Cette étude a été menée conformément aux normes éthiques de l'Hôpital municipal n°4 de Shanghai, École de médecine de l'Université Tongji, et a été approuvée par le comité d'éthique institutionnel (numéro d'approbation : 2026013-001). Les dents humaines extraites utilisées dans cette étude ont été collectées auprès de patients ayant subi une extraction dentaire pour des raisons orthodontiques ou parodontologiques. Un consentement éclairé écrit a été obtenu de tous les participants avant la collecte des échantillons. Aucune intervention clinique supplémentaire n'a été réalisée dans le cadre de cette étude. L'étude a été menée conformément aux exigences institutionnelles relatives à l'utilisation de dents humaines extraites.
Préparation et critères de sélection des échantillons
Un total de 141 dents permanentes monoradiculaires (incisives mandibulaires et prémolaires) récemment extraites a été reçu du service de stomatologie affilié à l'Université Tongji au Shanghai Fourth People’s Hospital. Toutes les dents ont été extraites pour des raisons orthodontiques ou parodontales. Un consentement éclairé a été obtenu auprès de chaque patient. Ont été incluses dans cette étude les dents dont la racine mesurait au moins dix millimètres, mesurée à l’aide d’un détecteur parodontal, les dents intactes sans lésions carieuses ni fissures, avec une formation radiculaire complète et une courbure radiculaire inférieure à dix degrés selon la méthode de Schneider. Ont été exclues les dents présentant plusieurs canaux, une calcification canalaire, une résorption interne ou un traitement endodontique antérieur. Après l’extraction, tout tartre visible et les résidus de tissus mous ont été éliminés à l’aide d’un instrument parodontal. Les dents ont ensuite été conservées dans une solution saline à 0,9 % à 4 °C jusqu’à leur utilisation afin d’éviter la déshydratation, et toutes les expériences ont été réalisées dans les trois mois suivant l’extraction. Les échantillons ont été répartis dans les groupes expérimentaux selon une séquence prédéfinie d’attribution alternée. Plus précisément, les échantillons ont été attribués séquentiellement à chaque groupe de manière alternée jusqu’à atteindre la taille d’échantillon requise pour chaque groupe. Aucun calcul formel de puissance a priori n’a été effectué. La taille de l’échantillon a été choisie en se basant sur des études ex vivo comparables antérieures, le nombre de combinaisons de paramètres d’irradiation évaluées et la disponibilité des dents extraites éligibles.
Préparation et stérilisation du canal radiculaire
La couronne de chaque dent a été retirée au niveau de la jonction cémento-émail à l’aide d’une scie à diamant à basse vitesse sous refroidissement continu par eau afin d’obtenir un segment radiculaire standardisé de 10 mm. La longueur de travail a été déterminée à 1 mm du foramen apical à l’aide d’un fichier K de taille 10. Les canaux radiculaires ont été préparés à l’aide du système rotatif en nickel-titane ProTaper Universal selon les instructions du fabricant, en suivant la séquence S1, S2, F1, F2 et F3 jusqu’à l’obtention d’une taille apicale de préparation F3. Pendant l’instrumentation, les canaux ont été irrigués avec environ 2 mL d’hypochlorite de sodium à 5,25 % après l’utilisation de chaque fichier rotatif, ce qui a donné un volume total d’irrigation d’environ 10 mL par canal. Un rinçage final a été effectué avec 5 mL d’EDTA à 17 % pendant 1 minute, suivi de 5 mL de solution saline stérile. Le foramen apical a été scellé avec une résine composite fluide afin de créer un système canalaire fermé. Les racines préparées ont été stérilisées par autoclavage à 121 °C pendant 20 minutes, conservées dans une solution saline tamponnée au phosphate stérile (PBS) à 4 °C, puis inoculées avec des bactéries dans les 24 heures suivant la stérilisation.
Souche bactérienne et conditions de culture
E. faecalis ATCC 29212 a été utilisée pour établir le modèle de canal radiculaire infecté. La souche a été cultivée sur gélose au bouillon cerveau-cœur (BHI) à 37 °C pendant 24 h en conditions aérobies. Une colonie isolée a été transférée dans un bouillon BHI et incubée à 37 °C pendant 18 à 24 h. La suspension bactérienne a été ajustée à environ 1,5 × 108 UFC/mL, ce qui correspond à un étalon McFarland 0,5, en utilisant une densité optique à 600 nm (DO600) comprise entre 0,08 et 0,10.
Mise en place de E. faecalis Modèle de canal radiculaire infecté
Pour établir un modèle de biofilm en canal radiculaire infecté, la surface externe de chaque racine stérilisée a été recouverte de deux couches de vernis à ongles incolore afin d'empêcher la pénétration bactérienne à travers le cément. La région apicale a été recouverte après que le foramen apical eut été obturé avec un composite résineux fluide, tandis que l'orifice du canal est resté découvert pour permettre l'inoculation bactérienne. À l'aide d'une micropipette stérile, 10 µL du E. faecalis la suspension a été transférée dans chaque canal radiculaire individuel afin de remplir toute la longueur du canal sans débordement. Les échantillons inoculés ont ensuite été placés individuellement dans des plaques de culture stériles à 24 puits, avec ajout de 1,5 mL de bouillon BHI dans chaque puit. Les échantillons ont été mis en culture à 37°C en conditions aérobies pendant 21 jours. Le milieu de culture a été éliminé et remplacé tous les 2 jours par du bouillon BHI stérile frais afin d'assurer un apport continu en nutriments pour la croissance bactérienne et d'éliminer les débris cellulaires accumulés. Aucune inoculation supplémentaire avec E. faecalis n'a été effectuée lors du changement de milieu. À l'issue de la période d'incubation, tous les échantillons viables ont été lavés une fois au PBS pour éliminer les bactéries planctoniques faiblement adhérentes avant les tests expérimentaux. Deux échantillons choisis aléatoirement ont été utilisés pour visualiser la formation de biofilm mature et la pénétration bactérienne dans les tubules dentinaires par microscopie électronique à balayage (MEB). Les spécimens ont été fixés dans du glutaraldéhyde à 2,5 % à 4°C pendant 24 h, rincés trois fois au PBS, déshydratés par une série graduée d'éthanol (30 %, 50 %, 70 %, 80 %, 90 % et 100 %), chaque étape durant 10 min, puis divisés longitudinalement, séchés à l'air, montés sur des supports en aluminium, recouverts par pulvérisation d'or et examinés au MEB.
Groupes expérimentaux et protocoles d'irradiation laser
Les 135 échantillons de racines infectées ont été répartis en trois groupes expérimentaux principaux selon le système laser utilisé : le groupe laser à diode 808 nm, le groupe laser au thulium 1940 nm et le groupe laser à l'erbium 2940 nm. Chaque groupe laser comprenait 45 échantillons, subdivisés ultérieurement selon les paramètres d'irradiation. Le laser à diode a été utilisé à des puissances moyennes de 1,0, 1,5 ou 2,0 W, chaque réglage de puissance étant appliqué pendant 10, 20 ou 30 s, conduisant à neuf sous-groupes comportant trois échantillons par sous-groupe. Le laser au thulium a été utilisé à des puissances moyennes de 1,5, 2,5 ou 3,5 W, chaque réglage de puissance étant appliqué pendant 10, 20 ou 30 s, donnant également lieu à neuf sous-groupes avec trois échantillons par sous-groupe. Le laser à l'erbium fonctionnait en mode d'impulsion super-courte à une fréquence fixe de 15 Hz. Des énergies d'impulsion de 10, 20 ou 30 mJ ont été appliquées pendant 10, 20 ou 30 s, générant ainsi neuf sous-groupes avec trois échantillons par sous-groupe. Les lasers à diode 808 nm et au thulium 1940 nm ont tous deux fonctionné en mode continu.
Au total, six échantillons supplémentaires ont été inclus, trois échantillons étant attribués à chacun des groupes de contrôle négatif et positif. Le groupe de contrôle négatif a été traité avec une solution saline stérile, tandis que le groupe de contrôle positif a été traité avec de l'hypochlorite de sodium (NaOCl) à 5,25 % pendant 30 s.
Pour les groupes au laser, un protocole d'irradiation standardisé a été suivi. La fibre optique a été introduite dans le canal radiculaire jusqu'à la longueur de travail et déplacée en un mouvement spiralé lent et continu du tiers apical vers le tiers coronal pendant toute la durée de l'irradiation. Des fibres ou embouts spécifiques au laser ont été utilisés plutôt qu'une fibre interchangeable unique. Le laser à diode de 808 nm a été acheminé à travers une fibre émettrice terminale de 200 µm, le laser au thulium de 1940 nm à travers une fibre émettrice terminale de 200 µm, et le laser à l'erbium de 2940 nm à travers un embout émetteur radial de 400 µm. La fibre ou l'embout d'acheminement a été retiré à une vitesse d'environ 1 mm/s. Une fois l'orifice du canal atteint, il a été réinséré jusqu'à la longueur de travail, et le mouvement spiralé apical vers coronal a été répété jusqu'à l'achèvement de la durée d'irradiation prévue.
Pour les lasers au thulium et à l'erbium, les canaux ont été maintenus remplis de sérum physiologique stérile pendant l'irradiation afin de simuler une activation laser assistée par l'eau. Environ 10 µL de sérum physiologique stérile ont été introduits dans chaque canal pour le remplir jusqu'au niveau de l'orifice canalaire avant l'irradiation. Le sérum physiologique a été renouvelé avant chaque cycle d'irradiation, si nécessaire, afin de maintenir un canal rempli de liquide tout au long du traitement. Pour le groupe laser à diode, les canaux ont été séchés à l'aide de points de papier stériles avant l'irradiation, car le laser à diode de 808 nm présente une absorption relativement faible dans l'eau et a été utilisé pour produire un effet antibactérien photothermique direct à l'intérieur du canal. En revanche, les lasers au thulium de 1940 nm et à l'erbium de 2940 nm présentent une absorption dans l'eau nettement plus élevée et ont donc été utilisés dans des canaux remplis de sérum physiologique afin de faciliter des effets photothermiques et photomécaniques médiés par l'eau. Le traitement au laser a été répété une fois par jour pendant trois jours consécutifs.
Mesure de la température de la surface radiculaire externe
Les variations de température en temps réel sur la surface radiculaire externe ont été mesurées pendant la première journée d'irradiation laser. Chaque échantillon radiculaire a été fixé verticalement sur un support d'éprouvette à température ambiante (22 °C ± 1 °C). Un thermocouple de type K relié à un thermomètre numérique a été placé en contact ferme avec le tiers moyen de la surface radiculaire externe, perpendiculairement à l'axe longitudinal de la racine. La sonde du thermocouple a été positionnée à l'aide d'une pince réglable et fixée à la surface de la racine avec un ruban adhésif résistant à la chaleur afin de maintenir un contact ferme et constant tout au long de la mesure. La sonde du thermocouple a été étalonnée avant chaque session de mesure à l'aide d'eau bouillante (100 °C) et d'un mélange glace-eau (0 °C). Les relevés de température ont été enregistrés à des intervalles de 50 ms pendant toute la durée d'irradiation (10, 20 ou 30 s). La température de base et la température maximale enregistrée pendant ou immédiatement après l'irradiation laser ont été mesurées pour chaque échantillon. L'augmentation de température entre la température de base et la température maximale a été calculée sous la forme de ΔT. Une valeur de ΔT supérieure à 10 °C a été considérée comme le seuil pouvant entraîner des lésions des tissus parodontaux.
Évaluation microbiologique : dénombrement des colonies et taux d'inhibition
Afin de déterminer l'effet antibactérien des traitements au laser, des échantillons ont été prélevés après chaque traitement au laser. Le canal a été séché à l’aide de points de papier stériles. Un nouveau fichier stérile Hedström de taille 40 a été utilisé pour chaque prélèvement afin d’obtenir des copeaux de dentine à partir des parois du canal, évitant ainsi toute contamination croisée entre les échantillons. Chaque copeau de dentine a été transféré dans un tube microcentrifuge distinct contenant 1 mL de PBS stérile. Les tubes ont été vigoureusement agités au vortex pendant 30 secondes afin de libérer les bactéries des copeaux de dentine. Des dilutions sériées dix fois successives, allant de 10−1 à 10−6, ont été préparées en transférant 100 µL de la suspension bactérienne dans 900 µL de PBS stérile à chaque étape de dilution. Des aliquots (30 µL) de chaque dilution ont été étalés sur des boîtes de gélose infusion cerveau-cœur distinctes, puis incubés à 37°C pendant 24 heures. Les colonies ont été dénombrées et exprimées en unités formant colonies (UFC). Chaque dilution a été ensemencée en triple, et le nombre moyen de colonies provenant des trois boîtes a été utilisé pour l’analyse. Les boîtes ont été codées avant le dénombrement, et l’investigateur effectuant le dénombrement des colonies était aveugle quant aux attributions des traitements.

Ici, C est le nombre moyen de CFU du groupe témoin négatif (sérum physiologique) et T est le nombre moyen de CFU du groupe expérimental.
Analyse de la courbe de croissance bactérienne
L'effet de divers traitements laser sur la cinétique de croissance bactérienne a été étudié en traçant des courbes de croissance. Le jour 3 après le traitement laser final, les canaux ont été rincés avec 5 mL de solution saline stérile. Le contenu des canaux a été prélevé à l’aide de points de papier stériles, puis transférés dans un tube de centrifugation contenant 5 mL de bouillon BHI. Le tube a été agité au vortex pour mettre en suspension les bactéries dans le bouillon. La suspension bactérienne a été ajustée à 1 × 106 UFC/mL. La concentration bactérienne a été ajustée en fonction des mesures d’OD600, à l’aide d’une courbe de calibration établie précédemment pour E. faecalis ATCC 29212, puis confirmée par dénombrement des colonies viables. Un aliquot de 200 µL de la suspension a été ajouté dans chaque puits d’une microplaque stérile à 96 puits. En outre, 20 µL d’huile minérale stérile ont été ajoutés dans chaque puits afin de minimiser l’évaporation. La microplaque a été placée dans un spectrophotomètre-incubateur maintenu à 37 °C, et l’OD600 a été mesurée chaque heure pendant 24 heures. Avant chaque mesure d’OD600, la microplaque a été agitée en rotation à environ 300 tr/min pendant 10 secondes afin d’assurer une suspension bactérienne homogène. Chaque échantillon a été testé en cinq puits réplicats.
Analyse statistique
Toutes les données numériques sont présentées sous forme de moyenne ± écart type (ET). Les analyses statistiques ont été réalisées à l'aide du logiciel SPSS version 26.0. La distribution des données a été évaluée à l'aide du test de Shapiro–Wilk. Une analyse de la variance (ANOVA) a été utilisée pour comparer plus de deux groupes, suivie du test de Tukey de différence significative honnête (HSD) pour les comparaisons par paires. Les comparaisons entre deux groupes ont été effectuées à l'aide d'un test t pour échantillons indépendants. L'homogénéité des variances a été vérifiée à l'aide du test de Levene avant l'application des tests paramétriques. Lorsque l'hypothèse d'homogénéité des variances n'était pas respectée, une correction de Welch a été appliquée, selon les cas. Le seuil de significativité statistique a été fixé à P < 0,05. Les graphiques ont été réalisés à l'aide du logiciel GraphPad Prism version 9.0.