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Article de méthode

Flux de travail optimisé d’affichage de surface de levure pour l’évolution dirigée des protéases

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DOI :

10.3791/72559

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4 août 2026

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1Department of Bioengineering, The University of Texas at Dallas, 2Department of Biological Sciences, The University of Texas at Dallas, 3Center for Systems Biology, The University of Texas at Dallas

Dans cet article

Résumé

Ce protocole offre un flux de travail optimisé pour l’évolution dirigée des protéases virales chez Saccharomyces cerevisiae en utilisant un système de sélection basé sur l’affichage de surface. Il décrit la conception de la bibliothèque d’inserts d’ADN et de la cassette de substrat, l’électroporation optimisée pour une haute efficacité de transformation, la sélection par tri cellulaire activée par fluorescence pour le clivage des protéases, et le séquençage des variantes enrichies.

Résumé

L’évolution dirigée imite le processus évolutif naturel dans un environnement de laboratoire rapide et contrôlé pour faire évoluer des protéines ayant des fonctions ou des traits souhaitables. Le dépistage d’un large pool de gènes mutants codant pour les protéines permet de sélectionner fonctionnellement les variantes souhaitées pour des applications en biotechnologie, médecine et biologie synthétique. En utilisant ce protocole, nous réalisons une évolution dirigée dans Saccharomyces cerevisiae pour concevoir des variantes de protéase à haute spécificité pour une séquence de substrat non native. Nous présentons ces variantes de protéases à la surface des cellules de levure afin de faciliter la sélection des variantes souhaitées via le tri cellulaire activé par fluorescence (FACS) sur plusieurs cycles d’enrichissement. Quatre éléments clés de la cassette substrat sont co-exprimés avec la bibliothèque de protéases : une protéine de fusion composée de (i) la sous-unité du récepteur d’adhésion de la levure Aga2, (ii) les séquences de substrat de sélection et (iii) de contre-sélection, (iv) les séquences de marqueurs épitopiques, et une séquence optionnelle de réticulum endoplasmique (RE) de signal. Les cellules de levure dans lesquelles seule la séquence du substrat de sélection est clivée sont isolées à l’aide de FACS multicolore via des anticorps anti-épitopes fluorescents (marqués par phycoérythrine/fluorescéine isothiocyanate). Nous fournissons ici des détails du protocole optimisé, étape par étape, pour mener une campagne d’évolution de protéase, incluant la conception de la bibliothèque d’inserts d’ADN et la conception de cassettes de substrat, l’électroporation des cellules de levure avec une haute efficacité de transformation (jusqu’à10 9 transformants par microgramme d’ADN), la sélection, l’enrichissement et le séquençage des variantes évoluées basées sur FACS. Nous démontrons notre protocole d’évolution dirigée en faisant évoluer la protéase d’inclusion nucléaire A (TEVp) du virus de la gravure du tabac, passant de la séquence naturelle de substrat, ENLYFQ↓S, à la fendure d’une nouvelle séquence, ENLYFE↓S.

Introduction

Les protéases cystéines de la famille des Potyviridae, en particulier les protéases d’inclusion nucléaire A (NIa), représentent une source largement inexploitée d’endopeptidases spécifiques à la séquence. Avec plus de 3 800 membres de la famille caractérisée, les protéases NIa clivent une séquence distincte de substrat composé de sept acides aminés. La famille des potyviraux offre un ensemble diversifié de protéases pour l’ingénierie de systèmes de contrôle des protéines programmables, la construction de circuits génétiques orthogonaux basés sur des protéases, et le développement d’outils biotechnologiques spécifiques à chaqueséquence 1,2. Malgré cette diversité naturelle, seules deux protéases NIa, TEVp et la protéase du virus tacheté de veine du tabac (TVMVp), ont été minutieusement caractérisées et conçues pour un usage large en laboratoire etbiotechnologique 3,4. Cette boîte à outils limitée des protéases limite l’espace de conception pour les circuits multicomposants nécessitant des activités orthogonalesde protéases 5, ce qui motive les efforts pour étendre et caractériser davantage les protéases NIa par une évolution dirigée 6,7.

L’affichage de surface de la levure s’est imposé comme l’une des plateformes les plus puissantes pour l’évolution dirigée, permettant un criblage à haut débit de bibliothèque protéique via le tri cellulaire activé par fluorescence (FACS)6,7. Par exemple, le système de dépistage du réticulum endoplasmique de la levure (YESS) associe l’activité de la protéase à l’affichage de surface via la voie sécrétoire de S. cerevisiae 6,7. Le système YESS a été appliqué à l’ingénierie de nouvelles spécificités protéase-substrat et a démontré son utilité pour des campagnes d’évolution dirigée sur plusieurs tours. Dans ce système, les variantes de protéase sont co-exprimées avec une protéine de fusion contenant une cassette de substrat de clivage avec des marqueurs épitopiques, et l’ancre de surface Aga1p est exprimée dans la souche de levure EBY100. Le marquage différentiel avec des anticorps fluorescents distingue les cassettes de substrat non clivé affichées à la surface cellulaire. Ce mécanisme d’affichage dépendant de l’activité est directement compatible avec la sélection itérative basée sur FACS pour des bibliothèques de 10,7 ou plusvariantes 6,7.

Un prérequis fondamental pour l’évolution dirigée est la capacité d’introduire des bibliothèques variantes à une échelle suffisante pour assurer une couverture adéquate de l’espace de séquence ciblé. Pour les bibliothèques de mutagenèse à saturation du site couvrant plusieurs positions d’acides aminés, des rendements de transformation de 108 à 10 transformantsuniques sont nécessaires pour garantir que la diversité introduite dans la bibliothèque soit bien représentée dans la population triée. Plusieurs méthodes existent pour introduire de l’ADN exogène dans S. cerevisiae, chacune avec des plafonds de débit distincts. La méthode de transformation chimique conventionnelle utilise de l’acétate de lithium/ADN porteur simple brin/polyéthylène glycol (LiAc/ssDNA/PEG) en raison de sa simplicité et de son accessibilité. Cependant, il atteint généralement des efficacités de transformation de seulement 10unités de formation de colonies (CFU) de 4 à10 6 par microgramme d’ADN, ce qui ne correspond pas à la variation de séquence nécessaire pour les campagnes de grande bibliothèque8. En revanche, la méthode d’électroporation applique un champ électrique à haute tension pour perméabiliser transitoirement la membrane cellulaire et faciliter l’absorption de l’ADN. L’électroporation atteint systématiquement les plus grandes efficacités de transformation parmi les méthodes disponibles, avec des protocoles optimisés rapportant des rendements de 108–109 CFU 9. Il a été observé que l’efficacité de l’électroporation chez S. cerevisiae est critiquement sensible à la phase de croissance cellulaire, à la masse d’ADN et à la composition tampon, fournissant un cadre largement adapté pour l’évolution dirigéeà l’échelle des bibliothèques 9.

Le protocole décrit ici utilise la souche S. cerevisiae EBY100, une souche hôte largement adoptée pour l’affichage de surface de levure. EBY100 a été conçu par Boder et Wittrup en intégrant une cassette d’expression AGA1 sous le contrôle du promoteur GAL1 induit par le galactose dans le locus chromosomique AGA1 de la souche mère déficiente en protéase BJ546510. La souche est commercialisée via l’ATCC (numéro de catalogue MYA-4941 ; déposant K.D. Wittrup), porteur du génotype MATa AGA1 ::GAL1-AGA1 ::URA3 ura3-52 trp1 leu2-Δ1 his3-Δ200 pep4 ::HIS3 prb1Δ1.6R can1 GAL (URA+, leu−, trp−). En conséquence, Aga1p et la fusion cassette Aga2p sur substrat sont exprimées à partir du même promoteur inducible au galactose, garantissant que les deux sous-unités sont co-induites et s’assemblent dans le complexe Aga1p–Aga2p lié au disulfure qui ancre la fusion affichée à la paroi cellulaire.

Malgré l’utilisation généralisée d’EBY100 dans les applications d’affichage de levures, aucun protocole publié n’a été optimisé de manière systématique pour électroporer cette souche à des rendements à l’échelle de la bibliothèque. Les paramètres spécifiques à EBY100, tels que la phase optimale de croissance à la récolte, la composition du milieu pendant la sous-culture et la relation quantitative entre la densité optique initiale à 600 nm (OD600) et l’efficacité de transformation, restent à caractériser et optimiser rigoureusement. Ici, nous rapportons que l’efficacité de transformation dans EBY100 augmente de manière monotone avec le TD600 de la culture lors de la récolte, les cellules en phase terminale de logarithme produisant des taux de transformation nettement plus élevés que celles récoltées au début de la phase de log. Nous avons évalué des paramètres critiques du protocole, notamment les valeurs initiales deOD 600 lors de l’inoculation, l’utilisation d’un milieu de 2 × extrait de levure Peptone Dextrose (YPD) pour les sous-cultures, les formulations de tampons d’électroporation et les conditions de croissance post-électroporation. Le protocole présenté ici fournit un flux de travail optimisé étape par étape (Figure 1A–C, Figure 2, Figure 3A–D, Figure 4A–E) pour préparer des cellules EBY100 électrocompétentes et effectuer une électroporation à haute efficacité de bibliothèque d’ADN, donnant des taux de transformation constamment supérieurs à 109 CFU. Pour valider ce protocole, nous avons mené une campagne complète d’évolution dirigée pour concevoir TEVp avec une spécificité de clivage modifiée à travers quatre cycles de sélection et d’enrichissement basés sur FACS. Le séquençage de variantes enrichies de protéase a confirmé une diversification substantielle dans les résidus ciblés dans la poche de liaison au substrat de la protéase, démontrant que le protocole offre une couverture suffisante de l’espace de séquence pour soutenir des campagnes d’évolution productives. Ce protocole sera d’une grande utilité pour les chercheurs utilisant EBY100 pour l’évolution dirigée basée sur l’affichage de surface de la levure et le criblage à haut débit compatible FACS des protéases, anticorps9, kinases11 et récepteurs12, entre autres protéines.

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Protocole

Toutes les expériences impliquant S. cerevisiae recombinant ont été menées conformément aux politiques et procédures du Comité institutionnel de biosécurité et de sécurité chimique de l’Université du Texas à Dallas. Les souches de levure recombinantes ont été manipulées sous le contrôle de biosécurité de niveau 1 (BSL-1) conformément aux pratiques microbiologiques institutionnelles établies. L’électroporation, la culture et le tri cellulaire activé par fluorescence (FACS) ont été réalisés conformément aux procédures institutionnelles de biosécurité approuvées. Les cultures de levures et les consommables contaminés ont été décontaminés et éliminés comme déchets bio-dangereux conformément aux directives institutionnelles.

1. Préparation du vecteur et de l’insert

  1. Génération de bibliothèques de protéases potyvirales via la mutagenèse par saturation de site
    1. La conception utilise des logiciels de conception de séquences qui chevauchent des oligonucléotides directs et inverses de 30 à 50 mers pour générer une bibliothèque mutante de protéases. Remplacer le codon de type sauvage dans l’oligonucléotide correspondant par un codon dégénéré NNS, où N représente A, T, G ou C, et S représente G ou C, pour les positions ciblées pour la mutagenèse.
    2. Concevoir le chevauchement de 3′ entre chaque paire d’oligonucléotides avant et arrière avec une température de fusion (Tm) de 55 à 60 °C. Concevez les premier et dernier oligonucléotides pour contenir un chevauchement de 50 nt avec le vecteur d’affichage de surface de la levure au-delà des sites de restriction.
    3. Assurez-vous qu’au moins une extrémité de l’insert chevauche exactement une extrémité du vecteur linéarisé pour faciliter la recombinaisonhomologue 13. Éviter les espaces entre les oligonucléotidesadjacents 14.
    4. Resuspendez les oligos à 100 μM avec un H2Odéionisé. Dans un tube stérile de 1,5 mL, combinez 0,5 μL de chaque oligo pour obtenir un volume final de 200 μL (concentration finale de 250 nM pour chaque oligo).
    5. Installer une réaction PCR avec les composants listés dans le Tableau 1 pour assembler la bibliothèque de protéases, en utilisant les conditions de thermocyclage du Tableau 2.
    6. Installer une seconde réaction PCR en utilisant les oligos les plus externes avant et arrière (Tableau 3) en utilisant le premier produit PCR assemblé comme modèle. Amplifiez le produit comme indiqué dans le tableau 4.
    7. Faites passer le deuxième produit PCR sur un gel d’agarose à 1 % avec du bromure d’ethidium (0,5 μg/mL) à 240 V pendant 30 minutes. Retirez la bande correspondant à la longueur d’ADN attendue.
      REMARQUE : ATTENTION : Le bromure d’ethidium est un mutagène et doit être manipulé à l’aide d’un équipement de protection individuelle (EPI) approprié, incluant une blouse de laboratoire, des gants en nitrile et des lunettes de sécurité. Évitez le contact cutané et l’inhalation. Éliminer les gels, tampons et consommables contenant du bromure d’ethidium comme déchets chimiques dangereux conformément aux directives de sécurité institutionnelles.
    8. Purifiez avec un kit d’extraction en gel. Éluvez 50 μL deH2Odéionisé.
    9. Mesurez la concentration d’ADN à l’aide d’un spectrophotomètre. Stockez l’ADN à −20 °C.
      REMARQUE : Chaque réaction de 50 μL de la2e PCR produirait environ 0,5 à 1,0 μg d’ADN total. Puisque chaque électroporation nécessite 12 μg de la bibliothèque de protéases (c’est-à-dire l’insertion), il faut augmenter les réactions en conséquence.
  2. Assemblage de cassette de substrat
    1. Préparez les plaques LB-agar et les milieux liquides LB-chloramphénicol. Voir les recettes au tableau 5.
    2. Concevez un ensemble d’oligonucléotides de 30 mérigènes qui se chevauchent dans les directions avant et arrière pour l’assemblage des cassettes de substrat. Concevez les extrémités 5′ de chaque oligonucléotide inverse et l’oligonucléotide avant du fragment suivant pour qu’elles correspondent de 4 nucléotides.
    3. Resuspendez les oligos lyophilisés à 100 μM à l’aide de H2Odéionisé.
    4. Mélangez les réactifs comme dans le tableau 6.
    5. Utilisez le programme de cyclage du tableau 7 pour recuit et phosphoryler le mélange oligo.
    6. Diluez les oligos recuit 4 fois dans del’H2Odéionisé pour atteindre une concentration finale de 1,25 μM.
    7. Combinez le mélange d’oligos recuit avec le vecteur (par exemple, pDD1523), en suivant le tableau 8.
    8. Effectuez l’assemblage Golden Gate, en suivant le programme de cyclisme du tableau 9.
      REMARQUE : Par exemple, le plasmide pDD1523 possède un site de restriction de type IIS (BsmBI) en aval du promoteur GAL1/10. Un assemblage réussi permet l’induction au galactose de la cassettesubstrat 7.
    9. Transformez le plasmide résultant en E. coli.
    10. Cellules de plaque sur agar LB avec l’antibiotique correspondant. Incuber pendant 16 à 18 heures à 37 °C.
    11. Choisissez des colonies isolées et inoculez-les dans 5 mL de milieux LB. Incuber toute la nuit (16–18 h) à 37 °C avec secouage (220 tr/min).
    12. Extraire les plasmides de cultures nocturnes à l’aide d’un kit de mini-préparation de plasmides.
    13. Mesurez la concentration plasmidique à l’aide d’un spectrophotomètre, puis envoyez pour un séquençage.
  3. Linéarisation du vecteur d’affichage de la levure
    1. Linéariser le plasmide d’affichage de la levure, par exemple digère pDD1524 avec des enzymes de restriction SphI et PstI pour préparer le vecteur d’affichage de la levure contenant la cassette substrat pour l’électroporation. Mélangez les réactifs listés dans le tableau 10 et incubez à 37 °C pendant 1 heure.
    2. Faites passer le produit de digestion par restriction sur un gel d’agarose à 1 % à 240 V pendant 30 minutes. Retirez la bande correspondant à la longueur d’ADN attendue et purifiez à l’aide d’un kit d’extraction en gel.
      REMARQUE : Chaque digestion de restriction de 50 μL produirait environ 0,5 à 1,0 μg d’ADN total. Puisque chaque électroporation nécessite 4 μg de vecteur linéarisé, il faut augmenter en conséquence les réactions de digestion.

2. Électroporation

Note : Suivez les procédures de sécurité institutionnelles pour la manipulation des matériaux biologiques et des réactifs, portez des EPI appropriés et éliminez les déchets biologiques et chimiques conformément aux directives institutionnelles.

  1. Préparation des tampons, plaques et milieux (2 jours avant l’électroporation)
    1. Préparer des milieux de croissance (1 × YPD ; 2 × YPD ; Acides casminés synthétiques dextrose, SDCAA+ ; et acides casminés de galactose synthétique, SGCAA+), plaques (YPD et SDCAA), tampon d’électroporation et eau stérile suivant les recettes du Tableau 5. Conserver à 4 °C.
  2. Préparation d’une plaque striée d’EBY100.
    1. Faites sortir de la levure EBY100 sur l’agar YPD à partir d’un stock de glycérol. Faites pousser à 30 °C pendant 2 jours.
    2. Conservez l’assiette à 4 °C après la croissance.
      REMARQUE : Une plaque striée reste utilisable jusqu’à 1 mois ; Marquez la date de la série sur la plaque.
  3. Préparation de la pré-culture de l’EBY100 (1 jour avant l’électroporation)
    1. Préparez 125 mL de 1 × YPD dans une fiole Erlenmeyer de 500 mL.
    2. Préparez 25 mL de 1 × YPD dans un tube conique de 50 mL. À l’aide d’une pointe de micropipette, prélevez les cellules EBY100 de la plaque cultivée pendant 2 jours. Ensuite, transférez les cellules de levure de la pointe de la pipette dans le tube conique contenant 1 × YPD.
      REMARQUE : La traînée de cellules doit former une tache d’environ 1 à 2 mm de long.
    3. Retirez la pointe de la micropipette et faites un vortex sur le tube conique pour garantir un mélange adéquat.
    4. Préparez une pré-culture de 150 mL en transférant 25 mL de 1 × YPD contenant les cellules de levure dans la fiole de 500 mL contenant 125 mL de 1 × YPD. Tourbillonnez pour mélanger.
    5. À l’aide d’un spectrophotomètre, mesurez le OD600 en préparant deux microcuvettes d’un trajet de 1 cm : l’une avec 1 mL de 1 × YPD comme témoin blanc et l’autre avec 1 mL de pré-culture
    6. Cultivez 150 mL de pré-culture toute la nuit (16–20 h) à 30 °C avec un mouvement orbital à 270 tr/min.
  4. Préparation de la sous-culture au niveau initialsouhaité de 600 (le jour de l’électroporation)
    1. Préparez le tampon de conditionnement et le milieu de prolifaction, comme décrit dans le tableau 5.
    2. Mesurez le OD600 de la préculture nocturne (OD₆₀₀ attendu est de 17–22). Pour être dans la plage linéaire du spectrophotomètre, mesurez une dilution 1:20 de la pré-culture.
    3. Calculez le volume de pré-culture nécessaire pour inoculer une sous-culture de 100 mL. Une sous-culture initiale OD600 de 3,0 à 4,0 est recommandée.
    4. Diluez la culture jusqu’à l’OD initialsouhaité de 600 dans 100 mL de 2 × YPD dans une flasque Erlenmeyer de 500 mL.
    5. Incubez la sous-culture de 100 mL à 30 °C avec des vibrations orbitales à 270 tr/min pendant 4 heures.
  5. Préparation des milieux pendant une incubation de 4 heures
    1. Gardez le tampon d’électroporation glacé et l’eau stérile prêts (depuis l’étape 2.1.1).
    2. Préparez le tampon de conditionnement (100 mL), en suivant la recette du Tableau 5. Utilisez 20 mL de tampon de conditionnement par transformation ; Augmentez l’échelle en conséquence. Conserver à température ambiante (20–23 °C).
      REMARQUE : ATTENTION : Le tampon conditionneur contient du dithiothréitol (DTT) et de l’acétate de lithium (LiAc), qui sont des irritants chimiques pouvant provoquer des irritations de la peau et des yeux. Portez des EPI appropriés, y compris une blouse de laboratoire, des gants en nitrile et des lunettes de sécurité, et manipulez ces réactifs conformément aux procédures institutionnelles de sécurité chimique. Éliminer les solutions inutilisées et les tampons usagés comme déchets chimiques conformément aux directives institutionnelles.
    3. Préparez un milieu de croissance (50 mL) : mélangez ensemble 25 mL de 2 × YPD et 25 mL de sorbitol de 1 M. Utilisez 8 mL de milieu de croissance par transformation. Conserver à température ambiante (20–23 °C).
  6. Préparation des cellules de levure électrocompétentes après incubation de 4 heures.
    1. Divisez la sous-culture de 100 mL en deux tubes coniques de 50 mL. Collectez les cellules par centrifugation à 4 °C et 1 500 × g pendant 3 minutes, puis décantez le milieu. Gardez les cellules sur la glace jusqu’à la fin de l’étape 2.6.4.
    2. Resuspendez doucement chaque pellet cellulaire avec 25 mL d’eau stérile glacée. Centrifugez à 4 °C et 1 500 × g pendant 3 minutes, puis décantez le milieu.
    3. Répétez l’étape 2.6.2.
    4. Resuspendez doucement chaque pellet cellulaire avec 25 mL de tampon d’électroporation glacé. Centrifugez à 4 °C et 1 500 × g pendant 3 minutes, puis décantez le milieu.
    5. Retirez les cellules de la glace et resuspendez doucement chaque pellet cellulaire avec 10 mL de tampon de conditionnement à température ambiante (20–23 °C). Ensuite, concentrez-vous dans une seule flasque Erlenmeyer de 125 mL et incubez à 30 °C avec un mouvement orbital à 270 tr/min pendant 30 minutes.
    6. Versez les cellules dans un tube de 50 mL. Centrifugez à 4 °C et 1 500 × g pendant 3 minutes. Découper les médias.
    7. Resuspendez doucement la pellete cellulaire avec 50 mL de tampon d’électroporation glacé. Centrifugez à 4 °C et 1 500 × g pendant 3 minutes, puis décantez le milieu.
    8. Resuspendez la pellete cellulaire à un volume final de 1 mL en ajoutant environ 100 à 200 μL de tampon d’électroporation. Gardez les cellules sur la glace jusqu’à l’électroporation.
      REMARQUE : Les cellules électrocompétentes peuvent être congelées (c’est-à-dire placées dans un congélateur à –80 °C) et utilisées plus tard sans perte significative d’efficacité d’électroporation.
  7. Électroporation, excroissance et plaque
    1. Pré-refroidissement des cuvettes d’électroporation avec un espace de 0,2 cm sur la glace.
    2. Transférez 380 μL du projectile en suspension dans un tube stérile de 1,5 mL. Mélangez avec 4 μg d’ADN plasmidique ou 4 μg de vecteur plasmidique linéarisé et 12 μg d’insert. Mélangez doucement en pipettant.
      REMARQUE : Pour maximiser le nombre de cellules électroporées, les concentrations d’ADN vectoriel et d’insertion devraient idéalement être de 700 à 800 ng/μL. Si les concentrations sont inférieures, utilisez un concentrateur à vide.
    3. Transférez la suspension dans la ou les cuvettes d’électroporation pré-refroidies. Gardez sur la glace pendant 5 minutes.
    4. Essuyez les côtés de la cuvette après 5 minutes avec une lingette de laboratoire sans peluches pour éliminer l’humidité résiduelle, qui peut provoquer des arcs lors de l’électroporation. Évitez toute bulle ou cellule au-dessus des plaques métalliques dans la cuvette, car elles peuvent aussi provoquer des arcs. Pour maintenir la température froide de la cuvette, ne touchez pas aux électrodes de la plaque.
    5. Préparez 8 mL de milieu de croissance dans un tube conique de 50 mL.
    6. Électroporez les cellules avec les réglages suivants : une tension de 2,5 kV, une capacité de 25 μF, et une résistance de 200 Ω9. La plage de constantes de temps acceptable est de 2,8 à 4,5 ms.
      REMARQUE : ATTENTION : L’électroporation implique des impulsions électriques à haute tension. Assurez-vous que les cuvettes sont bien bien placées et respectez les instructions de fonctionnement du fabricant. Éliminer les cuvettes d’électroporation usagées comme déchets bio-dangereux conformément aux directives institutionnelles.
    7. Inondez immédiatement la cuvette avec environ 200 μL de milieu de croissance provenant du tube conique et transférez les cellules électroporées dans le tube conique de 50 mL. Ajoutez 200 à 350 μL supplémentaires de milieu de croissance jusqu’à ce qu’il ne reste plus de liquide visible dans la cuvette.
    8. Incubez le tube conique de 50 mL de cellules électroporées dans 8 mL de milieu de croissance à 30 °C sans secousser pendant 1 heure. Inversez le tube toutes les 15 minutes pour mélanger.
    9. Collectez les cellules par centrifugation à 1 500 × g, 25 °C pendant 3 minutes. Ensuite, décantis le média.
    10. Resuspendre les cellules dans un milieu de perte de levure approprié pour maintenir la sélection des cellules transformées. Pour les plasmides contenant le marqueur de sélection TRP1, il faut resuspendre les cellules dans 250 mL de SDCAA+ (qui ne contient pas de tryptophane) afin de récupérer sélectivement la levure qui a conservé le plasmide.
    11. Incubez toute la nuit (16–20 h) à 30 °C avec un mouvement orbital à 270 tr/min.

3. Induction, coloration et tri cytométrique en flux des cellules de levure

  1. Induction de la bibliothèque de protéases et de la cassette substrat (1 jour avant le tri)
    1. Mesurez OD600 comme à l’étape 2.4.2 après la croissance immédiate des transformants dans les milieux de déglutissement.
    2. Aliquote 12 mL de transformants de levure et centrifugeuse à 3 200 × g pendant 5 minutes.
    3. Retirez le surnageant et remettez la pellete cellulaire en milieu d’induction SGCAA+ à un OD600 de 0,5. Calculez le volume de resuspension requis à l’aide de l’équation de dilution, C1V1 = C2V2.
    4. Transférer dans une flasque Erlenmeyer de 125 mL et faire pousser toute la nuit pendant 18 à 24 heures à 30 °C avec un mouvement orbital à 270 tr/min.
  2. Coloration par anticorps fluorescents (le jour du tri)
    1. Mesurezle OD 600 des cellules après l’induction. Utilisez deux cuvettes : l’une avec 1 mL de SGCAA+, et l’autre avec 950 μL de SGCAA+ mélangés à 50 μL de cellules. Multipliez la valeur mesuréede 600 de l’OD par 20 pour obtenir le véritable OD600 des cellules post-induction.
    2. Normaliser chaque échantillon à 3 × 107 cellules pour la coloration des anticorps et le tri FACS. Utilisez C1V1 = C2V2 pour calculer le volume de cellules à transférer depuis la fiole d’induction.
      REMARQUE : Pour la mutagenèse de saturation NNS à quatre sites, la taille théorique de la bibliothèque est de 106 variantes. Pour échantillonner suffisamment la bibliothèque, criblez au moins 10 fois la taille de la bibliothèque, soit 10cellules 7 . Exemple : si désiréC 1V1 = 3 × 107 cellules et C2 = post-induction OD600 de 6 (c’est-à-dire 6 × 107 cellules/mL), alors aliquote 500 μL de cellules induites (c’est-à-dire V2 = 3 × 107 cellules / 6 × 107 cellules/mL = 500 μL).
    3. Transférez le volume calculé des cellules dans un tube de 1,5 mL et centrifugez à 5 000 × g pendant 5 minutes.
    4. Retirez le surnageant et résuspendez dans 500 μL de solution physiologique tamponnée phosphate (PBS) + 0,5 % d’albumine sérique bovine (BSA).
    5. Centrifugez à 5 000 × g pendant 5 minutes et répétez l’étape 3.2.4.
    6. Centrifugez à 5 000 × g pendant 5 minutes, puis complétez l’étape 3.2.7.
    7. Préparez un mélange de coloration anticorps dans un tube de 1,5 mL contenant de l’isothiocyanate anti-HA fluorescéine (FITC) (0,5 μg/107 cellules), l’anti-FLAG phycoérythrine (PE) (0,05 μg/10 7 cellules) et PBS + 0,5 % de BSA (100 μL/10 7 cellules). Garde le tube sur la glace.
    8. Retirez le surnageant et resuspendez avec le mélange de teinture. Utilisez 300 μL de mélange de coloration par 3 × 107 cellules. Ne faites pas de vortex dans le tube ; Seulement inverser ou faire un flick.
    9. Gardez les cellules sur la glace dans le noir pendant 1 heure après la resuspension.
  3. Lavage post-tache
    1. Centrifugez les cellules colorées à 5 000 × g pendant 5 minutes. Retirez le surnageant et remettez la pellete en suspension dans un PBS contenant 0,5 % de BSA en utilisant 0,5 mL par 1 × 107 cellules (par exemple, 500 μL pour 1 × 107 cellules ou 1,5 mL pour 3 × 107 cellules).
    2. Centrifugeuse à 5 000 × g, 5 min. Retirez le surnageant, resuspendez dans 750 μL de PBS + 0,5 % de BSA.
    3. Transférez 750 μL supplémentaires de PBS + 0,5 % de BSA dans un tube de collecte de 10 mL.
  4. FACS
    1. Effectuer le démarrage et la préparation nécessaires du cytomètre pour une nouvelle expérience.
    2. Créez trois diagrammes de points. Sur le premier diagramme de points, sélectionnez le nom de l’axe X pour afficher le canal de la zone de diffusion directe (FSC-A) et le nom de l’axe Y pour afficher le canal de la zone de diffusion latérale (SSC-A).
      REMARQUE : Cela facilitera la sélection des cellules vivantes.
    3. Gardez le nom de l’axe X pour afficher le canal FSC-A tout en changeant le canal de l’axe Y pour afficher la hauteur de diffusion directe (FSC-H) sur le second point-plot.
      REMARQUE : Cela facilitera le choix des chansons.
    4. Sélectionnez le nom de l’axe X pour afficher le canal PE et celui de l’axe Y pour afficher le canal FITC sur le troisième diagramme de points.
    5. Effectuez un contrôle négatif sur le cytomètre en utilisant les canaux 530/30 nm (FITC) et 585/42 nm (PE). Effectuer le tri à l’aide d’une buse de 70 μm à une pression de gaine de 70 psi. Prélever des échantillons à une vitesse de 4000 à 5000 événements/s.
    6. Tracez une porte polygonale autour de la population principale de cellules de levure intactes pour exclure les débris et les petites particules présentant des signaux faibles de FSC-A et SSC-A sur le premier diagramme de points (FSC-A contre SSC-A).
    7. Des singlets de porte sur un graphique FSC-H versus FSC-A à l’intérieur de cette porte, en sélectionnant la population linéaire présentant une relation proportionnelle entre FSC-H et FSC-A. Excluez les événements qui s’écartent de la distribution linéaire et correspondent aux doublets et aux agrégats de cellules.
      REMARQUE : Le troisième diagramme de points pour PE versus FITC affichera un groupe diagonal de points pour le contrôle négatif (c’est-à-dire les cellules de levure exprimant la cassette du substrat intact).
    8. Prélever des échantillons et trier les cellules de levure selon les valeurs de PE/FITC souhaitées dans un ou plusieurs tubes de collecte. Analyser un nombre total de cellules correspondant à au moins 10 fois la taille théorique de la bibliothèque afin d’assurer une représentation adéquate de toutes les variantes (par exemple, analyser ~1 × 107 cellules pour une bibliothèque avec une diversité théorique de ~1 × 106 variantes).
    9. Positionnez la porte de tri sous la diagonale PE/FITC de la population témoin négative.
      REMARQUE : Des portes plus strictes améliorent l’enrichissement des variantes souhaitées mais réduisent la récupération cellulaire.
  5. Après le FACS
    1. Tube(s) de collecte centrifugeuse à 3 200 × g pendant 5 minutes. Retirez soigneusement le surnageant, en laissant 1 mL, puis resuspendez dans 5 mL de PBS.
      REMARQUE : Laissez 1 mL de surnageant, car la granule cellulaire au fond ne sera pas visible après centrifugation.
    2. Centrifuge à nouveau à 3 200 × g pendant 5 minutes. Retirez le surnageant, il ne reste que 1 mL. Resuspendez avec 4 mL de SDCAA+.
    3. Dans une fiole Erlenmeyer de 250 mL, ajoutez 15 mL de SDCAA+. Transférez les cellules en suspension de l’étape 3.5.2 dans cette fiole.
    4. Incuber toute la nuit pendant 18 à 24 heures à 30 °C avec un mouvement orbital à 270 tr/min.
    5. Répétez les étapes 3.1, 3.2, 3.3 et 3.4 pour chaque cycle d’évolution dirigée.

4. Récupération et séquençage des plasmides individuels

  1. Développer des colonies individuelles
    1. Fabriquez un stock de glycérol en mélangeant 500 μL de la culture liquide après l’étape 3,5.4 et 500 μL de glycérol stérile à 50 %, obtenant ainsi une solution de bouillon de glycérol à 25 %. Vortex pour mélanger soigneusement les cellules.
    2. Conservez au congélateur à –80 °C toute la nuit. Pour un stockage à long terme, transférez dans de l’azote liquide.
    3. Grattez la base de glycérol à l’aide d’une pointe stérile de 1000 μL et mélangez-la à 100 μL de SDCAA+. Placez ce mélange sur une plaque SDCAA et évadez-le à l’envers à 30 °C.
    4. Choisissez les colonies après 3 jours, et cultivez-les toute la nuit dans 1,5 mL de SDCAA+ dans des tubes de 14 mL.
  2. Effectuer un mini-prep de levure pour extraire les plasmides
    1. Pelletez la culture toute la nuit en centrifugant à 16 000 × g pendant 1 minute puis en resuspendant 200 μL de la solution 1 à partir d’un kit de purification de plasmides de levure.
    2. Ajoutez 5 μL de solution enzymatique lytique (5 U/μL).
    3. Incubez dans un incubateur à 37 °C pendant 4 heures sur un mélangeur de bout en bout.
    4. Effectuez un cycle de congélation-dégel en congelant à -80 °C pendant 20 minutes et en décongelant à 42 °C pendant 10 minutes dans un bain-marie.
    5. Ajoutez 200 μL de la solution 2 d’un kit de purification de plasmides de levure, mélangez en inversant 2 à 3 fois, puis laissez reposer 5 minutes.
    6. Ajoutez 400 μL de solution 3 provenant d’un kit de purification de plasmides de levure et mélangez en inversant 2 à 3 fois. Centrifugeuse à 16 000 × g pendant 5 minutes.
    7. Purifiez l’ADN plasmidique à l’aide d’un kit de purification avec une colonne de forte capacité de liaison à l’ADN.
      REMARQUE : En raison de la grande quantité d’ADN génomique de levure cisaillé provenant des cellules lysées, une colonne à base de silice avec une capacité de liaison à l’ADN plus élevée (35 μg) doit être utilisée au lieu d’une colonne de purification de l’ADN plasmidique de levure à capacité plus faible (5 μg)15.
    8. Mesurez la concentration d’ADN à l’aide d’un spectrophotomètre. Les rendements d’ADN sont de 10 à 30 ng/μL.
  3. Transformer les plasmides purifiés en cellules d’E. coli chimiquement compétentes
    1. Préparez les milieux SOC, en suivant la recette du tableau 5, ainsi que les plaques de LB-chloramphénicol. Préchauffez également un bain-marie à 42 °C.
    2. Réchauffez une plaque LB-chloramphénicole pour chaque plasmide à 37 °C pendant 20 minutes.
    3. Sortez un tube de cellules chimiquement compétentes du congélateur à –80 °C et décongelez-les sur de la glace.
    4. Aliquote 30 μL de cellules compétentes pour chaque plasmide dans un tube de 1,5 mL sur glace.
    5. Pipeter 3 μL de plasmide dans des cellules compétentes. Faites un coup pour mélanger et laissez reposer 5 minutes sur de la glace.
    6. Effectuez un choc thermique en incubant brièvement les cellules dans le bain-marie à 42 °C pendant 40 secondes.
    7. Incubez sur glace pendant 2 minutes.
    8. Ajoutez 300 μL de milieu SOC aux cellules et incubez pendant 15 minutes à 37 °C à 220 tr/min.
    9. Placez 50–100 μL de cellules compétentes transformées sur des plaques préchauffées.
    10. Incubez les plaques à 37 °C à l’envers pendant 18 heures.
  4. Récolte de colonies
    1. Ajoutez 5 mL de milieu liquide LB-chloramphénicole à des tubes de culture à fond rond de 14 mL.
    2. Choisissez une colonie avec une pointe stérile de 1000 μL, puis plongez-la dans un tube de culture.
    3. Placez les tubes dans un vibrateur (220 tr/min, angle 30°–45° pour maximiser l’aération) à 37 °C pendant 18 heures.
  5. Extraction de plasmides à partir de culture liquide bactérienne
    1. Centrifugez les cultures liquides à 3 200 × g pendant 4 minutes. Décante le surnageant.
    2. Extraire les plasmides des cultures nocturnes à l’aide d’un kit de purification des plasmides.
    3. Mesurer la concentration des plasmides purifiés à l’aide d’un spectrophotomètre.
  6. Soumettre les plasmides pour séquençage
    REMARQUE : Utilisez des services tels que le séquençage des nanopores à plasmides entiers, ou, alternativement, le séquençage Sanger avec une amorce flanquant la région mutagenisée.

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Résultats

Une construction efficace de la bibliothèque est essentielle pour assurer une couverture suffisante de l’espace mutationnel. Pour éviter la perte de variantes fonctionnelles rares, le nombre de transformants doit atteindre au moins 10× à 100× la taille théorique de la bibliothèque. Parce que l’efficacité de transformation chez S. cerevisiae est influencée par la concentration cellulaire et est la plus élevée dans les cellules16 en phase logarithmique préc...

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Discussion

L’évolution dirigée est une méthode à haut débit qui utilise des cycles itératifs de diversification et de sélection pour identifier des protéines ayant une fonction biochimique améliorée ou nouvelle17. Dans ce protocole, nous détaillons un flux de travail optimisé pour faire évoluer la reconnaissance protéase-substrat à l’aide d’un système d’affichage de surface cellulaire chez S. cerevisiae. Le système d’affichage de surface associe l’activité des proté...

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Déclarations de divulgation

Les auteurs ne déclarent aucun intérêt concurrent. Les données brutes supportant ce protocole, y compris les fichiers FASTQ de séquençage Nanopore, les fichiers de cytométrie en flux (FCS), les données sources utilisées pour générer les figures et tableaux, ainsi que les plasmides pDD1523 et pDD1524, ont été déposées dans Zenodo et sont publiquement disponibles à 10.5281/zenodo.20746804

Remerciements

Nous remercions tous les membres du laboratoire Dingal pour leurs conseils, leur expertise et leurs discussions. Nous remercions également le UTD Flow Cytometry Core pour son infrastructure et son soutien. Le M.B.L. est soutenu par la bourse de troisième cycle Eugene McDermott de l’UTD. Cette recherche a été soutenue par un fonds de démarrage de l’UTD et des subventions NIGMS des National Institutes of Health au laboratoire du P.C.D.P.D. (R35GM150967).

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
Réactifs
10 mM dNTP MixNEBN0447SRéactions PCR (Tableaux 1, 3)
10X PBS, pH 7,4FisherBP3994Tampon de coloration de base (Étapes 3.2–3.3)
5X Q5 Reaction BufferNEBB9027SVendu séparément; également inclus avec la polymérase Q5
Agar, BactoBD Difco281230-500gPlaque d'agar SDCAA (Tableau 5); 15 g/L
Agarose (Low-EEO/Multi-Purpose/Grade de Biologie Moléculaire)Fisher BioReagentsBP160-500Électrophorèse sur gel
Anti-FLAG PE AntibodyBioLegend637309Coloration FACS; anti-FLAG conjugué à PE
Anti-HA Tag Antibody [FITC]GenScriptA01621Coloration FACS; anti-HA conjugué à FITC
Bacto Casamino AcidsBD Difco223120Médias SDCAA+, SGCAA+, SCAA (Tableau 5); 5 g/L
Bacto Peptone / TryptoneRPIT60060-10000.0Préparation des médias LB/SOB; 20 g/L dans YPD (Tableau 5)
BSA, Bovine Serum Albumin, Fraction VSigma-Aldrich126575-10GM0,5% dans PBS; tampon de coloration (Étapes 3.2–3.3)
BsmBI-v2 (200 U)NEBR0739SAssemblage Golden Gate du cassette de substrat (Tableau 8)
Calcium chloride solution (1M)Sigma-Aldrich21115-100mLTampon d'électroporation: 1 mM final (Tableau 5)
ColiRollers® Plating BeadsSigma-Aldrich71013-3Stériliser en les mettant dans des flacons de réactifs et en les autoclavant à 121ºC, 15 psi, pendant 15 minutes.
D-GalactoseThermo FisherA12813.30250 g; stock à 20% p/v pour l'induction SGCAA+ (Tableau 5)
D-SorbitolThermo Fisher1327300.10Tampon d'électroporation (1 M) et médias de croissance (Tableau 5)
Dextrose (D-Glucose), anhydreSigma-AldrichG8270-1KGYPD, SDCAA+, stock à 20% p/v en dextrose (Tableau 5)
Difco Yeast Nitrogen Base w/o Amino AcidsSigmaY0626-250G6,7 g/L dans SDCAA/SGCAA (Tableau 5)
Difco YPD Broth (pré-mélangé)BD242820-500gAlternative YPD pré-faite; 500 g
DL-Dithiothreitol (DTT)Sigma-AldrichD0632-1GTampon de conditionnement: 10 mM final; aliquot 250 µL, conserver à -20°C
E.Z.N.A. CyclePure PCR Purification KitOmega Bio-tekD6492-02Nettoyage des produits PCR
E.Z.N.A. Gel Extraction KitOmega Bio-tekD2500-01Purification sur gel après PCR et digestion par restriction (Étapes 1.1.8, 1.3.2)
E.Z.N.A. Plasmid DNA Mini Kit IOmega Bio-tekD6942-02Purification de plasmides (Étape 4.2)
Glycerol (≥99%)FisherBP229-4Stock à 50% v/v pour les stocks en glycerol (Étape 4.1.1)
Kanamycin Sulfate FisherBP906-5SDCAA+ et SGCAA+: 50 µg/mL final; remplace Sigma K0879-5G
KLD Enzyme MixNEBM0554SKinase-Ligase-DpnI; mutagenèse dirigée
KLD Reaction BufferNEBB0554AUtilisé avec le KLD Enzyme Mix
LB Broth (Lennox)Sigma-AldrichL3022-1KGCulture liquide d'E. coli
Lithium Acetate Dihydrate (LiOAc·2H2O)Thermo FisherA17921.30Tampon de conditionnement: 0,1 M final; ajouter avant le DTT (Tableau 5)
Luria Agar (Luria-Bertani Agar)RPIL24020-2000.0Plaque d'E. coli; remplace Sigma LB Agar Lennox L2897-1KG
OmniPur Casamino AcidsSigma2240-500GMSource alternative d'acides aminés casamino
pDD1523Zenodo10.5281/zenodo. 20746804pCTCon2-TRP-CEN/ARS-Gal10-SPAga2-BsaI; Gal1-Aga2-sfGFP
pDD1524Zenodo10.5281/zenodo. 20746804pCTCon2-Aga2-6xHis-ENLYFQS-FLAG-ENLYFES-HA-ERS
Penicillin-Streptomycin Solution, 100XCorning30-002-CISDCAA+, SGCAA+: 1X final
PstI-HF (5000 U)NEBR3140SLinéarisation des vecteurs (Tableau 10); utiliser la version HF
Q5 HF DNA PolymeraseNEBM0492SPolymérase de haute fidélité; alternative à Q5 Hot Start
Q5 High GC EnhancerNEBB9028APour les réactions PCR à haut contenu en GC
Q5 Hot Start DNA PolymeraseNEBM0491LAssemblage et amplification PCR (Tableaux 1, 3)
rCutSmart Buffer (10X)NEBB6004SFourni avec PstI-HF et SphI-HF (Tableau 10)
SalI-HFNEBR3138LEnzyme de restriction additionnel
SOC MediumNEBB9020SRécupération post-transformation
Sodium Chloride (NaCl)FisherS271-1Préparation des médias LB / SOB
So

Références

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