L'étude a été menée conformément à la Déclaration d'Helsinki, et le protocole a été approuvé par le Comité d'éthique du Deuxième Hôpital Affilié de l'Université médicale de Nanjing (numéro d'approbation : 2021-KY-100-01). Un consentement éclairé écrit a été obtenu de la part de tous les participants.
Cette étude observationnelle rétrospective monocentrique a été menée au Département de neurologie de l'Hôpital affilié n°2 de l'Université médicale de Nanjing. De janvier 2022 à décembre 2023, un total de 32 patients atteints de maladie de Parkinson primitive répondant aux Critères diagnostiques pour la maladie de Parkinson (édition 2020) ont été inclus. Au final, six patients répondant à des critères de sélection stricts et ayant terminé toutes les procédures de l'étude ont été inclus dans l'analyse ultérieure. Les détails du dépistage, des exclusions et du suivi sont présentés dans la Figure supplémentaire 1.
Collecte des échantillons fécaux et analyse des communautés microbiennes
Le microbiote fécal a été obtenu auprès de donneurs sains. Le processus de sélection des donneurs a été strictement mené conformément au Consensus d'experts chinois sur l'application clinique de la transplantation de microbiote fécal. Critères d'inclusion des donneurs : âge compris entre 18 et 40 ans, sans antécédent de maladies chroniques ; absence d'antécédents de maladies gastro-intestinales, de troubles métaboliques, de maladies auto-immunes ou de troubles psychiatriques ; absence d'utilisation d'antibiotiques, de probiotiques, d'immunosuppresseurs ou d'inhibiteurs de la pompe à protons au cours des 3 derniers mois ; absence de voyage dans des zones épidémiques, de transfusion sanguine ou d'intervention chirurgicale au cours des 6 derniers mois. Le dépistage sanguin et fécal permettant d'exclure les maladies infectieuses et les agents pathogènes comprend : le virus de l'immunodéficience humaine (VIH), le virus de l'hépatite B (VHB), le virus de l'hépatite C (VHC), Treponema pallidum, Clostridium difficile, Salmonella, Shigella, Campylobacter, pathogène Escherichia coli, les virus entériques et les parasites. Le volume d'un seul échantillon de selles valable doit être d'au moins 50 g. Utiliser un système automatisé de purification de la microflore fécale (voir Table des matériels), 500 mL de sérum physiologique stérile ont été ajoutés à chaque 100 g de selles fraîches, suivis de trois cycles de centrifugation et de lavage normalisés (700 × g, 3 min), puis immédiatement inoculé après préparation d'une suspension avec du sérum physiologique stérile dans un rapport volumétrique de 1:2. Les sujets ont reçu une injection unique de 150 mL de suspension contenant environ 5 × 10^13 bactéries viables13.
Tous les receveurs ont reçu une transplantation fécale par coloscopie, avec avancement de l'endoscope jusqu'au caecum et au côlon ascendant ; la suspension a été administrée lentement et de manière homogène par le canal de biopsie afin de favoriser une colonisation préférentielle du côlon droit. Après l'administration, les patients sont restés en position décubitus latéral droit pendant au moins 2 h. Préalablement à la procédure, un régime pauvre en résidus était suivi pendant 3 jours, puis un régime liquide complet pendant 24 h avant l'intervention, avec jeûne solide pendant 6 h et jeûne hydrique pendant 2 h avant l'infusion. La veille de la transplantation, une purge standard de tout l'intestin était effectuée à l'aide d'une solution d'électrolytes au polyéthylène glycol jusqu'à obtention d'un épanchement clair et sans selles. Les restrictions médicamenteuses comprenaient l'arrêt des antibiotiques systémiques au moins 72 h avant la transplantation fécale et leur évitement pendant 1 semaine après celle-ci. Les inhibiteurs de la pompe à protons (IPP) étaient interrompus 24 à 48 h avant la procédure, et les laxatifs ainsi que les probiotiques étaient suspendus le jour de la transplantation.
Durant la procédure, la fréquence cardiaque, la pression artérielle et la saturation en oxygène ont été surveillées en continu, et tout symptôme, tel qu'une distension abdominale, des douleurs ou des nausées, a été observé ; l'infusion a été immédiatement interrompue en cas de douleur abdominale sévère ou d'hypotension. Pendant les 7 premiers jours suivant la transplantation, un suivi quotidien a été effectué afin de noter la fréquence des selles, la consistance des selles et tous les événements indésirables, notamment les douleurs abdominales, la diarrhée, la fièvre et l'hématochacie. Un suivi à long terme s'est prolongé jusqu'à 5 mois, avec des prélèvements fécaux planifiés pour l'analyse de la microflore intestinale et des évaluations cliniques à l'aide de l'échelle d'évaluation unifiée des troubles de Parkinson (UPDRS) et du score de constipation de Wexner, accompagnés de la documentation des modifications des symptômes et de l'utilisation de médicaments concomitants, afin d'évaluer de manière exhaustive à la fois l'efficacité et la sécurité.
Des échantillons fécaux ont été recueillis à six moments différents : avant la TSM et à 1, 2, 3, 4 et 5 mois après la TSM. Tous les participants ont reçu des instructions normalisées pour le prélèvement des échantillons de selles. Environ 10 à 20 g de la partie centrale des selles ont été prélevés à l’aide de pinces stériles et placés dans des récipients de collecte stériles. Les échantillons ont été transportés au laboratoire dans les 2 à 3 heures suivant le prélèvement, puis répartis en aliquots dans des tubes microcentrifuge stériles de 1,5 mL (voir Tableau des matériaux) par des chercheurs formés, en conditions aseptiques. Tous les aliquots ont été immédiatement stockés à −80 °C en attendant des analyses ultérieures.
Après le prélèvement des échantillons fécaux, tous les spécimens ont été transportés sur de la glace sèche vers un prestataire commercial de séquençage (voir Tableau des matériaux) pour le séquençage du gène ARNr 16S. La préparation des bibliothèques, le séquençage et le contrôle qualité initial ont été réalisés selon le protocole standard du prestataire. L'ADN génomique a été extrait de chaque échantillon fécal, puis les régions hypervariables V3–V4 du gène bactérien ARNr 16S ont été amplifiées par réaction en chaîne par polymérase (PCR) à l'aide des amorces 341F et 805R. Le séquençage a été effectué sur une plateforme de séquençage à courtes lectures en laboratoire (voir Tableau des matériaux) utilisant une chimie en lecture double de 2 × 300 pb afin de caractériser les profils microbiens intestinaux des patients avant la FMT et à différents moments de suivi post-FMT. Après le séquençage, les lectures brutes ont été traitées afin d'obtenir des séquences de haute qualité destinées à l'analyse microbienne ultérieure. L'attribution taxonomique a été réalisée à l'aide d'un logiciel commercial d'assignation taxonomique 16S et de sa base de données associée d'identification microbienne (voir Tableau des matériaux). Les profils taxonomiques obtenus ont été utilisés pour les analyses ultérieures de la diversité microbienne, de la composition des communautés, de l'abondance différentielle et des fonctions microbiennes prédites.
Évaluations cliniques et étiquettes analytiques
Les patients atteints de MP ont été répartis en deux groupes selon la gravité de la maladie en fonction de la durée d'évolution : un groupe à forte gravité (>6 ans, désigné « _H ») et un groupe à faible gravité (≤6 ans, désigné « _L »). Les échantillons fécaux prélevés avant la FMT ont été définis comme des échantillons de référence et étiquetés FB_H ou FB_L selon le groupe de gravité correspondant. Les échantillons recueillis à 1, 2, 3, 4 et 5 mois après la FMT ont été étiquetés FP1M_H, FP2M_H, FP3M_H, FP4M_H et FP5M_H pour le groupe à forte gravité, et FP1M_L, FP2M_L, FP3M_L, FP4M_L et FP5M_L pour le groupe à faible gravité. Les paramètres cliniques évalués comprenaient le score de constipation de Wexner, l'échelle des symptômes non moteurs (NMSS), le questionnaire sur les symptômes non moteurs (NMSQ), l'inventaire neuropsychiatrique (NPI), le stade de Hoehn–Yahr, l'échelle des activités de la vie quotidienne (ADL), l'indice de qualité du sommeil de Pittsburgh (PSQI), l'échelle unifiée des troubles de la maladie de Parkinson (UPDRS I–VI) et le score total de l'UPDRS. Une combinaison de méthodes statistiques descriptives et inférentielles a été utilisée pour analyser les variations des indicateurs cliniques des patients atteints de MP dans le groupe à forte gravité (_H) et le groupe à faible gravité (_L) à six moments différents. Afin d'explorer préliminairement les différences entre groupes à tous les moments, les distributions des indicateurs entre les groupes _H et _L ont été comparées à chaque moment à l'aide du test de Wilcoxon-Mann-Whitney, puis un modèle linéaire mixte (LMM) plus rigoureux, incluant des intercepts aléatoires spécifiques à chaque patient, a été appliqué. En raison de la taille limitée de l'échantillon, les résultats du modèle à effets mixtes sont fournis uniquement comme références exploratoires. Le critère d'évaluation principal de cette étude exploratoire était la variation de la diversité et de la composition du microbiote intestinal entre le moment de référence et les moments postérieurs à la transplantation du microbiote fécal, les modifications cliniques étant considérées comme des critères secondaires.
Regroupement des OTU, analyse de la diversité et abondance taxonomique
Des unités taxonomiques opérationnelles (OTU) ont été utilisées pour résumer la composition des communautés microbiennes, et les séquences présentant une similarité ≥97 % ont été regroupées dans la même OTU. La profondeur du séquençage a été évaluée à l'aide de courbes de raréfaction basées sur l'indice de Shannon, les paliers des courbes indiquant généralement une couverture suffisante pour les analyses ultérieures de la diversité.
La diversité alpha a été évaluée à l'aide des indices Chao1 et de l'estimateur d'abondance basé sur la couverture (ACE) pour la richesse microbienne, ainsi que des indices de Shannon et de Simpson pour la diversité globale et l'équité. La diversité bêta a été évaluée à l'aide des distances UniFrac pondérées et non pondérées, suivies d'une analyse en coordonnées principales (PCoA) afin de visualiser les différences de composition des communautés microbiennes entre les groupes. Les différences entre groupes en matière de diversité alpha et bêta ont été évaluées respectivement à l'aide de tests non paramétriques et d'une analyse de variance multivariée permutationnelle (PERMANOVA), comme décrit dans la section d'analyse statistique.
La composition taxonomique a été résumée aux niveaux de phylum, classe, ordre, famille et genre à partir de données de séquençage du gène de l'ARNr 16S. À l'aide d'un package d'analyse en écologie des communautés pour R (voir Tableau du matériel), identifier et visualiser les 10 taxons les plus abondants à chaque niveau taxonomique. Les profils taxonomiques ont été représentés à l'aide de diagrammes en barres, et certains taxons ont été comparés plus en détail entre les groupes à l'aide de boîtes à moustaches.
Analyse de l'abondance différentielle des taxons microbiens
Les taxons différemment abondants parmi les groupes prédéfinis ont été identifiés à l'aide de l'analyse de la taille de l'effet par discrimination linéaire (LEfSe). LEfSe combine le test de Kruskal-Wallis, le test de Wilcoxon et l'analyse discriminante linéaire (LDA) afin d'identifier les taxons présentant à la fois une signification statistique et une valeur discriminatoire. Les taxons ayant une valeur P < 0,05 et un score LDA (log10) > 3 ont été considérés comme différemment abondants. Les abondances relatives des taxons discriminants ont été visualisées à l'aide de diagrammes en barres taxonomiques.
Prédiction fonctionnelle et analyse de corrélation clinique
Les profils fonctionnels prédits du microbiote intestinal ont été déduits à partir de données de séquençage du gène ARNr 16S à l'aide de Tax4Fun2 et annotés selon la base de données Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes (KEGG). Les voies prédites différemment enrichies ont été identifiées à l'aide de LEfSe, avec un seuil de P < 0,05 et un score LDA (log10) > 3. Étant donné que ces profils fonctionnels ont été inférés plutôt que mesurés directement par des approches métagénomiques ou métabolomiques, ils ont été interprétés comme des différences fonctionnelles prédites. Une analyse de corrélation de rang de Spearman a été réalisée afin d'explorer les associations entre les caractéristiques microbiennes et les indicateurs cliniques.
Analyse statistique
Les analyses statistiques ont été réalisées à l'aide du logiciel R (voir la table des matériels). Les variables cliniques ont été résumées sous forme de médianes et d'intervalles (minimum–maximum). Les indices de diversité alpha ont été comparés entre les groupes à l'aide du test de Wilcoxon, tandis que la diversité bêta a été évaluée par PERMANOVA avec 999 permutations. Les taxons et voies fonctionnelles prédites différemment abondants ont été identifiés à l'aide de LEfSe, avec un seuil de significativité défini à P < 0,05 et un score LDA (log10) > 3. Pour l'analyse longitudinale de différence d'abondance, un modèle à effets mixtes avec des intercepts aléatoires spécifiques à chaque patient a été appliqué, suivi de comparaisons par paires post-hoc corrigées par la méthode de taux de fausses découvertes de Benjamini-Hochberg. Une analyse de corrélation de Spearman a été utilisée pour évaluer les associations entre les caractéristiques microbiennes intestinales et les indicateurs cliniques, les valeurs de P de corrélation étant corrigées par la méthode de taux de fausses découvertes de Benjamini–Hochberg. Une valeur de P bilatérale < 0,05 a été considérée comme statistiquement significative. Une correction pour comparaisons multiples a été appliquée aux analyses de corrélation et d'abondance taxonomique. Compte tenu de la petite taille de l'échantillon et du plan d'échantillonnage longitudinal répété, les analyses statistiques ont été considérées comme exploratoires, et les résultats ont été interprétés avec prudence.