Article de recherche

La N-lactoyl-phénylalanine améliore la fonction cardiaque dans un modèle murin de cardiomyopathie diabétique en régulant le métabolisme lipidique

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DOI :

10.3791/72633

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1 septembre 2026

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1Nanjing Drum Tower Hospital Clinical College, Nanjing University of Chinese Medicine, 2Affiliated Hospital of Medical School, Nanjing University, 3Institute of Advanced Synthesis, School of Chemistry and Molecular Engineering, Nanjing Tech University

Dans cet article

Résumé

Ce protocole décrit des approches in vivo et in vitro pour étudier la manière dont la N-lactoyl-phénylalanine affecte la cardiomyopathie diabétique, le métabolisme lipidique cardiaque et la synthèse du cholestérol, en ciblant particulièrement la voie de la protéine kinase activée par l'adénosine monophosphate alpha 1/réductase de l'hydroxy-3-méthylglutaryl-coenzyme A.

Résumé

La cardiomyopathie diabétique (DCM) est l'une des complications les plus graves du diabète. La N-lactoyl-phénylalanine (Lac-Phe), un métabolite endogène, peut favoriser la perte de poids et améliorer l'homéostasie glucidique. Cette étude visait à évaluer l'effet thérapeutique de la Lac-Phe sur la DCM et à explorer davantage le mécanisme sous-jacent. Des souris diabétiques de type 2 présentant une DCM ont été traitées par Lac-Phe. La Lac-Phe a amélioré la fonction contractile cardiaque, atténué le remodelage pathologique et réduit l'accumulation lipidique dans le cœur. In vitro, les effets de la Lac-Phe ont été étudiés dans des cellules H9c2 stimulées par une concentration élevée de glucose et d'acide palmitique. La Lac-Phe a réduit l'accumulation lipidique en diminuant la synthèse du cholestérol dans les cellules H9c2. Sur le plan mécanistique, la Lac-Phe a favorisé la phosphorylation et l'activation de la protéine kinase activée par l'AMP (AMPKα1). Ensuite, l'AMPKα1 activée a phosphorylé et inhibé sa cible en aval, la 3-hydroxy-3-méthylglutaryl-coenzyme A réductase (HMGCR), entraînant une réduction de la synthèse du cholestérol et, en fin de compte, une amélioration du déséquilibre du métabolisme lipidique dans les cellules H9c2. Ces résultats indiquent que la Lac-Phe améliore le métabolisme lipidique dans les cellules H9c2 en cas de DCM via la voie AMPKα1/HMGCR, améliorant ainsi la fonction contractile cardiaque et atténuant le remodelage pathologique. La Lac-Phe pourrait représenter une approche thérapeutique potentielle pour la cardiomyopathie diabétique.

Introduction

Le diabète est une maladie métabolique caractérisée par une hyperglycémie persistante1Au cours des deux dernières décennies, le diabète est devenu l'une des dix principales causes de décès dans le monde, plus de six millions de personnes décédant chaque année du diabète et de ses complications.2. La cardiomyopathie diabétique (DCM), une affection cardiaque pathologique résultant du diabète, représente l'une des complications les plus graves associées au diabète3,4Il fonctionne comme un facteur de risque indépendant d'insuffisance cardiaque et se caractérise par des altérations structurelles et fonctionnelles du myocarde.5,6, notamment la fibrose cardiaque et l'hypertrophie des cardiomyocytes, qui conduisent finalement à une dysfonction diastolique et systolique. Bien que plusieurs thérapies cardiovasculaires conventionnelles, telles que βles bêta-bloquants, les inhibiteurs de l'enzyme de conversion de l'angiotensine et les bloqueurs du récepteur de type 1 de l'angiotensine II sont actuellement utilisés dans la prise en charge de la MCD7,8, leur efficacité reste sous-optimale en milieu clinique. Étant donné que les mécanismes sous-jacents à la MDC n'ont pas été étudiés de manière approfondie9, il n'existe actuellement aucune stratégie de traitement claire ciblant cette maladie10,11Les manifestations cliniques de la MCD évoluent d'une dysfonction diastolique asymptomatique au stade précoce à une dysfonction systolique et une insuffisance cardiaque clinique au stade avancé, pouvant même entraîner la mort.12,13Il est donc urgent d'explorer et de développer des options thérapeutiques efficaces pour cette affection.

Un métabolisme lipidique déséquilibré est une caractéristique clé de la MDC14. Dans la MDC, l'augmentation des niveaux d'acides gras libres (AGL) dans le sang peut entraîner une absorption excessive d'acides gras par les cardiomyocytes15,16. Le métabolisme des acides gras dans les cardiomyocytes dépend principalement de l'oxydation des acides gras. Avec le temps, l'oxydation des acides gras dans les cardiomyocytes est insuffisante pour métaboliser complètement tous les acides gras absorbés, et des acides gras en excès ainsi que leurs métabolites intermédiaires s'accumulent dans les cardiomyocytes17. Cette surcharge lipidique induit une lipotoxicité, perturbe l'approvisionnement énergétique myocardique et favorise le stress oxydatif cardiaque ainsi que les réponses inflammatoires, provoquant finalement des lésions sévères des cardiomyocytes18,19. Par conséquent, réguler activement le métabolisme lipidique cardiaque pourrait représenter une cible thérapeutique potentielle pour la MDC20.

Le N-lactoyl-phénylalanine (Lac-Phe) est un métabolite endogène dont la concentration augmente rapidement après l'exercice21. D'un point de vue mécanistique, le Lac-Phe est synthétisé par l'enzyme cytosolique carnosine dipeptidase 2 (CNDP2) via la condensation du lactate et du phénylalanine. Cette voie biosynthétique est largement répartie dans divers types cellulaires, notamment les macrophages, les cellules épithéliales et les cellules souches mésenchymateuses, qui sécrètent le Lac-Phe dans la circulation après une activité physique22. Une administration chronique de Lac-Phe s'est révélée efficace pour réduire l'apport alimentaire, diminuer l'obésité et le poids corporel, ainsi qu'améliorer l'homéostasie du glucose21. Une étude récente a montré que le Lac-Phe peut améliorer la capacité du métabolisme lipidique des microglies/macrophages après une lésion de la moelle épinière23. Fait intéressant, des études indiquent que l'administration aiguë et chronique de métformine, un traitement de première intention pour le diabète de type 2, peut augmenter les niveaux de Lac-Phe et que ce dernier médie les effets anti-obésité de la métformine22. De plus, Sha et al. ont récemment démontré que le Lac-Phe atténue la mort des cellules myocardiques en soulageant le dysfonctionnement mitochondrial, améliorant ainsi l'insuffisance cardiaque induite par la constriction aortique transversale (TAC)24. L'hyperglycémie prolongée et l'obésité sont des facteurs importants contribuant à la dysrégulation du métabolisme lipidique dans la cardiomyopathie diabétique (DCM)25. Dans leur ensemble, ces données suggèrent que le Lac-Phe pourrait avoir un effet thérapeutique potentiel sur la DCM. Cependant, à ce jour, le rôle spécifique du Lac-Phe dans la DCM n'a pas été étudié.

Dans cette étude, nous avons constaté que l'administration exogène de Lac-Phe à des souris atteintes de cardiomyopathie diabétique améliorait efficacement la fonction contractile cardiaque et atténuait le remodelage pathologique cardiaque. Nous avons découvert que Lac-Phe améliorait la fonction cardiaque chez les souris atteintes de CMD en régulant le déséquilibre du métabolisme lipidique. Lac-Phe réduisait l'accumulation de gouttelettes lipidiques (LD) dans les cardiomyocytes des souris atteintes de CMD et diminuait la teneur en cholestérol du cœur. Sur le plan mécanistique, Lac-Phe favorisait la phosphorylation et l'activation de la protéine kinase activée par l'adénosine monophosphate alpha 1 (AMPKα1), ce qui induisait la phosphorylation de la 3-hydroxy-3-méthylglutaryl-coenzyme A réductase (HMGCR). La phosphorylation de HMGCR diminue son activité, entraînant une réduction de la production de cholestérol et, par conséquent, une amélioration du déséquilibre du métabolisme lipidique dans les cardiomyocytes. Ces résultats fournissent une base théorique pour le traitement potentiel de la CMD par Lac-Phe.

Protocole

The animal study protocol was approved by the Institutional Ethics Committee of Nanjing Drum Tower Hospital (Approval Number: 2025AE1065, 26 September 2025) and was conducted in accordance with the guidelines outlined in the Guidelines for the Care and Use of Laboratory Animals (8th Edition), published by the National Institutes of Health of the United States.

Animals

Thirty 5-week-old male C57BL/6J mice were used in this study. After 1 week of adaptive feeding, all mice were housed with access to food and water under an alternating 12 h day-night cycle at a temperature of 22°C ± 2°C and humidity of 40%–60%. An HFD combined with low-dose STZ was used to establish the DCM mouse model (Figure 1A). Four weeks after initiation of high-fat diet (HFD; 60% fat, 20% protein, and 20% carbohydrate) feeding, mice were fasted overnight and subsequently administered streptozotocin (STZ; 8 mg/mL dissolved in citrate buffer, pH 4.5) via intraperitoneal injection at a dosage of 35 mg/kg/day for three consecutive days. Control group mice were fed a control diet (10% fat, 20% protein, and 70% carbohydrate) and received equivalent volumes of citrate buffer. Following 15 additional weeks of high-fat diet maintenance, mice meeting both criteria, random blood glucose of ≥13.3 mmol/L and left ventricular ejection fraction (LVEF) of <55%, were defined as successfully established DCM models. These validated DCM mice were numbered and randomly assigned to the DCM and DCM + Lac-Phe groups using a random number table. Approximately half of the mice failed to develop the model; these animals were euthanized in accordance with animal ethics requirements. In brief, mice were divided into three groups: Control, DCM, and DCM + Lac-Phe (n = 10 for each group). All 10 mice per group underwent echocardiography, body weight measurement, and OGTT. Following the 28-day treatment period, hearts were collected for subsequent analyses. There were 10 mice in each group. Of these, three mice per group were used for transcriptome sequencing, three were used for transmission electron microscopy and histological staining, and three were used for protein expression analysis. The remaining mouse in each group was reserved as a backup. After successful establishment of the DCM model, Lac-Phe was dissolved in normal saline to a final concentration of 10 mg/mL. Mice in the DCM + Lac-Phe group received intraperitoneal Lac-Phe at 50 mg/kg/day in an injection volume of 5 mL/kg, once daily for 28 consecutive days. Mice in the Control and DCM groups were administered an equivalent volume of normal saline as vehicle control.

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Figure 1. Lac-Phe improves cardiac function and pathological remodeling in mice with diabetic cardiomyopathy. (A) Schematic of the HFD/STZ-induced DCM mouse model and Lac-Phe treatment protocol. (B) Body weights of mice in the Control, DCM, and DCM + Lac-Phe groups during the 4-week treatment period; n = 10 per group. (C) Oral glucose tolerance test (OGTT) in the indicated groups; n = 10 per group. (D) Representative echocardiographic images at 0, 2, and 4 weeks of treatment. (E,F) Quantification of left ventricular ejection fraction (LVEF) (E) and fractional shortening (FS) (F); n = 10 per group. (G) Representative hematoxylin and eosin (H&E)-stained heart sections. Scale bar = 1 mm. (H,I) Representative Masson’s trichrome staining of heart sections (H) and quantification of fibrotic area (I); n = 3 per group. Scale bar = 50 μm. (J,K) Representative wheat germ agglutinin (WGA) staining of heart sections (J) and quantification of relative cardiomyocyte area (K); n = 3 per group. Scale bar = 20 μm. Data are presented as the mean ± standard deviation. P < 0.05, **P < 0.001. Please click here to view a larger version of this figure.

Cardiac function

Following anesthesia with isoflurane inhalation, mice were secured in a supine position on a temperature-controlled platform (37°C). Left ventricular dimensions and mitral valve blood flow velocity during diastole and systole were measured using an echocardiography machine equipped with a 40 MHz transducer, from which LVEF and shortening fraction (FS) were calculated. Three consecutive cardiac cycles were collected from each mouse.

Cell treatment

H9c2 cells were cultured in Dulbecco’s modified Eagle’s medium supplemented with 10% fetal bovine serum and 1% penicillin–streptomycin at 37°C in a humidified atmosphere containing 5% CO₂. Cells were passaged every 2–3 days upon reaching 70%–80% confluence. For experiments, cells were seeded in 10 cm dishes and then divided into three groups: Control, high glucose/palmitic acid (HG/PA), and HG/PA + Lac-Phe. Cells in the HG/PA and HG/PA + Lac-Phe groups were first exposed to 0.25 mM palmitic acid and 50 mM glucose for 24 h. Thereafter, cells in the HG/PA + Lac-Phe group were treated with 10 μg/mL Lac-Phe for an additional 24 h while HG/PA exposure was maintained; cells in the HG/PA group received an equivalent volume of PBS under the same HG/PA conditions. In the p-AMPK inhibition experiments, 10 μM AMPK-IN-3 (dissolved in DMSO) was added simultaneously with Lac-Phe for 24 h, and the corresponding control groups received an equal volume of DMSO. For the atorvastatin experiments, H9c2 cells under HG/PA conditions were treated with 10 μM atorvastatin for 24 h, either alone or in combination with 10 μg/mL Lac-Phe.

Histological staining

After 28 days of Lac-Phe administration, mouse hearts were harvested and immersion-fixed in 4% paraformaldehyde (pH 7.4) for 24 h. Fixed cardiac tissues were paraffin-embedded and sectioned into 6-μm-thick slices. Tissue sections were stained with hematoxylin and eosin, wheat germ agglutinin, and Masson’s trichrome. All staining procedures were performed strictly following the manufacturers’ protocols. Whole-slide imaging was performed at 20× magnification using a high-resolution brightfield microscope equipped with a digital camera system.

Western blot analysis

Protein concentration was determined using the Bradford assay. Tissue lysates were resolved by SDS-PAGE on 10% (w/v) acrylamide gels and electrophoretically transferred to polyvinylidene difluoride membranes. Nonspecific binding sites were blocked with 5% bovine serum albumin for 2 h at room temperature. Membranes were then incubated overnight at 4°C with primary antibodies (diluted 1:1,000), followed by six washes with TBST (5 min each) on a shaker. The membranes were then incubated with horseradish peroxidase-conjugated secondary antibodies (diluted 1:5,000) for 2 h at room temperature, followed by another six washes with TBST (5 min each). Protein bands were visualized using an enhanced chemiluminescence reagent kit. Quantification of western blot results was performed by densitometric analysis using ImageJ software. All antibodies used in this study are listed in the Table of Materials.

Transcriptomics

Total RNA was isolated from cardiac tissue of C57BL/6J mice using TRIzol Reagent and RNeasy mini kits. RNA quality was evaluated using a 2100 bioanalyzer, demonstrating high RNA purity and integrity. RNA-seq libraries were prepared according to the VAHTS Universal V10 RNA-seq Library Prep Kit and sequenced using an Illumina NovaSeq 6000 System (single-read, 150 bp). Differentially expressed genes were identified using DESeq2, with an adjusted P value < 0.05 and an absolute log₂ fold change > 1 considered statistically significant. Gene Ontology (GO) enrichment analysis was conducted on differentially expressed genes, and the significance of enrichment of differentially expressed genes in GO terms was calculated using the hypergeometric distribution algorithm.

Oil Red O staining and LD540 lipid staining

Cardiac tissue was embedded in OCT compound and then cut into 10-μm-thick sections. The frozen sections were equilibrated at room temperature for 30 min and fixed with 4% paraformaldehyde for 10 min. After washing with PBS, the sections were placed in 60% isopropyl alcohol for 15 s and covered with Oil Red O working solution for 30 min. The sections were then treated with 60% isopropyl alcohol for 15 s and washed three times with PBS. For LD540 lipid staining, H9c2 cells were washed with PBS and fixed with 4% paraformaldehyde for 10 min at room temperature. The cells were then incubated with 10 μM LD540 for 30 min at room temperature.

Transmission electron microscopy (TEM)

Fresh mouse heart tissues were cut into 1–2 mm3 pieces, fixed in electron microscope fixative at 4°C for 4 h, then washed with double-distilled water and immersed in ethanol solutions of progressively increasing concentrations. The samples were embedded, sectioned, and then observed under a transmission electron microscope.

Total cholesterol (TC) content

Total cholesterol (TC) levels in serum and H9c2 cell samples were measured using the Amplex Red Cholesterol and Cholesteryl Ester Assay Kit according to the manufacturer’s instructions.

Oral Glucose Tolerance Test (OGTT)

Mice were fasted for 14 h (from 19:00 to 9:00) and gavaged with glucose (20% stock, 2 g/kg). Blood glucose levels were determined using blood collected from the tail vein at 0, 15, 30, 60, and 120 min after gavage.

Cell counting kit-8 (CCK-8) measurement

CCK-8 was used to measure cell viability. H9c2 cells were seeded into 96-well plates at an initial density of 3 × 104 cells/well. After treatment with different concentrations of Lac-Phe under HG/PA conditions for 24 h, 10 μL of the kit reagent was added to 100 μL of culture medium per well, followed by incubation at 37°C for 4 h. The absorbance was measured at 450 nm using a multimode microplate reader to obtain the optical density (OD) value.

Molecular docking

The crystal structures of Lac-Phe and AMPKα1 were downloaded from PubChem26. The molecular docking process was carried out using CB-DOCK227.

Statistical analysis

All echocardiographic measurements, histological staining, and image quantifications were performed by investigators blinded to group assignment. All data analyses were performed using Prism and SPSS 20.0. Each experiment was repeated at least three times, and the data were presented as the mean ± standard deviation. Homogeneity of variance was assessed using Levene’s test. Normality was confirmed by graphical inspection of residuals. Comparisons among multiple groups were conducted using one-way analysis of variance, followed by Tukey's post hoc test for pairwise comparisons. For OGTT data, two-way repeated-measures ANOVA was used, with group as the between-subjects factor and time as the within-subjects factor, followed by Bonferroni's post hoc test. P < 0.05 was considered statistically significant.

Résultats

Lac-Phe améliore la fonction cardiaque chez des souris atteintes de cardiomyopathie diabétique

Nous avons induit une cardiomyopathie dilatée (DCM) chez des souris C57BL/6J à l'aide d'un régime riche en graisses (HFD) combiné à des injections de streptozotocine (STZ) (Figure 1A) et ont réparti aléatoirement les souris DCM correctement établies en un groupe non traité (groupe DCM) et un groupe traité au Lac-Phe, les souris C57BL/6J témoins servant de contrôle négatif. Selon l'étude de Li et al.21, nous avons sélectionné une dose thérapeutique de 50 mg/kg de Lac-Phe. Après l'établissement réussi du modèle, le groupe traité au Lac-Phe a reçu des injections exogènes de Lac-Phe pendant quatre semaines, tandis que le groupe non traité a reçu des injections d'un volume équivalent de sérum physiologique. Par rapport au groupe DCM, les souris atteintes de cardiomyopathie diabétique traitées au Lac-Phe ont présenté une réduction significative du poids corporel après quatre semaines (Figure 1B). La TTOG a révélé que, par rapport au groupe témoin négatif, les souris du groupe DCM présentaient des concentrations sanguines de glucose significativement élevées à tous les points temporels mesurés, indiquant une altération de la tolérance au glucose. En revanche, les souris DCM traitées avec le Lac-Phe présentaient une amélioration de la tolérance au glucose (Figure 1C). L'analyse échocardiographique a révélé que, par rapport aux souris du groupe témoin négatif, les souris atteintes de CMD présentaient une FEVG et une FS significativement réduites (Figure 1D–F). Le traitement par Lac-Phe a augmenté la fraction d'éjection du ventricule gauche (LVEF) et la fraction de raccourcissement (FS) chez les souris atteintes de DCM. L'analyse histopathologique utilisant l'H&La coloration #38;E a révélé une hypertrophie pathologique dans le tissu cardiaque de souris atteintes de CMD par rapport aux souris témoins (Figure 1G). Le traitement par Lac-Phe a nettement atténué l'hypertrophie myocardique. La coloration trichrome de Masson a en outre démontré que le Lac-Phe atténuait significativement la fibrose myocardique dans les cœurs atteints de cardiomyopathie dilatée (DCM).Figure 1H, I). La coloration par la WGA a indiqué que le Lac-Phe réduisait significativement la surface en coupe transversale des cardiomyocytes dans les cœurs atteints de cardiomyopathie dilatée (DCM)Figure 1J, K). Ces expériences démontrent que l'administration exogène de Lac-Phe améliore efficacement la fonction cardiaque et atténue le remodelage pathologique chez des souris présentant une cardiomyopathie dilatée.

Le Lac-Phe améliore le métabolisme lipidique dysrégulé dans la MDC

Afin de mieux élucider le mécanisme d'action de Lac-Phe dans la MCD, nous avons réalisé une analyse transcriptomique de tissus cardiaques de souris. Après l'acquisition des données, des analyses des voies GO et KEGG ont été effectuées. L'analyse GSEA du processus métabolique des acides gras et l'analyse d'enrichissement des voies KEGG ont révélé des altérations des voies liées au métabolisme lipidique (Figure 2A,B). Afin d'approfondir l'étude du mode d'action de Lac-Phe dans le cœur de souris atteintes de MCD, nous avons réalisé une analyse en microscopie électronique en transmission (MET) (Figure 2C,D) pour examiner si le traitement par Lac-Phe modifiait la morphologie ultrastructurale du cœur de souris MCD. Les images MET ont révélé une augmentation significative de la densité des gouttelettes lipidiques (LD) dans le cœur de souris MCD par rapport aux souris témoins, tandis que l'administration de Lac-Phe a efficacement réduit cette densité de LD. Compte tenu de l'importance bien établie de la dysrégulation du métabolisme lipidique dans la MCD, nous avons évalué davantage l'accumulation lipidique cardiaque à l'aide de la coloration au rouge oléine (Figure 2E,F). L'analyse histologique a montré une accumulation lipidique fortement accrue dans le cœur de souris MCD, alors que le traitement par Lac-Phe a réduit cette accumulation. Le traitement par Lac-Phe a également abaissé le taux de cholestérol total (TC) dans le sérum de souris MCD (Figure 2G). Afin de choisir une dose appropriée de Lac-Phe pour les expériences in vitro, nous avons utilisé le test CCK-8 pour mesurer la viabilité des cellules H9c2 traitées avec différentes concentrations de Lac-Phe dans des conditions HG/PA (Figure 2H). Les cellules H9c2 traitées avec Lac-Phe à une concentration de 10 μg/mL dans des conditions HG/PA ont présenté le taux de survie le plus élevé parmi les concentrations testées. Nous avons donc sélectionné une concentration de 10 μg/mL de Lac-Phe pour les expériences ultérieures. Les cellules H9c2 exposées aux conditions HG/PA ont montré une accumulation lipidique significative, comme démontré par la coloration LD540 et la quantification de la fluorescence (Figure 2I,J), et la teneur en TC était également augmentée (Figure 2K). Le traitement par Lac-Phe a inversé ces modifications, réduisant de manière significative à la fois l'accumulation lipidique et les niveaux de TC dans les cellules H9c2. Dans leur ensemble, ces résultats expérimentaux démontrent que Lac-Phe atténue efficacement l'accumulation lipidique cardiaque et améliore la dysrégulation du métabolisme lipidique chez les souris MCD, tout en réduisant l'accumulation lipidique et les niveaux de TC dans les cellules H9c2 traitées par HG/PA.

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Figure 2. Le Lac-Phe améliore le métabolisme lipidique dysrégulé dans la cardiomyopathie diabétique. (A) Analyse d'enrichissement des ensembles de gènes (GSEA) du processus métabolique des acides gras dans les groupes Témoin et DCM. (B) Analyse d'enrichissement des voies de Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes (KEGG) comparant les groupes DCM et DCM + Lac-Phe. (C) Images représentatives de microscopie électronique en transmission (TEM) de tissus cardiaques, les flèches rouges indiquant les gouttelettes lipidiques (LD). Échelle = 2 μm. (D) Quantification du nombre moyen de LD par 100 μm2 ; n = 3 par groupe. (E,F) Coloration représentative par le rouge d'huile O de tissus cardiaques (E) et quantification de la surface positive relative au rouge d'huile O (F) ; n = 3 par groupe. Échelle = 20 μm. (G) Niveaux relatifs de cholestérol total (TC) dans le sérum des groupes indiqués ; n = 3 par groupe. (H) Viabilité cellulaire mesurée par le test CCK-8 dans les cellules H9c2 traitées avec 0, 1, 5, 10 ou 20 μg/mL de Lac-Phe dans des conditions HG/PA. (I,J) Coloration représentative LD540 des cellules H9c2 (I) et quantification de l'intensité moyenne de fluorescence LD540 (J) ; n = 3 par groupe. Échelles = 200 μm. (K) Niveaux de TC dans les cellules H9c2 des groupes indiqués ; n = 3 par groupe. Les données sont exprimées comme moyenne ± écart-type. *P < 0,05, **P < 0,01, ***P < 0,001, ****P < 0,0001. Veuillez cliquer ici pour visualiser une version agrandie de cette figure.

Lac-Phe augmente la phosphorylation de HMGCR dans les cœurs de souris atteintes de DCM et dans les cellules H9c2

Afin d'identifier des cibles potentielles par lesquelles le Lac-Phe améliore le métabolisme lipidique, nous avons criblé des protéines associées à la MCD à l'aide de GeneCards28 et prédit les protéines pouvant interagir avec le Lac-Phe à l'aide de SwissTargetPrediction29 (Figure 3A). En comparant les résultats, nous avons identifié six gènes cibles potentiels (Figure 3B). L'analyse de ces six gènes a révélé que HMGCR est un régulateur central du métabolisme du cholestérol et joue également un rôle clé dans la MCD (Figure 3C)30. Afin de déterminer si le Lac-Phe régule le métabolisme lipidique via HMGCR, nous avons d'abord examiné le rapport p-HMGCR/HMGCR dans les cœurs de souris. Une analyse par immunobuvardage a montré que le rapport p-HMGCR/HMGCR était diminué dans les cœurs de souris atteintes de MCD, tandis que le traitement au Lac-Phe augmentait ce rapport (Figure 3D,E). Ces résultats sont compatibles avec une augmentation de la phosphorylation de HMGCR et une réduction de son activité après traitement au Lac-Phe. Des expériences in vitro ont montré que, dans des conditions HG/PA, le rapport p-HMGCR/HMGCR était diminué dans les cellules H9c2, tandis que le traitement au Lac-Phe augmentait ce rapport (Figure 3F,G). Ces résultats démontrent que le Lac-Phe augmente la phosphorylation de HMGCR dans les cœurs de souris atteintes de MCD et dans les cellules H9c2 traitées au HG/PA, soutenant ainsi l'implication de HMGCR dans les effets du Lac-Phe sur le métabolisme lipidique.

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Figure 3. Le Lac-Phe augmente la phosphorylation de HMGCR dans les cœurs de souris atteintes de cardiomyopathie diabétique et dans les cellules H9c2. (A) Diagramme de Venn montrant la superposition entre les protéines associées à la CMD et les protéines associées au Lac-Phe prédites. (B) Six protéines communes associées à la CMD et au Lac-Phe. (C) Réseau d'interactions protéine-protéine montrant HMGCR au sein du réseau des protéines associées à la CMD. (D,E) Images représentatives de transferts immuno-sudés de p-HMGCR et de HMGCR dans les tissus cardiaques des groupes indiqués (D) et quantification du rapport p-HMGCR/HMGCR (E) ; n = 3 par groupe. (F,G) Images représentatives de transferts immuno-sudés de p-HMGCR et de HMGCR dans les cellules H9c2 des groupes indiqués (F) et quantification du rapport p-HMGCR/HMGCR (G) ; n = 3 par groupe. La β-tubuline a été utilisée comme témoin de chargement. Les données sont exprimées comme moyenne ± écart-type. *P < 0,05. Veuillez cliquer ici pour visualiser une version agrandie de cette figure.

Lac-Phe combiné à l'atorvastatine améliore le métabolisme lipidique dans les cellules H9c2

Afin d'évaluer davantage l'effet de la Lac-Phe sur le métabolisme lipidique via HMGCR, nous avons utilisé l'atorvastatine comme contrôle. Des expériences in vitro ont montré que, dans des conditions HG/PA, un traitement combiné à la Lac-Phe et à l'atorvastatine entraînait une réduction plus importante de l'accumulation lipidique que le traitement à l'atorvastatine seul. La coloration par LD540 et la quantification de la fluorescence ont démontré que le traitement combiné à la Lac-Phe et à l'atorvastatine réduisait l'accumulation des gouttelettes lipidiques dans les cellules H9c2 (Figure 4A,B). La mesure du contenu en cholestérol total (TC) a révélé un effet similaire (Figure 4C). Une analyse par immunoblotting a montré que le traitement combiné à la Lac-Phe et à l'atorvastatine augmentait significativement le ratio p-HMGCR/HMGCR (Figure 4D,E). Ces résultats indiquent qu'un traitement combiné à la Lac-Phe et à l'atorvastatine est associé à une réduction de l'accumulation lipidique et des taux de cholestérol total, ainsi qu'à une augmentation de la phosphorylation de HMGCR dans les cellules H9c2.

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Figure 4. Le Lac-Phe combiné à l'atorvastatine améliore le métabolisme lipidique dans les cellules H9c2. (A,B) Coloration représentative par LD540 des cellules H9c2 provenant des groupes de traitement indiqués (A) et quantification de l'intensité moyenne de fluorescence LD540 (B) ; n = 3 par groupe. Échelle = 200 μm. (C) Niveaux de cholestérol total (TC) dans les cellules H9c2 provenant des groupes de traitement indiqués ; n = 3 par groupe. (D,E) Images représentatives de western blot de p-HMGCR et HMGCR dans les cellules H9c2 provenant des groupes de traitement indiqués (D) et quantification du ratio p-HMGCR/HMGCR (E) ; n = 3 par groupe. La β-tubuline a été utilisée comme témoin de chargement. Les données sont exprimées en moyenne ± écart-type. *P < 0,05, **P < 0,01, ****P < 0,0001. Veuillez cliquer ici pour visualiser une version agrandie de cette figure.

Lac-Phe augmente la phosphorylation de AMPKα1

Afin d'approfondir le mécanisme moléculaire par lequel le Lac-Phe régule HMGCR, nous avons réanalysé les données du transcriptome cardiaque de souris. Grâce à une analyse KEGG des données transcriptomiques, nous avons identifié 160 voies enrichies de manière différentielle entre les groupes DCM et Contrôle, ainsi que 89 voies enrichies de manière différentielle entre les groupes DCM et DCM + Lac-Phe (Figure 5A). Soixante voies présentaient un chevauchement entre ces deux comparaisons. Parmi ces 60 voies communes, nous avons sélectionné la voie AMPK. L'AMPK joue un rôle essentiel dans la régulation du métabolisme lipidique dans la DCM31. De plus, l'AMPK est en amont de HMGCR (Figure 5B). Nous avons émis l'hypothèse que le Lac-Phe pourrait réguler HMGCR en modulant l'AMPK, améliorant ainsi le métabolisme lipidique. Pour tester cette hypothèse, nous avons tout d'abord réalisé un docking moléculaire entre AMPKα1 et le Lac-Phe à l'aide de CB-DOCK2. Les résultats de docking moléculaire ont montré que la conformation de liaison prédite la mieux classée entre le Lac-Phe et AMPKα1 présentait une affinité de −7,6 kcal/mol (Figure 5C). Ces résultats suggèrent une interaction potentielle entre le Lac-Phe et AMPKα1, mais n'établissent pas de liaison intracellulaire directe. Afin de déterminer si le Lac-Phe affecte la voie AMPK dans la DCM, nous avons examiné la phosphorylation d'AMPKα1 dans les cœurs de souris atteintes de DCM. Une analyse par immunobuvardage a révélé que le rapport p-AMPKα1/AMPKα1 était diminué dans les cœurs de souris DCM, tandis que le traitement par Lac-Phe augmentait ce rapport (Figure 5D,E). Des expériences in vitro ont montré que, dans des conditions HG/PA, le rapport p-AMPKα1/AMPKα1 était diminué dans les cellules H9c2, alors que le traitement par Lac-Phe augmentait ce rapport (Figure 5F,G). Ces résultats indiquent que le Lac-Phe augmente la phosphorylation d'AMPKα1 dans les cœurs de souris DCM et dans les cellules H9c2 traitées par HG/PA.

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Figure 5. Le Lac-Phe augmente la phosphorylation de AMPKα1 dans les cœurs de souris atteintes de cardiomyopathie diabétique et dans les cellules H9c2. (A) Diagramme de Venn montrant la superposition entre les résultats d'enrichissement des voies pour les comparaisons DCM/Témoin et DCM + Lac-Phe/DCM. (B) Schéma illustrant la phosphorylation de AMPK et de HMGCR et l'inhibition associée de la synthèse du cholestérol. (C) Interaction prévue de docking moléculaire en trois dimensions entre le Lac-Phe et AMPKα1 ; affinité de liaison = −7,6 kcal/mol. (D,E) Images représentatives de transferts immuno (western blot) de p-AMPKα1 et de AMPKα1 dans les tissus cardiaques des groupes indiqués (D) et quantification du rapport p-AMPKα1/AMPKα1 (E) ; n = 3 par groupe. (F,G) Images représentatives de transferts immuno de p-AMPKα1 et de AMPKα1 dans les cellules H9c2 des groupes indiqués (F) et quantification du rapport p-AMPKα1/AMPKα1 (G) ; n = 3 par groupe. La protéine GAPDH a été utilisée comme témoin de chargement. Les données sont exprimées comme moyenne ± écart-type. *P < 0,05, **P < 0,01. Veuillez cliquer ici pour visualiser une version agrandie de cette figure.

L'inhibition de l'AMPK atténue la phosphorylation de HMGCR induite par le Lac-Phe et l'amélioration du métabolisme lipidique dans les cellules H9c2

Nous avons ensuite ajouté un inhibiteur de la p-AMPK à des cellules H9c2 traitées par Lac-Phe. L'inhibiteur de la p-AMPK a diminué le ratio p-AMPKα1/AMPKα1 (Figure 6A,B) et réduit le ratio p-HMGCR/HMGCR (Figure 6C,D). Ces résultats indiquent qu'une inhibition de la phosphorylation de l'AMPK s'accompagne d'une réduction de la phosphorylation de l'HMGCR durant le traitement par Lac-Phe. L'inhibiteur de la p-AMPK a également atténué l'effet du Lac-Phe sur le métabolisme lipidique. La coloration par LD540 et la quantification de la fluorescence ont montré une accumulation accrue de lipides dans les cellules H9c2 traitées avec l'inhibiteur de la p-AMPK, comparé aux cellules traitées au Lac-Phe sans inhibition de l'AMPK (Figure 6E,F). Les niveaux de TC dans les cellules H9c2 ont également augmenté suite à l'inhibition de l'AMPK (Figure 6G). L'ensemble de ces résultats confirme l'implication de la voie de signalisation AMPKα1/HMGCR dans les effets du Lac-Phe sur le métabolisme lipidique. Le Lac-Phe a augmenté la phosphorylation de l'AMPKα1, ce qui a été associé à une augmentation de la phosphorylation de l'HMGCR ainsi qu'à une réduction de l'accumulation lipidique et des niveaux de TC. L'inhibition de l'AMPK a atténué ces effets dans les cellules H9c2, ce qui soutient l'hypothèse selon laquelle le Lac-Phe améliore le métabolisme lipidique par la régulation de la voie AMPKα1/HMGCR.

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Figure 6. L'inhibition de l'AMPK atténue les effets du Lac-Phe sur la phosphorylation de l'HMGCR et l'accumulation lipidique dans les cellules H9c2. (A,B) Images représentatives de western blot de p-AMPKα1 et AMPKα1 dans les cellules H9c2 traitées avec HG/PA, le Lac-Phe et/ou l'AMPK-IN-3 comme indiqué (A) et quantification du rapport p-AMPKα1/AMPKα1 (B) ; n = 3 par groupe. (C,D) Images représentatives de western blot de p-HMGCR et HMGCR dans les cellules H9c2 provenant des groupes de traitement indiqués (C) et quantification du rapport p-HMGCR/HMGCR (D) ; n = 3 par groupe. La GAPDH et la β-tubuline ont été utilisées comme contrôles de chargement dans (A) et (C), respectivement. (E,F) Coloration représentative au LD540 des cellules H9c2 provenant des groupes de traitement indiqués (E) et quantification de l'intensité moyenne de fluorescence au LD540 (F) ; n = 3 par groupe. Échelle = 200 μm. (G) Niveaux de cholestérol total (TC) dans les cellules H9c2 provenant des groupes de traitement indiqués ; n = 3 par groupe. Les données sont exprimées en moyenne ± écart-type. *P < 0,05, **P < 0,01, ***P < 0,001. Veuillez cliquer ici pour consulter une version agrandie de cette figure.

Dans leur ensemble, les résultats des expériences in vivo et in vitro appuient un mécanisme proposé selon lequel le Lac-Phe augmente la phosphorylation de AMPKα1 et de HMGCR, ce qui est associé à une réduction des taux de cholestérol et de l'accumulation lipidique, ainsi qu'à une amélioration de la fonction cardiaque et du remodelage pathologique dans la DCM. Le voie proposé AMPKα1/HMGCR sous-jacent aux effets du Lac-Phe est résumé schématiquement dans la Figure 7.

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Figure 7. Mécanisme proposé par lequel le Lac-Phe améliore le métabolisme lipidique dans la cardiomyopathie diabétique via la voie AMPK/HMGCR. Schéma illustrant le mécanisme proposé selon lequel le Lac-Phe favorise la phosphorylation de l'AMPKα1, suivie de la phosphorylation de l'HMGCR, ce qui est associé à une réduction de l'accumulation de gouttelettes lipidiques et de la lipotoxicité dans la cardiomyopathie diabétique. AMPK, protéine kinase activée par l'AMP ; HMGCR, hydroxy-3-méthylglutaryl-CoA réductase ; LD, gouttelette lipidique. Veuillez cliquer ici pour visualiser une version agrandie de cette figure.

Disponibilité des données :

Les données brutes soutenant les résultats de cette étude ont été déposées dans Zenodo et sont accessibles publiquement à l'adresse https://zenodo.org/records/21991371 

Discussion

Dans cette étude, nous fournissons des preuves soutenant un effet thérapeutique du Lac-Phe sur la MCD. Le Lac-Phe a amélioré le remodelage cardiaque et la dysfonction cardiaque dans la MCD tout en réduisant la production de cholestérol dans les cardiomyocytes et en corrigeant le déséquilibre du métabolisme lipidique. Sur le plan mécanistique, le Lac-Phe a augmenté la phosphorylation de l'AMPKα1. Par la suite, l'augmentation de la phosphorylation de l'AMPKα1 a été associée à une augmentation de la phosphorylation et à l'inhibition de sa cible en aval HMGCR, conduisant à une réduction de la synthèse du cholestérol et, en fin de compte, à une amélioration du déséquilibre du métabolisme lipidique dans les cardiomyocytes. En résumé, cette étude démontre que le Lac-Phe améliore le métabolisme lipidique cardiaque dans la MCD par l'intermédiaire de la voie de signalisation AMPK/HMGCR. Un résumé schématique des principaux résultats et du mécanisme proposé est présenté dans la Figure 7.

Un déséquilibre du métabolisme lipidique est l'un des facteurs clés contribuant à la lésion myocardique dans la MCD15. L'accumulation excessive de lipides dans les cardiomyocytes entraîne une lipotoxicité, provoquant une dysfonction des cardiomyocytes et un remodelage cardiaque pathologique16. Une hyperglycémie prolongée et l'obésité sont des facteurs importants menant à des troubles du métabolisme lipidique25. On a montré que le Lac-Phe est une substance endogène capable de réduire efficacement l'ingestion alimentaire, de diminuer l'obésité et le poids corporel, et d'améliorer l'homéostasie glucidique21. Des études récentes ont également montré que le Lac-Phe peut réguler le métabolisme lipidique dans les microglies/macrophages lors d'une lésion de la moelle épinière23, démontrant ainsi que le Lac-Phe peut moduler le métabolisme lipidique dans un autre modèle de maladie. En tant que métabolite endogène, le rôle du Lac-Phe dans les maladies métaboliques suscite un intérêt considérable. Cependant, le rôle du Lac-Phe dans la MCD n'a pas encore été pleinement étudié. Notre étude a mis en évidence un rôle du Lac-Phe dans le métabolisme lipidique des cardiomyocytes dans la MCD. Grâce à une analyse transcriptomique, nous avons observé que le traitement par le Lac-Phe était associé à des modifications des voies liées au métabolisme lipidique dans le cœur de souris atteintes de MCD. La coloration par le rouge oléine et les observations en microscopie électronique à transmission ont confirmé une réduction de l'accumulation lipidique dans le cœur des souris MCD traitées au Lac-Phe. Ces résultats suggèrent que le Lac-Phe exerce des effets cardioprotecteurs dans la MCD en réduisant l'accumulation lipidique cardiaque et en atténuant le remodelage pathologique. Des expériences in vitro ont également démontré que l'administration de Lac-Phe atténuait l'accumulation lipidique dans les cellules H9c2 exposées à des conditions HG/PA.

HMGCR est une enzyme limitante dépendante du NADPH dans la voie du mévalonate30. HMGCR catalyse la conversion de l'HMG-CoA en mévalonate, une étape critique de la biosynthèse du cholestérol30,31,32. HMGCR constitue une cible thérapeutique pertinente pour les maladies cardiovasculaires et la cardiomyopathie diabétique (DCM)33. Cliniquement, l'inhibition d'HMGCR est une approche établie pour réduire le risque cardiovasculaire34. Nos données expérimentales montrent que le Lac-Phe augmente la phosphorylation d'HMGCR dans le cœur de souris diabétiques de type 2, ce qui est compatible avec une inhibition de l'activité d'HMGCR et une réduction de la synthèse du cholestérol. Des études in vitro ont en outre montré que l'administration de Lac-Phe augmentait la phosphorylation d'HMGCR dans des cellules H9c2 exposées à des conditions de glucose élevé/acide palmitique (HG/PA), accompagnée d'une diminution des niveaux de cholestérol. Le traitement combiné par Lac-Phe et le médicament hypocholestérolémiant atorvastatine a également produit des effets plus marqués que l'atorvastatine seule dans les conditions expérimentales étudiées. Dans les cellules H9c2 traitées par atorvastatine, l'ajout de Lac-Phe a accru la phosphorylation d'HMGCR et réduit l'accumulation lipidique. Ces résultats soutiennent la faisabilité d'une stratégie ciblant la phosphorylation d'HMGCR via le Lac-Phe afin de réduire la production de cholestérol et de rétablir l'équilibre du métabolisme lipidique dans la DCM. Toutefois, il reste à déterminer si le Lac-Phe pourrait constituer une stratégie thérapeutique sûre et efficace pour les patients atteints de DCM.

AMPK, une enzyme clé du métabolisme énergétique mitochondrial, joue un rôle central dans l'étude des maladies métaboliques telles que le diabète35,36. Grâce à la régulation des processus de phosphorylation et de déphosphorylation, l'AMPK exerce une fonction essentielle dans le métabolisme cardiaque des lipides. L'AMPK phosphorylée correspond à sa forme active37. L'AMPK phosphorylée (p-AMPK) favorise l'entrée des acides gras dans les mitochondries pour l'oxydation des acides gras (FAO) en régulant la CPT-138. Conformément à des études antérieures39, nos résultats montrent qu'une augmentation de la phosphorylation de l'AMPK est associée à une augmentation de la phosphorylation de l'HMGCR et à une réduction de la synthèse du cholestérol. Chez les souris présentant une cardiomyopathie diabétique (DCM) induite par la streptozotocine (STZ) et un régime riche en graisses (HFD), une hyperglycémie persistante peut entraîner des modifications des niveaux cardiaques de p-AMPK40. Au stade initial du diabète, lorsque la fonction cardiaque n'est pas encore altérée, les niveaux cardiaques de p-AMPK peuvent rester inchangés10,37,41. Dans le diabète avancé, après une hyperglycémie persistante de plus de 8 semaines, le remodelage cardiaque pathologique commence et les niveaux de p-AMPK peuvent diminuer10. Le maintien de l'activation de l'AMPK a été proposé comme une stratégie efficace pour prévenir la DCM10,42. La métformine, un médicament largement utilisé pour traiter le diabète de type 2, a montré qu'elle active la voie de l'AMPK, mais elle a été décrite comme ayant un effet neutre sur le cœur43,44. Fait intéressant, une administration aiguë ou chronique de métformine peut augmenter les niveaux de Lac-Phe22. Ces observations suggèrent que le Lac-Phe pourrait contribuer aux signaux métaboliques associés à l'activation de l'AMPK ; toutefois, la présente étude n'établit pas que le Lac-Phe exogène produit un effet plus spécifique ou plus sûr que la métformine.

Dans notre étude, la phosphorylation de l'AMPKα1 a été nettement réduite dans le modèle de CMD à un stade avancé, comme illustré aux figures 5D et 5E, un résultat conforme à des recherches antérieures42. Une analyse transcriptomique a révélé des modifications impliquant la voie de l'AMPK dans les cœurs de souris diabétiques de type 2 traitées par le Lac-Phe, et une analyse par immunoblotting a montré une augmentation de la phosphorylation de l'AMPKα1 après le traitement au Lac-Phe. Un docking moléculaire a suggéré une interaction potentielle entre le Lac-Phe et l'AMPKα1, ce qui est en accord avec une étude récente23. Il est important de noter que le docking moléculaire seul ne permet pas d'établir une liaison intracellulaire directe entre le Lac-Phe et l'AMPKα1. Des expériences in vitro ont montré que le traitement avec un inhibiteur de l'AMPK supprimait la phosphorylation de l'AMPKα1 et était associé à une diminution de la phosphorylation de l'HMGCR. Après l'ajout de l'inhibiteur de l'AMPK, les effets du Lac-Phe ont été atténués, coïncidant avec une accumulation accrue de lipides et une teneur élevée en cholestérol dans les cellules H9c2. Dans leur ensemble, ces résultats soutiennent l'implication de la signalisation AMPKα1/HMGCR dans les effets du Lac-Phe sur le métabolisme lipidique. Le Lac-Phe a augmenté la phosphorylation de l'AMPKα1, ce qui a été associé à une augmentation de la phosphorylation de l'HMGCR, à une réduction des niveaux de cholestérol et à une diminution de l'accumulation lipidique ; l'inhibition de l'AMPK a atténué ces effets.

Cette étude présente plusieurs limites. Premièrement, toutes les expériences animales ont été réalisées sur des souris mâles. Bien que nous ayons démontré l'effet thérapeutique du Lac-Phe sur la MCD chez des souris C57BL/6J mâles, le sexe est un facteur important influençant les maladies cardiovasculaires45. Par conséquent, il reste inconnu si le Lac-Phe exerce les mêmes effets chez les souris femelles. Deuxièmement, le séquençage du transcriptome a été effectué sur des échantillons de cœur entier, ce qui aurait pu masquer des modifications spécifiques à certains types cellulaires cardiaques après le traitement au Lac-Phe. Le séquençage au niveau monocellulaire pourrait offrir une meilleure compréhension de l'hétérogénéité cellulaire et moléculaire sous-jacente aux effets observés46,47 et constitue une approche alternative pour approfondir cette hypothèse. Enfin, en raison des limitations liées à l'équipement échographique utilisé dans cette étude, nous n'avons pas pu évaluer la fonction diastolique cardiaque chez la souris. Des études supplémentaires sont donc nécessaires afin de préciser les effets thérapeutiques du Lac-Phe sur la MCD, d'évaluer d'éventuelles différences liées au sexe, d'analyser les réponses spécifiques selon les types cellulaires, d'apprécier la fonction diastolique et de mieux élucider les mécanismes sous-jacents aux effets observés. En résumé, cette étude fournit des éléments soutenant le Lac-Phe comme un métabolite endogène potentiellement intéressant pour le traitement de la MCD. De plus, nos résultats appuient un mécanisme proposé selon lequel le Lac-Phe réduit l'accumulation lipidique dans les cardiomyocytes durant la MCD via la voie AMPKα1/HMGCR. Plus précisément, le Lac-Phe augmente la phosphorylation de l'AMPKα1, associée à une augmentation de la phosphorylation de l'HMGCR, à une réduction de la synthèse du cholestérol et de l'accumulation lipidique, ainsi qu'à une amélioration du remodelage pathologique. Des recherches supplémentaires sont nécessaires pour établir l'interaction moléculaire entre le Lac-Phe et l'AMPKα1 et pour déterminer les applications translationnelles potentielles de ces résultats.

Déclarations de divulgation

Conflit d'intérêts :

Les auteurs n'ont rien à divulguer.

Remerciements

Nous tenons à exprimer notre profonde gratitude aux chercheurs et au personnel du Collège clinique de l'hôpital Nanjing Drum Tower et de l'hôpital affilié de la faculté de médecine de l'Université de Nanjing pour leur soutien technique. Cette recherche a été financée par des subventions de la Fondation nationale des sciences naturelles de Chine (n° de subvention 81870291 et 82300384), de la Fondation chinoise des sciences postdoctorales (n° de subvention 2023M731625) et de la Fondation des sciences naturelles de la province du Jiangsu (n° de subvention BK20220175). Nous remercions également l'Institut d'innovation en synthèse avancée de l'Université Nanjing Tech pour les ressources et le soutien collaboratif fournis.

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
AMPK-IN-3 (inhibiteur de p-AMPK)MedChemExpress (MCE)HY-132921Utilisé à 10 μM au cours d'expériences d'inhibition de l'AMPK afin d'inhiber la signalisation de l'AMPK dans les cellules traitées par le Lac-Phe.
Kit d'analyse du cholestérol et des esters de cholestérol Amplex RedBeyotimeS0211SUtilisé pour déterminer les taux de cholestérol total dans des échantillons de sérum et de cellules H9c2.
Anti-AMPKα1Cell Signaling Technology2532 ; RRID : AB_330331Anticorps primaire utilisé pour l'analyse par immunotransfert de la protéine kinase activée par l'AMPα1.
Anti-GAPDHCell Signaling Technology5174 ; RRID : AB_10622025Anticorps primaire utilisé pour l'analyse par immunotransfert de GAPDH.
Anti-HMGCRAbcamab174830 ; RRID : AB_2749818Anticorps primaire utilisé pour l'analyse par immunotransfert de HMGCR.
Anti-p-AMPKα1 (Thr172)Cell Signaling Technology2535 ; RRID : AB_331250Anticorps primaire utilisé pour l'analyse par immunotransfert de l'AMPK phosphoryléeα1.
Anti-p-HMGCR (Ser872)Abcamab124350Anticorps primaire utilisé pour l'analyse par immunotransfert de HMGCR phosphorylée.
anticorps anti-IgG de lapin marqué à la HRPCell Signaling Technology7074 ; RRID : AB_2099233Utilisé à une dilution de 1:5 000 pour la détection par immunoblotting.
Anti-β-tubulineCell Signaling Technology2128 ; RRID : AB_823664Anticorps primaire utilisé pour l'analyse par immunotransfert de β-tubuline
AtorvastatineMedChemExpress (MCE)HY-17379Utilisé seul ou en combinaison avec Lac-Phe pour évaluer les effets sur l'accumulation lipidique, les taux de cholestérol total et la phosphorylation de HMGCR dans les cellules H9c2 traitées au HG/PA.
albumine sérique bovineSigma-AldrichA7906Utilisé à 5 % pour bloquer la liaison non spécifique lors de l'analyse par immunotransfert.
Réactif ou kit de dosage de BradfordThermo Fisher Scientific23200Utilisé pour déterminer la concentration en protéines avant l'analyse par immunotransfert.
Souris C57BL/6J (mâles, âgées de 5 semaines)Centre de recherche sur les animaux modèles de l'Université de NanjingN/AUtilisé pour établir le modèle murin de cardiomyopathie diabétique induite par un régime riche en graisses (HFD) et la streptozotocine (STZ).
Kit de comptage cellulaire-8 (CCK-8)SharebioSB-CCK8SUtilisé pour mesurer la viabilité des cellules H9c2 après traitement.
Tampon citratePréparé en interneN/APréparé à pH 4,5 et utilisé pour dissoudre la streptozotocine (STZ) ainsi que comme témoin véhicule correspondant.
Régime témoin (10 % de lipides, 20 % de protéines, 70 % de glucides)Research Diets, Inc.D12450JUtilisé comme aliment pour les souris du groupe témoin.
D-(+)-GlucoseSigma-AldrichN/AUtilisé pour le traitement des cellules HG/PA et pour le test de tolérance orale au glucose.
Diméthylsulfoxyde (DMSO)Sigma-AldrichD2650Utilisé comme solvant pour l'AMPK-IN-3 et comme contrôle véhicule correspondant.
Dulbecco’s modifié de Eagle’milieu sGibco, Thermo Fisher Scientific11965092Utilisé comme milieu de culture de base pour les cellules H9c2.
Appareil d'échocardiographie équipé d'un transducteur de 40 MHzFUJIFILM VisualSonicsVevo 3100 LT ; transducteur de 40 MHzUtilisé pour mesurer les dimensions du ventricule gauche et la vélocité du flux sanguin au niveau de la valve mitrale, et pour déduire la fraction d'éjection du ventricule gauche (LVEF) et la fraction de raccourcissement (FS).
Fixateur pour microscope électroniqueServiceBioG1102Utilisé pour fixer un tissu cardiaque de souris frais en vue d'une microscopie électronique en transmission.
ÉthanolSigma-AldrichE7023Utilisé à des concentrations progressivement croissantes pour la déshydratation lors de la préparation d'échantillons en microscopie électronique en transmission.
sérum de veau fœtalGibco, Thermo Fisher Scientific10099141Utilisé à 10 % pour compléter le milieu de culture des cellules H9c2.
Ligne cellulaire H9c2SunncellRRID : CVCL_0286Utilisé comme modèle cellulaire cardiaque in vitro pour les expériences de traitement avec HG/PA et Lac-Phe.
Coloration à l'hématoxyline et à l'éosineServiceBioG1005-1/2Utilisé pour l'évaluation histologique du tissu cardiaque.
Régime riche en lipides (60 % des kcal sous forme de lipides)Research Diets, Inc.D12492Utilisé avec une faible dose de STZ pour établir le modèle murin de cardiomyopathie diabétique.
Microscope en champ clair haute résolutionLeicaDM2500Utilisé pour l'imagerie complète de coupes de tissu cardiaque coloré à un grossissement de 20× grossissement
ImageJInstituts nationaux de la santéN/AUtilisé pour la quantification densitométrique des résultats de western blot.
IsofluraneSigma-Aldrich792632Utilisé pour l'anesthésie lors de l'échocardiographie chez la souris.
Alcool isopropyliqueSigma-AldrichI9516Utilisé à 60 % lors de la coloration par le rouge O sudan des coupes cardiaques congelées.
Coloration lipidique LD540BeyotimeC2050S-1Utilisé à 10 μM pour colorer les lipides intracellulaires.
Masson’coloration trichromeServiceBioG1006Utilisé pour la coloration histologique du tissu cardiaque.
N-lactoyl-phénylalanine (Lac-Phe)MedChemExpress (MCE)HY-146098Administré à des souris DCM et utilisé pour traiter des cellules H9c2 exposées au HG/PA.
Solution de travail au Oil Red OServiceBioG1015-100MLUtilisé pour colorer les lipides dans des coupes de tissu cardiaque congelé.
Kit Omni-ECL de chimiluminescence efficaceEpiZymeSQ203LUtilisé pour la visualisation chimiluminescente des bandes protéiques après transfert western.
Acide palmitiqueSigma-AldrichP0500Utilisé à 0,25 mM avec du glucose élevé pour établir le modèle de cellules H9c2 traitées au HG/PA.
ParaformaldéhydeSigma-AldrichP6148Préparé sous forme de solution à 4 % et utilisé pour fixer les tissus et cellules cardiaques avant une coloration histologique ou lipidique.
Pénicilline-streptomycineGibco, Thermo Fisher Scientific15140122Utilisé à 1 % dans le milieu de culture des cellules H9c2.
Solution saline tamponnée au phosphate (PBS)Gibco, Thermo Fisher Scientific10010023Utilisé pour les lavages au cours des procédures de coloration et comme véhicule correspondant dans les expériences de traitement des cellules.
PrismGraphPad SoftwareVersion 8.0Utilisé pour l'analyse statistique des données expérimentales.
membrane de transfert en PVDF, 0.45 μmThermo Fisher Scientific88518Utilisé pour le transfert électrophorétique des protéines lors de l'analyse par immunotransfert.
RNeasy Mini KitQIAGEN74104Utilisé pour l'isolement/la purification d'ARN total à partir de tissu cardiaque de souris.
Solution de chlorure de sodium à 0,9 % (sérum physiologique)Sigma-AldrichS8776Utilisé pour dissoudre le Lac-Phe et comme contrôle véhicule pour les souris témoins et DCM.
SPSSIBMVersion 20.0Utilisé pour l'analyse statistique des données expérimentales.
Streptozotocine (STZ)Sigma-AldrichS0130Administré avec un régime riche en graisses (HFD) pour établir le modèle murin de cardiomyopathie diabétique.
Tampon TBS Tween-20 (20×)Thermo Fisher Scientific28360Utilisé pour laver les membranes après l'incubation avec les anticorps primaires et secondaires lors de l'analyse par immunotransfert (western blot).
Tissue-Tek O.C.T. CompoundSakura Finetek4583Utilisé pour inclure le tissu cardiaque avant la préparation de coupes congelées destinées à la coloration par le rouge Oil O.
Microscope électronique en transmissionHITACHIHT7800Utilisé pour examiner les modifications ultrastructurales du tissu cardiaque de souris.
TRIzol RéactifInvitrogen15596026Utilisé pour l'isolement d'ARN total à partir de tissu cardiaque de souris.
Kit de préparation de bibliothèque pour RNA-séq VAHTS Universal V10VazymeNR616-01Utilisé pour préparer les bibliothèques d'ARN-séq destinées à l'analyse transcriptomique.
Lectine de germe de blé (WGA)ServiceBioW7024Utilisé pour l'évaluation histologique du tissu cardiaque.

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