efficacité de transformation utilisant un vecteur linéarisé (4 μg) et un insert de bibliothèque de protéase (12 μg) aux mêmes valeurs initiales OD₆₀₀. Les données dans (A) sont présentées comme OD₆₀₀ ± SD issues de deux expériences biologiques indépendantes (n = 2). Les données dans (B) sont présentées comme le nombre moyen de transformants par électroporation sur un axe logarithmique des y, avec des répliques biologiques individuelles indiquées sous forme de cercles (n = 2). La signification statistique pour les expériences d’optimisation plasmide et d’optimisation par électroporation vectoriel et insert a été déterminée à l’aide d’ANOVA unidirectionnelle sur des efficacités d’électroporation transformées log10, suivie du test de comparaison multiple de Dunnett utilisant OD₆₀₀ = 1,0 comme témoin. ns, pas significatives ; p < 0,01 (**) ; p < 0,0001 (****). La signification statistique de la différence entre les efficacités de transformation plasmide uniquement et vecteur-plus-insert a été déterminée à l’aide d’ANOVA bidirectionnelle sur les efficacités de transformation transformées log10. p < 0,0001 (****). Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figurine.

Figure 6 : Enrichissement des clones de levure basé sur le tri cellulaire activé par fluorescence (FACS). (A) Représentation schématique de la stratégie de verrouillage. Les cellules étaient divisées en trois régions : Q1, cellules de phycoythrine (PE) basses ; Q2, cellules PE élevées/fluorescéine isothiocyanate (FITC) élevées ; et Q3, cellules PE élevées avec fluorescence FITC faible à intermédiaire. Les cellules de Q3 ont été collectées pour enrichissement. (B) Graphiques FACS représentatifs d’une campagne évolutive indépendante montrant des cycles séquentiels de tri avec une stricteur croissante de verrouillage FITC. Les cellules à FITC moyen et faible ont été collectées séparément pour le séquençage. Les pourcentages indiquent la fraction de cellules de levure vivantes et uniques dans la population verrouillée. (C) Graphique FACS représentatif montrant des cellules de levure électroporées et non colorées comme témoin négatif. (D) Histogrammes des intensités de fluorescence FITC-A (gauche) et PE-A (droite) correspondant aux données indiquées dans (C). Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figurine.

Tableau 1 : Mélange de réaction pour l’amplification PCR de la bibliothèque de protéases au premier cycle. Composition de la réaction PCR utilisée pour l’amplification du premier cycle de la bibliothèque de protéases, incluant les concentrations finales et les quantités de chaque réactif dans une réaction de 50 μL. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce tableau.

Tableau 2 : Conditions de cyclage pour l’amplification PCR de la bibliothèque de protéases au premier tour. Le programme de cycle thermique a été utilisé pour l’amplification PCR en premier cycle de la bibliothèque de protéases. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce tableau.

Tableau 3 : Mélange de réaction pour l’amplification PCR au second cycle de la bibliothèque de protéases. Composition de la réaction PCR utilisée pour l’amplification de second cycle de la bibliothèque de protéases, incluant les concentrations finales et les quantités de chaque réactif dans une réaction de 50 μL. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce tableau.

Tableau 4 : Conditions de cyclage pour l’amplification PCR de 2e cycle de la bibliothèque de protéases. Le programme de cycle thermique a été utilisé pour l’amplification PCR de la bibliothèque de protéases en second cycle. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce tableau.

Tableau 5 : Milieux et réactifs pour l’électroporation et la croissance des levures. Description tabulaire de la masse requise par chaque composant chimique pour formuler des quantités spécifiques de 1 × et 2 × extrait de levure Peptone Dextrose (YPD), tampon d’électroporation, tampon de conditionnement, milieux de prolifaction, acides casminés synthétiques dextrose avec antibiotiques (SDCAA+), acides calaminés de galactose synthétique avec antibiotiques (SGCAA+), milieux de bouillon de lysogenèse (LB), milieux LB-chloramphénicols, milieux Super Optimal Bouillon (SOB) et Super Optimal Bouillon avec milieux de répression catabolite (SOC). Des instructions pour la préparation des solutions stock, telles que 2 M de sorbitol, 1 M de dithiothréitol (DTT) et 2 M d’acétate de lithium (LiAc), sont incluses. Des instructions supplémentaires pour la préparation des plaques d’agar SDCAA, LB et YPD sont fournies. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce tableau.

Tableau 6 : Mélange de réaction pour le recuit et la phosphorylation des oligos. Composition du mélange réactionnel utilisé pour le recuit simultané et la phosphorylation des oligonucléotides pour l’assemblage de cassettes sur substrat. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce tableau.

Tableau 7 : Conditions de cyclage pour le recuit et la phosphorylation des oligos. Programme de température utilisé pour le recuit des oligonucléotidiques et la phosphorylation pour l’assemblage de cassettes de substrat. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce tableau.

Tableau 8 : Mélange de réaction pour l’assemblage Golden Gate de la cassette substrat et du plasmide vectoriel. Composition de la réaction d’assemblage Golden Gate utilisée pour liganer la cassette substrat dans le plasmide vectoriel. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce tableau.

Tableau 9 : Conditions de cyclage pour l’assemblage Golden Gate du plasmide de cassette et vecteur de substrat. Programme de cyclage thermique utilisé pour l’assemblage Golden Gate. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce tableau.

Tableau 10 : Mélange de réaction pour la linéarisation du plasmide vectoriel. Composition de la réaction de digestion de restriction utilisée pour linéariser le plasmide vectoriel avant la construction de la bibliothèque. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce tableau.

Tableau 11 : Résultats du séquençage nanopore des variants TEVp clivant ENLYFES. Les plasmides ont été extraits des cellules de levure après la quatrième et dernière séance FACS. Les mutations de chaque clone sont indiquées par rapport à la séquence de type sauvage. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce tableau.

Figure supplémentaire 1 : Relation entre la densité de culture initiale et finale de l’EBY100 pendant la sous-culture. Les cultures EBY100 ont été subcultivées à des valeurs initiales différentes de₆₀₀ D, et la DO finale₆₀₀ a été mesurée après incubation dans des conditions de croissance identiques (30 °C, 220 trpm). La densité finale de culture augmentait linéairement avec l’augmentation de l’OD initial₆₀₀ (R² = 0,969, p = 5,77 × 10⁻⁵). Les points de données représentent les moyennes ± DE de (n = 2–4) réplications biologiques indépendantes. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.

Figure supplémentaire 2 : Conception rationnelle de la bibliothèque de mutagenèse TEVp. Représentation cartoon de TEVp (ID PDB : 1LVB) avec les quatre résidus (or) <5Å éloignés du résidu P1 (violet) ciblés pour la mutagenèse de saturation du site. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.

Discussion

L’évolution dirigée est une méthode à haut débit qui utilise des cycles itératifs de diversification et de sélection pour identifier des protéines ayant une fonction biochimique améliorée ou nouvelle¹⁷. Dans ce protocole, nous détaillons un flux de travail optimisé pour faire évoluer la reconnaissance protéase-substrat à l’aide d’un système d’affichage de surface cellulaire chez S. cerevisiae. Le système d’affichage de surface associe l’activité des protéases à un phénotype détectable basé sur la fluorescence, permettant un enrichissement FACS des clones désirés. Nous fournissons les étapes détaillées pour l’assemblage des cassettes de bibliothèques de protéases et de substrats, l’électroporation à haute efficacité, le tri et la porte FACS, ainsi que le séquençage final des variantes de protéases.

L’une des étapes les plus essentielles de l’évolution dirigée est d’assurer une diversité suffisante dans les bibliothèques et une couverture des mutations^{potentielles 17}. Nos expériences d’efficacité d’électroporation montrent qu’une sous-culture initiale_{OD 600} de 3,0 donne la plus haute efficacité de transformation, dépassant^10,9 UFC. Cette échelle, obtenue grâce à une électroporation optimisée de la levure, dépasse largement celle des méthodes conventionnelles de transformation chimique et permet une couverture adéquate de grandes bibliothèques combinatoires ^8,9. Un filtrage et un tri FACS précis sont essentiels pour séparer les cellules présentant les propriétés de clivage souhaitées de celles présentant un clivage non spécifique. Lors de plusieurs cycles de sélection basée sur FACS, la stratégie de contrôle devient de plus en plus stricte pour enrichir sélectivement les variantes de protéase souhaitées. Si la barrière est trop large, les cellules indésirables peuvent être triées avec les variantes souhaitées. Un contrôle strict (par exemple, des seuils de plus en plus bas pour le signal FITC entre les cycles) permet à la population cellulaire de s’enrichir pour les variantes de protéases ayant une spécificité et une activité plus élevées envers la nouvelle séquence de substrat^{cible 10}. Conformément aux campagnes^{précédentes 7,18}, nous avons réalisé la mutagenèse NNS-codon de quatre résidus dans la poche de liaison au substrat de TEVp qui interagissent avec le résidu P1 du substrat, Q (T146, D148, H167, S170) (Figure supplémentaire 2). Les graphiques FACS présentés à la Figure 6B représentent une expérience de tri représentative unique illustrant la stratégie de contrôle et le flux de travail d’enrichissement. Fait intriguant, les résultats de notre campagne ont produit des variants TEVp avec un ensemble différent de mutations d’acides aminés (Tableau 11). Ces résultats soutiennent une caractéristique clé de l’évolution des protéases : plusieurs parcours évolutifs peuvent mener au même objectif.

Des modifications et des stratégies de dépannage peuvent être nécessaires lors de la réalisation des expériences. Par exemple, lors de l’électroporation, travailler sur la glace lorsque cela est nécessaire et resuspendre soigneusement les granulés cellulaires à chaque étape garantit que les cellules sont vivantes et en bonne santé avant l’électroporation. Les cellules de levure sont délicates tout au long des étapes d’électroporation jusqu’à l’étape de récupération de la prolifference. De plus, une modification du liquide de la gaine FACS peut être nécessaire pour prévenir la floculation des cellules de levure. Le liquide de gaine est couramment utilisé dans les machines FACS et peut contenir des conservateurs inhibant la croissance bactérienne et fongique. Par conséquent, le liquide de gaine peut être remplacé par du PBS pur afin d’éviter la mort cellulaire lors du tri.

Le système d’affichage de surface de la levure nécessite des protéines correctement repliées pour traverser avec succès la voie sécrétoire. Certaines variantes de protéase peuvent perdre leur activité en raison d’un mauvais repliement, entraînant des faux positifs lors de la sélection du FACS causés par un clivage non spécifique ou une fluorescence de fond. Des sources bien caractérisées de faux positifs méritent d’être notées pour des campagnes basées sur des plasmides comme celle-ci. Parce que le clivage est perçu comme une perte de l’épitope C-terminal, toute mutation qui perturbe cette marque produit le même phénotype à faible FITC qu’un véritable événement de clivage ; De telles mutations par étiquette apparaissent lors de la recombinaison homologue à grande échelle et peuvent s’enrichir au fil des cycles de tri successifs. L’intégration chromosomique de la cassette à substrat constant a récemment démontré qu’elle atténue ce^{problème 19}. Le protocole repose sur l’utilisation d’une bibliothèque d’insert tout en maintenant le vecteur (contenant la cassette substrat) constant. Par conséquent, ce protocole n’est pas adapté à ceux qui souhaitent faire évoluer à la fois des bibliothèques de protéase et de substrats.

La plateforme YESS a été pionnière dans une voie générale pour reprogrammer la spécificité protéase-substrat¹⁸. Les améliorations récentes incluent : l’ajout d’un contrôle enzymatique/substrat titrable dans YESS2.0⁷, le couplage au séquençage de nouvelle génération, la possibilité d’un profilage de spécificité^{haute résolution 20}, et l’intégration chromosomique des rapporteurs pour réduire le bruit d’expression et les faux^{positifs 19}. D’autres stratégies orthogonales, telles que l’évolution continue assistée par les phages, ont également été appliquées dans l’ingénierie de la spécificité des protéases pour des cibles^{thérapeutiques 21}. Ces outils ont trouvé des applications au-delà de l’ingénierie des protéases TEV, telles que le profilage haute résolution de la protéase principale du SARS-CoV-2 pour guider^{la conception} 22 de l’inhibiteur. Un déterminant crucial de toute telle campagne est de générer suffisamment de transformants pour couvrir de grandes bibliothèques combinatoires (>10⁹), qui n’avaient pas été systématiquement optimisées dans la souche EBY100 S. cerevisiae . En définissant les conditions de phase de croissance et d’électroporation qui entraînent la transformation EBY100 au-dessus de^10,9 UCF, ce protocole élimine ce goulot d’étranglement, permettant un dépistage complet basé sur FACS de millions de variants.

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Reagents
10 mM dNTP Mix	NEB	N0447S	PCR reactions (Tables 1, 3)
10X PBS, pH 7.4	Fisher	BP3994	Staining buffer base (Steps 3.2–3.3)
5X Q5 Reaction Buffer	NEB	B9027S	Sold separately; also included with Q5 polymerase
Agar, Bacto	BD Difco	281230-500g	SDCAA agar plates (Table 5); 15 g/L
Agarose (Low-EEO/Multi-Purpose/Molecular Biology Grade)	Fisher BioReagents	BP160-500	Gel Electrophoresis
Anti-FLAG PE Antibody	BioLegend	637309	FACS staining; PE-conjugated anti-FLAG
Anti-HA Tag Antibody [FITC]	GenScript	A01621	FACS staining; FITC-conjugated anti-HA
Bacto Casamino Acids	BD Difco	223120	SDCAA+, SGCAA+, SCAA media (Table 5); 5 g/L
Bacto Peptone / Tryptone	RPI	T60060-10000.0	LB/SOB media preparation; 20 g/L in YPD (Table 5)
BSA, Bovine Serum Albumin, Fraction V	Sigma-Aldrich	126575-10GM	0.5% in PBS; staining buffer (Steps 3.2–3.3)
BsmBI-v2 (200 U)	NEB	R0739S	Golden Gate assembly of substrate cassette (Table 8)
Calcium chloride solution (1M)	Sigma-Aldrich	21115-100mL	Electroporation buffer: 1 mM final (Table 5)
ColiRollers® Plating Beads	Sigma-Aldrich	71013-3	Sterilize by putting in reagent bottles and autoclaving at 121ºC, 15 psi, for 15 mins.
D-Galactose	Thermo Fisher	A12813.30	250 g; 20% w/v stock for SGCAA+ induction (Table 5)
D-Sorbitol	Thermo Fisher	1327300.10	Electroporation buffer (1 M) and outgrowth media (Table 5)
Dextrose (D-Glucose), anhydrous	Sigma-Aldrich	G8270-1KG	YPD, SDCAA+, 20% w/v dextrose stock (Table 5)
Difco Yeast Nitrogen Base w/o Amino Acids	Sigma	Y0626-250G	6.7 g/L in SDCAA/SGCAA (Table 5)
Difco YPD Broth (pre-mixed)	BD	242820-500g	Pre-made YPD alternative; 500 g
DL-Dithiothreitol (DTT)	Sigma-Aldrich	D0632-1G	Conditioning buffer: 10 mM final; aliquot 250 μL, store −20°C
E.Z.N.A. CyclePure PCR Purification Kit	Omega Bio-tek	D6492-02	PCR product cleanup
E.Z.N.A. Gel Extraction Kit	Omega Bio-tek	D2500-01	Gel purification post-PCR and restriction digest (Steps 1.1.8, 1.3.2)
E.Z.N.A. Plasmid DNA Mini Kit I	Omega Bio-tek	D6942-02	Plasmid purification (Step 4.2)
Glycerol (≥99%)	Fisher	BP229-4	50% v/v stock for glycerol stocks (Step 4.1.1)
Kanamycin Sulfate	Fisher	BP906-5	SDCAA+ and SGCAA+: 50 μg/mL final; replaces Sigma K0879-5G
KLD Enzyme Mix	NEB	M0554S	Kinase-Ligase-DpnI; site-directed mutagenesis
KLD Reaction Buffer	NEB	B0554A	Used with KLD Enzyme Mix
LB Broth (Lennox)	Sigma-Aldrich	L3022-1KG	E. coli liquid culture
Lithium Acetate Dihydrate (LiOAc·2H2O)	Thermo Fisher	A17921.30	Conditioning buffer: 0.1 M final; add before DTT (Table 5)
Luria Agar (Luria-Bertani Agar)	RPI	L24020-2000.0	E. coli plating; replaces Sigma LB Agar Lennox L2897-1KG
OmniPur Casamino Acids	Sigma	2240-500GM	Alternative casamino acids source
pDD1523	Zenodo	10.5281/zenodo. 20746804	pCTCon2-TRP-CEN/ARS-Gal10-SPAga2-BsaI; Gal1-Aga2-sfGFP
pDD1524	Zenodo	10.5281/zenodo. 20746804	pCTCon2-Aga2-6xHis-ENLYFQS-FLAG-ENLYFES-HA-ERS
Penicillin-Streptomycin Solution, 100X	Corning	30-002-CI	SDCAA+, SGCAA+: 1X final
PstI-HF (5000 U)	NEB	R3140S	Vector linearization (Table 10); use HF version
Q5 HF DNA Polymerase	NEB	M0492S	High-fidelity polymerase; alternative to Q5 Hot Start
Q5 High GC Enhancer	NEB	B9028A	For high GC-content PCR reactions
Q5 Hot Start DNA Polymerase	NEB	M0491L	PCR assembly and amplification (Tables 1, 3)
rCutSmart Buffer (10X)	NEB	B6004S	Supplied with PstI-HF and SphI-HF (Table 10)
SalI-HF	NEB	R3138L	Additional restriction enzyme
SOC Medium	NEB	B9020S	Post-transformation recovery
Sodium Chloride (NaCl)	Fisher	S271-1	LB / SOB media preparation
Sodium Hydroxide (NaOH)	Fisher	S318-500	Media pH adjustment
Sodium Phosphate Dibasic (Na2HPO4)	Sigma-Aldrich	S9763-500G	SDCAA plates, SCAA media: 38 mM (Table 5)
Sodium Phosphate Monobasic, anhydrous	VWR (BDH)	BDH4542-1KGP	SDCAA plates, SCAA media: 62 mM; replaces NaH2PO4·H2O monohydrate
SphI-HF (1000 U)	NEB	R3182S	Vector linearization in tandem with PstI-HF (Table 10)
Streptomycin	Life Technologies / Sigma	S6501-5g	Antibiotic
T4 DNA Ligase Buffer (10X)	NEB	B0202S	Table 6
T4 Polynucleotide Kinase (500 U)	NEB	M0201S	Table 6
T7 DNA Ligase (3000 U/mL)	NEB	M0318S	Table 8
Yeast Extract	RPI	Y20020-5000.0	YPD (10 g/L) and LB/SOB media
Zymolyase (1000 U)	Zymo Research	E1004-A	Yeast cell wall digestion for plasmid extraction (Step 4.2.2)
Zymoprep Yeast Plasmid Miniprep II	Zymo Research	D2004	Yeast plasmid extraction; includes Solutions 1, 2, 3 (Step 4.2)
ZymoPURE II Plasmid Midi Kit	Zymo Research	D4201-B	Mid-scale plasmid prep; for larger-volume preparations
Equipment and Consumables
Disposable Cuvettes, 1.5 mL	Fisher	14-955-127	For measuring OD600 of liquid cultures
Erlenmeyer Flask, 125 mL	VWR	10536-912	Pre-culture and conditioning incubation
Erlenmeyer Flask, 250 mL	VWR	10536-914	Yeast subculture
Erlenmeyer Flask, 250 mL	VWR	75809-646	Wide-mouth variant
Erlenmeyer Flask, 500 mL	VWR	10536-926	Main pre-culture flask (Step 2.3.1, 2.4.3)
Falcon 50 mL Conical Tubes	Falcon	352070	Cell washes, centrifugation throughout protocol
Flow Cytometry Sorter: BD Fusion	BD Biosciences	FACSAria Fusion Flow Cytometer (catalog number not applicable)	For Fluorescence-Activated Cell Sorting (FACS)
Gene Pulser/MicroPulser Electroporation Cuvettes, 0.2 cm gap	Bio-Rad	1652086	For electroporation of electrocompetent EBY100
GenePulser Xcell Electroporation System	Bio-Rad	1652660	INSTRUMENT; 2.5 kV, 25 μF, 200 Ω (Step 2.7.6)
New Brunswick Innova 40R - Benchtop Orbital Shaker	Eppendorf	M12990084	For yeast liquid culture incubation
Petri Dishes, 100 mm	Fisher	FB0875712	YPD and SDCAA agar plates
SpectraMax QuickDrop UV-Vis Spectrophotometer	Molecular Devices	SpectraMax QuickDrop	For measuring OD600 of liquid cultures and DNA concentration
Vacufuge plus	Eppendorf	2231001204	For concentrating DNA
Software
BD FACSDiva (Version: 8.0)	BD Biosciences	https://www.bdbiosciences.com/en-us/products/software/instrument-software/bd-facsdiva-software	Collection of tools for flow cytometer and application setup, data acquisition, and data analysis
Benchling (Version: Web-based platform, continuous release)	Benchling, Inc.	https://www.benchling.com/	Sequence design software
SnapGene (Version: 8.0.1)	SnapGene, Inc.	https://www.snapgene.com/	Sequence design software