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Activation mécanique des macrophages induite par le péristaltisme

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DOI :

10.3791/72607

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18 août 2026

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1Department of Biomedical Engineering, Texas A&M University

Dans cet article

Résumé

Ce protocole décrit la mise en place et le fonctionnement d'un bioréacteur breveté destiné à des études de mécano-immunomodulation. Ici, à l'aide d'un bioréacteur sur mesure reproduisant des forces physiologiques, nous démontrons que les macrophages développent une réponse nettement pro-inflammatoire à une stimulation mécanique.

Résumé

L'inflammation est un processus complexe à l'origine de maladies aiguës et chroniques. Elle est régulée par une cascade de signaux biochimiques et biophysiques qui entraînent l'activation des cellules immunitaires. Les macrophages constituent un type principal de cellules immunitaires impliquées dans de nombreuses affections inflammatoires, notamment le cancer, la fibrose et les maladies auto-immunes. Les méthodes traditionnelles d'étude de l'activation des macrophages reposent sur une stimulation biochimique par des cytokines ou chimioattractants définis, induisant une activation des macrophages vers des états pro- ou anti-inflammatoires. Des données récentes suggèrent que les signaux biophysiques jouent également un rôle dans l'activation des macrophages, en complément des signaux biochimiques présents dans les tissus. L'un de ces signaux mécaniques fréquents est la péristaltisme, qui associe des contraintes mécaniques multiaxiales et des contraintes de cisaillement, et qui se produit dans le tractus gastro-intestinal, l'utérus, les voies respiratoires en développement et les uretères. Ici, nous avons testé l'hypothèse selon laquelle le péristaltisme pourrait activer les macrophages. Dans ce protocole, l'utilisation d'un bioréacteur péristaltique est décrite afin d'étudier l'activation mécanique des macrophages. Des membranes de polydiméthylsiloxane ont été recouvertes de fibronectine afin de favoriser l'adhésion des macrophages. Des macrophages dérivés de moelle osseuse murine immortalisés (iBMDM) ont été ensemencés sur des membranes revêtues de fibronectine et maintenus en conditions statiques (témoins) ou exposés au péristaltisme pendant 4 heures. Le péristaltisme a activé les macrophages, avec des différences significatives dans l'expression génique de Il6 (50,9 fois supérieur aux témoins statiques ; p < 0.0001, test-t) et Nos2 (19,8 fois supérieur aux témoins statiques ; p = 0,0046). Curieusement, aucune modification significative n'a été observée dans Chil3 (1,22 fois supérieur aux témoins statiques ; p = 0,9726) ou Mrc1 (1,16 fois supérieur aux témoins statiques ; p = 0.9810) par rapport aux témoins statiques, indiquant que les stimuli mécaniques sont principalement responsables de l'activation pro-inflammatoire. Les résultats obtenus soutiennent le concept de mécano-immunomodulation des macrophages, en particulier en réponse aux mécaniques de la péristaltisme, largement présentes dans de nombreux tissus basés sur le muscle lisse.

Introduction

Les macrophages sont des cellules immunitaires innées qui jouent des rôles essentiels dans la défense de l'hôte, le remodelage tissulaire et la régulation de l'inflammation par la phagocytose et la sécrétion de cytokines1,2,3,4. Selon les stimuli présents dans le microenvironnement in vivo, les macrophages non différenciés (M0) peuvent polariser de manière plastique vers des phénotypes pro-inflammatoires (M1) ou anti-inflammatoires/pro-régénératifs (M2)5,6. Les modèles in vitro sont généralement utilisés pour isoler ces différents stimuli afin de mieux comprendre les mécanismes complexes régissant la polarisation des macrophages. Les macrophages M1 classiquement activés sont généralement induits in vitro par des stimuli biochimiques tels que le lipopolysaccharide (LPS) et l'interféron gamma (IFN-γ), ce qui entraîne une augmentation de l'expression de médiateurs inflammatoires, notamment la synthase de l'oxyde nitrique inducible (iNOS), l'interleukine-6 (IL6) et le facteur de nécrose tumorale alpha (TNF-α)7,8. Les macrophages M2 activés de manière alternative sont couramment induits par exposition à l'interleukine-4 (IL-4) et à l'interleukine-13 (IL-13), favorisant ainsi des réponses de remodelage tissulaire et de cicatrisation8,9. Les macrophages M2 sont davantage subdivisés en phénotypes M2a, M2b et M2c selon leurs voies d'activation distinctes et leurs profils d'expression de marqueurs membranaires10,11. Bien que la régulation biochimique de la polarisation des macrophages ait été largement caractérisée dans les systèmes in vivo et in vitro, les macrophages résident dans des microenvironnements hautement dynamiques contenant également des stimuli biophysiques importants12. En plus des cytokines et chimioattractants solubles, les macrophages sont exposés à la matrice extracellulaire et aux interactions cellule-cellule, à la rigidité du substrat, aux contraintes de cisaillement du fluide, à la pression hydrostatique et à la déformation tissulaire cyclique12,13,14. En tant que cellules mécanosensibles, les macrophages peuvent modifier leurs phénotypes inflammatoires en réponse à ces signaux physiques, soulignant ainsi l'importance de la mécanobiologie dans la régulation immunitaire.

Un nombre croissant de publications a démontré que des stimuli mécaniques isolés in vitro peuvent influencer de manière significative les états d'activation des macrophages (Figure 1). L'exposition à des substrats plus rigides augmente la polarisation M1 et la production de cytokines inflammatoires par rapport à des substrats plus mous, qui induisent un phénotype pro-régénérateur15,16,17,18,19,20. De même, le cisaillement fluide module le phénotype des macrophages de manière dépendante de l'intensité, des niveaux faibles d'écoulement du fluide interstitiel favorisant souvent une activation pro-régénérateur21,22, tandis que des contraintes de cisaillement plus élevées, comparables à celles observées dans les artères, peuvent induire des réponses pro-inflammatoires23,24,25,26,27,28. Des modèles in vitro de traction cyclique conçus pour imiter la mécanique des tissus musculosquelettiques, myocardiques, pulmonaires et intestinaux ont également montré une augmentation de l'expression de médiateurs inflammatoires, bien que les résultats varient selon l'intensité, la durée, la fréquence et la dimensionnalité de la force appliquée29,30,31,32. En outre, la mécanosensibilité des macrophages varie selon les espèces et les sources cellulaires, soulignant l'importance du choix de modèles expérimentaux appropriés pour les études de mécanobiologie13,14.

Schéma de l'activation des macrophages ; stimuli biochimiques et biophysiques ; modifications phénotypiques ; facteurs de stress.
Figure 1 : Schéma illustrant les stimuli biochimiques et biophysiques in vitro induisant l'activation des macrophages vers des états pro-inflammatoires ou pro-régénératifs. Les macrophages peuvent être stimulés in vitro vers un état pro-inflammatoire par l'ajout de stimuli chimiques, tels que le lipopolysaccharide (LPS) et l'interféron γ (IFN-γ), ou par exposition à des stimuli mécaniques, notamment le cisaillement, une rigidité accrue, des étirements uniaxiaux cycliques et statiques induisant une déformation, la compression, et la déformation induite par compression multiaxiale. Les macrophages peuvent être induits vers un état pro-régénératif par l'ajout in vitro de stimuli chimiques, notamment l'interleukine-13 (IL-13) et l'IL-4. Ils peuvent également adopter un phénotype pro-régénératif lorsqu'ils sont exposés à des stimuli mécaniques tels qu'un cisaillement oscillant, un écoulement interstitiel, des substrats mous ou de faibles niveaux de déformation cyclique uniaxiale. Veuillez cliquer ici pour visualiser une version agrandie de cette figure.

Outre l'étude des stimuli mécaniques isolés de manière indépendante, il est important de s'appuyer sur ces travaux afin d'examiner l'impact combiné de forces physiques, étant donné que les macrophages in vivo sont généralement exposés à des combinaisons de forces simultanées. La péristaltisme représente un tel environnement mécanique complexe, constitué d'une déformation cyclique multiaxiale et d'une contrainte de cisaillement fluide simultanées, générées par la contraction du muscle lisse33. Ces mécanismes sont présents dans plusieurs systèmes organiques, notamment le tube digestif, les voies respiratoires en développement, le système vasculaire, l'utérus et les uretères34,35,36. De façon importante, la fonction péristaltique est fréquemment altérée dans les maladies inflammatoires, telles que la fibrose, les maladies inflammatoires de l'intestin, le cancer et les troubles de remodelage des voies respiratoires, toutes impliquant une inflammation importante médiée par les macrophages33,37,38,39. Malgré le rôle reconnu des macrophages dans ces pathologies, une lacune critique persiste quant à la compréhension de la manière dont les forces mécaniques péristaltiques influencent directement l'activation des macrophages.

Ce protocole décrit l'utilisation d'un système de bioréacteur à péristaltisme pour étudier la mécano-immunomodulation des macrophages dans des conditions mécaniques proches de la physiologie. Contrairement aux systèmes classiques de culture statique ou aux plates-formes de stimulation mécanique par force unique, cette méthode permet l'application simultanée d'une contrainte cyclique multiaxiale et d'une contrainte de cisaillement fluide, reproduisant ainsi plus fidèlement le microenvironnement mécanique in vivo des tissus à base de muscle lisse. Dans ce protocole, des macrophages dérivés de moelle osseuse murine immortalisés (iBMDM) cultivés dans des bioréacteurs en conditions péristaltiques ont montré une augmentation des marqueurs d'activation M1, sans tendance vers l'activation M2. Ces résultats démontrent que les sollicitations mécaniques péristaltiques suffisent à moduler le comportement inflammatoire des macrophages et appuient la notion plus large de mécano-immunomodulation dans les tissus exposés à des forces dynamiques générées par le muscle lisse. Cette méthode est particulièrement adaptée aux chercheurs étudiant la mécanobiologie, l'inflammation, le génie tissulaire, la physiologie gastro-intestinale, le développement pulmonaire, la fibrose, et d'autres maladies dans lesquelles les macrophages sont soumis à des microenvironnements mécaniques complexes. Grâce à un montage soigneux, une calibration régulière et une surveillance continue, les utilisateurs peuvent garantir des performances reproductibles du bioréacteur et éviter les limitations courantes de cette technique.

Protocole

Le protocole décrit l'assemblage et le fonctionnement d'un système de bioréacteur breveté40 pour des études de mécano-immunomodulation. Les réactifs et l'équipement utilisés sont listés dans le Tableau des matériaux.

1. Culture cellulaire

  1. Entretenir les macrophages dérivés de moelle osseuse murine immortalisés (iBMDMs) dans du RPMI 1640 complet supplémenté avec 10 % de FBS inactivé par la chaleur, 1 % de tampon HEPES, 1 % de pyruvate de sodium et 1 % de pénicilline-streptomycine, à 37 °C avec 5 % de CO2.

2. Fabrication du polydiméthylsiloxane (PDMS)

  1. Prélevez et mélangez la base et l'agent de réticulation du kit d'élastomère de silicone selon un rapport de 10:1 (p/p).
  2. Agitez le mélange pendant 5 min afin d'assurer un homogénéisation uniforme.
  3. Verser délicatement le PDMS mélangé dans une boîte de Pétri carrée de 100 mm x 15 mm jusqu'à ce que le PDMS atteigne une hauteur de 3 mm.
  4. Placez les boîtes de Pétri contenant le PDMS dans un dessiccateur.
  5. Dégazez sous vide pendant 1 h pour éliminer les bulles d'air.
  6. Retirez le PDMS du dessiccateur et vérifiez qu'aucune bulle d'air n'est présente.
  7. Transférez les membranes de PDMS non réticulées dans une étuve préchauffée à 60 ˚C, et laissez-les réticuler pendant 4 h.
  8. Retirez les membranes de PDMS de l'étuve et laissez-les refroidir à température ambiante pendant toute la nuit.
  9. Après 18 à 24 h, détachez soigneusement les membranes de PDMS réticulées des boîtes de Pétri et découpez-les pour obtenir des membranes de PDMS de 70 mm x 40 mm x 3 mm.

3. Stérilisation de la membrane en PDMS

  1. À l’intérieur d’une hotte de sécurité biologique, rincer les membranes en PDMS avec de l’éthanol à 70 % et les placer directement sur la surface de la hotte (BSC) (Supplémentaire Figure 1).
  2. Stériliser sous rayonnement UV pendant 10 min, puis transférer la membrane en PDMS dans une boîte de culture de 90 mm non traitée pour culture tissulaire, en orientant la face exposée au UV vers le haut.
    NOTE : Saisir la membrane en PDMS uniquement par les côtés et ne jamais croiser les mains au-dessus de la membrane afin de réduire le risque de contamination.
  3. Pour les expériences de péristaltisme, utiliser les membranes en PDMS à leurs dimensions d’origine.
  4. Pour les conditions de culture statique, découper chaque membrane en PDMS de 70 mm x 40 mm en deux moitiés égales de 35 mm x 40 mm.

4. Revêtement des membranes PDMS par la fibronectine

  1. À l’intérieur d’une hotte stérile, préparez un volume suffisant d’une solution stérile de fibronectine à 0,5 mg/mL dans du tampon au phosphate salin (PBS) pour ajouter 100 µL par membrane.
  2. Distribuez 100 µL de cette solution d’enrobage au centre de chaque membrane en PDMS, en veillant à ce que la zone recouverte soit parfaitement alignée avec la surface de contact entre la membrane en PDMS et la vis.
    NOTE : Utilisez une pipette pour étaler délicatement la solution en une couche mince et uniforme.
  3. Laissez les membranes en PDMS recouvertes dans la boîte de culture, couvercle retiré, pendant 45 min afin de permettre l’adsorption.
    NOTE : Laissez le vantail de l’hotte ouvert pour maintenir un flux d’air continu.
  4. Au bout de 45 min, aspirez la solution de fibronectine restante sur chaque membrane.
  5. Rincez délicatement les membranes avec 1 mL de PBS stérile.

5. Ensemencement des cellules iBMDM sur la membrane PDMS

  1. Lorsque la confluence atteint 70 à 80 %, faire une trypsine sur les cellules iBMDM cultivées dans un flacon T25 afin de les détacher de la surface.
  2. Déterminer la concentration cellulaire à l’aide d’un hémocytomètre et préparer une densité cellulaire de 100 000 cellules/mL dans le milieu.
  3. Sur chaque membrane PDMS revêtue de fibronectine, semer 1 mL de la suspension cellulaire préparée par membrane.
  4. Pour chaque expérience, semer au moins une membrane statique et une membrane soumise à la péristaltique afin d’assurer une comparaison parallèle entre les conditions.
  5. Placer les membranes PDMS semées dans un incubateur humidifié à 37 °C avec 5 % de CO2 pendant au moins 24 h pour permettre l’attachement cellulaire, tant dans les conditions statiques que péristaltiques (Supplémentaire Figure 1B).

6. Réacteur biologique

  1. Fabriquez le bioréacteur à l'aide des fichiers de conception assistée par ordinateur (CAO) et des spécifications fournis dans le brevet du bioréacteur (US12522795)40 ou obtenez une unité préassemblée auprès des auteurs.

7. Assemblage et étalonnage du circuit Arduino

  1. Construction du circuit
    1. Assembler le circuit de commande sur une maquette électronique à l’aide de potentiomètres, de résistances, de transistors et de fils conducteurs comme indiqué dans la figure supplémentaire 2.
    2. Installer l’environnement de développement Arduino (IDE) sur l’ordinateur et ouvrir un nouveau croquis.
    3. Régler la vitesse du moteur à 5 tours par minute (tr/min) et la pompe péristaltique à 28 mL/min.
    4. Connecter la carte Arduino à l’ordinateur via USB et téléverser le code fourni dans le fichier supplémentaire 1 à l’aide du bouton de téléversement dans l’IDE.
      NOTE : La LED de l’Arduino passe au orange pendant le téléversement, puis revient au vert une fois prête à fonctionner. Une fois le téléversement terminé, l’Arduino exécute automatiquement le programme dès qu’il est sous tension.
  2. Étalonnage du moteur
    1. Démarrer le moteur et compter les rotations pendant 1 minute à l’aide d’un chronomètre.
      NOTE : Ajuster le paramètre de vitesse du moteur dans le code Arduino selon les besoins afin d’atteindre 5 tr/min.
    2. Retéléverser le code après chaque ajustement jusqu’à atteindre la vitesse souhaitée.
  3. Étalonnage de la pompe
    1. Faire fonctionner la pompe pendant 30 secondes et mesurer la masse recueillie afin de vérifier un débit de 28 mL/min (~14 g en 30 s).
    2. Ajuster le potentiomètre et répéter l’opération jusqu’à ce que la masse recueillie en 30 secondes soit régulièrement proche de 14 g.
  4. Une fois le moteur et la pompe étalonnés, les associer à une unité de bioréacteur.
    NOTE : L’ensemble étalonné moteur–pompe–bioréacteur est désormais prêt à être utilisé expérimentalement (Figure 2).

Schéma du bioréacteur pour le montage de culture de macrophages ; imagerie et résultats d'analyse PCR pour l'étude cellulaire.
Figure 2 : Schéma du montage du bioréacteur à péristaltisme et des analyses en aval. Les cellules iBMDM sont ensemencées sur une membrane en PDMS revêtue de fibronectine, placée à l'intérieur du bioréacteur. Après 4 h d'exposition à la péristaltisme ou de maintien en tant que témoins statiques, les cellules sont récoltées pour des analyses en aval, incluant la qPCR, la coloration immunofluorescente et l'imagerie. Veuillez cliquer ici pour visualiser une version agrandie de cette figure.

8. Assemblage et mise en place du bioréacteur à péristaltisme

  1. Préparation des composants
    1. Réunir tous les composants nécessaires, notamment une bouteille de milieu, un bouchon de milieu, un embout imprimé en 3D pour la bouteille de milieu, un couvercle de bioréacteur imprimé en 3D, un fond de bioréacteur imprimé en 3D, un entraînement par vis imprimé en 3D, des attaches de serrage (trois par bioréacteur), une pince multiprise, une pince coupante, des boîtes de culture tissulaire de 150 mm, de la graisse au silicone et un support de moteur imprimé en 3D. Pulvériser chaque élément avec de l'éthanol à 70 % avant de le placer à l'intérieur de l'enceinte de sécurité biologique (ESB).
    2. Placer le moteur à courant continu, la pompe péristaltique et une longueur supplémentaire de tubulure de pompe à l'intérieur de l'enceinte de sécurité biologique.
    3. Fermer le capot du BSC et allumer la lampe UV pendant 10 min pour stériliser tous les composants (Figure supplémentaire 1C).
  2. Vérification de l'attachement cellulaire et de la viabilité
    1. Examiner au microscope les membranes PDMS statiques ensemencées et celles soumises à de la péristaltisme. Confirmer >80 % d'attachement cellulaire sur les surfaces de PDMS revêtues de fibronectine et examen de la morphologie cellulaire pour évaluer la viabilité.
    2. Capturer des images représentatives des cellules avant l'assemblage, selon les besoins.
  3. Préparation des contrôles statiques
    1. Aspirer 1 mL de milieu RPMI complet de chaque membrane statique.
    2. Ajouter 1 mL de milieu RPMI complet frais à chaque membrane.
    3. Étiqueter les boîtes comme étant statiques et les replacer dans l'incubateur.
  4. Assemblage du bioréacteur à péristaltisme
    1. Ajouter 15 mL de milieu dans chaque flacon de milieu désigné pour une utilisation en bioréacteur.
    2. Fixer les bouchons de milieu équipés des embouts imprimés en 3D (contenant des orifices d'entrée et de sortie) sur les bouteilles de milieu. Réserver.Supplémentaire Figure 1D).
    3. Assembler la base du bioréacteur.
      1. Insérez le moteur à vis imprimé en 3D dans le puits central du fond du bioréacteur.
      2. Insérez le moteur à courant continu dans l'emplacement du moteur situé sur le fond du bioréacteur.
      3. Veiller à ce que l'arbre moteur s'insère fermement dans le trou central du système d'entraînement à vis imprimé en 3D.
      4. Faire glisser le support du moteur en place pour stabiliser le moteur.
  5. Placer le bioréacteur partiellement assemblé dans une boîte de culture tissulaire de 150 mm afin de faciliter le transfert du PSC vers l'incubateur une fois l'assemblage terminé (Supplémentaire Figure 1E).
  6. Appliquer une fine couche de graisse silicone sur les rainures du vilebrequin là où la membrane en PDMS entrera en contact avec le vilebrequin. Cela permet une rotation facile de la vis, réduisant ainsi le frottement.
  7. Chargement de la membrane en PDMS ensemencée de cellules
    1. Transférez délicatement les membranes en PDMS ensemencées de cellules et destinées à la péristaltisme de l'incubateur vers le caisson de sécurité biologique.
    2. Aspirez le milieu de chaque membrane et placez la membrane dans le bioréacteur avec la surface ensemencée en cellules orientée vers le haut, opposée à l'interface du système à vis graissée.
    3. Positionnez le couvercle du bioréacteur de manière à ce que l'empreinte de la chambre à cellules s'aligne avec la membrane en PDMS. Faites glisser le couvercle dans les rainures de guidage du fond du bioréacteur.
  8. Fixation du bioréacteur
    1. Fixez le haut et le bas du bioréacteur à l'aide de colliers serrés et de pinces diagonales.
    2. Couper l'excédent de longueur du collier serre-fil avec une pince.
  9. Connexions fluidiques et configuration du système
    1. Aligner la pompe péristaltique de manière que son connecteur métallique soit orienté dans la même direction que le connecteur du moteur.
    2. Reliez le tube de la pompe le plus proche du bioréacteur au port d'entrée le plus près du moteur sur le dessus du bioréacteur. Enfoncez complètement le tube sur la buse d'entrée.
    3. Immergez l'extrémité opposée de ce tube à l'intérieur de la bouteille de milieu.
    4. À l'aide du morceau supplémentaire de tube de pompe, reliez une extrémité à l'embout de sortie du couvercle du bioréacteur, et placez l'autre extrémité à l'intérieur de la bouteille de milieu, au-dessus du niveau du milieu, afin de permettre la recirculation sans écoulement inverse (Supplémentaire Figure 1F).
  10. Incubation et fonctionnement
    1. Placer l'ensemble du réacteur biologique (dans la boîte de 150 mm) à l'intérieur de l'incubateur (Supplémentaire Figure 1G) et maintenir la carte de circuit/Arduino à l'extérieur, branchée à l'alimentation.
    2. Connecter les pinces crocodile
      1. Pompe : positif à positif, négatif à négatif.
      2. Moteur : inverser la polarité selon la conception du circuit.
    3. Placer des boîtes de Petri stériles vides dans l'incubateur pour la collecte ultérieure des échantillons.
    4. Laisser fonctionner le système de bioréacteur à péristaltisme pendant 4 h (ou la durée souhaitée)Supplémentaire Figure 1H) dans des conditions de culture standard dans l'incubateur.

9. Démontage du bioréacteur

  1. Ouvrez l'incubateur et soulevez le tube d'entrée depuis la bouteille de milieu pour permettre à l'air d'entrer dans le système et évacuer complètement le milieu résiduel du bioréacteur.
  2. Une fois l'écoulement du milieu arrêté, débranchez les câbles du moteur et/ou de la pompe de la carte électronique afin d'interrompre le mouvement mécanique.
  3. Déplacez l'ensemble du bioréacteur dans l'enceinte stérile, retirez les tubes, coupez les attaches rapides et retirez le couvercle du bioréacteur.
  4. Aspirez le milieu résiduel provenant de la membrane en PDMS et transférez la membrane dans la même boîte de Pétri utilisée lors de la préparation.
  5. Vérifiez l'attachement et la viabilité des cellules en évaluant la morphométrie cellulaire au microscope de culture cellulaire, puis effectuez les analyses complémentaires selon les besoins.

10. Analyse en aval

  1. Prélèvement des échantillons pour qPCR
    1. Dans la cabine de sécurité biologique (CSB), étiqueter des tubes de microcentrifugation de 1,5 mL avec les identifiants des échantillons, incluant le type cellulaire et les conditions expérimentales.
    2. Vérifier la présence des cellules sur le PDMS à l’aide d’un microscope de culture cellulaire, tant pour les conditions statiques que pour celles de péristaltisme.
    3. Aspirer le milieu résiduel de chaque membrane en PDMS.
    4. Préparer fraîchement le tampon de lyse pour ARN en ajoutant du β‑mércaptoéthanol au tampon RLT selon un rapport de 1:100.
    5. Ajouter 370 µL du tampon RLT + β-mércaptoéthanol à chaque membrane en PDMS afin de lyser les cellules.
    6. À l’aide d’un racloir cellulaire stérile, racler fermement la zone ensemencée en cellules sur le PDMS afin de détacher toutes les cellules.
    7. Transférer environ 350 µL du lysat dans le tube de 1,5 mL correspondant.
    8. Procéder à l’extraction de l’ARN ou conserver les échantillons à -80 °C jusqu’à utilisation ultérieure.
    9. Décontaminer la CSB.
      NOTE : Le tampon RLT et le β-mércaptoéthanol doivent être manipulés conformément à leurs fiches de données de sécurité (FDS) respectives et éliminés dans les conteneurs de déchets appropriés.
  2. Coloration immunofluorescente
    1. Ajouter 1 mL de paraformaldéhyde (PFA) à 4 % sur chaque membrane et incuber à température ambiante pendant 20 minutes.
    2. Aspirer le PFA et le jeter dans le conteneur désigné pour les déchets dangereux.
    3. Ajouter 1 mL de PBS sur chaque membrane afin d’éliminer le fixateur résiduel.
    4. Continuer selon le protocole de coloration immunofluorescente adapté aux marqueurs ciblés.

11. Nettoyage des bioréacteurs et des composants associés

  1. Vaporiser de l'éthanol à 70 % sur toutes les composantes du bioréacteur qui entrent en contact avec le milieu, les cellules ou les membranes en PDMS, y compris les orifices d'entrée et de sortie du bioréacteur.
  2. Aspirer tout milieu restant dans la bouteille de milieu, puis rincer l'intérieur en vaporisant généreusement de l'éthanol à 70 % et en aspirant à nouveau.
  3. Retirer toutes les composantes désinfectées de l'enceinte stérile et les entreposer dans un endroit propre désigné à cet effet.
  4. Pour les bouteilles de milieu :
    1. Nettoyer avec de l'eau de Javel à 20 %, agiter, puis verser le contenu dans l'évier sous un filet d'eau courante.
    2. Nettoyer à l'aide de vinaigre dilué à 1:10, laver avec du savon et de l'eau ultrapure, rincer ensuite avec de l'éthanol à 70 % et faire sécher à l'envers.
    3. Nettoyer les bouchons des bouteilles de milieu et les embouts de pompe avec de l'éthanol à 70 %.
  5. Nettoyage des pompes péristaltiques
    1. Placer des béchers de 250 mL contenant soit (1) de l'éthanol à 70 %, soit (2) de l'eau ultrapure, soit (3) un récipient vide pour les déchets.
    2. Relier la pompe avec un tube en circuit fermé et l'alimenter à l'aide de la carte électronique contrôlée par Arduino.
    3. Faire fonctionner la pompe pendant 1 minute dans de l'éthanol à 70 %, puis pendant 1 minute dans de l'eau ultrapure afin de rincer dans le bécher vide destiné aux déchets.

Résultats

Ce protocole vise à démontrer une méthode reproductible permettant de déterminer comment les forces mécaniques péristaltiques modulent directement l'activation des macrophages. Avant les expériences en bioréacteur, la polarisation appropriée des iBMDM en réponse à des conditions standard de stimulation biochimique a été confirmée. Conformément à ce protocole, des membranes en PDMS ont été recouvertes de fibronectine et ensemencées avec des iBMDM. Les cellules ont été laissées à s'adhérer pendant 24 h avant un examen visuel afin de confirmer une adhésion réussie, une distribution uniforme à la surface de la membrane et la viabilité, observée par la morphologie irrégulière en « œuf brouillé » décrite par le fournisseur (Figure 3A, B). Les membranes présentant une mauvaise adhérence, un semis irrégulier ou des signes de détachement cellulaire ont été exclues de l'expérimentation, car ces conditions peuvent entraîner une stimulation mécanique incohérente et des voies de signalisation variables en aval. Les membranes correctement semées ont été soit assemblées dans le système de bioreacteur afin de subir une stimulation péristaltique, soit maintenues comme témoins statiques. Après 4 h de culture, les échantillons ont été réévalués afin de confirmer que les cellules étaient restées attachées à la suite de la stimulation mécanique (Figure 3C, D). Après avoir confirmé la rétention cellulaire dans toutes les conditions, l'activation des macrophages a été évaluée par qPCR et par coloration immunofluorescente.

Une analyse de qPCR a été réalisée pour évaluer les modifications de l'expression des gènes associés aux macrophages M1 pro-inflammatoires, Il6, Nos2, et CD40, ainsi que les gènes associés à M2, Chil3 et Mrc1 (Tableau 1). Ces résultats ont démontré que la stimulation péristaltique favorisait l'activation des macrophages vers un phénotype pro-inflammatoire. La culture péristaltique a significativement augmenté Il6 expression de 50,9 fois par rapport aux témoins statiques (p < 0,0001, non apparié test t) et Nos2 expression de 19,8 fois (p = 0,0046, test t non apparié) (Figure 4A). CD40 l'expression a également augmenté de 7,7 fois, bien que ce changement ne soit pas significatif (p = 0,1106, test t non apparié)Figure 4A). En revanche, aucun changement significatif n'a été observé dans Chil3 (1,22 fois supérieur aux témoins statiques ; p = 0,9726, non apparié test t) ou Mrc1 (1,16 fois supérieur aux témoins statiques ; p = 0,9810, test non apparié test t) (Figure 4B). Ensemble, ces résultats indiquent que les forces péristaltiques appliquées favorisent de manière privilégiée l'activation des macrophages de type pro-inflammatoire plutôt que les voies d'activation alternative.

Afin d'évaluer davantage la polarisation des macrophages, une coloration par immunofluorescence a été réalisée à l'aide d'anticorps dirigés contre le marqueur pan-macrophage F4/80 et soit le marqueur associé au phénotype M1, CD40 (Figure 5A), soit le marqueur associé au phénotype M2, YM1/YM2 (Figure 5B). Les échantillons ont été contre-colorés à la DAPI et imagés avec des paramètres d'acquisition identiques afin de permettre la comparaison entre les conditions. L'intensité moyenne de fluorescence (MFI) a été quantifiée pour chaque marqueur et normalisée par rapport au signal F4/80 correspondant dans la même image. Les macrophages soumis à la stimulation péristaltique ont présenté une MFI normalisée de CD40 de 1,74 ± 0,72, représentant une augmentation de 64,80 % par rapport aux témoins statiques, bien que cette augmentation ne soit pas statistiquement significative (Figure 5C). Conformément aux résultats de la qPCR, aucune variation significative de l'expression normalisée de YM1/YM2 n'a été observée après stimulation péristaltique, avec seulement une augmentation de 5 % par rapport aux témoins statiques (Figure 5D). Ces résultats représentatifs démontrent que le protocole induit de façon reproductible une réponse macrophagique principalement pro-inflammatoire par stimulation mécanique seule.

Comparaison de la dispersion cellulaire, statique par rapport à la péristaltisme, à 0 h et 4 h ; analyse d'images microscopiques.
Figure 3 : Les images en champ clair montrent une confirmation visuelle de l'adhésion cellulaire avant et après la péristaltisme. Images en champ clair de cellules sur des membranes en PDMS, provenant des conditions statiques (A,C) et de péristaltisme (B,D), prises avant la mise en place du bioréacteur (t = 0 h) et après la fin de l'expérience (t = 4 h). Les barres d'échelle = 200 µm. Veuillez cliquer ici pour visualiser une version agrandie de cette figure.

Histogramme d'expression génique ; changement de pli dans M1 et M2 avec des conditions statiques versus péristaltiques.
Figure 4: L'analyse de l'expression génique montre une activation pro-inflammatoire des macrophages via stimulation péristaltique Changement d'expression génique en fonction du rapportA) Marqueurs M1 Il6, Nos2 et Cd40, et (BMarqueurs M2 Chil3 et Mrc1. *p < 0.05, ****p < 0,0001, ns = non significatif. Toutes les données sont exprimées en moyenne ± écart-type (ET) ; n = 3 pour chaque groupe. Veuillez cliquer ici pour visualiser une version agrandie de cette figure.

Expérience de polarisation des macrophages ; marqueurs CD40, YM1/2, microscopie de fluorescence, tableau d'analyse des données.
Figure 5 : La coloration immunofluorescente confirme l'activation pro-inflammatoire des macrophages après l'activation de la péristaltisme. Images immunofluorescentes représentatives de macrophages marqués pour le marqueur pan-macrophage F4/80 (vert) et soit (A) les marqueurs M1 CD40 (rose) soit (B) les marqueurs M2 YM1/YM2 (rouge). Les échelles = 20 µm. (C) Quantification de l'intensité moyenne de fluorescence (IMF) de CD40 normalisée par rapport à F4/80. (D) Quantification de l'IMF de YM1/YM2 normalisée par rapport à F4/80. Toutes les données sont exprimées comme moyenne ± écart-type ; n = 3 pour chaque groupe. Veuillez cliquer ici pour visualiser une version agrandie de cette figure.

GèneAmorceSéquence (5′–3′)
GapdhFAGGTCGGTGTGAACGGATTTG
GapdhRGGGGTCGTTGATGGCAACA
Chil3FCAG GTC TGG CAA TTC TTC TGA A
Chil3RGTC TTG CTC ATG TGT GTA AGT GA
Nos2FGGA GTG ACG GCA AAC ATG ACT
Nos2RTCG ATG CAC AAC TGG GTG AAC
Mrc1FCTC TGT TCA GCT ATT GGA CGC
Mrc1RTGG CAC TCC CAA ACA TAA TTT GA
Il-6FTCTATACCACTTCACAAGTCGGA
Il-6RGAA ATT GCC ATT GCA CAA CTC TTT
Cd40FTTGTTGACAGCGGTCCATCTA
Cd40RGCCATCGTGGAGGTACTGTTT

Tableau 1 : Séquences des amorces pour les gènes analysés par qPCR.

Figure suplémentaire 1 : Flux de travail pour la préparation du PDMS, l'assemblage du bioréacteur et la mise en place de la perfusion. (A) Préparation du PDMS dans l'enceinte stérile. (B) Semis cellulaire. (C) Stérilisation UV des composants du bioréacteur. (D) Assemblage du bioréacteur. (E) Bioréacteur fixé. (F) Branchement de la pompe. (G) Installation dans l'incubateur à 0 h. (H) Installation dans l'incubateur à 4 h. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.

Figure supplémentaire 2 : Circuit du bioréacteur avec plaque de montage, pompe, moteur et câblage. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.

Fichier supplémentaire 1 : Code Arduino pour le bioréacteur. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.

Discussion

La compréhension actuelle de la manière dont les forces péristaltiques influencent la fonction des macrophages reste limitée, malgré la fréquence d’un péristaltisme dysrégulé dans les maladies inflammatoires. Bien que des stimuli mécaniques individuels tels que le cisaillement et la déformation cyclique soient connus pour moduler l’activation des macrophages, les effets combinés de la déformation multiaxiale et du flux de fluide, qui ensemble constituent le péristaltisme, n’ont pas été largement étudiés dans le contexte de la mécanobiologie des macrophages. Le protocole décrit ici fournit une plateforme reproductible permettant d’étudier comment ces forces mécaniques combinées régulent le comportement inflammatoire des macrophages dans des conditions physiologiquement pertinentes. À l’aide de ce système, il a été démontré qu’une exposition à une stimulation péristaltique pendant 4 h favorise un phénotype de macrophage principalement pro-inflammatoire, caractérisé par une expression significativement accrue de Il6 et de Nos2.

Il est important de noter que la mécanosensibilité des macrophages dépend fortement de l'amplitude, de la fréquence et de la durée de la force appliquée12,13,14. Des études antérieures ayant examiné des stimuli mécaniques isolés ont montré que les états d'activation des macrophages varient considérablement selon ces paramètres. Par conséquent, les études futures devraient analyser une gamme plus étendue de conditions péristaltiques, incluant des déformations et des contraintes de cisaillement modifiées ainsi qu'une durée accrue sous stimulation mécanique, afin de mieux définir le spectre des réponses des macrophages induites par la mécanique péristaltique. De plus, la présente étude était limitée par le choix de se concentrer sur la péristaltisme comme stimulus mécanique, plutôt que sur la contrainte de cisaillement fluide ou la déformation cyclique prise isolément. Les études futures pourraient utiliser cette plateforme de bioréacteur pour explorer l'activation des macrophages en fonction de divers stimuli mécaniques, le tout avec la rigueur offerte par une plateforme unique. L'élargissement de ces recherches pourrait aider à identifier les seuils mécaniques favorisant soit des phénotypes inflammatoires, soit des phénotypes pro-régénératifs, selon les contextes tissulaires.

La mécanosensibilité des macrophages dépend également fortement de la rigidité et de la topographie du substrat. Il est important de noter que la rigidité du PDMS choisi pour cette étude pourrait avoir un impact sur l'activation des macrophages indépendamment des effets des forces péristaltiques15,16,17,18,19. Afin de contrôler la rigidité comme variable, nous avons comparé nos macrophages exposés à la péristaltisme à des macrophages cultivés sur du PDMS de rigidité équivalente dans des conditions statiques. De futures études pourraient davantage contrôler la rigidité en tant que variable en modulant le rapport du PDMS, en utilisant d'autres matériaux pour le substrat ou en cultivant les macrophages dans une boîte de culture tissulaire en 2D pour comparaison. Par ailleurs, bien que nous n'ayons pas modifié la topographie du PDMS, notre dispositif permet des études futures sur cette variable.

Un des principaux atouts de ce protocole réside dans son adaptabilité à un large éventail d'études sur l'inflammation. Bien que ce travail utilise des macrophages dérivés de moelle osseuse immortalisés (iBMDM), le système peut être facilement modifié pour accueillir des macrophages primaires, des monocytes, des macrophages tissulaires résidents ou des systèmes de co-culture multicellulaires. Par exemple, des cellules épithéliales, stromales ou musculaires lisses pourraient être intégrées afin de mieux recréer le microenvironnement cellulaire du tractus gastro-intestinal, de l'utérus ou des uretères. De plus, la composition de la matrice extracellulaire peut être adaptée au tissu d'intérêt en modifiant l'enduit appliqué sur la membrane en PDMS. Dans cette étude, la fibronectine s'est révélée nécessaire pour maintenir l'adhésion des iBMDM durant la stimulation péristaltique, tandis que des enduits de collagène I et de collagène IV ont entraîné un détachement cellulaire important. Toutefois, les enduits matriciels optimaux peuvent varier selon la source des macrophages ou la configuration de la co-culture. Par conséquent, une validation rigoureuse de l'adhésion cellulaire aux points de contrôle recommandés est essentielle pour garantir une stimulation mécanique reproductible et des analyses ultérieures fiables.

Plusieurs considérations techniques sont essentielles pour la mise en œuvre réussie de ce protocole, notamment l'entretien régulier, qui permet d'éviter les pannes les plus fréquentes. Un assemblage correct du bioréacteur et son étanchéité assurée à l'aide de colliers plastiques sont particulièrement importants, car une étanchéité incomplète pourrait entraîner des fuites de milieu, des profils altérés de contrainte et de déformation de cisaillement, un risque de contamination ou une perte de viabilité cellulaire. De plus, les pompes et les moteurs doivent être correctement étalonnés afin de maintenir une stimulation péristaltique reproductible, et un rinçage régulier des tubulures de pompe à l'éthanol et à l'eau ultrapure empêche l'accumulation de résidus. Enfin, les cellules semées sur les membranes en PDMS doivent être vérifiées pour s'assurer d'une bonne adhérence et d'une confluence de 80 % avant leur introduction dans le bioréacteur. L'ensemble de ces mesures de dépannage et des contraintes du système souligne la nécessité d'un assemblage soigneux, d'un étalonnage constant et d'une surveillance continue afin de garantir des performances reproductibles du bioréacteur.

Dans l'ensemble, ce protocole fournit une plateforme polyvalente et physiologiquement pertinente pour étudier la mécano-immunomodulation dans des environnements mécaniques dynamiques complexes. En permettant l'application simultanée d'une contrainte cyclique multiaxiale et d'une contrainte de cisaillement fluide, ce système complète les modèles traditionnels in vitro à force unique et offre un outil précieux pour l'étude de l'inflammation dans les tissus pilotés par le muscle lisse. Cette approche pourrait être largement applicable à l'étude des maladies gastro-intestinales, de la fibrose, du cancer et d'autres pathologies dans lesquelles les macrophages sont exposés à des microenvironnements mécaniques dynamiques.

Déclarations de divulgation

Les auteurs n'ont aucun conflit d'intérêts à divulguer.

Remerciements

Ce travail a été financé par la subvention numéro 2440798 de la National Science Foundation. Figure 1 et Figure 2 ont été créées à l'aide d'une version sous licence de BioRender.com.

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
Trypsine-EDTA à 0,25 %Fisher25200056
Tubes microcentrifuge de 1,5 mLUSA Scientific1615-5510
Boîtes de Pétri de 100 mm × 15 mmFisher50-190-0276
Boîtes de culture de 150 mmFisherFB012925
Paraformaldéhyde à 4 %Santa Cruzsc-281692
Boîtes de culture de 90 mmFisherFB012923
Anticorps Alexa Fluor 488 Anti-F4/80Abcamab204266
Anticorps Alexa Fluor 647 Anti-CD40Abcamab275158
Arduino UnoAmazonB008GRTSV6
Plaque d'essaiAmazon
Buffer RLTQiagen79216
Grattoir à cellulesFisher353087
DAPIMilliporeSigma50-874-10001
ExsiccateurMilliporeSigmaZ119008
Pince diagonaleAmazon
Sérum de veau fœtalInnovative Biosciences11-01-500
FibronectineMilliporeSigmaF1141-1MG
Solution tampon HEPESFisher (Gibco)15630080
iBMDMApplied Biological Materials Inc. (abm)T0673
Moteur RobotshopFT-SPARK16-360
Anticorps PE Anti-Ym-1 + Ym-2Abcamab211621
Pénicilline-StreptomycineFisher15140122
Pompe péristaltiqueDigiKey1150
Solution saline tamponnée au phosphateFisher14190250
Filament PLAAmazonB0D7ZYCVTY
Potentiomètre B1K 1K OhmAmazon‎B0CZ747F6F
RPMI 1640Fisher11875085
Gras siliconeAmazonB000XBH9HI
Pince multipriseAmazon
Pyruvate de sodiumCytiva HycloneSH3023901
Kits d'élastomère de silicone Sylgard 184FisherNC9285739
Flacon de culture T-25Fisher229331
TransistorDigiKeyIRF520NPBF-ND
Câblage/Clips crocodileAmazon
Courroies de serrage de 18 poucesAmazon
β-mercaptoéthanolFisherAC125472500

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