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Mesure de la réparation des cassures double brin de l'ADN à l'aide du test DR-white chez Drosophila melanogaster

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DOI :

10.3791/72635

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14 août 2026

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1Department of Human Science, Georgetown University

Dans cet article

Résumé

Le test DR-white est un test rapporteur génétique polyvalent permettant de détecter les résultats de la réparation des cassures double brin de l'ADN chez l'organisme pluricellulaire Drosophila melanogaster.

Résumé

Les études traditionnelles sur la réparation des cassures double brin (CDB) de l'ADN sont fréquemment limitées à des investigations biochimiques ou à des systèmes unicellulaires (p. ex. cellules, levures). Afin de faciliter l'étude de la réparation des CDB dans un organisme pluricellulaire, nous utilisons le test DR-white chez Drosophila melanogaster. Le test DR-white est un essai rapporteur simple mais polyvalent de réparation des CDB, qui porte une unique séquence de reconnaissance I-SceI, pouvant être coupée par l'expression de la méganucléase I-SceI. L'expression de I-SceI peut être induite de manière constitutive, par choc thermique, ou sous d'autres promoteurs, permettant ainsi d'étudier la réparation spécifique à certains tissus ou stades de développement. Un avantage majeur de cet essai est sa capacité à distinguer les résultats de réparation impliquant la recombinaison homologue (RH), la jonction non homologue d'extrémités (NHEJ) et l'appariement de brins simples (SSA). Cet article fournit un protocole détaillé pour le test établi DR-white, incluant un déroulement étape par étape pour induire des CDB dans la lignée germinale pré-méiotique et analyser phénotypiquement les événements de réparation en comptant la descendance. Il décrit également l'analyse moléculaire des événements de réparation par réaction en chaîne par polymérase (PCR), séquençage, et le script R Tracking of Indels by DEcomposition (TIDE). Ce protocole constitue un outil utile pour étudier les mécanismes génétiques et moléculaires de la réparation de l'ADN dans un modèle organisme.

Introduction

L'intégrité du génome est fréquemment compromise par des lésions de l'ADN, parmi lesquelles les cassures double brin (CDB) sont particulièrement toxiques. Si elles ne sont pas réparées, ces cassures peuvent entraîner une perte génétique, des réarrangements chromosomiques et la mort cellulaire.1. Les cellules ont donc développé plusieurs voies de réparation des cassures double brin (DSB). La jonction non homologue des extrémités (NHEJ) ligature directement les deux extrémités de la DSB, pouvant introduire des indels au niveau du site de cassure ; brin simple l'association des extrémités simples (SSA) exploite des séquences complémentaires situées de part et d'autre du site de cassure pour effectuer la réparation, entraînant des délétions au niveau du site de cassure ; tandis que la recombinaison homologue (HR) utilise une séquence homologue comme matrice pour la réparation2,3.

Historiquement, les études sur la réparation des cassures double brin (DSB) se sont limitées à des dosages biochimiques4 ou à des systèmes unicellulaires, tels que les bactéries5,6, les levures7,8 et les cultures de cellules de mammifères9,10. Bien que ces modèles aient été essentiels pour identifier les protéines fondamentales de la réparation ainsi que leurs mécanismes, ils manquent de la complexité biologique d’un organisme pluricellulaire. Drosophila melanogaster est devenu un modèle pluricellulaire populaire pour l’étude de la réparation de l’ADN. Toutefois, de nombreux dosages actuels sont adaptés à des voies de réparation spécifiques11 ; utilisent de grandes aberrations chromosomiques, comme l’excision des éléments P12 ; ou nécessitent des analyses moléculaires longues13. Le test DR-white répond à ces difficultés en fournissant un indicateur génétique simple de la réparation de l’ADN chez Drosophila14. Cette étude présente un protocole complet, pratique et détaillé, étape par étape, pour réaliser des dosages génétiques et moléculaires permettant de mesurer la réparation des DSB de l’ADN à l’aide du test bien établi DR-white.

Le test utilise deux répétitions directes du gène Drosophila white (w), qui confère la couleur rouge sauvage de l'œil (Figure 1). Les deux copies sont non fonctionnelles : la première, Sce.white, contient une insertion portant la séquence de reconnaissance de la méganucléase I-SceI au niveau d'un site SacI sauvage et introduit un codon d'arrêt prématuré ; la seconde, iwhite, est tronquée aux deux extrémités 5’ et 3’ et sert de matrice pour la réparation par recombinaison homologue. Un transgène Drosophila yellow (y+), qui confère la couleur brune sauvage du corps, est présent entre les deux répétitions de white. Puisque la cassette DR-white est intégrée dans un fond génétique mutant y w, les mouches DR-white présentent un phénotype sauvage pour la couleur brune du corps et mutante pour la couleur blanche des yeux.

Les cassures double brin (DSB) peuvent être induites au niveau de Sce.white en croisant des mouches DR-white avec des mouches portant un transgène I-SceI. La réparation des DSB dans la lignée germinale pré-méiotique peut être mesurée en analysant la descendance issue d'un croisement témoin. La réparation par NHEJ conduit au phénotype parental corps brun et yeux blancs (Figure 1A), tandis que la réparation par HR restaure la séquence sauvage de white et donne des descendants corps brun et yeux rouges (Figure 1B). La réparation par SSA de la DSB ou un crossing-over mitotique entraîne la perte du transgène yellow intermédiaire, produisant des mouches corps jaune et yeux blancs (Figure 1C). Pour analyser les résultats de réparation dans les cellules somatiques, nous avons adapté l'algorithme Tracking Indels by DEcomposition (TIDE) afin de détecter spécifiquement la réparation NHEJ avec traitement et la réparation HR dans le test DR-white15,16.

Le test DR-white présente plusieurs avantages par rapport aux tests de réparation de l'ADN précédemment établis chez Drosophila. Comme les cassures sont générées et réparées dans la lignée germinale, les résultats de la réparation peuvent être facilement détectés par analyse phénotypique. En même temps, ce test est extrêmement polyvalent. Bien qu'il soit principalement conçu pour mesurer la réparation par recombinaison homologue (HR), il peut détecter les trois voies de réparation. Nous avons également mis au point deux autres modèles de réparation fonctionnels (Figure 2). Le modèle iwhite.mu contient 28 polymorphismes nucléotidiques simples (SNP) silencieux et produit également une descendance aux yeux rouges (Figure 2A), facilitant ainsi l'étude des longueurs des tracts de conversion génique (GCT) et de la réparation HR entre des séquences divergentes14. Le modèle iwhiteΔ9 comporte une délétion de neuf paires de bases au niveau du site SacI de type sauvage et donne des descendants aux yeux orangés (Figure 2B). Cette particularité permet aux chercheurs de suivre la réparation HR à partir de modèles distincts, une caractéristique propre au test DR-white15.

Protocole

1. Test DR-white

  1. Croisements génétiques (Figure 3A)
    NOTE : Pour les protocoles standards de culture et de génétique chez Drosophila, se référer à "Fly pushing: The theory and practice of Drosophila genetics" par Ralph J. Greenspan17. Les informations sur les génotypes des souches sont fournies dans le Tableau des Matériaux.
    1. Élever les mouches à 25 °C avec des cycles lumière/obscurité de 12 h sur un milieu standard pour Drosophila, saupoudré de levure active.
    2. Préparer cinq flacons de choc thermique en croisant 8 à 10 femelles vierges DR-white avec 3 à 5 mâles porteurs d’un transgène I-SceI (Croisement 1, Figure 3A) par flacon.
      NOTE : Différents transgènes I-SceI peuvent être utilisés selon l’application. Dans ce protocole, le transgène hsp70-I-SceI a été utilisé pour l’induction par choc thermique11. Afin d’éviter une expression fuiteuse de I-SceI chez les générations précédentes, il est important de combiner les transgènes DR-white et I-SceI dans la même mouche uniquement à cette génération.
    3. Le même jour, préparer des bouteilles d’expansion d’une souche y w. Ces mouches serviront de témoins. Trois bouteilles d’expansion suffisent pour environ 60 à 80 croisements témoins.
    4. Incuber les flacons de choc thermique et les bouteilles d’expansion y w à 25 °C pendant 3 jours.
    5. Le troisième jour, transférer les flacons de choc thermique et les bouteilles d’expansion y w sur un milieu frais afin de constituer un jeu de secours.
  2. Choc thermique/induction des cassures double brin (DSB)
    NOTE : Si vous n’utilisez pas un transgène I-SceI inductible par choc thermique, passez à l’étape 1.2.5, généralement réalisée 3 jours après l’étape 1.1.5.
    1. Faire vieillir les flacons de choc thermique pendant 3 h à 25 °C afin de s’assurer que tous les descendants ont franchi la transition mère-zygote.
    2. Placer les flacons d’origine dans un bain-marie à 38 °C pendant 1 h. Veiller à ce que le niveau d’eau soit au moins égal à la base du tampon de coton afin que les larves ne puissent pas grimper au-dessus du niveau de l’eau.
    3. Surveiller la température du bain-marie toutes les 15 minutes et la maintenir à 38 ± 0,5 °C, car les résultats d’induction et de réparation dépendent de la durée et de la température du choc thermique.
    4. Replacer les flacons à 25 °C.
    5. Le jour suivant, ajouter un tiers d’un essuie-tout plié dans le milieu pour absorber l’excès d’humidité. Si le milieu est sec, ajouter environ 100 µL d’eau sur l’essuie-tout. Ajouter un tampon de coton dans les bouteilles d’expansion y w.
    6. Incuber les flacons ayant subi le choc thermique pendant 6 jours supplémentaires à 25 °C, ou jusqu’à l’émergence des mouches.
    7. Vider les flacons de secours et les bouteilles d’expansion 3 jours après le transfert. Ajouter un tampon de coton aux bouteilles d’expansion y w de secours environ 4 jours après leur vidage.
      NOTE : Si nécessaire, les flacons de secours peuvent subir un choc thermique selon les étapes 1.2.1 à 1.2.6 et être traités comme décrit ci-dessous.
  3. Croisements témoins
    1. Récupérer les mouches ayant subi le choc thermique et portant les transgènes DR-white et I-SceI pendant 4 à 5 jours après le début de l’émergence afin de réduire les biais liés au stade de développement.
      NOTE : Les mouches ayant correctement subi le choc thermique et portant les transgènes DR-white et I-SceI présentent des yeux en mosaïque dus à des événements de réparation embryonnaires et larvaires ayant donné naissance à des tissus adultes. L’étendue de la mosaïque ne corrèle pas toujours avec les événements de réparation germinale et ne doit donc pas être un critère déterminant lors du choix des mouches expérimentales pour les croisements témoins (étape 1.3.3).
    2. Récupérer des femelles vierges y w pendant 5 jours. Prélever 5 femelles vierges par nombre attendu d’échantillons. Les prélever dans les bouteilles d’expansion de secours dès qu’elles commencent à émerger.
    3. Préparer les flacons témoins en croisant un mâle ayant subi le choc thermique avec 4 à 5 femelles vierges y w (Croisement 2 ; Figure 3A). Choisir les mâles aléatoirement parmi l’ensemble collecté à l’étape 1.3.1 afin de réduire les biais liés au stade de développement. Incuber les croisements témoins à 25 °C.
      NOTE : Pour éviter les événements de crossing-over entre DR-white et I-SceI, on analyse généralement les lignées germinales mâles ; toutefois, les descendants femelles peuvent également être analysés. Si l’on analyse les descendants femelles, les flacons témoins du Croisement 2 sont préparés selon un ratio 2 femelles : 5 mâles y w et incubés pendant 5 à 6 jours (étape suivante) afin d’assurer une bonne productivité.
    4. Vérifier la productivité 4 jours après la mise en place des flacons témoins afin d’évaluer quand ils doivent être vidés.
      NOTE : S’assurer qu’un nombre suffisant d’œufs a été pondu pour garantir au moins 20 descendants analysables, mais éviter que les cultures ne deviennent trop denses, auquel cas les mouches risquent de rester collées au milieu.
    5. Lorsque les flacons témoins sont prêts (jusqu’à 4 à 5 jours après la mise en place des croisements témoins), éliminer les mouches et ajouter un tiers d’un essuie-tout plié dans le milieu pour absorber l’excès d’humidité.
      NOTE : Les mâles peuvent être collectés à ce stade si des analyses supplémentaires (par exemple, génotypage moléculaire) sont nécessaires.
    6. Incuber les flacons témoins pendant 5 à 6 jours supplémentaires à 25 °C.
  4. Analyse phénotypique
    NOTE : Environ 25 flacons témoins sont préparés pour chaque condition dans chaque expérience génétique (par exemple, mutants homozygotes et témoins hétérozygotes). Chaque expérience génétique est répétée 2 à 3 fois, et les données de chaque flacon sont regroupées.
    1. Analyser les descendants du Croisement 2 (Figure 3A) pendant environ 9 jours après l’émergence des premières mouches.
    2. Anesthésier les mouches à l’aide de CO2 ou en les transférant dans un flacon vide sans milieu et en les plaçant à -20 °C pendant au moins 30 min.
      NOTE : Si les mouches sont congelées, elles peuvent être analysées jusqu’à plusieurs jours plus tard.
    3. Placer les mouches sur un coussin à mouches et analyser les phénotypes appropriés (Figure 3A). N’inclure dans le jeu de données que les flacons contenant au moins 20 mouches analysées.
      1. Pour l’analyse, trier d’abord les mouches portant la cassette DR-white (en utilisant la fluorescence positive pour la protéine fluorescente rouge [RFP+] comme marqueur), puis analyser la couleur des yeux et du corps.
      2. Le transgène y+ lié à la cassette DR-white entraîne une couleur de corps brun intermédiaire, non complètement sauvage. Pour distinguer entre l’absence de DSB/RNHE (corps brun ; y+ w-) et la SSA (corps jaune ; y- w-), comparer les mouches aux descendants y w ne possédant pas le chromosome DR-white (RFP-). Les événements de SSA auront la même coloration jaune que ces mouches. Classer comme absence de DSB/RNHE les mouches plus foncées (plus brunes) que celles-ci.
        NOTE : Des écarts par rapport aux phénotypes décrits dans la Figure 3A  peuvent indiquer une contamination, et le flacon ne doit pas être analysé. Bien que des mouches mortes entières puissent être analysées, les mouches endommagées doivent être écartées si leurs phénotypes ne peuvent être déterminés.

2. Analyse TIDE (Figure 4)

  1. Extraction de l'ADN génomique (ADN-g)18
    1. Collecter les mouches (ou larves) ayant subi un choc thermique portant à la fois le transgène DR-white et I-SceI, comme chez les descendants du Croisement 1 (Figure 3A).
    2. Placer une mouche individuelle dans un tube microcentrifuge de 1,5 mL et la congeler rapidement (par exemple, dans un bain d'éthanol/glacière sèche ou dans de l'azote liquide).
      ATTENTION : manipuler la glace sèche, l'azote liquide, l'éthanol, l'isopropanol et d'autres produits chimiques en utilisant des équipements de protection individuelle appropriés et conformément aux procédures de sécurité institutionnelles.
      POINT D'ARRÊT :  Les échantillons peuvent être stockés à -80 °C et traités ultérieurement si nécessaire. Pour l'analyse de mouches ou de larves, utiliser une seule mouche ou larve par échantillon. Pour l'analyse de tissus plus petits (par exemple, cerveaux, disques imaginaux), regrouper les échantillons afin d'augmenter le rendement en ADN.
    3. Homogénéiser chaque échantillon dans 50 µL de tampon A (100 mM Tris-Cl, pH 7,5 ; 100 mM d'acide éthylènediaminotétraacétique [EDTA] ; 100 mM de chlorure de sodium ; 0,5 % de dodécylsulfate de sodium [SDS]) à l’aide d’un homogénéisateur électrique.
    4. Incuber les échantillons dans un bain-marie à 65 °C pendant 30 min.
    5. Ajouter 100 µL de tampon B (1,4 M d'acétate de potassium, 4,3 M de chlorure de lithium) à chaque échantillon et mélanger brièvement en retournant les tubes.
      REMARQUE : si des mouches entières sont utilisées, des volumes plus élevés peuvent être nécessaires pour homogénéiser complètement les échantillons. Dans ce cas, maintenir un rapport volumétrique de 1:2 entre le tampon A et le tampon B.
    6. Incuber les échantillons sur de la glace pendant au moins 30 min.
    7. Centrifuger les échantillons à environ 16 000 x g pendant 15 min à 4 °C.
    8. Transférer 125 µL du surnageant clarifié dans de nouveaux tubes microcentrifuge de 1,5 mL. Éviter tout précipité.
    9. Ajouter 100 µL d'isopropanol à 100 % à température ambiante par 125 µL de surnageant, puis mélanger brièvement en retournant les tubes.
    10. Centrifuger les échantillons à environ 16 000 x g pendant 10 min à température ambiante.
    11. Aspirer le surnageant en prenant soin de ne pas perturber le culot d'ADN.
      REMARQUE : le culot d'ADN peut ne pas être visible à ce stade. Noter l'orientation des tubes lors du chargement du microcentrifugegeur et aspirer sur la face opposée à celle où le culot est attendu.
    12. Laver les culots avec 250 µL d'éthanol glacé à 70 %, puis mélanger brièvement en retournant doucement les tubes.
    13. Centrifuger les échantillons à environ 16 000 x g pendant 5 min à 4 °C.
    14. Aspirer le surnageant en prenant soin de ne pas perturber le culot.
      REMARQUE : le culot peut être plus visible après le lavage à l'éthanol. Sinon, consulter la Remarque de l'étape 2.1.11.
    15. Laisser les tubes débouchés à température ambiante pour évaporer tout éthanol résiduel. Éviter de trop sécher le culot, car il pourrait ne pas se reconstituer complètement.
    16. Ajouter 20 µL d'eau sans nucléase et laisser les culots se reconstituer toute la nuit à 4 °C.
      POINT D'ARRÊT : si le culot d'ADN n'est pas complètement dissous, on peut ajouter davantage d'eau.
    17. Le jour suivant, retourner doucement les tubes et mesurer la concentration en ADN. Conserver les échantillons à -20 °C s'ils ne sont pas traités immédiatement.
      REMARQUE : pour une extraction à partir d'une seule mouche, les rendements sont typiquement d’environ 100 ng/µL. Des échantillons de haute qualité sont essentiels. Le rapport d'absorbance A260/A280 doit se situer entre 1,7 et 2,0. Des valeurs en dehors de cette plage suggèrent la présence de contaminants tels que des protéines. Le rapport A260/A230 doit être compris entre 2,0 et 2,2. Des valeurs en dehors de cette plage indiquent la présence de contaminants tels que l'éthanol ou des sels tampons. Des échantillons à faible rendement ou de mauvaise qualité peuvent entraîner une amplification PCR médiocre.
  2. Réaction en chaîne par polymérase (PCR)
    1. Amplifier la région Sce.white par PCR en utilisant 100 ng d'ADN-g et les amorces DR-white_8f (5’-GTGGATCAGGTGATCCAGG) et DR-white_8a (5’-CTTAAGCCATCGTCAGTTGC), selon les instructions du fabricant. Inclure un échantillon témoin de mouche DR-white (c’est-à-dire la souche parentale DR-white, sans transgène I-SceI). Utiliser les conditions de cyclage suivantes : 94 °C pendant 3 min ; {94 °C pendant 30 s ; descente progressive à 66 °C (-0,5 °C/cycle) pendant 30 s ; 72 °C pendant 30 s} x 16 cycles ; {94 °C pendant 30 s ; 58 °C pendant 30 s ; 72 °C pendant 30 s} x 20 cycles ; 72 °C pendant 5 min ; maintien à 12 °C.
      REMARQUE : si un réactif différent est utilisé, les conditions de cyclage peuvent nécessiter des ajustements.
    2. Électrophoréser environ 2 µL du produit de PCR sur un gel diagnostique d'agarose à 1 % dans du tampon tris-acétate-EDTA (TAE) afin de confirmer l'amplification de Sce.white. La taille attendue de l'amplicon est d’environ 1,7 kb.
    3. Purifier les amplicons Sce.white par PCR et mesurer la concentration en ADN.
    4. Séquencer le produit PCR purifié en utilisant l'amorce DR-white_9f (5’-GAGCCCACCTCCGGACTGGAC).
      REMARQUE : nous séquençons généralement 40 ng de produit PCR purifié, mais cela peut varier selon les instructions du service de séquençage.
  3. Analyse TIDE
    REMARQUE : la plupart des erreurs liées à l'utilisation du script R TIDE proviennent d'un formatage incorrect du code.
    1. Télécharger les packages R requis (c’est-à-dire sangerseqR et Biostrings) depuis Bioconductor.org. Utiliser la barre de recherche pour localiser la dernière version de chaque package.
    2. Analyser les chromatogrammes de séquence pour s'assurer qu'ils sont de bonne qualité. N'analyser que les chromatogrammes présentant peu ou pas de fond avant le site de cassure.
    3. Télécharger les fichiers de trace de séquence (avec l'extension .ab1) et placer tous les fichiers dans un même dossier informatique. Simplifier autant que possible les noms des fichiers de séquence (par exemple, F1, Het2, Hom3) afin de faciliter les modifications du script aux étapes suivantes.
    4. Ouvrir le script R TIDE (Supplemental File 1) dans l'environnement de développement intégré RStudio (IDE ; voir la Table of Materials). Dans le panneau Source, localiser la ligne commençant par Control <- (Supplemental File 2A) et entrer exactement le nom du fichier de séquence témoin tel qu'enregistré, y compris l'extension .ab1, entre guillemets.
      REMARQUE : la « séquence témoin » correspond à la séquence PCR obtenue à partir de la souche parentale DR-white sans transgène I-SceI ni induction.
    5. Localiser la ligne commençant par samplename <- c( et entrer chaque nom de fichier de séquence entre parenthèses (Supplemental File 2A). Inclure l'extension .ab1, placer chaque nom entre guillemets séparés, et séparer les noms par des virgules.
    6. Enregistrer le script R TIDE modifié dans le même dossier que les séquences à analyser. Conserver un nom de fichier simple pour éviter des erreurs aux étapes suivantes.
    7. Dans l'IDE, accéder au dossier TIDE en utilisant l'onglet Fichiers dans le panneau Sortie (Supplemental File 2B).
    8. Cliquer sur le menu déroulant More et sélectionner Open New Terminal Here (Supplemental File 2C). Un nouveau terminal s'ouvrira dans le panneau Console (en bas à gauche).
    9. Dans le terminal nouvellement ouvert, taper « R » puis appuyer sur Entrée (Supplemental File 2D).
    10. Une fois R lancé dans le terminal, exécuter le script R TIDE en tapant source("TIDE_analysis.R") puis appuyer sur Entrée (Supplemental File 2E). Le terminal exécutera le script et produira une représentation graphique (Supplemental File 2F) ainsi qu'un fichier .csv contenant les données brutes pour chaque échantillon (Supplemental File 2G et Supplemental File 3). Les fichiers de sortie sont enregistrés dans le même dossier que le script R et les fichiers de séquence.
      REMARQUE : si le même script R est réexécuté, tout nouveau fichier .csv généré écrasera les anciens. En cas d'analyses multiples sur les mêmes fichiers, faire une copie du dossier.
    11. Analyser les données en ouvrant chaque fichier .csv.
      1. Interpréter les données brutes comme des proportions d'indels dans la séquence échantillon. La conversion par recombinaison homologue du site de reconnaissance I-SceI vers la séquence sauvage SacI produit la délétion canonique de 23 pb ; le script indique cette valeur HR sur une ligne séparée en bas du fichier de sortie (Supplemental File 2G). La valeur 0-indel représente l'absence de cassure double brin (DSB) ou une réparation NHEJ sans indels. Additionner toutes les autres valeurs d'indels pour obtenir la NHEJ avec traitement. La somme de la NHEJ avec traitement et de la HR correspond au nombre total d'événements de réparation de DSB détectables.
      2. Calculer les proportions des voies de réparation parmi les événements de réparation de DSB détectables à l’aide des équations suivantes :
        Proportion de NHEJ avec traitement = (NHEJ avec traitement) / (NHEJ avec traitement + HR)
        Proportion de HR = (HR) / (NHEJ avec traitement + HR)
        REMARQUE : environ 10 à 15 échantillons sont utilisés pour chaque condition dans chaque expérience génétique (par exemple, mutants homozygotes et témoins hétérozygotes). Chaque expérience génétique est répétée 2 à 3 fois, et les données individuelles sont regroupées.

Résultats

Drosophila nécessite Rad51 pour la réparation par recombinaison homologue

Des expériences germinales réussies produisent les classes phénotypiques attendues illustrées dans la Figure 3A et au moins 20 descendants analysables par flacon. Des phénotypes inattendus ou moins de 20 descendants analysables indiquent une contamination ou une productivité insuffisante et doivent être exclus conformément à l'étape 1.4.3. Pour l'analyse TIDE, les échantillons réussis produisent un amplicon d’environ 1,7 kb et des chromatogrammes présentant peu de bruit de fond avant le site de rupture ; l’ADN de faible rendement ou contaminé et les chromatogrammes bruités sont sous-optimaux et ne doivent pas être analysés.

Lorsqu'on utilise le test DR-white avec une source d'I-SceI induite par choc thermique, la fréquence de réparation par recombinaison homologue (HR) chez les mouches de type sauvage est de 38,5 ± 1,2 % (moyenne ± erreur type de la moyenne), tandis que la réparation par annealing de brins simples (SSA) se produit environ à 3,2 ± 0,35 % (Figure 3B et Fichier supplémentaire 4). Rad51 (codée par l'homologue spnA chez Drosophila) est nécessaire pour l'étape d'invasion de brin de la recombinaison homologue14,19. Ainsi, la perte de Rad51 devrait entraîner une réparation inefficace par HR. En effet, dans un fond DmRad51-/-, la réparation par HR est réduite à 1,3 ± 0,4 %, avec une augmentation concomitante de la réparation par SSA (34,5 ± 1,8 % ; Figure 3B et Fichier supplémentaire 4)14. Ceci est très probablement dû à des événements de réparation initialement engagés dans la recombinaison homologue, qui sont réparés de manière alternative par l'annealing de brins simples des séquences répétées de white.

Contribution de Drosophila CtIP à une réparation efficace par recombinaison homologue dans les tissus somatiques

L'algorithme TIDE permet de mesurer le choix de la voie de réparation dans les cellules somatiques. Dans un fond génétique non muté, la NHEJ avec traitement se produit dans 59,0 % des événements de réparation détectables, et la HR se produit dans 41,0 % (Figure 4B et Fichier supplémentaire 4). CtIP joue un rôle important dans l'initiation de la réparation par HR en favorisant la résection des extrémités de l'ADN20. Ainsi, dans un fond DmCtIP-/-, le choix de la voie HR est nettement réduit dans les cellules somatiques, passant de 41,0 % chez les témoins hétérozygotes à 10,9 % chez les mutants homozygotes (Figure 4B et Fichier supplémentaire 4)16. Cela suggère que chez Drosophila, CtIP contribue à la réparation par HR, mais n'est pas essentiel pour celle-ci.

Schéma du test DR-white illustrant les voies de réparation de l'ADN ; méthodes HR, NHEJ, SSA avec les éléments du gène Sce.white.
Figure 1 : Test rapporteur de cassure double-brin (DSB) DR-white et résultats de réparation. Le test du répétition directe du gène white contient deux copies non fonctionnelles du gène white : Sce.white (avec une insertion de 23 pb contenant le site de reconnaissance I-SceI et introduisant un codon d'arrêt prématuré) et iwhite (séquence donneuse tronquée aux extrémités 5′ et 3′). Le croisement de mouches portant DR-white et un transgène I-SceI produit une cassure double-brin spécifique au site, pouvant être analysée de manière phénotypique ou moléculaire. Les phénotypes obtenus sont : (A) descendants aux yeux blancs (y+ w−), indiquant l'absence de DSB, une HR intersœur ou une NHEJ ; (B) descendants aux yeux rouges (y+ w+), indiquant une recombinaison homologue intrachromosomique ayant restauré la séquence sauvage SacI à partir du donneur iwhite ; et (C) descendants au corps jaune et aux yeux blancs (y− w−), indiquant une réparation par annealing de brin simple (SSA) ou un crossing-over mitotique. Figure adaptée de Do et al.14. Abréviations : CO = crossing-over ; DR-white = répétition directe du gène white ; DSB = cassure double-brin ; HR = recombinaison homologue ; NHEJ = jonction non homologue des extrémités ; SSA = annealing de brin simple. Veuillez cliquer ici pour visualiser une version agrandie de cette figure.

Schéma d'édition génique : recombinaison homologue, clivage par I-SceI, DR-white.mu, ADN, iwihiteΔ9, sites SacI.
Figure 2 : Dérivés du test DR-white. (A) Le test DR-white.mu contient 28 SNP silencieux dans la séquence donneuse iwhite.mu, entraînant une divergence de séquence de 1,4 % entre les répétitions directes. La conversion génique des polymorphismes individuels varie selon les événements de recombinaison homologue (HR) et peut être déterminée par séquençage. (B) Le système DR-white utilisant le donneur iwhiteΔ9 permet de distinguer la recombinaison interhomologue de la recombinaison intrachromosomique. Une recombinaison homologue (HR) à partir du donneur intrachromosomique iwhite restaure la séquence sauvage de SacI et produit une descendance aux yeux rouges. Une HR à partir du donneur interhomologue iwhiteΔ9 produit une descendance aux yeux orangés, car la délétion de 9 pb diminue l'expression du gène white. La figure est adaptée de Do et al.14 et Fernandez et al.15. Abréviations : DSB = cassure double brin ; HR = recombinaison homologue ; SNP = polymorphisme nucléotidique unique. Veuillez cliquer ici pour consulter une version agrandie de cette figure.

Voies de réparation des gènes de Drosophile, diagramme de croisements génétiques, analyse du graphique en barres de la distribution des descendants.
Figure 3 : Protocole expérimental pour la détection des résultats de la réparation des cassures double brin dans la lignée germinale pré-méiotique. (A) Le croisement 1 associe le rapporteur DR-white (ou un dérivé) à un transgène I-SceI (dans cet exemple, sur le deuxième chromosome). Les descendants portant à la fois le test DR-white et le transgène I-SceI conservent les événements de réparation dans leurs tissus germinaux et somatiques. Pour analyser les événements individuels de réparation dans la lignée germinale pré-méiotique, les descendants portant les deux transgènes sont croisés avec des mouches témoins y w (croisement 2), et les descendants sont notés comme décrit dans la Figure 1. (B) Événements individuels de réparation des cassures double brin dans la lignée germinale de mouches de type sauvage (n = 106 lignées germinales) et de mutants homozygotes DmRad51 (n = 46 lignées germinales). **P < 0,01 ; ****P < 0,0001 par ANOVA à deux facteurs suivie du test de comparaisons multiples de Sidak. Les barres représentent les moyennes ; les barres d'erreur représentent l'EM. Les données ont été réanalysées à partir de Do et al.14. Abréviations : ANOVA = analyse de la variance ; CO = crossing-over ; DSB = cassure double brin ; HR = recombinaison homologue ; NHEJ = jonction non homologue des extrémités ; SEM = erreur standard de la moyenne ; SSA = appariement de brins simples. Veuillez cliquer ici pour visualiser une version agrandie de cette figure.

Processus d'édition génique par séquençage Sanger avec analyse TIDE ; inclut un tableau comparatif des méthodes de réparation.
Figure 4 : Protocole expérimental pour la détection des résultats de la réparation des cassures double brin à l'aide du suivi des indels par décomposition (TIDE). (A) Des mouches portant le transgène DR-white et un transgène induit I-SceI sont analysées par extraction d'ADN génomique, amplification par PCR du site de cassure double brin, séquençage Sanger et analyse TIDE à l'aide d'un script R. (B) Données représentatives provenant de mutants DmCtIP-/- (n = 23) et de témoins hétérozygotes DmCtIP+/- (n = 31). Les événements de réparation détectables sont calculés comme la somme de la recombinaison homologue (HR) et de la jonction non homologue des extrémités (NHEJ) avec traitement, en excluant l'absence de cassure double brin ou la NHEJ sans indels. ****P < 0,0001 par ANOVA à deux facteurs suivie du test de comparaisons multiples de Sidak. Les barres représentent les moyennes ; les barres d'erreur indiquent l'erreur type de la moyenne (SEM). Les données ont été réanalysées à partir de Thomas et al.16. Abréviations : ANOVA = analyse de la variance ; DSB = cassure double brin ; gDNA = ADN génomique ; HR = recombinaison homologue ; NHEJ = jonction non homologue des extrémités ; PCR = réaction en chaîne par polymérase ; SEM = erreur type de la moyenne ; TIDE = suivi des indels par décomposition. Veuillez cliquer ici pour visualiser une version agrandie de cette figure.

Fichier supplémentaire 1 : Script R TIDE pour l'identification des insertions et des délétions dans les chromatogrammes de séquence par rapport à un témoin sans cassure double-brin (DSB). Le nom du fichier témoin modifiable par l'utilisateur, les noms des fichiers d'échantillons et la séquence cible de I-SceI sont indiqués vers la fin du script. Les entrées requises, les fichiers de sortie et leur interprétation sont décrits à la section 2.3. Les packages sangerseqR et Biostrings sont nécessaires.Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.

Fichier supplémentaire 2 : Guide illustré pas à pas du flux de travail du script R TIDE. Les panneaux illustrent les actions logicielles décrites à la section 2.3.Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.

Fichier supplémentaire 3 : Exemple de sortie TIDE et calculs des événements de réparation. La valeur 0-indel représente l'absence de cassure double-brin (DSB) ou de NHEJ sans indels ; la ligne HR distincte représente le produit canonique de suppression de 23 pb ; tous les pourcentages d'indels restants sont additionés comme NHEJ avec traitement. La réparation détectable totale est calculée comme la somme de HR et de NHEJ avec traitement.Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.

Fichier supplémentaire 4 : Données brutes sous-jacentes aux Figures 3B et 4B, organisées en feuilles de calcul modifiables distinctes. Ces données ont été réanalysées à partir des études précédemment publiées citées dans les légendes correspondantes des figures.Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.

Discussion

La polyvalence du système DR-white constitue un facteur essentiel de son impact passé et futur dans le domaine de la réparation de l'ADN. Premièrement, la séquence d'intégration attB présente dans le construct rapporteur DR-white permet aux chercheurs de cibler ce rapporteur à de nombreux emplacements au sein du génome de Drosophila21, plusieurs lignées ciblées étant déjà disponibles22. Deuxièmement, la disponibilité de différents transgènes I-SceI, tels que l'expression induite par choc thermique via le promoteur hsp70 (cette étude), l'expression constitutive via le promoteur ubiquitin23, ou encore l'expression germinale préméiotique via le promoteur Bam24, offre de nombreux contextes développementaux et spécifiques aux tissus pour explorer la réparation des cassures double brin (DSB). Quel que soit le transgène I-SceI utilisé , les croisements génétiques doivent être soigneusement planifiés afin de s'assurer que le transgène I-SceI n'est introduit qu'au cours du croisement final, garantissant ainsi une induction adéquate des DSB. Il est important de noter que les fréquences de réparation peuvent varier considérablement selon l'emplacement génomique du DR-white et/ou le transgène I-SceI utilisé. De futures expériences pourraient comparer davantage les emplacements génomiques et les transgènes I-SceI afin de déterminer si c'est le contexte génomique ou la spécificité tissulaire qui oriente la réparation des DSB.

Un avantage particulier du test DR-white et de ses dérivés est qu'ils permettent d'identifier la réparation des cassures double brin (DSB) par recombinaison homologue, par NHEJ avec traitement, et, dans la plupart des cas, par SSA. Bien qu'il ait été conçu pour détecter phénotypiquement les événements de réparation dans la lignée germinale, ce système permet également l'analyse des tissus somatiques grâce à l'analyse algorithmique TIDE. Malgré ces avantages, certaines limites de ce test doivent être prises en compte. Notamment, le test DR-white pourrait sous-estimer les fréquences de recombinaison homologue (HR). Comme dans d'autres tests rapporteurs génétiques utilisant des DSB induites par nucléase, la réparation par HR à partir d'un chromatide sœur (HR intersœur) ne peut être distinguée d'un événement sans DSB ou d'un NHEJ sans traitement. Ainsi, une partie au moins de la catégorie « Pas de DSB/NHEJ » pourrait correspondre à des événements de HR. Compte tenu de cette limitation, les résultats comparant des facteurs génétiques (tels que des lignées mutantes) doivent être interprétés avec prudence. D'autres limites du test incluent l'impossibilité de quantifier les événements préméiotiques n'ayant pas produit de descendants viables. Par exemple, les événements de DSB non réparés et ayant entraîné la mort cellulaire ne seront pas comptabilisés chez les descendants. Bien que la fertilité globale puisse constituer une mesure qualitative de la mort des cellules germinales, des tests cellulaires (comme le test TUNEL) peuvent s'avérer nécessaires. En outre, l'analyse par script R TIDE fournit uniquement la proportion d'événements détectables dans une population cellulaire. Pour déterminer les séquences spécifiques des indels résultants, un séquençage d'événements de réparation individuels par séquençage ADN multiplex est requis.

Le test DR-white a déjà eu un impact profond sur l'étude de la réparation des cassures double brin (DSB). Son application a permis d'identifier des facteurs contribuant à la réparation des DSB chez les organismes multicellulaires, notamment l'âge25, le sexe26, l'emplacement de la DSB22,26, l'emplacement de la séquence donneuse15, le cycle cellulaire et le type de tissu26. De plus, nous avons utilisé ce test pour identifier plusieurs protéines qui orientent également le choix de la voie de réparation et/ou la réparation de séquences divergentes chez Drosophila, notamment Msh627, Blm28, Rif116 et CtIP16,29. En effet, l'utilisation bien établie de Drosophila comme organisme modèle génétique, doté de protéines de réparation de l'ADN conservées, fournit un système simple et multicellulaire permettant d'étudier les facteurs génétiques, cellulaires et organismiques qui contribuent à la réparation des DSB dans des contextes biologiques complexes.

Déclarations de divulgation

Les auteurs n'ont pas de conflits d'intérêts financiers ou non financiers à divulguer.

Remerciements

Cette méthode a été développée alors que J.R.L. bénéficiait d'une bourse de recherche de l'AFAR délivrée par l'American Federation for Aging Research.  Ce travail a également été soutenu par le National Institute of General Medical Sciences (1R15GM110454 et 1R15GM129628) attribué à J.R.L. Les figures ont été réalisées avec l'aide de BioRender (https://BioRender.com/b8sbcjp) 2026.

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
Pestles de 0,5 mL sans RNase/DNaseFisher Scientific12141363Pour l'homogénéisation des échantillons en vue de l'extraction d'ADN génomique
Boules de cotonGenesee Scientific51-101Pour la culture standard de Drosophila
Incubateur réfrigéré Drosophila à effet PeltierShel LabSRI6PFPour la culture standard de Drosophila
Stock de Drosophila : y[1] w[1]Bloomington Drosophila  Stock CenterRRID:BDSC 1495
Stock de Drosophila : y[2] w[Δ] cho[2] v[1] ; P{70I-SceI}2B Sco / CyO, P{GFP, w+} LaRocque LabN/ACréé par le laboratoire LaRocque par recombinaison standard du stock RRID:BDSC_6934 (y[1] w[*]; P{ry[+t7.2]=70FLP}11 P{v[+t1.8]=70I-SceI}2B sna[Sco]/CyO, S[2]) provenant du Bloomington Drosophila Stock Center ; disponible sur demande auprès de l'auteur correspondant
Stock de Drosophila : y[2] w[Δ] cho[2] v[1] ; DR-white (y+).3 51C,RFP+ / [CyO-GFP]LaRocque LabN/AEssai DR-white intégré dans le stock RRID:BDSC_24482 (y[1] M{RFP[3xP3.PB] GFP[E.3xP3]=vas-int.Dm}ZH-2A w[*]; M{3xP3-RFP.attP’}ZH-51C) ; disponible sur demande auprès de l'auteur correspondant
Stock de Drosophila : y[2] w[Δ] cho[2] v[1] ; DR-white.mu (y+).3 51C,RFP+ / [CyO-GFP]LaRocque LabN/AEssai DR-white.mu intégré dans le stock RRID:BDSC_24482 (y[1] M{RFP[3xP3.PB] GFP[E.3xP3]=vas-int.Dm}ZH-2A w[*]; M{3xP3-RFP.attP’}ZH-51C) ; disponible sur demande auprès de l'auteur correspondant
Stock de Drosophila : y[1] w[*]; iwhite2 (y+).1 51C,RFP+ / [CyO]LaRocque LabN/ADonneur iwhiteΔ9 intégré dans le stock RRID:BDSC_24482 (y[1] M{RFP[3xP3.PB] GFP[E.3xP3]=vas-int.Dm}ZH-2A w[*]; M{3xP3-RFP.attP’}ZH-51C) ; disponible sur demande auprès de l'auteur correspondant
Fermetures de bouteilles Drosophila FlugsGenesee Scientific49-100Pour la culture standard de Drosophila
Stéréomicroscope fluorescent (RFP)TriTech ResearchSMT1-FLPour la manipulation et le tri standard de Drosophila "fly pushing" basés sur la fluorescence
Plateau FlyStuff pour DrosophilaGenesee Scientific59-172Pour la manipulation standard de Drosophila "fly pushing"
KimwipesKimberly-Clarke06-666A
Bain-marie MyBath 4 LMidwest ScientificMB-2000-4Pour  le choc thermique
NanoDrop OneThermo Fisher Scientific13-400-518LYPour la quantification de l'ADN
Milieu de formulation Nutri-fly BloomingtonGenesee Scientific66-121Pour la culture standard de Drosophila
Homogénéisateur motorisé sans fil Pellet PestleDWK Life SciencesK749540-0000Pour l'homogénéisation des échantillons en vue de l'extraction d'ADN génomique
Bouteilles en polypropylèneGenesee Scientific32-130Pour la culture standard de Drosophila
Vials en polystyrèneGenesee Scientific32-116Pour la culture standard de Drosophila, y compris le choc thermique
Amorce/oligonucléotide DR-white_8fN/A ; tout service de synthèse d'oligonucléotides convientN/A5'GTGGATCAGGTGATCCAGG
Amorce/oligonucléotide DR-white_8aN/A ; tout service de synthèse d'oligonucléotides convientN/A5’-CTTAAGCCATCGTCAGTTGC
Amorce/oligonucléotide DR-white_9fN/A ; tout service de synthèse d'oligonucléotides convientN/A5’-GAGCCCACCTCCGGACTGGAC
R StudioPositVersion 2023.06.1+524Version téléchargeable gratuite ; toute version de R Studio est acceptable, bien que les données présentées aient été analysées avec  la version 2023.06.1+524
Packages R Studio : BiostringsBioconductor.org (Version 3.24)Version 2.76.0Le script R invitera l'utilisateur à installer ce package
Packages R Studio : sangerseqRBioconductor.org (Version 3.24)Version 1.44.0Le script R invitera l'utilisateur à installer ce package
SapphireAMP Fast PCRTakaraRR350B
StéréomicroscopeLeicaM60Pour la manipulation standard de Drosophila "fly pushing"
Wizard SV Gel and PCR Clean up PromegaA9281

Références

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Ruptures double brin de l ADNr paration des DSBrecombinaison homologuejonction d extr mit s non homologuesrecuisson de brin simplem ganucl ase I SceIanalyse par PCRanalyse TIDE
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