Plateforme d'encre sacrificielle imprimée en 3D pour l'imagerie haute résolution de la fonction des cellules endothéliales dans les vaisseaux tortueux et les anévrismes

Résumé

Le protocole décrit comment concevoir et assembler des vaisseaux sanguins in vitro comportant des segments tortueux ou anévrismatiques, en utilisant soit une imprimante par extrusion, soit une application manuelle d'encre sacrificielle pasteurisée, ainsi que la manière d'analyser l'écoulement hémodynamique et les réponses des cellules endothéliales.

Résumé

La tortuosité vasculaire et les anévrismes représentent des risques importants pour la santé dans divers tissus humains et types de vaisseaux sanguins. Ces modifications de la forme des vaisseaux provoquent des anomalies dans la dynamique de l'écoulement sanguin, qui affectent considérablement la fonction endothéliale. Les modèles animaux de ces états pathologiques vasculaires se sont révélés instructifs dans certains cas, mais sont coûteux à établir et limités par la physiologie de l'espèce animale utilisée. En réponse à cela, les modèles in vitro tridimensionnels d'organes-sur-puce (OOC) sont devenus un ensemble d'outils puissants pour évaluer la fonction vasculaire et les réponses endothéliales dans des cellules humaines. Bien que chacun des modèles OOC présente des avantages, un système accessible est nécessaire pour étudier la perméabilité des vaisseaux, un indicateur clé de la fonction vasculaire dans les vaisseaux courbes et les anévrismes soumis à des taux de cisaillement et à des pressions physiologiques. Ici, la méthodologie présentée permet d'étudier les réponses des cellules endothéliales humaines aux anomalies d'écoulement dans un modèle de vaisseau courbe économique, utilisant une imprimante biologique d'entrée de gamme capable de produire des vaisseaux compatibles avec des débits physiologiques, des études de perméabilité, une microscopie optique à haute résolution et un soutien matriciel extracellulaire de rigidité physiologique.

Introduction

La morphologie des vaisseaux sanguins est un indicateur important de la fonction vasculaire, car la tortuosité des vaisseaux et les anévrismes sont des signes distinctifs clés de diverses maladies et de risques pour la santé. La tortuosité vasculaire peut être congénitale, comme dans les syndromes de Marfan¹, de Turner² et de Loeys-Dietz³, ou apparaître plus tard dans la vie comme manifestation de plusieurs maladies, notamment l'hypertension, le diabète, le cancer et possiblement l'athérosclérose^4,5,6. Les anévrismes des tissus artériels, y compris des artères carotides⁷, coronaires⁸, fémorales⁹, aortiques¹⁰ et cérébrales¹¹, sont associés à une morbidité et à des risques pour la santé dus à une dissection ou une rupture spontanée. En plus de provoquer des irrégularités d'écoulement et une inflammation endothéliale associée, la tortuosité vasculaire et les anévrismes peuvent indiquer un dysfonctionnement tissulaire et une inflammation sous-jacents. Par exemple, chez les nouveau-nés et les enfants, le syndrome de la tortuosité artérielle est cliniquement prédictif d'accident vasculaire cérébral pédiatrique¹², d'hypertension pulmonaire persistante et de dissection aortique^4,13. Chez les adultes, la vascularite rétinienne se manifeste par des vaisseaux rétiniens tortueux dont l'apparence s'atténue lorsque l'inflammation sous-jacente se résorbe¹⁴. La manière dont la tortuosité est perçue et traduite en signaux anormaux responsables de la progression de la maladie reste un domaine de recherche actif. On pense que les cellules endothéliales tapissant les vaisseaux sanguins agissent comme capteurs primaires dans ce processus. Un écoulement perturbé ou lent, induit par la tortuosité vasculaire ou les anévrismes, modifie le stress de cisaillement, entraînant des modifications endothéliales dans la signalisation inflammatoire¹⁵ et la fonction de barrière¹⁶. Les cellules endothéliales sont très sensibles au flux de liquide grâce à des mécanismes impliquant des cils primaires¹⁷, des protéines d'adhérence mécanosensibles^18,19 et des canaux ioniques^20,21, qui déclenchent une signalisation pouvant activer des fuites, l'inflammation et un reprogrammation endothéliale^22,23,24. Les méthodes permettant d'étudier les réponses endothéliales à la géométrie vasculaire tortueuse sont donc essentielles pour le développement de thérapies vasculaires.

Les fonctions endothéliales dans les états de maladies vasculaires ont été modélisées à l'aide de modèles animaux in vivo, de systèmes organe-sur-puce (OOC) et d'approches de bioprinting. Les modèles murins permettent de contrôler l'expression de gènes connus associés à la maladie et intègrent la complexité de l'architecture tissulaire et de la physiologie, y compris l'implication des cellules mésangiales et immunitaires. Les modèles murins d'athérosclérose²⁵, de syndrome de Marfan²⁶ et de divers anévrismes^27,28,29 fournissent des informations sur les pathologies associées au dysfonctionnement vasculaire. Malgré ces avantages, l'observation directe, la manipulation expérimentale et la quantification des cellules endothéliales sont difficiles à réaliser, en dehors des méthodes globales telles que le séquençage ARN. De plus, les modèles animaux soulèvent des considérations éthiques et des contraintes de coût, et sont limités par la physiologie propre à chaque espèce.

Plusieurs approches in vitro basées sur les organes-sur-puce (OOC) ont été développées pour étudier les réponses endothéliales humaines aux écoulements laminaire et perturbé^30,31,32 dans des systèmes à la fois en 2D^33,34 et en 3D^35,36,37. La littérature abondante sur les OOC³⁸ a été principalement impulsée par le génie biomédical, avec des caractéristiques de conception répondant à des questions biomédicales spécifiques. De nombreux modèles vasculaires sur puce utilisent des supports en polydiméthylsiloxane (PDMS) pour contrôler l'architecture des vaisseaux³⁸. Ces modèles permettent un contrôle haute résolution de géométries complexes et facilitent la modélisation des interactions entre organes et vaisseaux, notamment celles impliquant le foie³⁹, le cerveau⁴⁰ et le poumon⁴¹. Toutefois, des limites persistent. La faible perméabilité du PDMS et de polymères similaires aux macromolécules peut restreindre les études sur la fonction de barrière vasculaire. De plus, la plupart des PDMS durcis présentent une rigidité d’environ 0,8–10 MPa⁴², bien que des formulations alternatives puissent atteindre des plages plus physiologiques de 8–200 kPa⁴³. Les estimations de la rigidité de la membrane basale vasculaire varient de ~350 Pa⁴⁴ à ~70 kPa⁴⁵, selon le type de vaisseau et la méthodologie de mesure, la majorité des membranes basales vasculaires saines se situant dans la gamme de 2–3 kPa⁴⁶. Étant donné que des maladies vasculaires telles que l’athérosclérose et l’hypertension sont en partie associées à une augmentation de la rigidité de la matrice extracellulaire (ECM)^{47,48,49,50,51}, et que les cellules endothéliales réagissent à la rigidité de la ECM, il est important de contrôler cette rigidité dans des plages physiologiques dans les modèles in vitro. Des approches OOC plus récentes utilisent des substrats physiologiques permettant des géométries complexes^52,53, intègrent plusieurs types cellulaires afin de recréer la fonction organique^{39,54,55,56,57}, ou les interactions immuno-vasculaires⁵⁸, modélisent des structures vasculaires spécifiques à un patient^59,60, et soutiennent le développement préclinique de médicaments^61,62. Dans de nombreux modèles microvasculaires impliquant des interactions avec d'autres types cellulaires, les cellules endothéliales forment spontanément des vaisseaux présentant des géométries relativement peu contrôlées⁶³. En revanche, les systèmes OOC permettant des géométries vasculaires définies sous écoulement contrôlé nécessitent souvent des infrastructures, des matériaux et une expertise importants^53,64. Des méthodes robustes accessibles aux non-spécialistes sont donc nécessaires pour faciliter l’étude du comportement des cellules vasculaires dans des conditions physiologiquement pertinentes.

Les plates-formes d’impression biologique compatibles avec les hydrogels de MEC physiologiques offrent des modèles in vitro polyvalents pour étudier la fonction endothéliale dans diverses géométries vasculaires⁶⁵. Ces approches utilisent soit le dépôt dirigé de gels contenant des cellules endothéliales en forme de vaisseau sanguin⁶⁶, soit une encre sacrificielle permettant de générer des lumières tubulaires ouvertes intégrées dans la MEC, qui peuvent ensuite être dissoutes, laissant une lumière pouvant être ensemencée avec des cellules endothéliales⁵⁴. Des substrats de MEC biologiquement compatibles, tels que la gélatine, le collagène et le fibrinogène, peuvent être ajustés à des rigidités proches de celles de la membrane basale vasculaire (1–3 kPa⁶⁷) et permettent des essais de perméabilité vasculaire similaires à ceux utilisés in vivo. Bien que ces méthodes n’atteignent pas la même résolution de forme et de taille que la fabrication en PDMS, il est possible de produire des vaisseaux courbés, ramifiés et sténosés^52,66,68. Ces plates-formes conviennent donc particulièrement bien à la modélisation de géométries vasculaires, notamment des vaisseaux tortueux et anévrismatiques.

La méthode présentée ici utilise une approche d'impression 3D basée sur l'extrusion pneumatique, le positionnement tridimensionnel à l'échelle micrométrique, la régulation de la température du plateau d'impression et de la tête d'impression contenant l'encre, ainsi qu'une encre sacrificielle précédemment développée pour des interactions réno-vasculaires sur puce^67,69. L'encre sacrificielle est imprimée selon la géométrie vasculaire souhaitée, puis immédiatement encapsulée dans la MEC. Un changement de température permet ensuite d'éliminer l'encre, laissant une lumière ouverte dans la MEC qui est ensuite ensemencée par des cellules endothéliales humaines. La MEC de base est composée de gélatine et de fibrine, permettant une gélification rapide et une polymérisation du fibrine médiée par la thrombine, tout en offrant une rigidité mécanique adaptée à celle de nombreuses membranes basales vasculaires. D'autres composants de la MEC, tels que la laminine ou la fibronectine, peuvent être ajoutés afin de mieux imiter la composition de la membrane basale vasculaire^70,71,72 et favoriser l'adhésion endothéliale. Le système est assemblé dans des chambres réutilisables de type Rose⁷³, comprenant des supports métalliques, des joints en caoutchouc de silicone et des lamelles de microscope à haute résolution, ce qui permet la connexion à une pompe à fluide via des aiguilles à raccord Luer-lock. Alternativement, les plaques supérieure et inférieure peuvent être fabriquées par impression 3D à l'aide d'acide polylactique ou d'un matériau renforcé de fibres de carbone. Le système assemblé résiste aux pressions générées par des débits physiologiques. Une procédure de pasteurisation améliore également la stérilité de l'encre sacrificielle sans modifier ses propriétés physiques. De plus, une méthode utilisant un modèle d'aiguille et une bio-encre permet de fabriquer des vaisseaux droits contenant un anévrisme, sans recourir à une imprimante biologique. Les vaisseaux ainsi obtenus, tortueux ou présentant un anévrisme et endothélialisés, peuvent être observés sous écoulement physiologique par microscopie optique à haute résolution pendant environ une semaine, permettant l'étude des réponses endothéliales aiguës à une géométrie vasculaire modifiée.

Un avantage majeur de ce système réside dans sa compatibilité avec la microscopie optique. Les vaisseaux générés in vitro à l’aide de ce protocole peuvent être analysés par plusieurs modalités d’imagerie et conviennent particulièrement à la microscopie à fluorescence confocale à disque rotatif ou à balayage laser. La résolution spatiale et temporelle, la sensibilité ainsi que la distance de travail de l’objectif doivent être prises en compte lors du choix des conditions d’imagerie. Pour la plupart des vaisseaux générés avec ce système, l’objectif doit disposer d’une distance de travail suffisante pour atteindre une profondeur d’environ 100 à 300 µm à partir de la lame et permettre l’imagerie au niveau du point médian du vaisseau. Des objectifs à haute ouverture numérique sont nécessaires pour obtenir une imagerie haute résolution des structures endothéliales, notamment les organites et les adhésions cellulaires, ainsi que pour l’imagerie en temps réel exigeant une haute résolution temporelle, comme le suivi de billes repères sous écoulement. Certains tests nécessitant une capture de photons moins efficace, tels que les mesures de barrière endothéliale basées sur la fluorescence, peuvent être réalisés à l’aide d’objectifs à plus faible ouverture numérique, comme des objectifs à air de 10 à 20×.

Le protocole décrit la génération de vaisseaux tortueux et anévrismatiques composés de cellules endothéliales humaines dans un système in vitro permettant un écoulement physiologique des fluides et une microscopie à haute résolution. Le flux opérationnel comprend la conception des vaisseaux, la fabrication de la chambre, la préparation et l'impression 3D de l'encre sacrificielle, la préparation de la matrice extracellulaire et l'élimination de l'encre, l'ensemencement des cellules endothéliales et leur culture sous écoulement, l'évaluation des fuites vasculaires, la cartographie de l'écoulement et la coloration par immunofluorescence (Figure 1).

Protocole

1. Concevoir le récipient

1. Sélectionnez un segment de vaisseau qui s'insère dans la chambre compatible microscope. Pour une chambre Rose, maintenez une distance d'au plus 1,6 cm entre les réservoirs d'entrée et de sortie.
2. Importez l'angiographie TDM avec produit de contraste (Figure 2A), l'angiographie par résonance magnétique ou l'angiographie fluoroscopique dans ImageJ/FIJI ou un autre logiciel d'analyse d'images.
3. Utilisez l'outil de mesure ponctuelle pour définir les coordonnées XY le long du centre axial du vaisseau. Exportez les coordonnées vers un tableur (Figure 2B).
   NOTE : Les fichiers STL issus de l'angiographie TDM peuvent être importés directement dans la plupart des logiciels d'impression ; toutefois, l'impression basée sur des polygones peut nécessiter plusieurs passes et produire des vaisseaux tressés (figure supplémentaire 1). Utilisez le G-code direct pour une impression en une seule passe. Pour cette raison, la cartographie des coordonnées et la conception en G-code sont préférées. Voir l'exemple de G-code dans les fichiers supplémentaires.
4. Modifiez les coordonnées XY dans le tableur afin de positionner le centre du vaisseau à l'origine du repère graphique. Importez la limite de la chambre, si nécessaire, pour vérifier que l'impression finale tient dans la chambre.
5. Utilisez les coordonnées XY du vaisseau pour concevoir le vaisseau dans la première couche d'impression (Figure 2C). Réglez la hauteur de la première couche, incluant le vaisseau et les réservoirs d'entrée et de sortie contigus, à 200 µm.
6. Concevez des réservoirs d'entrée et de sortie permettant une insertion facile de l'aiguille. Utilisez des réservoirs en forme de losange lorsque cela est approprié pour diriger efficacement le fluide vers l'entrée du vaisseau, en minimisant les turbulences d'entrée (Figure 2).
7. Incluez les réservoirs dans la première couche d'impression afin qu'ils restent contigus au vaisseau. Ajoutez 5 à 9 couches au-dessus de la couche de base pour assurer un volume suffisant permettant le positionnement des aiguilles d'entrée et de sortie.  Pour la conception en G-code, les détails suivants sont importants :
   1. Réglez la tête d'impression et le plateau d'impression, lorsque le contrôle de température est disponible, à 37 °C à l'aide du logiciel d'impression ou des commandes G-code appropriées au début du fichier d'impression.
   2. Spécifiez la tête d'impression ou l'extrudeuse dans le G-code lorsque plusieurs têtes d'impression sont disponibles. Configurez le G-code pour utiliser des coordonnées absolues et des distances d'extrusion absolues.
   3. Ajustez la hauteur de couche en fonction de la taille et de la forme de l'aiguille, de la pression d'écoulement de l'encre et de la vitesse de la tête d'impression. Utilisez une hauteur de couche de 200 µm pour chaque couche de réservoir au-dessus de la première couche pour les exemples décrits ici.
   4. Utilisez une contre-pression de 14 à 17 psi et une vitesse de tête d'impression de 6 mm/s (G-code : F360) pour les réservoirs. Augmentez la vitesse de la tête d'impression à 15 mm/s (G-code : F900) pour le vaisseau.
8. Testez chaque nouveau design de vaisseau sur une lame de verre sans chambre avant d'imprimer le vaisseau final.

2. Préparer l'encre sacrificielle

1. Ajouter 2,1 g d'oxyde de polyéthylène (PEO) à 60 mL d'eau stérile froide pour préparer une solution à 3,5 % p/v dans un récipient stérile couvert contenant une barre d'agitation stérile. Agiter à 4 °C pendant au moins 48 h et vérifier périodiquement que toute la poudre est dissoute.
   REMARQUE : Conserver la solution de PEO dans un récipient hermétique à 4 °C pendant jusqu'à 1 mois.
2. Ajouter 17,5 g de Pluronic F-127 à 50 mL d'eau stérile froide pour préparer une solution à 35 % dans un récipient stérile couvert contenant une barre d'agitation stérile. Agiter à 4 °C pendant au moins 48 h et vérifier périodiquement l'incorporation complète de la poudre.
3. Combiner 11,4 mL de PEO à 3,5 % froid avec 28,6 mL de Pluronic F-127 à 35 % froid dans un tube conique stérile de 50 mL. Mélanger pendant au moins 24 h à 4 °C sur un agitateur rotatif.
4. Placer le tube debout à 4 °C toute la nuit pour permettre aux bulles de remonter à la surface de la solution.
5. Placer le tube contenant l'encre dans un bain-marie et incuber à 63 °C pendant 3 h. Laisser le bouchon légèrement ouvert pendant le chauffage pour permettre à l'air de s'échapper.
6. Retirer le tube du bain-marie et le laisser refroidir progressivement à température ambiante. Refermer le bouchon une fois la solution refroidie.
7. Placer l'encre pasteurisée sur de la glace pendant 2, en agitant doucement de temps en temps sans introduire de bulles.
8. Retirer le piston de la seringue, boucher l'orifice de l'aiguille et remplir la seringue à 60 %–70 % de sa capacité. Insérer le piston, retourner la seringue, retirer le bouchon de l'orifice de l'aiguille et expulser tout l'air emprisonné.
   REMARQUE : Conserver les seringues remplies à température ambiante pendant jusqu'à 1 mois.

3. Fabriquer la chambre Rose et préparer la plomberie

1. Fabriquez les plaques de serrage supérieure et inférieure en aluminium ou imprimez-les en 3D à l’aide des fichiers CAO/STL fournis (Figure 2). Prévoyez un orifice inférieur biseauté suffisamment grand pour permettre l’accès d’un objectif à haute ouverture numérique, ainsi qu’un rebord de support pour les vis qui compriment fermement les lamelles contre le joint.
   REMARQUE : L’aluminium assure un meilleur transfert thermique lors de l’utilisation d’un plateau chauffant en microscopie. Les pièces imprimées en 3D en PLA ou renforcées de fibres de carbone conviennent pour les prototypes, mais peuvent présenter un transfert thermique moins efficace et se déformer lors de chauffages répétés.
2. Découpez la feuille de silicone pour qu’elle corresponde aux plaques de serrage de 38 mm × 51 mm. Créez la fenêtre centrale d’observation à l’aide d’un poinçon de 18 mm.
3. Percez des trous adaptés au diamètre des vis choisies. Rincez abondamment le joint terminé à l’eau pour éliminer les débris résiduels de silicone.
4. Stérilisez les plaques de serrage métalliques, les vis, les écrous et les joints en silicone en autoclave, dans un sachet fermé en aluminium, à l’aide d’un cycle sec de 20 min.
5. Immergez les plaques imprimées en 3D dans de l’éthanol à 70 % pendant 1 min. Séchez les plaques dans un champ stérile.
6. Préparez des morceaux de tubulure de 10 à 30 cm équipés de raccords Luer-lock et de pinces à tubulure intégrées, de tubulure appropriée pour pompe péristaltique, d’un robinet trois voies, d’un amortisseur de pulsation et d’un réservoir de milieu à deux orifices (Figure 3).
7. Stérilisez les tubulures et les composants du réservoir compatibles avec la chaleur par autoclavage. Stérilisez les composants non autoclavables par exposition à l’éthanol.

4. Préparer les réactifs de la matrice extracellulaire

1. Ajouter 12,5 mL de PBS chaud à 37 °C à 1 g de fibrinogène de plasma humain pour préparer une solution mère à 80 mg/mL. Incuber à 37 °C et agiter doucement de temps en temps sans vortexer.
2. Laisser dissoudre le fibrinogène pendant 1 à 2 h, formant une solution trouble. Aliquoter la solution dans des tubes stériles et conserver à −20 °C jusqu'à 3 mois.
3. Ajouter 22,5 g de gélatine à 135 mL de PBS stérile dans un flacon stérile contenant une barre d'agitation magnétique. Agiter pendant 16 h à 70 °C, en agitant périodiquement le flacon pour assurer une dissolution complète.
4. Ajuster la solution de gélatine à un pH de 7,5 à l'aide de NaOH 1 M. Filtrer sous vide la solution chaude, la fractionner en aliquots et la conserver à 4 °C jusqu'à 6 mois.
   REMARQUE : Laisser la gélatine gonfler (bloom) pendant au moins 16 h avant la filtration. Maintenir la solution et l'appareil de filtration à 37 °C pendant la filtration sous vide afin de minimiser l'obstruction du filtre.
5. Dissoudre la thrombine de plasma humain dans du PBS stérile pour obtenir une concentration de 1 000 U/mL. Mélanger doucement, aliquoter et conserver à −20 °C jusqu'à 1 an.
6. Dissoudre 300 mg de transglutaminase dans 5 mL de PBS et incuber à 37 °C pendant 1 h avec des mélanges occasionnels. Filtrer stérilement la solution dans un tube neuf et la maintenir à température ambiante.
   REMARQUE : Préparer la solution de transglutaminase fraîchement chaque jour. Conserver la transglutaminase sous forme de poudre dans un environnement desséché à 4 °C.
7. Dissoudre le chlorure de calcium dans de l'eau pour préparer une solution à 1 M. Filtrer stérilement la solution et conserver à température ambiante jusqu'à 1 an.

5. Préparer et activer les lamelles

1. Tremper des lamelles propres dans de l'éthanol, puis les passer soigneusement à la flamme d'un bec Bunsen pour évaporer l'éthanol.
   ATTENTION : L'éthanol est inflammable. Garder l'éthanol en grande quantité à distance de la flamme nue et effectuer la stérilisation à la flamme en suivant les procédures de sécurité incendie appropriées en laboratoire.
2. Placer les lamelles dans un porte-lamelles en acier inoxydable sans fissurer ni ébrécher le verre.
3. Immerger les lamelles dans du (3-aminopropyl)triméthoxysilane à 0,5 % dilué dans de l'eau pendant 30 à 60 min à température ambiante. Appliquer une agitation douce pendant l'incubation.
   ATTENTION : Manipuler le (3-aminopropyl)triméthoxysilane en utilisant des équipements de protection chimique appropriés ainsi que des dispositifs de contrôle technique.
4. Laver les lamelles par six changements d'eau avec une agitation douce. Éviter que les lamelles ne se détachent lors du transfert du porte-lamelles.
5. Retirer le porte-lamelles de l'eau, essuyer l'excès d'eau et sécher à 50 °C pendant 30 min.
6. Laisser les lamelles refroidir à température ambiante tout en préparant du glutaraldéhyde à 0,5 % dans du PBS.
   ATTENTION : Le glutaraldéhyde est toxique et irritant. Préparer et manipuler la solution sous une hotte chimique appropriée tout en portant des équipements de protection individuelle adaptés.
7. Incuber les lamelles dans du glutaraldéhyde à 0,5 % pendant 60 min avec une agitation douce afin de minimiser l'accumulation de bulles et favoriser une activation uniforme.
8. Rincer les lamelles par trois changements d'eau stérile et les laisser sécher à l'air à température ambiante.
   REMARQUE : Conserver les lamelles activées sous dessiccation sous vide jusqu'à 2 mois.

6. Recouvrir les lamelles de la couche de base de la matrice extracellulaire

1. Chauffer le PBS 1×, le stock de gélatine et le stock de fibrinogène à 37 °C pendant 30 à 60 min.
2. Recouvrir l'intérieur d'une boîte de Pétri stérile de 15 cm avec du parafilm propre, vaporiser la surface avec de l'éthanol à 70 %, éliminer l'excès et laisser sécher à l'air dans une hotte de sécurité.
3. Ajouter successivement dans un tube conique de 15 mL : 1,68 mL de PBS tiède, 2,5 mL de stock de gélatine, 12,5 µL de CaCl₂ 1 M, 625 µL de stock de fibrinogène et 167 µL de solution de transglutaminase.
4. Placer le mélange de matrice extracellulaire (ECM) dans un bain-marie à 37 °C pendant 30 min.
5. Préparer un tube de 1,7 mL contenant 5 µL de stock de thrombine par lamelle.
6. Ajouter 400 µL de la préparation ECM au tube de thrombine et mélanger en pipetant une fois, tout en minimisant la formation de bulles.
7. Distribuer immédiatement 200 µL du mélange sur le parafilm stérile et poser une lamelle activée sur la goutte à l’aide de pinces. Appuyer doucement pour assurer une couverture complète.
   NOTE : Réaliser cette étape dans les environ 20 s suivant le mélange du mélange ECM avec la thrombine.
8. Couvrir la boîte de Pétri et incuber les lamelles revêtues pendant 10 min à température ambiante, puis pendant 2 h à 37 °C dans une étuve humidifiée.
9. Détacher délicatement chaque lamelle du parafilm en courbant le parafilm loin de la lamelle.
10. Placer les lamelles fraîchement revêtues, côté gel vers le haut, dans une boîte de Pétri propre, dans une étuve humidifiée, et les utiliser dans les 24 h.
11. Alternativement, incuber les lamelles revêtues toute une nuit dans une étuve non humidifiée et les utiliser dans les 2 jours.

7. Imprimer en bioprinting l'encre sacrificielle et l'encapsuler dans la MEC

1. Effectuez des impressions d'essai avant d'imprimer le vaisseau afin de vérifier que l'encre et les paramètres d'impression produisent les dimensions souhaitées du vaisseau. Chargez le fichier d'impression dans le logiciel de l'imprimante.
   REMARQUE : Une aiguille de distribution conique de 32 G avec l'encre composée de 25 % de Pluronic F127 et de 1 % de PEO produit de manière fiable des diamètres de vaisseaux d'environ 150 µm dans les conditions décrites ici. Optimisez la vitesse de la tête d'impression et la contre-pression à l'aide d'impressions de lignes simples sur du verre.
2. Assemblez la plaque de serrage inférieure, la lame inférieure revêtue de matrice extracellulaire (ECM), le joint en silicone, la plaque de serrage supérieure sans lame supérieure, et les deux vis. Placez l'ensemble dans une boîte de Pétri de 100 mm couverte et maintenez-le à 37 °C jusqu'à son utilisation le jour même.
3. Fixez l'aiguille d'impression à la seringue contenant l'encre et installez la seringue dans l'imprimante à extrusion pneumatique. Préchauffez la plateforme d'impression, la tête d'impression et une plaque chauffante adjacente à 37 °C.
4. Préparez la matrice ECM comme décrit à la section 6 et maintenez-la dans un bain-marie à 37 °C. Préparez 1,5 mL de matrice par chambre Rose en lots de 5 mL.
5. Placez 5 µL de solution mère de thrombine dans un tube stérile de 1,7 ou 2 mL pour chaque chambre. Tenez prêtes des lames supplémentaires activées et non revêtues dans la cabine de sécurité biologique.
6. Placez la chambre contenant la lame revêtue d'ECM sur la plateforme de l'imprimante et centrez-la à l'origine XY. Abaissez l'aiguille jusqu'à ce qu'elle entre en contact avec la surface d'ECM ou de verre au centre de la fenêtre de la chambre, puis définissez cette position comme origine XYZ.
7. Relevez l'aiguille et appliquez une pression maximale pour la remplir complètement d'encre et chasser toutes les bulles visibles. Essuyez la pointe de l'aiguille avec un tissu de laboratoire stérile.
8. Imprimez la géométrie du vaisseau et des réservoirs à l'aide du fichier G-code téléchargé. Relevez immédiatement l'aiguille et retirez la chambre après l'impression.
9. Examinez le vaisseau imprimé à la recherche de bulles ou d'interruptions. Jetez et réimprimez toute structure présentant l'un ou l'autre défaut.
10. Placez la chambre sur la plaque chauffante à 37 °C, retirez les vis et la plaque de serrage supérieure, puis mélangez 1 mL de matrice ECM préparée avec l'aliquot de thrombine en pipetant une fois.
11. Transférez le mélange d'ECM activé dans la chambre du vaisseau sans introduire de bulles, puis placez immédiatement une lame activée face vers le bas au-dessus de l'ECM. Remettez en place la plaque de serrage supérieure et serrez les vis fermement sans les serrer excessivement.
12. Placez la chambre terminée dans une boîte de Pétri de 100 mm couverte et incubez à 37 °C pendant 2 h.

8. Générer un anévrisme à l'aide d'un gabarit en fil métallique

1. Insérer des aiguilles de calibre 21 à travers les côtés opposés du joint en silicone et les aligner.
2. Soniquer un fil mandrin médical en acier inoxydable 304 de diamètre 0,0190 pouce dans du PBS contenant 1 % de BSA dans un tube conique de 15 mL. Retirer le fil et le laisser sécher à l’air dans une boîte de Pétri stérile placée dans une cabine de sécurité biologique.
3. Faire passer le fil revêtu de BSA à travers les deux aiguilles du joint (Figure 2). Courber légèrement une des extrémités sortantes pour faciliter la rotation ultérieure.
4. Stériliser au autoclave le joint, les aiguilles, le fil et l’ensemble du plateau de serrage dans un sachet en aluminium.
5. Positionner l’ensemble aiguille/joint au-dessus d’un coverslip activé et revêtu de MEC.
6. Fixer une aiguille de 21 G à une seringue contenant de l’encre pasteurisée à base de Pluronic/PEO.
7. Déposer une petite goutte d’encre sacrificielle sur le côté du fil, au centre de la chambre. Appliquer une petite goutte d’encre à chaque jonction entre l’aiguille et le fil afin de former un joint étanche.
8. Préparer le mélange de MEC et assembler la chambre comme décrit aux sections 7.10 à 7.12.
9. Une fois la MEC gélifiée, tourner délicatement l’extrémité courbée du fil pour le libérer de la MEC et de l’encre sacrificielle. Retirer lentement le fil du dispositif.
10. Remplir l’aiguille d’entrée avec du PBS à l’aide d’une pipette de 200 µL et laisser le PBS s’écouler à travers la lumière. Répéter une fois, puis passer à la section 9.

9. Rincer l'encre sacrificielle de la chambre du vaisseau

1. Relier un tube à un réservoir contenant du PBS froid (4 °C) supplémenté en antibiotiques, intégrer un robinet trois voies, et terminer le tube par un raccord mâle Luer-lock et une aiguille stérile de 23 G.
2. Remplir le tube d'alimentation avec du PBS froid à l’aide de la seringue fixée au robinet trois voies, jusqu’à ce que le PBS sorte de l’orifice de l’aiguille. Pincer le tube.
3. Remplir une deuxième section de tube avec du PBS et la terminer par une aiguille de 23 G. Pincer le tube et retirer la seringue de remplissage.
4. Insérer l’aiguille d’alimentation à travers le joint jusqu’au réservoir d’entrée et l’aiguille de drainage dans le réservoir de sortie. Vérifier le positionnement correct à l’aide d’un microscope inversé ou d’un stéréomicroscope.
5. Transférer l’ensemble à 4 °C et positionner le réservoir d’alimentation à 30 cm au-dessus de l’entrée. Placer la sortie à 5–10 cm en dessous de l’aiguille de sortie du vaisseau, au-dessus d’un récipient de déchets.
6. Ouvrir les pinces et faire circuler au moins 250 mL de PBS froid à travers la chambre. Vérifier la présence de fuites et de bulles dans le système pendant le rinçage.

10. Recouvrir et prétraiter la lumière du vaisseau avec des composants supplémentaires de la MEC

1. Diluer la fibronectine à 20 µg/mL, la laminine à 10 µg/mL ou la matrice de membrane basale à une dilution de 1:30 dans 3 mL de PBS.
2. Ajouter de la transglutaminase fraîchement préparée au réactif de matrice extracellulaire dilué.
3. Laisser le tube immédiatement adjacent au vaisseau raccordé à l'entrée et à la sortie.
4. Injecter lentement la solution de matrice extracellulaire/transglutaminase dans le vaisseau à l’aide d’une seringue de 1 mL. Répéter jusqu’à ce que les 3 mL aient traversé entièrement le vaisseau.
5. Bloquer les raccords, boucher l'entrée et la sortie avec des bouchons stériles de type Luer et incuber à 37 °C pendant 1 h à toute la nuit.
6. Rincer le vaisseau avec 100 mL de milieu endothélial complet contenant de la pénicilline/streptomycine. Bloquer les raccords du tube et boucher les sorties.
   REMARQUE : Conserver le vaisseau rempli de milieu à 4 °C pendant un maximum d'une semaine. S'assurer qu'aucune bulle ne subsiste dans la lumière.

11. Cellulariser le vaisseau

1. Incuber la chambre contenant le modèle de vaisseau de matrice extracellulaire à 37 °C pendant 2 h. Réchauffer le milieu endothélial complet contenant de la pénicilline/streptomycine à 37 °C.
2. Traiter les cellules endothéliales à la trypsine à partir d'une plaque de culture de 10 cm ou d'un flacon T75, puis neutraliser la trypsine avec du milieu complet. Transférer la suspension dans un tube conique de 15 mL et prélever un aliquot pour le comptage cellulaire.
3. Centrifuger les cellules à 1 000 × g pendant 5 min. Resuspendre le culot afin de préparer 150 µL de suspension cellulaire à 5 × 10⁶ cellules/mL.
4. Relier le tube de sortie à un réservoir stérile de déchets et maintenir la pince du tube fermée.
5. Déconnecter le tube d'entrée et éliminer le milieu résiduel du raccord de l'aiguille d'entrée. Tenir le vaisseau verticalement et pipeter la suspension cellulaire dans le raccord de l'aiguille.
6. Ouvrir la pince de sortie pour permettre à la suspension cellulaire d'entrer dans le vaisseau. Refermer la pince de sortie une fois que toute la suspension est entrée dans la lumière.
7. Ajouter du milieu complet réchauffé dans le raccord de l'aiguille d'entrée, puis le fermer avec un bouchon Luer stérile. Déconnecter et boucher la sortie.
8. Incuber la chambre à l'endroit à 37 °C pendant 3 h.
9. Répéter les sections 11.5 à 11.8 et incuber la chambre à l'envers à 37 °C pendant 3 h.
10. Rincer doucement le vaisseau avec 1 mL de milieu complet et incuber à 37 °C pendant 3 h.
11. Vérifier l'attachement endothélial par microscopie, rincer délicatement les cellules non attachées restantes avec du milieu frais, puis incuber à 37 °C pendant 12 à 24 h.

12. Faire la culture du vaisseau sous écoulement

1. Réchauffez 200 mL de milieu complet pendant 1 h et dégazez-le sous vide à l’aide d’un filtre stérile. Réchauffez à nouveau le milieu dans un incubateur à CO₂ humidifié.
2. Dans une hotte de sécurité biologique stérile, reliez en séquence la sortie du réservoir de milieu, le robinet trois voies, le tube de pompe, l’atténuateur de pulsation, le piège à bulles facultatif, le tube d’entrée, la chambre du vaisseau, le tube de sortie et le tube de retour au réservoir de milieu (Figure 3).
3. Amorcez tout le circuit d’écoulement avec le milieu et vérifiez qu’aucune bulle ou poche d’air n’est présente.
   NOTE : Remplissez de liquide les raccords et les embouts d’aiguille avant de les reconnecter. L’entrée de bulles d’air dans un vaisseau cellulaire peut entraîner une perte de cellules endothéliales en raison de forces de cisaillement brutales.
4. Transférez l’ensemble dans un incubateur à 37 °C et initiez un débit d’écoulement de 1 dyn/cm² dans le vaisseau. Maintenez ce débit pendant 12 h.
5. Augmentez le débit pour atteindre 12–16 dyn/cm² et maintenez-le pendant 18–24 h avant de réaliser les tests en aval. Pour calculer le débit nécessaire pour votre vaisseau, déterminez la longueur imprimée du vaisseau et son diamètre moyen. À l’aide d’une calculatrice en ligne, saisissez ces paramètres, sélectionnez une section circulaire, un milieu contenant 10 % de sérum, et une résistance négligeable des tubes (le diamètre des tubes est beaucoup plus grand que celui du vaisseau imprimé).
   NOTE : Utilisez le vaisseau le plus rapidement possible après l’ajustement du flux. Un culture prolongée au-delà d’une semaine peut entraîner des espaces entre les cellules endothéliales, potentiellement liés à une perte cellulaire ou à une modification de la MEC par des protéases endothéliales.

13. Réaliser le test de fuite vasculaire

1. Ajouter de l'albumine sérique de bovin (BSA) marquée avec Alexa 647 ou du dextran Alexa 647 de 10 kDa dans 35 mL de milieu complet afin d'obtenir une concentration finale de 5 mg/mL. Réchauffer la solution à 37 °C.
2. Préincuber le vaisseau avec l'agent test, tel que 250 ng/mL de TNFα, pendant 1 à 2 heures, et inclure le même agent dans le milieu d'essai.
3. Préparer un bain-marie à 37 °C et positionner la pompe près du microscope. Allumer le microscope, le logiciel d'acquisition et le système de chauffage de la platine, puis équilibrer la platine à 37 °C pendant 30 minutes avant l'acquisition d'images.
4. Arrêter l'écoulement dans l'incubateur, déconnecter le réservoir de milieu de culture, puis transférer la chambre et les tubulures associées sur la platine du microscope préalablement réchauffée.
5. Relier la pompe à environ 20 cm de tubulure équipée d'une micropipette en verre contenant du milieu non marqué. Insérer la tubulure de la micropipette dans le milieu contenant le marqueur fluorescent et placer la tubulure de sortie dans un récipient de collecte.
6. Régler la pompe pour obtenir un débit correspondant à 0,2 mL/min, sans démarrer l'écoulement tant que l'acquisition d'images n'est pas prête.
7. Se focaliser sur la ligne médiane du vaisseau en utilisant l'imagerie en contraste de phase, puis passer au canal de fluorescence 647. Démarrer l'écoulement au débit défini à l'étape 13.6 et acquérir des images toutes les 1 à 5 minutes selon le temps de réponse attendu.
8. Générer des kymogrammes à partir des images acquises et ajuster une pente linéaire aux valeurs d'intensité seuillées. Exprimer la fuite par la distance, en µm, parcourue par le marqueur depuis la surface externe du vaisseau par minute.

14. Cartographier l'écoulement du fluide

1. Vortexez les billes fluorescentes de 10 µm pendant 1 min, puis soumettez-les à une sonication dans un bain sonique pendant 1 min. Diluez les billes à 1,8 × 10⁵ billes/mL dans 10 mL de milieu complet.
2. Configurez le système d'écoulement sur la platine du microscope comme décrit à la section 13 pour le test de fuite vasculaire. Incluez un récipient de collecte en sortie et réglez le débit à 0,2 mL/min.
3. Placez au point focal le plan central du vaisseau à l’aide d’un objectif possédant une distance de travail appropriée. Acquérez les images à la fréquence maximale praticable autorisée par le temps d’exposition, la sensibilité du détecteur, l’intensité d’excitation et l’efficacité de collecte de la lumière.
4. Analysez la séquence d’images en laps de temps à l’aide d’un logiciel de vélocimétrie par images de particules.

15. Fixer et immunomarquer le vaisseau endothélialisé

1. Préparer 40 mL de paraformaldéhyde à 4 % dans du PBS contenant 10 mM de CaCl₂ et 10 mM de MgCl₂.
   ATTENTION : Le paraformaldéhyde est toxique. Préparer et manipuler les solutions contenant du paraformaldéhyde dans une hotte chimique appropriée tout en portant des équipements de protection individuelle adaptés.
2. Arrêter l'écoulement, pincer le tube d'entrée, le déconnecter de la pompe, puis le relier au tube de prélèvement utilisé pour le test de fuite vasculaire. Insérer le tube de prélèvement dans le fixateur et laisser passer 35 mL par gravité à travers le vaisseau.
3. Pincer le tube et incuber le vaisseau dans le fixateur à température ambiante pendant 30 min.
4. Rincer le vaisseau par gravité avec 25 mL de tampon de perméabilisation contenant 0,4 % de Triton, 20 mM de PIPES à pH 6,1, 138 mM de NaCl, 5 mM de KCl, 2 mM de MgCl₂, 2 mM d'EGTA et 5,5 mM de glucose. Pincer le tube et incuber pendant 10 min à température ambiante.
5. Rincer le vaisseau avec un tampon de blocage contenant 1 % de BSA, 0,05 % de Tween 20, 20 mM de Tris à pH 7,4, 140 mM de NaCl et 5 mM de KCl. Incuber pendant 2 h à température ambiante ou toute la nuit à 4 °C.
6. Diluer l'anticorps primaire sélectionné au ratio de 1:50 à 1:500 dans 100 à 500 µL de tampon de blocage. Retirer le tube d'entrée et introduire la solution d'anticorps en suivant la procédure décrite à la section 11 pour l'ensemencement cellulaire.
7. Incuber le vaisseau toute la nuit à 4 °C.
8. Reconnecter le tube d'entrée et rincer le vaisseau avec 20 mL de PBS.
9. Diluer les anticorps secondaires appropriés au ratio de 1:200 à 1:1 000 dans le tampon de blocage et, si nécessaire, ajouter la phalloïdine marquée au fluorochrome à 1:250. Introduire la solution en suivant la procédure décrite à la section 15.6 et incuber pendant 2 h à température ambiante.
10. Rincer le vaisseau avec 40 mL de PBS, fermer les pinces sur les tubes et boucher les extrémités.
    REMARQUE : Conserver le vaisseau marqué à 4 °C et réaliser l'imagerie dans les deux semaines.
11. Marquer l'actine F avec de la phalloïdine fluorescente, l'appareil de Golgi avec un anticorps anti-GM130 et les noyaux avec du DAPI.
12. Analyser les images de phalloïdine à l'aide de FibrilTool⁷⁴ afin de déterminer l'orientation moyenne des fibres de stress d'actine F.
13. Déterminer l'axe reliant les centres de masse de chaque noyau et de l'appareil de Golgi. Analyser et représenter graphiquement les orientations obtenues à l'aide d'un logiciel de calcul numérique, comme décrit précédemment⁷⁵.

Résultats

L'utilisation d'encre sacrificielle pour imprimer divers tissus tubulaires est bien établie par plusieurs équipes, notamment le laboratoire de Lewis, qui a fabriqué des tubules rénaux ainsi que des vaisseaux sanguins^67,76. Des approches similaires ont été utilisées pour imprimer des structures alvéolaires⁷⁷ et des tumeurs vascularisées⁷⁸. Ici, ces approches ont été adaptées afin de générer des géométries vasculaires permettant d'étudier les réponses endothéliales sous un écoulement fluide physiologique (Figure 2). Les géométries des vaisseaux ont été converties à partir d'une image vasculaire en une carte de coordonnées, puis en code G afin de définir le trajet d'impression (Figure 2A–C). L'approche résultante a permis la fabrication de modèles de vaisseaux destinés à étudier la manière dont la fonction endothéliale et l'organisation du cytosquelette sont modifiées par des vaisseaux tortueux et des anévrismes (Figure 2D–G). Un design imprimable en 3D de la chambre Rose a également été intégré, éliminant ainsi le besoin d'accéder à des services de mécanique (Figure 2H). Un exemple de fichier de code G pour l'impression de vaisseaux est fourni dans Fichier Supplémentaire 1, et les fichiers CAO correspondants pour la chambre Rose et le support de platine sont fournis respectivement dans Fichier Supplémentaire 2 et Fichier Supplémentaire 3. L'impression basée sur des fichiers STL peut nécessiter plusieurs passages de la tête d'impression, conduisant à des géométries de vaisseaux tressés avec des lumières séparées (Figure Supplémentaire 1). La plateforme résultante a été conçue pour être accessible aux biologistes cellulaires spécialisés en biologie vasculaire, même avec une expertise minimale en génie biologique, tout en supportant des pressions et des débits physiologiques, et en permettant l'accès à une microscopie haute résolution (Figure 2I).

Après la fabrication du vaisseau et sa cellularisation, le dispositif vasculaire a été intégré à un système de perfusion en boucle fermée afin de permettre une circulation contrôlée du milieu (Figure 3). Le système comprenait une pompe péristaltique, un robinet à trois voies relié à une seringue de remplissage, un piège à bulles, un amortisseur de pouls, le dispositif vasculaire et un réservoir de milieu, disposés séquentiellement dans le circuit d'écoulement (Figure 3A). Cette configuration permettait une circulation continue du milieu à travers le vaisseau génie-biologique, tout en intégrant des composants destinés au remplissage du système, à l'élimination des bulles et à l'amortissement des pulsations générées par la pompe péristaltique. Le système assemblé pouvait être utilisé avec le dispositif vasculaire placé dans le dispositif expérimental, comme illustré sur la Figure 3B, offrant ainsi une configuration pratique pour la perfusion ultérieure de vaisseaux cellularisés dans des conditions d'écoulement contrôlées.

Une modification apportée aux approches antérieures utilisant des encres sacrificielles consistait à pasteuriser l'encre avant l'impression. Cette modification s'est avérée nécessaire car l'application des protocoles publiés de préparation de l'encre entraînait une contamination fongique des cultures. Comme pour d'autres encres à base de Pluronic utilisées dans cette application, l'encre composée de 25 % de Pluronic F127 et de 1 % de PEO reste liquide à basse température et passe à un gel micellaire compacté lorsque la température augmente. Cette formulation présente une température de transition de 15 °C, ce qui est pratique pour la structuration des gabarits à la température de l'incubateur et pour l'élimination de l'encre à 4 °C. De façon similaire au Pluronic pur, ce matériau présente également un amincissement important sous cisaillement à la température d'impression (Figure 4A). Toutefois, même à basse température, l'encre est trop visqueuse pour une stérilisation par filtration à l'aide de filtres standards pour culture cellulaire et sous vide. Bien que l'encre puisse être stérilisée par pasteurisation à 70 °C ou plus pendant 20 s, ces températures modifient irréversiblement l'encre et réduisent sa viscosité à la température d'impression (données non montrées). Une pasteurisation à plus basse température et de durée prolongée, à 63 °C pendant >1 h, réduit la contamination par les champignons et autres microorganismes sans altérer la viscosité complexe de l'encre à des températures adaptées à l'impression. Une caractérisation rhéologique effectuée à l'aide d'un rhéomètre équipé d'une géométrie cône-plat de 25 mm a montré que l'encre brute et l'encre pasteurisée présentaient des viscosités similaires sur une gamme de vitesses de déformation aux températures d'impression (Figure 4B), démontrant ainsi que la pasteurisation n'altère pas la capacité d'impression. L'utilisation d'une encre pasteurisée permet également des cultures vasculaires à plus long terme sans recourir à des agents antimycosiques, qui peuvent modifier la fonction endothéliale.

Une fois le vaisseau cellulaire, les cellules endothéliales confluentes doivent recouvrir l'ensemble du vaisseau, comme illustré dans la Figure 5, avec la projection d'intensité maximale dans la Figure 5A et la coupe transversale dans la Figure 5B. Le débit du milieu peut alors être augmenté jusqu'à atteindre des taux de cisaillement physiologiques, qui peuvent être estimés pour des vaisseaux approximativement circulaires à l’aide de l’équation de Hagen-Poiseuille⁷⁹. En pratique, le débit nécessaire pour atteindre une contrainte de cisaillement souhaitée peut être estimé en tenant compte de la viscosité du milieu et de la résistance microfluidique. Dans une culture typique en 2D in vitro, un débit du milieu à 12 dyn/cm² induit la majorité des types cellulaires endothéliaux à s’orienter selon l’axe du flux. Cette réponse peut être visualisée par une coloration au phalloïdine marquée par un fluorochrome de l’actine F (Figure 5D,E) ou par l’analyse de l’axe golgi-noyau (Figure 5D,F), les deux méthodes montrant une orientation anisotrope compatible avec la polarisation endothéliale, comme décrit précédemment¹⁸. Bien que des contraintes de cisaillement supérieures à 40 dyn/cm² se produisent in vivo, de telles conditions n’ont pas été modélisées ici.

Une conséquence majeure d'une géométrie vasculaire modifiée est une modification de l'écoulement du fluide, auquel les cellules endothéliales réagissent via plusieurs voies de signalisation^80,81. Plusieurs méthodes permettent de surveiller la vitesse d'écoulement sanguin, notamment l'échographie Doppler 4D⁸², l'imagerie par résonance magnétique d'écoulement 4D⁸³ et l'imagerie de speckle laser⁸⁴. Bien que ces techniques offrent des avantages importants in vivo, la résolution des différences locales d'écoulement au sein d'un même vaisseau peut s'avérer difficile. La capacité d'imagerie à haute ouverture numérique de cette plateforme permet le suivi direct de particules fluorescentes (Figure 6B) et la cartographie à haute résolution spatiale des anomalies d'écoulement induites par la courbure des vaisseaux, grâce à la vélocimétrie par images de particules (Figure 6C). Par exemple, un écoulement plus lent est observé le long de la courbure interne du vaisseau par rapport à la courbure externe (Figure 6C), ce qui pourrait contribuer à modifier les réponses endothéliales⁸⁵.

Une fois qu'un vaisseau confluent est établi, la perméabilité et la fonction barrière peuvent être évaluées en perfusant des macromolécules marquées par un fluorophore, telles que des dextranes ou des protéines, à travers la lumière du vaisseau. Les vaisseaux perméables tapissés de CUVH s'opposent au passage de dextranes marqués par un fluorophore (Figure 6D,F). En revanche, l'exposition à des stimuli perturbateurs de la barrière, tels que le TNFα, augmente les fuites vasculaires (Figure 6H, J). Les taux locaux de fuite peuvent être visualisés à l'aide d'une analyse kymographique (Figure 6E,G,I,K). Puisque le kymographe représente la distance sur l'axe des X et le temps sur l'axe des Y, les taux relatifs de fuite peuvent être comparés en quantifiant les pentes des droites ajustées aux intensités de fluorescence segmentées (Figure 6E,G,I,K). Ces analyses permettent d'évaluer comment la géométrie locale du vaisseau influence la fonction barrière endothéliale en réponse à des stimuli définis.

Un avantage clé de cette plateforme est l'accès amélioré au microscope par rapport à ce qui est possible in vivo. Le système facilite également l'analyse immunohistochimique de l'organisation moléculaire endothéliale, en particulier du cytosquelette d'actine. Les cellules endothéliales sont très minces et sont entourées de cellules musculaires lisses in vivo, ce qui peut compliquer la localisation des structures cytosquelettiques spécifiquement au sein de l'endothélium. Cette plateforme permet une coloration et une imagerie simples des molécules d'adhésion et de l'actine filamentaire dans les cellules endothéliales (Figure 5) et prend en charge des analyses multicomposants difficiles à réaliser in vivo, notamment l'évaluation de la polarisation et de la division endothéliales sous écoulement physiologique (Figure 5D–F). La combinaison de ces tests sur une seule plateforme permet d'examiner directement les relations entre la géométrie des vaisseaux, les modifications de l'écoulement, la fonction barrière, l'organisation moléculaire endothéliale et l'adhésion intercellulaire.

Figure 1 : Fluxogramme de l’impression et de l’utilisation de vaisseaux sanguins 3D sur puce. Schéma des protocoles pour la génération et l’utilisation de vaisseaux sanguins 3D sur puce. Les cercles noirs indiquent les numéros de protocole correspondants. Les couleurs des boîtes indiquent la température à laquelle chaque protocole est réalisé ou à laquelle l’échantillon est incubé. Le flux opératoire comprend la modélisation de la forme des vaisseaux, la préparation de l’encre, la préparation de la matrice extracellulaire (ECM), la préparation de la chambre, l’impression des vaisseaux, le rinçage et le revêtement des vaisseaux, la cellularisation, la culture sous écoulement, les tests fonctionnels et l’analyse histologique. Veuillez cliquer ici pour visualiser une version agrandie de cette figure.

Figure 2 : Impression des vaisseaux et conception de la chambre. Les vaisseaux peuvent être conçus à partir d'images vasculaires in vivo afin de reproduire des géométries vasculaires spécifiques à chaque patient. (A) Petit vaisseau coronaire imagé par tomodensitométrie (CT) avec produit de contraste, reproduit avec autorisation de Parekh et al.⁸⁶ Échelle = 2 mm. (B) Carte des coordonnées des points de repère d'une portion du vaisseau montrée dans le panneau A, générée par enregistrement ponctuel dans FIJI. (C) Sortie en code G générée à partir de la carte de coordonnées à l'aide d'un logiciel de contrôle de l'imprimante. Les coordonnées X, Y et Z sont indiquées en bas à droite. (D) Schéma d'une chambre Rose contenant un vaisseau bioprinté. La conception avec écrous à empreinte supérieure est compatible avec la chambre en acide polylactique (PLA) imprimée en 3D. (E) Chambre Rose contenant un vaisseau et des réservoirs imprimés avec un bio-encre sacrificielle sur une lamelle revêtue de matrice extracellulaire (ECM). Échelle = 9 mm. (F) Schéma d'une chambre Rose configurée pour le modèle d'anévrisme. Un fil passant à travers les aiguilles d'entrée et de sortie sert de gabarit pour le vaisseau, et la bio-encre sacrificielle déposée sur le fil sert de gabarit pour l'anévrisme. (G) Chambre Rose contenant le fil et le gabarit en bio-encre sacrificielle sur une lamelle revêtue d'ECM. (H) Adaptateur d'objectif en PLA imprimé en 3D (à gauche) et chambre Rose (à droite), offrant des alternatives aux composants en aluminium usinés. Les pinces métalliques sur l'adaptateur d'objectif sont fixées à la plaque d'adaptation. Échelle = 30 mm. (I) Vaisseau imprimé et lavé dans une chambre Rose en aluminium montée sur un objectif de microscope, avec aiguilles et tubulures d'entrée et de sortie raccordées. Échelle = 20 mm. Abréviations : CT = tomodensitométrie ; ECM = matrice extracellulaire ; PLA = acide polylactique. Veuillez cliquer ici pour visualiser une version agrandie de cette figure.

Figure 3 : Système de circulation de fluide pour un vaisseau cellulaire dans une chambre de Rose. (A) Schéma de la configuration des tuyaux utilisée pour établir un écoulement de fluide à travers une chambre de Rose contenant un vaisseau cellulaire. Les flèches indiquent le sens de l'écoulement. Les composants numérotés sont : (1) pompe péristaltique, (2) robinet à trois voies avec seringue de remplissage, (3) piège à bulles, (4) amortisseur de pulsations, (5) dispositif de vaisseau et (6) réservoir de milieu. Tous les composants en contact avec le milieu de culture sont stérilisés avant utilisation. (B) Système de circulation de fluide contenant un vaisseau cellulaire dans une chambre de Rose placée à l'intérieur d'un incubateur de culture tissulaire. Les numéros correspondent aux composants illustrés dans le panneau A. Les aiguilles d'entrée et de sortie sont fixées avec du ruban adhésif pour assurer la stabilité. Barre d'échelle = 40 mm. Veuillez cliquer ici pour visualiser une version agrandie de cette figure.

Figure 4 : Caractérisation rhéologique de l’encre biologique sacrificielle. (A) Viscosité de cisaillement de l’encre de Pluronic F127 à 25 % / polyoxyéthylène (PEO) à 1 % non pasteurisée en fonction du taux de cisaillement à 5 °C, 10 °C, 14,4 °C, 15 °C et 23 °C. (B) Viscosité complexe en fonction de la fréquence angulaire pour l’encre de Pluronic F127/PEO non pasteurisée et pasteurisée à 25 °C et 37 °C. Abréviation : PEO = polyoxyéthylène. Veuillez cliquer ici pour visualiser une version agrandie de cette figure.

Figure 5: Imagerie et analyse quantitative de vaisseaux endothélialisés fixes et colorés. (A) Projection d'intensité maximale d'images de fluorescence au microscope confocal à disque rotatif d'un vaisseau entièrement cellularisé après ensemencement initial et culture sous faible contrainte de cisaillement (1 dyn/cm)²). Le vaisseau a été marqué pour la VE-cadhérine (vert), l'actine F (rouge) et l'ADN avec le DAPI (bleu). Échelle = 50 µm. (B) Coupe transversale reconstruite xz d'une pile z d'images de fluorescence confocales à disque rotatif d'un vaisseau entièrement cellularisé, marqué avec de la phalloidine fluorescente pour révéler l'actine F (rouge). Échelle = 50 µm. (CProjection d'intensité maximale d'une pile z d'images de fluorescence confocales à disque rotatif d'un vaisseau entièrement cellularisé après 24 h d'écoulement à 12 dyn/cm²²L'actine F a été marquée avec de la phalloidine fluorescente (rouge). Échelle = 100 µm. (DImage en fluorescence confocale à disque rotatif d'une région vasculaire après 24 h de culture sous un stress de cisaillement de 16 dyn/cm²Le vaisseau a été marqué pour la VE-cadhérine (jaune), l'actine F (magenta), le marqueur du golgi GM130 (vert) et l'ADN avec le DAPI (bleu). La flèche indique le sens du flux. Échelle = 30 µm. (E) Quantification représentative de l'orientation moyenne des fibres de stress à partir du canal F-actine du panneau D, à l'aide de FibrilTool74. Une grille de 45 régions, chacune ayant une aire de 1,600 µm², a été analysée, et les orientations moyennes des fibres sont représentées sous forme d'un histogramme radial par rapport à la direction de l'écoulement. (F) Quantification représentative de l'axe noyau-appareil de Golgi issue du panneau D, utilisée comme mesure de la polarisation des cellules endothéliales. Les vecteurs reliant le centre de chaque noyau au centre de l'appareil de Golgi correspondant sont représentés sous forme d'histogramme radial par rapport à la direction du flux ; n = 75 vecteurs. Abréviation : DAPI = 4′,6-diamidino-2-phénylindole Veuillez cliquer ici pour visualiser une version agrandie de cette figure.

Figure 6 : Analyse de l'écoulement de fluide et de la fuite vasculaire. (A) Schéma de la géométrie du vaisseau utilisé pour les analyses des panneaux B à K. Les lettres indiquent les régions approximatives du vaisseau correspondant aux panneaux respectifs. (B) Projection temporelle codée en couleurs d'une séquence d'images en fluorescence en microscopie confocale à disque tournant en enregistrement temporel, montrant des billes fluorescentes se déplaçant sous écoulement dans une région courbe du vaisseau. La couleur indique le numéro de l'image, de 1 à 100 ; les courbures externe et interne sont indiquées. (C) Analyse par vélocimétrie par images de particules (PIV) montrant la vitesse relative de l'écoulement dans la région courbe du vaisseau. Les couleurs représentent la vitesse relative, et les flèches indiquent la direction et l'amplitude de l'écoulement. Échelle = 50 µm. (D–G) Essai représentatif de barrière vasculaire sur un vaisseau non traité perfusé avec du dextran marqué par Alexa 647 de 10 kDa. (D,D′,D″) Images d'une région droite du vaisseau acquises respectivement à 0, 70 et 150 min. La ligne blanche indique la région utilisée pour le kymographe du panneau E. (E) Kymographe de la région droite du panneau D montrant un taux de fuite de 0,39 µm/min, correspondant à la pente de la ligne pointillée. (F,F′,F″) Images de la région courbe du vaisseau acquises à 0, 70 et 150 min. La ligne blanche indique la région utilisée pour le kymographe du panneau G. Échelle = 150 µm. (G) Kymographe de la région courbe du panneau F montrant un taux de fuite de 1,01 µm/min, correspondant à la pente de la ligne pointillée. (H–K) Essai représentatif de barrière vasculaire après préincubation avec 250 ng/mL de facteur de nécrose tumorale alpha (TNFα). (H,H′,H″) Images d'une région droite du vaisseau acquises respectivement à 0, 200 et 400 min. La ligne blanche indique la région utilisée pour le kymographe du panneau I. Échelle = 250 µm. (I) Analyse par kymographe de la région droite du vaisseau du panneau H montrant un taux de fuite de 2,1 µm/min, correspondant à la pente de la ligne pointillée. (J,J′,J″) Images de la région courbe du vaisseau acquises à 0, 200 et 400 min. La ligne blanche indique la région utilisée pour le kymographe du panneau K. Échelle = 250 µm. (K) Analyse par kymographe de la région courbe du vaisseau du panneau J montrant un taux de fuite de 6,7 µm/min, correspondant à la pente de la ligne pointillée. Les astérisques dans les panneaux D à K identifient les extrémités correspondantes des lignes utilisées pour générer les kymographes. Abréviations : PIV = vélocimétrie par images de particules ; TNFα = facteur de nécrose tumorale alpha. Veuillez cliquer ici pour consulter une version agrandie de cette figure.

Figure supplémentaire 1 : Impression de vaisseau à l'aide d'une programmation d'imprimante basée sur STL. (A) Image en contraste interférentiel différentiel d'un vaisseau imprimé généré à l'aide d'une programmation d'imprimante basée sur STL, qui dirige la tête d'impression vers deux passages, produisant une structure de vaisseau tressé. Échelle = 250 µm. (B) Reconstruction 3D du vaisseau tressé lavé et rempli d'albumine sérique bovine (BSA) marquée avec Alexa 647. Un espace est visible entre les lumières des deux brins tressés. Échelle = 100 µm. Abréviations : BSA = albumine sérique bovine ; STL = langage de tessellation standard. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.

Fichier supplémentaire 1 : G-code pour l'impression du vaisseau. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.

Fichier supplémentaire 2 : Dessin CAO de la chambre Rose. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.

Fichier supplémentaire 3 : Dessin CAO de l'adaptateur de fixation sur la platine. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.

Discussion

Un système robuste est décrit pour modéliser des géométries vasculaires associées à un écoulement perturbé, notamment des vaisseaux tortueux, des anévrismes et des points de branchement. La méthode permet une imagerie haute résolution, la cartographie des écoulements et l'évaluation de la fonction de barrière vasculaire, le tout dans une plateforme accessible aux biologistes cellulaires ayant une expérience limitée en bio-ingénierie. Bien que l'approche principale nécessite une imprimante biologique, des imprimantes commerciales basées sur l'extrusion sont disponibles, allant des systèmes open source à des plates-formes plus avancées dotées de plusieurs têtes d'impression. Les fonctionnalités clés de l'imprimante comprennent le contrôle de la température de la tête d'impression et de l'encre, une régulation précise de la pression et la température du plateau d'impression. En plus des vaisseaux tortueux et ramifiés imprimés en biologie, la méthode inclut également un modèle d'anévrisme pouvant être généré sans imprimante biologique. Ensemble, ces approches facilitent l'étude de la fonction des cellules endothéliales dans des vaisseaux tortueux à l'aide de méthodes de microscopie couramment disponibles dans les laboratoires de biologie cellulaire.

De nombreux systèmes de modèles in vitro sont disponibles pour l'étude de la fonction vasculaire^87,88, chacun présentant des avantages et des limites spécifiques. Le système décrit ici, adapté de travaux antérieurs^54,67,69, est particulièrement adapté à l'analyse des effets de la tortuosité vasculaire sur la fonction endothéliale, car il permet une modélisation directe des géométries de vaisseaux dérivés de patients et une variation systématique de la courbure vasculaire au sein d'un même dispositif. D'autres approches ont modélisé des vaisseaux coronariens de patients à l'aide de méthacrylate de gélatine photopolymérisable afin de générer des structures de vaisseaux réduites sous écoulement physiologique⁶⁰. Ces systèmes offrent une modélisation précise des vaisseaux, une analyse de l'écoulement et la possibilité d'intégrer des couches de la tunica media. Toutefois, leurs dimensions globales et leurs supports en verre peuvent limiter l'imagerie à haute résolution et les tests de fuite localisés. En revanche, des systèmes plus petits fondés sur l'auto-assemblage de cellules endothéliales dérivées de cellules souches pluripotentes induites permettent une imagerie à haute résolution et peuvent intégrer à la fois des cellules endothéliales et des cellules musculaires lisses vasculaires⁸⁹. Ces modèles offrent toutefois un contrôle moindre sur la géométrie des vaisseaux, et l'établissement de débits élevés ainsi que de fortes contraintes de cisaillement peut s'avérer difficile. Le système actuel représente donc une approche intermédiaire pratique, combinant une géométrie de vaisseau définie avec une imagerie à haute résolution de la tortuosité vasculaire.

Un avantage majeur de cette plateforme est la possibilité de générer des vaisseaux comprenant à la fois des régions courbes et des régions droites, permettant une comparaison directe de la géométrie locale des vaisseaux au sein du même échantillon, toutes autres variables expérimentales restant constantes, comme illustré dans la Figure 6. Un autre avantage réside dans la possibilité d'utiliser des images de vaisseaux provenant de patients, obtenues par angiographie ou tomodensitométrie avec produit de contraste. La limitation principale pour la reproduction de vaisseaux patients est la taille. Les vaisseaux de diamètre inférieur à 150 µm sont difficiles à imprimer de manière reproductible, tandis que les segments vasculaires s'étendant sur plusieurs centimètres nécessitent des chambres de montage plus grandes. Les segments vasculaires doivent également rester relativement plats dans la troisième dimension afin de pouvoir être imprimés sur la couche matricielle de base et rester dans la distance de travail de l'objectif pendant l'imagerie microscopique.

Dans des travaux futurs, le système décrit ici pourrait être davantage modifié pour modéliser des maladies telles que l'athérosclérose, dans laquelle la géométrie des vaisseaux peut contribuer à la physiopathologie. Des cellules endothéliales génétiquement modifiées ou d'autres types cellulaires supplémentaires, notamment des cellules musculaires lisses et des cellules immunitaires, pourraient être intégrés afin d'augmenter la complexité physiologique. L'incorporation de cellules musculaires lisses sous la couche endothéliale, comme cela a été démontré dans des systèmes plus simples, pourrait fournir des informations supplémentaires sur les interactions entre les cellules musculaires lisses et les cellules endothéliales dans la tortuosité vasculaire et les maladies⁹⁰. D'autres modifications pourraient inclure des cellules tumorales afin d'étudier l'intravasation^68,91 et l'influence de la tortuosité sur ce processus. La plateforme pourrait également servir à examiner comment un écoulement perturbé modifie les réponses inflammatoires^92,93 et contribue potentiellement aux complications vasculaires associées à des infections telles que la COVID-19⁹⁴. Étant donné l'implication étendue du système vasculaire dans la santé humaine et les maladies, des systèmes accessibles comme celui-ci pourraient faciliter des recherches supplémentaires sur la fonction endothéliale dans divers contextes pathologiques.

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
(3-Aminopropyl)triméthoxysilane (APTMS), 97 %	Sigma-Aldrich	281778	Utilisé pour la silanisation et l'activation des lamelles de verre avant l'attachement de la MEC.
Seringue stérile de 1 mL	Fisher Scientific	14-823-434	Utilisée pour la délivrance de réactifs, le revêtement de récipients et la manipulation de fluides.
Solution tampon phosphate salin (PBS) 1x	Thermo Fisher Scientific	J61196.AP	Utilisée pour la préparation des réactifs, les lavages et le rinçage des récipients.
Seringue stérile de 10 mL	Fisher Scientific	14-955-459	Utilisée pour la préparation des réactifs et le transfert de fluides.
Tubes coniques de 15 mL avec bouchon	Fisher Scientific	05-538-59A	Utilisés pour la préparation des réactifs, la manipulation des cellules et le stockage des solutions.
Boîte de Pétri en polystyrène de 150 mm	Fisher Scientific	FB0875714	Utilisée comme contenant stérile pour le travail ou l'incubation.
Aiguille 21G	Fisher Scientific	14-817-227	Utilisée pour la préparation du modèle de récipient et l'accès à la chambre.
Aiguille 23G	Fisher Scientific	14-817-237	Utilisée pour les connexions d'entrée et de sortie du récipient lors du rinçage et de la perfusion.
Aiguille de distribution effilée transparente 27G	Nordson	7018417	Utilisée pour l'extrusion de l'encre sacrificielle et la visualisation des bulles d'air pendant l'impression.
Seringue stérile de 3 mL	Fisher Scientific	14-955-459	Utilisée pour le transfert de fluides et la délivrance de réactifs. Vérifier le numéro de catalogue car le numéro fourni est également indiqué pour la seringue de 10 mL.
Fil médical en acier inoxydable 304, diamètre 0,0190 pouce	Component Supply	GWX-0190-36	Utilisé comme modèle amovible pour la lumière droite dans le modèle d'anévrisme basé sur fil.
Tubes coniques de 50 mL avec bouchon	Fisher Scientific	05-526B	Utilisés pour la préparation, le mélange, la pasteurisation et le stockage des réactifs.
Anticorps secondaire anti-souris Alexa 488	Thermo Fisher Scientific	A32723TR	Anticorps secondaire fluorescent utilisé pour l'immunomarquage.
Anticorps secondaire anti-lapin Alexa 555	Thermo Fisher Scientific	A-21428	Anticorps secondaire fluorescent utilisé pour l'immunomarquage.
Albumine de sérum bovin marquée Alexa 647	Thermo Fisher Scientific	A34785	Traceur macromoléculaire fluorescent utilisé pour les essais de barrière vasculaire ou de fuite.
Dextrane marqué Alexa 647, 10 kDa	Thermo Fisher Scientific	D22914	Traceur fluorescent utilisé pour évaluer la fonction de la barrière endothéliale et la fuite vasculaire.
Phalloïdine Alexa 647	Thermo Fisher Scientific	A22287	Utilisée pour marquer de façon fluorescente l'actine F dans l'imagerie du cytosquelette et l'analyse d'orientation.
Albumine, sérum bovin, Fraction V, sans acide gras	Sigma-Aldrich	126575-10GM	Utilisée pour le blocage et la préparation de solutions contenant des protéines.
Antibiotique-Antimycotique, 100x	Thermo Fisher Scientific	15240062	Supplément antimicrobien facultatif pour la MEC et le milieu de culture.
Anticorps anti-GM130, clone 4A3	Sigma-Aldrich	MABT1363	Anticorps primaire utilisé pour marquer l'appareil de Golgi dans l'analyse de la polarité endothéliale.
Anticorps monoclonal anti-VE-cadhérine, lapin, D87F2	Abcam	65707	Anticorps primaire utilisé pour visualiser les jonctions intercellulaires endothéliales.
Chlorure de calcium	Sigma-Aldrich	C7902	Utilisé dans la préparation de la MEC et les tampons de fixation. Vérifier si le réactif prévu est du chlorure de calcium anhydre ou hydraté.
Kits de connecteurs	World Precision Instruments	504954	Connecteurs Luer-à-tuyau utilisés pour assembler le circuit de perfusion microfluidique.
Support de coloration pour lamelles	Electron Microscopy Sciences	72240	Utilisé pour maintenir les lamelles pendant le nettoyage, la silanisation, l'activation et les lavages.
D-(+)-Glucose	Sigma-Aldrich	G7021-100G	Constituant du tampon de perméabilisation utilisé lors de l'immunomarquage.
DAPI	Thermo Fisher Scientific	62248	Colorant nucléaire fluorescent utilisé pour l'imagerie cellulaire et l'analyse de polarité.
Plaque chauffante numérique	Fisher Scientific	11-475-028	Utilisée pour maintenir la chambre du vaisseau et les réactifs à environ 37 °C pendant l'assemblage.
Sel tétrasodique d'EGTA	Sigma-Aldrich	E8145-10G	Agent chélatant utilisé dans le tampon de perméabilisation.
Connecteur Luer femelle à emboîtement pour tuyau de 1/16 po de diamètre interne	Scientific Commodities Inc.	BB330A	Utilisé pour connecter les tuyaux au sein du circuit microfluidique.
Luer femelle avec emboîtement de 1/16 po de diamètre interne, CrystalVu QC	Fisher Scientific	01-000-123	Utilisé pour les connexions de tuyaux et de chambres de vaisseaux.
Fibrinogène	Sigma-Aldrich	F8630	Composant de la MEC utilisé avec la gélatine et la thrombine pour former l'hydrogel de soutien du vaisseau. Vérifier la source : le manuscrit décrit du fibrinogène de plasma humain, alors que le tableau fourni indique du plasma bovin.
Amortisseur de pulsation de fluide	Darwin Microfluidics	SE-D1606-3NB-PC-31	Utilisé pour réduire les fluctuations pulsatoires générées par la pompe péristaltique.
Bandes de caoutchouc de silicone pour industrie alimentaire, résistantes aux hautes températures	McMaster-Carr	8417K51	Utilisées pour fabriquer le joint de la chambre Rose.
Gélatine provenant de peau de porc, force de gel 300, Type A	Sigma-Aldrich	G2500	Composant majeur de la MEC utilisé pour former l'hydrogel entourant la lumière du vaisseau.
Lamelle de verre, No. 1,5	VWR	EN-MAS-25X25-1-5-CS	Substrat pour microscopie haute résolution et surface de chambre.
Glutaraldéhyde, 25 %	Electron Microscopy Sciences	16220	Dilué pour l'activation des lamelles avant l'attachement de la MEC.
Kits de croissance-BBE	ATCC	PCS-100-040	Kits de suppléments utilisés avec le milieu basal pour cellules vasculaires pour la culture de cellules endothéliales.
Kits de croissance-VEGF	ATCC	PCS-100-041	Supplément de croissance endothéliale utilisé avec le milieu basal pour cellules vasculaires lorsque requis.
Fibronectine de plasma humain	Sigma-Aldrich	FC010	Revêtement facultatif de la MEC luminal utilisé pour favoriser l'attachement endothélial.
Pince à tube en ligne	Sigma-Aldrich	Z503371-1PAK	Utilisée pour arrêter et réguler le flux à travers le tube pendant la manipulation et l'incubation de la chambre.
Pompe péristaltique numérique Ismatec Reglo	Masterflex	78018-12	Utilisée pour générer un flux de fluide contrôlé à travers les vaisseaux cellulaires.
Lamine	Sigma-Aldrich	L2020-1MG	Revêtement facultatif de la MEC luminal pour modifier l'adhésion et la polarisation endothéliale.
Kits variés de coupleurs Luer-à-tuyau	World Precision Instruments	504954	Utilisés pour connecter les tuyaux, les seringues et les composants d'entrée/sortie de la chambre. Doublon du numéro de catalogue du kit de connecteurs ; conserver une seule entrée si identique.
Chlorure de magnésium hexahydraté	Sigma-Aldrich	M2393-100G	Constituant des tampons de fixation et de perméabilisation.
Connecteur Luer mâle à emboîtement pour tuyau de 1/16 po de diamètre interne	Scientific Commodities Inc.	BB329A	Utilisé pour les connexions de tuyaux microfluidiques.
Raccord mâle Luer, 1/16 po de diamètre interne	World Precision Instruments	13160-100	Utilisé pour connecter les tuyaux aux seringues et aux composants de la chambre.
Matrigel	Sigma-Aldrich	CLS356234-1EA	Revêtement facultatif de la MEC luminal utilisé pour l'attachement endothélial.
Bouchons de flacon de milieu	Fisher Scientific	05-719-310	Bouchons à deux orifices utilisés pour construire des réservoirs stériles de milieu de culture pour le circuit de flux.
Tuyau en silicone Nalgene Pharma-Grade, 1/16 po de diamètre interne	Thermo Fisher Scientific	8600-0020	Tuyau souple utilisé dans les circuits de perfusion et de rinçage microfluidiques.
Parafilm	Electron Microscopy Sciences	70990-125	Utilisé comme surface non adhérente pendant la polymérisation des revêtements de MEC sur les lamelles.
PBS, 10x, pH 7,4	Thermo Fisher Scientific	70011044	Solution tampon concentrée utilisée pour préparer les solutions de PBS utilisables.
Pénicilline/Streptomycine	Thermo Fisher Scientific	15140122	Supplément antibiotique utilisé dans le milieu de culture endothélial et les solutions de rinçage.
PIPES	Sigma-Aldrich	P1851-25G	Composant tampon de la solution de perméabilisation.
Pluronic F-127	Sigma-Aldrich	P2443	Composant thermoréactif de l'encre sacrificielle.
Robinet trois voies en polycarbonate avec Luer mâle	Fisher Scientific	NC9593742	Utilisé pour amorcer, commuter et contrôler les trajets de fluide dans le circuit de perfusion.
Polyéthylène oxyde (PEO)	Sigma-Aldrich	372781	Composant polymère de la formulation d'encre sacrificielle.
Agitateur rotatif	Fisher Scientific	88861050	Utilisé pour mélanger l'encre sacrificielle PEO/Pluronic à 4 °C.
Bac de coloration pour unité de lame	MSE Supplies	DWK90020	Utilisé pour le lavage, la coloration ou l'incubation des réactifs sur les lamelles.
Lamelle carrée, No. 2, 25 mm x 25 mm	Sigma-Aldrich	CLS285525-1000EA	Lamelle de chambre ; le verre plus épais No. 2 offre une résistance accrue à la rupture et est compatible avec des objectifs à air ou à eau adaptés.
Aiguille de distribution émoussée en acier inoxydable, 21 G, 1 pouce	Component Supply	NE-212PL	Utilisée pour la délivrance de fluides ou la construction du modèle de vaisseau à base de fil.
Unités de filtration sous vide Steriflip	MilliporeSigma	SE1M179M6	Utilisées pour filtrer stérilement la gélatine chaude et d'autres solutions compatibles.
Seringues stériles en plastique de 5 mL	Allevi	PSYR5-S	Utilisées pour charger l'encre sacrificielle destinée à l'impression par extrusion pneumatique.
Thrombine, plasma humain, haute activité	Sigma-Aldrich	605195	Utilisée pour initier la polymérisation du fibrine lors de la formation du gel de MEC.
Transglutaminase	Moo Gloo	1201	Enzyme de réticulation utilisée lors de la préparation et de la modification de la MEC en gélatine/fibrine.
Triton X-100	Sigma-Aldrich	648466	Détergent utilisé pour la perméabilisation des cellules endothéliales avant l'immunomarquage.
Enzyme TrypLE Express, 1x, rouge de phénol	Thermo Fisher Scientific	12605010	Réactif de dissociation cellulaire utilisé pour récolter les cellules endothéliales avant l'ensemencement des vaisseaux.
Tween 20	Sigma-Aldrich	11332465001	Composant détergent du tampon de blocage pour l'immunomarquage.
Milieu basal pour cellules vasculaires	ATCC	PCS-100-030	Milieu basal utilisé pour la culture de cellules endothéliales et les expériences de perfusion.